Stabilized formulation of adenovirus
专利汇可以提供Stabilized formulation of adenovirus专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且空中感染ウィルス、特にアデノウィルス、及びより特定には組換えアデノウィルスを含んで成る組成物に、アルキル成分及びポリエチレングリコール（PEG）を含んで成る非イオン性界面活性剤を添加することによって、前記組成物を安定化するための方法が開示される。 そのような界面活性剤を含んで成る、アデノウィルス、特に遺伝子療法のために適切な組換えアデノウィルスの医薬及び他の組成物がまた開示される。，下面是Stabilized formulation of adenovirus专利的具体信息内容。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝別れしたアルキルである]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝別れしたアルキルである]、又は下記式II：
で示される構造、又はそれらの組合せを有する請求項７記載の方法。
式IIにおいて、RがC a H (2a+1) CO 2 -であり、ここでaが10〜70であり；
式III において、RがCH 3であり、Xが55であり、Yが29であり、そしてZが55であり又はRがCH 3であり、Xが98であり、Yが67であり、そしてZが98であり；又は 式IVにおいて、R'が(CH 3 ) 3 C・CH 2 C(CH 3 ) 2 -であり、Aがフェニレンであり、そしてXが９〜10であり、又はR'が(CH 3 ) 3 C・CH 2 C(CH 3 ) 2 -であり、Aがシクロへキシレンであり、そしてXが９〜10である、請求項９記載の方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝別れしたアルキルである]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、ここでYは10〜15である]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Rは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、そしてここでXは23であり、そしてYは12であるか、又はXは20であり、そしてYは12である]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝別れしたアルキルである]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、ここでYは10〜15である]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Rは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、そしてここでXは23であり、そしてYは12であるか、又はXは20であり、そしてYは12である]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝別れしたアルキルである]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成り、ここで前記ウィルス量又は活性の損失が、前記非イオン性界面活性剤が存在しない場合の損失に比較して、約２〜８℃、室温、37℃、-20℃又は-70℃での所定の期間にわたって約30％以下であることを特徴とする方法。
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝別れしたアルキルである]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せ、及び少なくとも１つの医薬的に許容できるキャリヤー、塩又は賦形剤を含んで成る組成物。
ｂ）安定化有効量の下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝別れしたアルキルである]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せ；及び ｃ）少なくとも１つの医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物。
ｂ）安定化有効量の下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝別れしたアルキルである]、又は下記式II：
で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せ；及び ｃ）少なくとも１つの医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物。
発明の記載 ：
