新型冠状病毒N基因核酸检测试剂盒
阅读：2发布：2020-06-07
专利汇可以提供新型冠状病毒N基因核酸检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了新型冠状病毒N基因核酸检测 试剂 盒 ，具体的地，本发明公开了一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的N基因核酸的试剂盒及方法，具有极高的灵敏度和特异性。，下面是新型冠状病毒N基因核酸检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针组；
其中，所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，
所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物，
所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；
所述探针组包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含所述引物对集和所述探针组。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含热启动酶和逆转录酶。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第二容器内还包含dNTPs。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照品，所述阳性对照品包含具有N基因片段的假病毒。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第二容器内还包含RNA酶抑制剂。
7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照品。
8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含内标；所述内标为含内标核酸片段的假病毒。
9.一种非诊断目的的多重检测新型冠状病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）提供待检测对象的核酸样本；
（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、引物对集和探针组；
所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，
所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物，
所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；
所述探针组包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸样本来自环境样本。
新型冠状病毒N基因核酸检测试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。基于目前的流行病学调查，潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。此次疫情临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多在1周后恢复。世界卫生组织将本次引起病毒性肺炎病例的病原体命名为2019新型冠状病毒，即“2019-nCoV”。
[0003] 新型冠状病毒（2019-nCoV）属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状；另外2种是SARS冠状病毒和MERS冠状病毒（中东呼吸综合症冠状病毒）。
[0004] 目前传统的分离培养法培养检测2019新型冠状病毒耗电时长、成本高，未能形成快速、完整的2019新型冠状病毒检测体系。
[0005] 因此，针对新型冠状病毒（2019-nCoV）有必要开发快速、灵敏、使用便捷的检测体系，以满足临床需要。
发明内容
[0006] 本发明针对新型冠状病毒基因组N基因开发了新型冠状病毒诊断体系，能够高效率、高特异性、低成本的对新型冠状病毒2019-nCoV感染患者进行检测。
[0007] 在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的引物对集，所述引物对集包括：第一引物对组，所述第一引物对组包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
[0008] 在另一优选例中，所述引物对集还包括：内标引物对组，所述内标引物对组包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
[0009] 本发明的第二方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的探针组，所述探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针。
[0010] 在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针。
[0011] 在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
[0012] 在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
[0013] 本发明的第三方面，提供了一种用于多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
[0014] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。
[0015] 在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1-6所示的多核苷酸序列；优选地所述引物探针混合液由PCR缓冲液配制。
[0016] 在另一优选例中，所述第一容器内还包含dNTPs。
[0018] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照品，所述阳性对照品包含具有N基因片段的假病毒；优选地，所述第三容器内还包含具有内标核酸片段的假病毒。
[0019] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照品；优选地，所述阴性对照品为生理盐水。
[0020] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含内标；优选地，所述内标为含内标核酸片段的假病毒。
[0021] 本发明的第四方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的方法，所述方法包括步骤：（1）提供待检测对象的核酸样本；
（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。
（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。
[0023] 在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
[0024] 在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性对照品，和/或阴性对照品。
[0025] 在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR酶系。
[0026] 本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸。
[0027] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
[0029] 图1：优化后的荧光PCR反应体系扩增曲线；图2：灵敏度检测结果；
图3：重复性检测结果；
图4：特异性检测结果；
图5：典型临床样本检测结果；
图6：对照引物对N-F2和N-R2的检测结果；
图7：对照引物对N-F3和N-R3的检测结果。
图3：重复性检测结果；
图4：特异性检测结果；
图5：典型临床样本检测结果；
图6：对照引物对N-F2和N-R2的检测结果；
图7：对照引物对N-F3和N-R3的检测结果。
[0030]
具体实施方式
[0031] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒及方法，采用N基因特异引物和Taqman探针，结合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程，实现对新冠状病毒（2019-nCoV）N基因的检测，具有特异性强、灵敏度高、准确性高、快速简便等多种优点，可用于科研和临床应用检测，包括对新型冠状病毒的流程病学研究等方面。
[0032] 在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0033] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101 和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0034] 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
[0035] 多重PCR多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
[0036] 影响多重PCR反应的因素有很多，比如：（1）反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。
所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
[0037] （2）引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
[0039] （4）引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
[0040] 虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
[0041] 本发明提供的检测新型冠状病毒的N基因的检测试剂盒，本试剂盒同时包括内源性内标检测系统，用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。本试剂盒为双重荧光检测试剂盒，具有敏度高、特异性强、重复性好等特点。
[0042] 本发明提供一种特异性检测样品中N基因的