本発明は、例えばウィルス、例えば空中感染ウィルス（例えば、アデノウィルス）を含んで成る組成物に、アルキル成分、及びポリエチレングリコール成分[構造O-(CH 2 CH 2 O) z -H（ここで、Zは少なくとも２である）を有するPEG（また、ポリエチレンオキシド構造体としても知られている）]、例えばブリジ界面活性剤、又はポリソルベート、例えばポリソルベート20を含んで成る、安定化有効量の非イオン性界面活性剤を添加することによって、前記組成物、例えば医薬組成物を安定化する方法に関する。 好ましい態様においては、前記非イオン性界面活性剤は、下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、10〜70個の炭素原子の線状又は枝分かれアルキルであり、前記アルキルは任意には、１又は複数（例えば１〜３）のカルボキシ、カルバミド、ハロゲン（F, Cl, Br, I）、ヒドロキシ、アミノ又は１〜３個の環により置換され、前記環は芳香族化合物（例えば、６〜14個のC原子の）、又はシクロアルキル（例えば、３〜12個のC原子の）、又は複素環式化合物（例えば、４〜14個のC原子及び１〜３個のN, S, O又はP原子）であり得、そして任意には、１又は複数のアルキル（例えば、1〜12個のC原子の）、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲン（上記のような）、ニトロ、スルホキシ、カルボキシ又はカルバミド（ここで環グループは好ましくは、単環、二環であり得る）により置換される]、又は下記式II：
[式中、Rは、10〜70個の炭素原子を有する−CO 2 R'であり、そしてW＋X＋Y＋Zは20であり、ここでR'は上記Rについての通りである]、又は下記式III ：
[式中、Rは上記の通りであり、そしてXは５〜100であり、Yは25〜75であり、そしてZは50〜100である]、又は下記式IV：
[式中、Xは５〜15であり、環Aはフェニレン又はシクロへキシレンであり、そしてR'は上記Rについての通りである]
で示される構造、又はそれらの組合せを有する。
特に好ましい態様においては、
式Iにおいて、Rは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、ここでYは10〜15であり；そして最も好ましい態様においては、Xは23であり、そしてYは12であり（ブリジ35）、又はXは203であり、そしてYは12であり（ブリジ58）；
式IIにおいて、RはC a H (2a+1) CO 2 -であり、ここでaは10〜70であり；そして最も好ましい態様においては、RはC 11 H 23 CO 2 -（Tween20）であり；
式III において、RはCH 3であり、Xは55であり、Yは29であり、そしてZは55であり（プルロニックF68）、又はRはCH 3であり、Xは98であり、Yは67であり、そしてZは98であり（プルロニックF−127）；又は 式IVにおいて、R'は(CH 3 ) 3 C・CH 2 C(CH 3 ) 2 -であり、Aはフェニレンであり、そしてXは９〜10であり（トリトンX-100、NP40）、又はR'は(CH 3 ) 3 C・CH 2 C(CH 3 ) 2 -であり、Aはシクロへキシレンであり、そしてXは９〜10である（還元されたトリトンX-100）。
本発明の１つの観点は、アデノウィルスを含んで成る組成物に、安定化有効量の上記で定義されたような式I, II, III 又はIVの本発明の非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを添加することを含んで成る、前記組成物の安定化方法であり；ここで前記アデノウィルスはトランスジーン、例えば遺伝子療法に使用するための治療用遺伝子を発現する組換えアデノウィルスであり；前記非イオン性界面活性剤は、ブリジ界面活性剤、例えばブリジ35又はブリジ58、ポリソルベート（Tween）界面活性剤、例えばポリソルベート20, 40, 60又はトリトン様分子、例えばトリトンX−100、トリトンX−114又はNP-40であり、その濃度は決定的なミセル濃度（CMC）、例えば約0.005％〜約0.1％（v/v）、好ましくは約0.05％〜約0.08％、より好ましくは約0.05％である。
本発明のもう１つの観点は、上記方法により調製された、安定化されたアデノウィルス組成物、及び少なくとも１つの医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物である。
本発明のもう１つの観点は、アデノウィルス、及び安定化有効量の上記に示されるような式I, II、III 又はIVの本発明の非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せ、及び任意には、１又は複数の塩及び/又は賦形剤を含んで成る組成物、例えば医薬組成物であり、そして医薬組成物の場合、１又は複数の医薬的に許容できるキャリヤー、塩及び/又は賦形剤を含んで成り；ここで前記アデノウィルスは、トランスジーン、例えば遺伝子療法への使用のための治療遺伝子を発現する組換えアデノウィルスであり；ここで中性界面活性剤は、ブリジ界面活性剤、例えばブリジ35又はブリジ58、ポリソルベート（Tween）界面活性剤、例えばポリソルベート20、40、60又は65、特にポリソルベート20、プルロニック分子、例えばプルロニックF127又はF68, 又はトリトン様分子、例えばトリトンX−100、トリトンX−114又はNP−40であり、そのMCM濃度においては、約0.005％〜約0.1％（v/v）、好ましくは約0.05％〜約0.08％、より好ましくは約0.05％である。
もう１つの観点は、アデノウィルスを含んで成る組成物の安定化方法であり、ここで改良点は、安定化有効量の式I、II、III 又はIVの非イオン性界面活性剤を前記組成物に添加することである。
本発明のもう１つの観点は、空中感染ウィルスを含んで成る組成物に、安定化有効量の上記に示されるような式I、II、III 又はIVの本発明の非イオン性界面活性剤、又はその組合せを添加することを含んで成る、前記組成物を安定化するための方法である。 本発明のもう１つの観点は、空中感染ウィルス；上記に示されるような式I、II、III 又はIVの本発明の非イオン性界面活性剤、又はその組合せ；及び任意には、１又は複数の塩又は賦形剤を含んで成る組成物、例えば医薬組成物である。 医薬組成物は、１又は複数の医薬的に許容できるキャリヤー、塩及び/又は賦形剤を含んで成る。
“安定化する”、例えばウィルスを含んで成る組成物を安定化するとは、安定剤の不在下で同じ条件下で貯蔵されるサンプルにおける損失の量に比較して、前記組成物におけるウィルスの利用できる（測定できる）量及び/又は活性の損失を、定義された期間にわたって阻害することを意味する。
本発明の方法により達成される安定化の典型的な程度は、例えば例２及び図１〜６に示される。 例えば、図１に示されるように、安定剤の不在下で２〜８℃でインキュベートされる、ガラス容器における高く精製されたアデノウィルス組成物は、１ヶ月後、約2.5対数（230倍の損失）の感染能を失うが；しかしTween 20が存在する場合、その損失は約0.5対数（約３倍の損失）以下である。 換言すれば、Tween 20の存在下で２〜８℃での１ヶ月後の回収されたウィルス活性は、Tween 20の不在下での回復された活性よりも約80倍、高い。
図１はまた、同じ実験がプラスチック容器において行われる場合、Tween 20の不在下での活性の相対的低下は約40％であることを示す。 図２においては、ウィルス濃度が測定される（HPLCにより）。 図２は、ガラス又はプラスチック容器のいずれかにおいて、アデノウィルス組成物が、Tween 20の存在下で２〜８℃での１ヶ月後、アデノウィルス濃度の検出できる損失は示されないことを示す。 対照的に、ガラス容器におけるウィルスは、この濃度でわずか0.25ヶ月後、その濃度の約1/3を失う。
図３及び４は、Tween 20が-70℃でインキュベートされるアデノウィルス組成物を安定化することを示す。 図３は、ガラスプラスチック容器のいずれかにおいて、ウィルスが-70℃でインキュベートされる場合、感染能の検出できる損失は存在しないことを示す。 １〜12ヶ月のインキュベーションのいずれかの時点でのウィルス感染能の回収が、Tween 20の不在下でよりもその存在下で、約0.5〜0.8対数、高い（約３〜４倍、高い）。 図４は、ウィルスの濃度が測定される場合（HPLCにより）、類似する発見を示す。
図５及び６は、Tween 20が、-20℃でインキュベートされるアデノウィルス組成物を安定化することを示す。 図５は、ガラス又はプラスチック容器のいずれかにおいて、ウィルスが-20℃でインキュベートされる場合、ウィルス感染能の回収が、Tween 20が存在する場合、2.5ヶ月のインキュベーションのあと、実質的に末変化のままであるが；しかしTween 20の不在下で、感染能は、わずか１ヶ月のインキュベーションの後、約0.6対数（約80％）、低下することを示す。 図６においては、ウィルス濃度が測定される（HPLCにより）。
図６は、ガラス又はプラスチック容器のいずれかにおいて、ウィルスの濃度は、Tween 20の存在下で-20℃での14ヶ月のインキュベーションの後、実質的に未変化のままであることを示す。 Tween 20が添加されない場合、ウィルスの濃度は、このアッセイにおける検出能力の限界以下に低下する。 ウィルスの回収は、ガラス又はプラスチック管のいずれかにおいてインキュベートされる場合、Tween 20の不在下でよりも少なくとも約15倍、良好である。
本発明は、ウィルス、例えばアデノウィルスを含んで成る組成物に、上記のような量の非イオン性界面活性剤を添加することを含んで成る、前記組成物を安定化するための方法に関し、ここでウィルス量及び/又は活性の損失は、前記剤が存在しない場合の損失に比較して、約２〜８℃、室温、37℃、-20℃又は-70℃での所定の期間（例えば、少なくとも５時間）にわたって、約30％、例えば０〜30％以下、好ましくは約10％以下、より好ましくは約５％以下、及び最も好ましくは約２％以下である。
ウィルス調製物は、少なくとも約５〜24時間、好ましくは少なくとも約１〜30日、より好ましくは少なくとも約１〜12ヶ月、及び最も好ましくは少なくとも約２〜３年又はそれ以上の間、本発明の方法により、そのような程度に安定化され得る。 定義された期間の後の出発量に比較して、残留ウィルスの量は、２％以上（例えば、100％まで）、例えば約２％、５％、10％、25％又は75％以上であり得る。 最も好ましい態様においては、前記量は、約90％以上（例えば、約95％、98％又は99％）である。
“活性”とは、ウィルスの存在性及び/又は感染能（感染単位、感染力価）を意味する。
理論的に結びつけることは所望しないが、本発明の安定剤は、例えばウィルスの自己凝集、及び/又はウィルスが存在する容器の表面、又は組成物の他の成分へのウィルスの結合（吸着）を阻害することによって機能する。 そのような安定化は、ウィルスの構造的統合性を防げないで（例えば、表面タンパク質が変性されない）、又は感染能を妨げないで達成される。
好ましい態様においては、アデノウィルスの組成物を安定化する剤は、安定剤の不在下で生じる低下に比較して、特定の温度で所定の期間、アデノウィルスの貯蔵の間に生じる測定できるアデノウィルス濃度及び/又は活性の損失を阻害する。
本発明の方法の１つの利点は、延長された期間、種々の温度のいずれかでのウィルスの安定化を提供することである。 例えば、これは、特に凍結以上の温度でのウィルス調製物の長期貯蔵を可能にし、それにより、費用が高い冷凍及び/又は凍結システムを用いる必要性を排除する。 この方法は、例えば実験目的のために（例えば、HPLC分析の前、ガラス又はプラスチックオートサンプラーバイアルにおけるアデノウィルス調製物の安定化のために）；医薬組成物の調製、貯蔵及び/又は保存のために；及び参照剤としての、及び診断のために収集された臨床検体におけるウィルスの感染能の保存を確保するために有用である。
例えば、上記式I、II、III 又はIVにより、本発明に包含されいずれかの適切な界面活性剤は、本発明の方法又は組成物に使用され得る。 式Iは、例えばブリジ35（Xが23であり、そしてYが12である場合）；ブリジ58（Xが20であり、そしてYが12である場合）；及びブリジ3J（Xが23であり、そしてYが11である場合）を包含する。 式IIは、例えば種々のポリソルベート（ポリオキシエチレン20ソルビタン分子）、例えばポリソルベート20（ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウレート、Tween 20）、ポリソルベート40（ポリオキシエチレン20ソルビタンモノパルミテート、Tween 40）、ポリソルベート60（ポリオキシエチレン20ソルビタンモノステアレート、Tween 60）、及びポリソルベート65を包含する。
式III は、種々のプルロニック127（Xが98であり、Yが67であり、そしてZが98である場合）、及びプルロニックF68（Xが55であり、Yが29であり、そしてYが55である場合）を包含する。 式IVは、例えば種々のトリトン様分子、還元されたトリトンX−100（Xが９〜10であり、そしてAがシクロヘキシレンである場合）、及びトリトン−100又はNP−40（Xが９〜10であり、そしてAがフェニレンである場合）を包含する。
好ましい態様においては、特に医薬組成物である組成物に関しては、界面活性剤は、患者への使用のために許可された界面活性剤、例えば注射用界面活性剤、例えばTween 20である。
いずれか適切な濃度の界面活性剤が使用され、但し、そては安定化有効量、すなわち組成物におけるウィルスの安定化を達成できる量である。 典型的には、界面活性剤は、CMC濃度、例えば約0.005％〜0.1％（v/v）、好ましくは約0.05へ0.08％、及びより好ましくは約0.05％で存在する。 組成物におけるウィルスを安定化するためにいかに多くの界面活性剤が必要とされるかを決定するための方法は、当業界において通常のことである。 ウィルス濃度又は活性をアッセイするための典型的な方法は、本明細書の他の部分に記載されている。
本発明の方法により安定化され得るウィルスは、当業者に明らかであろう。 そのようなウィルスは、病原性又は非病原性であり得る。 一般的に、本発明の方法により安定化され得るウィルスは、空中感染ウィルスである。 好ましくはそのようなウィルスの中には、次のウィルスが存在する：DNA又はRNAウィルス、次のファミリーであるウィルス：パルボウィルス（例えば、アデノ関連ウィルス）、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、B型肝炎−ウィルス、ピコルナウィルス、カルシウィルス、アストロウィルス、トガウィルス、フラビウィルス、コロナウィルス、パラミクソウィルス、プラドウィルス、フィロウィルス、インフルエンザウィルス、アレナウィルス、ブンヤウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、等。 本発明の方法により安定化され得るウィルスの中には、次のものが包含される：呼吸器管感染に関与するウィルス、例えばライノウィルス及びRSウィルス（RSV）。 本発明の方法により安定化され得るウィルスは、タンパク質コート及び疎水性表面を有するウィルスを包含する。
最も好ましいものは、同定されているいずれかの血清型のアデノウィルス、例えば鳥類又は哺乳類アデノウィルス、例えばアデノウィルス２及びアデノウィルス５である。 最も好ましい態様においては、組換えウィルス、例えば遺伝子療法のために適切である組換えアデノウィルスが使用される。 種々のウィルスベクター、例えば遺伝子療法適用のために適切である、適切な遺伝子を欠失するアデノウィルス（例えばE1遺伝子欠失アデノウィルス）が記載されている。 種々の遺伝子のいずれかが、例えばマーカーとして又は治療剤として作用することができ、そして適切な調節配列の制御下でそのようなベクター中にクローン化され、そして次に、例えば遺伝子療法における患者中に導入され得る。
適切なベクター及びそこで発現され得る遺伝子の選択、及びそのような構造体の製造方法及びインビトロ又はエクスビボ遺伝子療法への使用方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrook, J . など (1989). Molecular Cloning : A LaboratoryMamal. Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。 本発明の方法に使用され得る遺伝子、例えばポリペプチド、例えば酵素、ホルモン、サイトカイン（例えば、インターフェロン又はインターロイキン）、成長因子（例えば、FGF−１〜FGF−23のいずれか）、等をコードする遺伝子を包含する。
また、マーカー遺伝子、例えばlacZ又はGreen Fluorescent Proteinが発現され得る。 もちろん、上記ウィルスのいずれかの変異体又は変異形が、そのようなウィルスの組み換え、ハイブリッド、キメラ、等の形で、本発明の方法により調製され得る（安定化され得る）。 本明細書における論議の多くは、アデノウィルスの調製に向けられる。 しかしながら、当業者は、いずれかの適切なウィルスが、本明細書に記載される方法、特に空中感染ウィルスにより安定化され得ることを理解するであろう。 特定ウィルスが本発明の界面活性剤により安定化され得るかどうかを決定するための方法は、従来のことである。 ウィルス濃度又は活性を測定するための典型的なアッセイは、本明細書に記載される。
用語“アデノウィルスを安定化する”とは、本明細書において使用される場合、単一型のアデノウィルス、又は単一のアデノウィルス粒子又はいずれかの数の粒子を含んで成る多重型のアデノウィルスを含んで成る調製物を安定化することを言及する。
いずれかの適切な濃度のウィルスが、本発明の方法により安定化され得る。 例えば、アデノウィルスは、約１×10 8 〜約１×10 13個のウィルス粒子/mlの濃度範囲であり得る。 種々の濃度の純度を有するウィルスが、本発明の方法により安定化され得る。 例えば、それらは、中位に精製された調製物〜高く精製された調製物、例えばクロマトグラフィー及び膜分離段階、例えば限外濾過段階により調製されたウィルスの範囲であり得る。 本発明は特に、高く精製されたウィルス調製物、例えば約99.9％の純度である（例えば、0.1％以下のタンパク質汚染を有する）、ほぼ均質の調製物の安定化のために適切である。
安定化されなければ、そのような高く精製された調製物は、貯蔵の間、感染能を急速に失う。 例えば、ガラス製オートサンプラーバイアル（例えば、RP-HPLC又はSEC-HPLC）からの高く精製されたアデノウィルスの回収率は、室温での16時間の貯蔵の後、わずか約71％であり、そして２時間後、わずか約60％であることが、HPLC分析により測定される場合に観察されている。 その損失は、理論的に結びつけることは所望しないが、オートサンプラーバイアルの壁へのウィルス粒子の吸着に、少なくとも一部によるものであると思われる。
ウィルスは、種々のレジメのいずれかにより安定化され得る。 例えば、本発明の界面活性剤は、アデノウィルスの液体調製物に添加されるか；融解の前、その間又はその後、凍結されたアデノウィルスの容器に添加されるか：又はそれは、液体調製物に添加され、次に凍結される。
ウィルスの量（質量、濃度）を測定する方法は、通常のことであり、そして従来のことである。 アデノウィルスに関しては、例えばHPLC（例えば、キャプシドタンパク質、例えばヘキソンの量を決定することにより）によりウィルス粒子の量を測定することにができるか、又は例えばParticle Count Determinationによりウィルス粒子の数を決定することができる。 そのような測定は、利用できる（測定できる）ウィルス質量の量、例えばウィルスが存在する容器の壁に吸着されないウィルスの量を検出する。 例えば、ウィルス濃度を測定するためにRP-HPLCの使用を例示する例２を参照のこと。 複数のキャプシド成分の量を決定し、そして比較することによって、ビリオンが損なわれているかどうかを決定することができる。 HPLCによる測定は、例えばウィルスの免疫原性、生物分布、等に影響を及ぼすことができる、コートタンパク質分子における変化（例えば、酸化、脱アミノ化、等）の検出を可能にする。
ウィルスの活性（例えば、生存性及び/又は感染能）を測定する方法はまた、通常のことであり、そして従来のことである。 アデノウィルスに関しては、細胞障害効果（CPE）、エンドポイント希釈（EPD）又はプラーク形成アッセイによる感染粒子の数を測定することができるか、又はFTTCラベルされた抗−ペントン（コートタンパク質）抗体と共に、FACS分析を用いることができる。 例えば、Mitterederなど., (1996), J. Virology 70, 7498を参照のこと。 そのような測定は、利用できる（測定できる）ウィルス感染能、例えば他のビリオンに、又はウィルスが存在する容器の壁に吸着されない感染性ビリオンの量を検出する。 例えば、ウィルス感染能を測定するためにエンドポイント希釈法の使用を例示する例２を参照のこと。 トランスジーンを発現する組換えアデノウィルスの場合、アデノウィルスの活性は、トランスジーンの発現の量に相互関係し；従って、活性は発現されるトランスジーンの量又は活性を定量化することによって測定され得る。
種々の時点のいずれかでウィルス濃度又は活性をを測定することができる。 例えば、ウィルス組成物を容器に移した後、ウィルス濃度又は活性の初期の急速な損失（たぶん容器壁へのウィルス付着の結果として）、続く遅い損失の期間が存在する。 当業者は、アッセイを行う適切な期間を、研究される変数に依存して選択することができる。
本発明はまた、有効量のウィルス、例えばアデノウィルスを含んで成る医薬組成物にも関する。 “有効量”とは、治療効果を達成するために効果的である量を、本明細書において意味する。 例えば、CF遺伝子を含んで成る、有効量の組換えアデノウィルスは、嚢胞性繊維症に投与される場合、疾病の徴候を減じるのに効果的である量である。
本発明の医薬組成物は、種々の従来の医薬的に許容できるキャリヤーのいずれかを含む。 好ましい態様においては、医薬組成物は、液体形で存在するが、但しそれらはまた、固体（例えば、凍結乾燥された）形で存在することもできる。 本発明の医薬組成物は、無菌水（例えば、注射のためのUSP品種の水）、及び任意には、従来の緩衝液、例えば約6.5〜7.5、好ましくは約７のpH及び約0.1×〜４×の濃度でのPBS、又は約７〜８、好ましくは約7.5のpH及び約0.05M〜0.1Mの濃度でのトリスを含んで成る。 中性pHで効果的である他の緩衝液、例えばクエン酸緩衝液もまた使用され得る。 本発明の組成物はまた、任意には、塩（例えば、約１〜5mM、好ましくは約2mMの濃度でのMgCl 2 ）、及び/又は容量オスモル濃度/重量オスモル濃度を調節するための剤、例えばスクロースを、約１〜８％、好ましくは約２％（±10％）（wt/v）の濃度で含んで成る。
最も好ましい態様においては、本発明の医薬組成物は、約6.95のpHでの１×PBS中、約５×10 7 〜５×10 11個の粒子/mlのアデノウィルス、好ましくは組換えアデノウィルス、約0.05％(v/v)でのTween 20、約2mMのMgCl 2及び約2％（wt/v）のスクロースを含んで成る。 任意には、特に医薬組成物の形で存在する場合、本発明の組成物は、１又は複数の従来の医薬的に許容できる賦形剤又は安定剤を含む。
本発明の配合物は、種々のプラスチック材料、例えばポリプロピレン、ポリエチレン又はポリカーボネート、又はガラス、例えばブラウン又はホワイト硼珪酸HPLCバイアルのいずれかにより製造された種々の容器、例えばガラス又はプラスチック容器、例えばバイアル又は注射器（例えば、内部シリコーン被膜を含んで成るHypak注射器）のいずれにおいても安定している。
本発明の医薬組成物は、種々の治療用途に使用され得る。 例えば、治療用トランスジーンを含んで成る組換えアデノウィルスは、欠損遺伝子によるトランスジーン置換が増強された免疫学的応答又は同様の応答を提供する遺伝子治療に使用され得る。
当業者は、前述の記載を用いて、本発明をその十分な程度、さらなる詳細を伴わないで利用できると思われる。 従って、次の好ましい特定の態様は、単なる例示のために構成され、そして本発明を制限するものではない。
前述の及び次の例においては、すべての温度は、特にことわらない限り、℃で示され、そしてすべての部及び％は重量によってである。
例１：アデノウィルス組成物を安定化するそれらの能力についての種々の剤の試験 ：
アデノウィルス、例えばアデノウィルスタイプ５は、RP−HPLCカラム上への注入に基づいて、それらのタンパク質に分解し、そしてそのタンパク質は、アセトニトリル/TFAグラジエントにより溶離される場合、分離する。 アデノウィルス生成プロトコールにおけるいくつかの段階の定量化及び純度分析のために有用である特徴的なタンパク質フィンガープリントが得られる。 しかしながら、安定化されていない場合、ウィルスタンパク質ピークの収率は変動し、そしてサンプルがオートサンプラー管に保持される場合、時間と共に低下することが観察された。
この現象を調べるために、高く精製されたアデノウィルスサンプルを、HPLCカラム中に注入する前、オートサンプラーシステムにおいて数時間、貯蔵する。 他方では、安定化されない場合、従来のRP−HPLC又はSEC−HPLCアッセイにより測定される場合、ウィルスタンパク質ピークの統合された領域（例えば、ヘキソンピーク下の）は、サンプルが、オートサンプラーシステムにおいて、室温又は４℃のにいずれかで、数時間、貯蔵される場合、時間と共に低下する。 例えば、回収率は、室温での1.6時間後、わずか約70％であり、そして２時間後、わずかに約60％である。 損失は、少なくとも一部、表面（オートサンプラー管の壁）へのウィルスの結合のためであることが示されており；この結合は時々、ウィルス凝集体（他のウィルスに結合するウィルス）の沈殿により仲介される。
いくつかの剤を、それらの吸着工程を妨げるために添加し、そして組成物を安定化するそれらの能力について試験する。 サンプルを、オートサンプラー管において、いずれかの所望する時間、例えば約１〜20時間インキュベートする。 所望により、アッセイを、そのアッセイの間、所望する時点、例えば均等に間隔を開けられた時点で行う。 剤の中でも、プルロニック、ブリジ58及びTween 20を試験する。
さらなる実験を、種々のタイプのHPLC貯蔵バイアル、貯蔵の温度及び界面活性剤の濃度（0〜0.1％（v/v）の範囲）の効果を決定するために、ブリジ58及びTween 20により行う。 界面活性剤の存在下での凍結ウィルスサンプルの効果をまた、評価する。 ブリジ58及びTween 20の最適濃度はそれぞれ約0.05％（v/v）である。 0.1％で、両界面活性剤は、ウィルスの部分的破壊をもたらすように思える。 Tween 20は、ウィルスの凍結、及びブリジ58よりもHPLCバイアルから良好な定量的回収を可能にする。 0.05％のTween 20の添加は、ウィルスサンプルの融解の後、オートサンプラーにおいて16時間以上の安定性を提供する。
例２：種々の条件下でのTween 20の試験 ：
アデノウィルス組成物を、２〜８℃、-20℃又は-70℃で、ガラス又はプラスチック容器（例えば、バイアル又は注射器）において、１ヶ月（２〜８℃）又は14ヶ月（-20℃及び-70℃）までの間、インキュベートする。 アリコートを、エンドポイント希釈又はRP-HPLC分析のいずれかにより、定期的にアッセイする。 典型的な実験の結果が図１〜６に示され、そして本明細書の他の部分で論じられている。 試験されるすべての条件下で、ウィルスの高い安定性が、サンプルをTween 20の不在下でよりもTween 20の存在下でインキュベートする場合に得られる。
例３：他の条件下でのTween 20の試験 ：
試験を例２に記載のようにして行い、但し追加のパラメーター、例えばTween 20の最適濃度、室温（約20〜25℃）及び37℃でのインキュベーション、及びより長い時間のインキュベーション（例えば、約２〜３又はそれ以上の年月まで）をまた試験する。 その結果は、室温及びより長い時間のインキュベーションで、Tween 20がアデノウィルス組成物を効果的に安定化することを確かにする。
前述の記載から、当業者は、本発明の必須特徴を容易に確かめることができ、そして本発明の範囲内で、種々の使用法及び条件に適合せしめるために、本発明の変更及び修飾を行うことができる。
さらなる詳細を伴わないで、当業者は、前述の記載により、本発明をその十分な程度に利用できると思われる。 従って、前述の好ましい特定の態様は単なる例示であって、本発明を制限するものではない。
上記に引用されるすべての出願、特許及び出版物の全開示は、引用により本明細書に組み込まれる。
本発明の観点は、次のものを包含する：
アデノウィルスを含んで成る組成物に、アルキル成分及びポリエチレングリコール（PEG）成分を含んで成る、安定化有効量の非イオン性界面活性剤を添加することを含んで成る、前記組成物を安定化するための方法；
安定化有効量の下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、１又は複数のカルボキシ、カルバミド、ハロゲン、ヒドロキシ又はアミンにより、又は芳香族化合物又はシクロアルキル、及び複素環式化合物であり、そして任意には、１又は複数のアルキル、ヒドロキシ、アミン、ハロゲン、ニトロ、スルホキシ、カルボキシ又はカルバミド基により置換され得る１〜３個の環により任意に置換された、10〜70個の炭素原子の線状又は枝分かれアルキルである]、又は下記式II：
[式中、Rは、10〜70個の炭素原子を有する−CO 2 R'であり、そしてW＋X＋Y＋Zは20であり、ここでR'は上記Rについての通りである]、又は下記式III ：
[式中、Rは上記の通りであり、そしてXは５〜100であり、Yは25〜75であり、そしてZは50〜100である]、又は下記式IV：
[式中、Xは５〜15であり、環Aはフェニレン又はシクロへキシレンであり、そしてR'は上記Rについての通りである]で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る、アデノウィルスを含んで成る組成物の安定化方法；
安定化有効量の下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、ここでYは10〜15である]、又は下記式II：
[式中、RはC a H (2a+1) CO 2 -であり、ここでaは10〜70である]、又は下記式III ：
[式中、RはCH 3であり、Xは55であり、Yは29であり、そしてZは55（プルロニックF68）であり、又はRはCH 3であり、Xは98であり、Yは67であり、そしてZは98（プルロニックF127）である]、又は下記式IV：
[式中、R'は(CH 3 ) 3 C・CH 2 C(CH 3 ) 2 -であり、Aはフェニレンであり、そしてXは９〜10（トリトンX-100、NP40）であり、又はR'は(CH 3 ) 3 C・CH 2 C(CH 3 ) 2 -であり、Aはシクロへキシレンであり、そしてXは９〜10（還元されたトリトンX-100）である]で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る、アデノウィルスを含んで成る組成物の安定化方法；
安定化有効量の下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Rは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、そしてここでXは23であり、そしてYは12であるか、又はXは20であり、そしてYは12である]、又は下記式II：
[式中、RはC 11 H 23 CO 2 -である（Tween20）]で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る、アデノウィルスを含んで成る組成物の安定化方法；
上記のような方法、ここで界面活性剤はポリソルベート20（Tween 20）であり、アデノウィルスは、組換えアデノウィルスであり、前記アデノウィルスは遺伝子療法のために適切な組換えアデノウィルスであり、界面活性剤は、0.005％〜0.1％（v/v）の濃度、0.05〜0.08％（v/v）の濃度、又は0.05％（v/v）の濃度で存在し；
本発明の方法により製造された、安定化されたアデノウィルス組成物及び少なくとも１つの医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物；
ａ）アデノウィルス；
ｂ）安定化有効量の本発明の非イオン性海面活性剤；及び ｃ）少なくとも１つの医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物、
ここで、アデノウィルスは、組換えアデノウィルスであり、前記アデノウィルスは遺伝子療法のために適切な組換えアデノウィルスであり、界面活性剤は、0.005％〜0.1％（v/v）の濃度、0.05〜0.08％（v/v）の濃度、又は0.05％（v/v）の濃度で存在し；
本発明の医薬組成物、ここでアデノウィルスは遺伝子療法のために適切な組換えアデノウィルスであり、界面活性剤が0.05％（v/v）の濃度でのTween 20であり、そして医薬的に許容できるキャリヤーが2mMのMgCl 2及び２％スクロース（wt/v）、並びに好ましくは無菌水を含んで成る。
他の観点は次のものを包含する。
空中感染ウィルスを含んで成る組成物に、アルキル成分及びポリエチレングリコール（PEG）成分を含んで成る、安定化有効量の非イオン性界面活性剤を添加することを含んで成る、前記組成物を安定化するための方法；
安定化有効量の下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは、１又は複数のカルボキシ、カルバミド、ハロゲン、ヒドロキシ又はアミンにより、又は芳香族化合物又はシクロアルキル、及び複素環式化合物であり、そして任意には、１又は複数のアルキル、ヒドロキシ、アミン、ハロゲン、ニトロ、スルホキシ、カルボキシ又はカルバミド基により置換され得る１〜３個の環により任意に置換された、10〜70個の炭素原子の線状又は枝分かれアルキルである]、又は下記式II：
[式中、Rは、10〜70個の炭素原子を有する−CO 2 R'であり、そしてW＋X＋Y＋Zは20であり、ここでR'は上記Rについての通りである]、又は下記式III ：
[式中、Rは上記の通りであり、そしてXは５〜100であり、Yは25〜75であり、そしてZは50〜100である]、又は下記式IV：
[式中、Xは５〜15であり、環Aはフェニレン又はシクロへキシレンであり、そしてR'は上記Rについての通りである]で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る、空中感染ウィルスを含んで成る組成物の安定化方法；
安定化有効量の下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Xは４〜30であり、そしてRは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、ここでYは10〜15である]、又は下記式II：
[式中、RはC a H (2a+1) CO 2 -であり、ここでaは10〜70である]、又は下記式III ：
[式中、RはCH 3であり、Xは55であり、Yは29であり、そしてZは55（プルロニックF68）であり、又はRはCH 3であり、Xは98であり、Yは67であり、そしてZは98（プルロニックF127）である]、又は下記式IV：
[式中、R'は(CH 3 ) 3 C・CH 2 C(CH 3 ) 2 -であり、Aはフェニレンであり、そしてXは９〜10（トリトンX-100、NP40）であり、又はR'は(CH 3 ) 3 C・CH 2 C(CH 3 ) 2 -であり、Aはシクロへキシレンであり、そしてXは９〜10（還元されたトリトンX-100）である]で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る、空中感染ウィルスを含んで成る組成物の安定化方法；
安定化有効量の下記式I：
RO(CH 2 CH 2 O) x -HI
[式中、Rは(CH 3 )(CH 2 ) Y -であり、そしてここでXは23であり、そしてYは12であるか、又はXは20であり、そしてYは12である]、又は下記式II：
[式中、RはC 11 H 23 CO 2 -である（Tween20）]で表される非イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せを、前記組成物に添加することを含んで成る、空中感染ウィルスを含んで成る組成物の安定化方法；
上記のような方法、ここで界面活性剤はポリソルベート20（Tween 20）、又は0.005％〜0.1％（v/v）であり；
本発明の方法により製造された、安定化された空中感染ウィルス組成物及び少なくとも１つの医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物；
ａ）アデノウィルス；
ｂ）安定化有効量の本発明の非イオン性海面活性剤；及び ｃ）少なくとも１つの医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る、空中感染ウィルスを含んで成る医薬組成物、
ここで、前記界面活性剤は、0.005％〜0.1％（v/v）の濃度で存在する。
本発明のもう1つの観点は、安定化有効量の本発明の非イオン性界面活性剤を、アデノウィルスを含んで成る組成物に添加する改良点を特徴とする、前記組成物を安定化するための方法であり；
空中感染ウィルス又は好ましくはアデノウィルス、及びアルキル成分及びポリエチレングリコール（PEG）成分を含んで成る、安定化有効量の非イオン性界面活性剤を含んで成る組成物；他の好ましい観点においては、そのような組成物は、式I−IVの非イオン性界面活性剤、又は本発明の他の組成物について上記に記載されるような副観点を含んで成る。
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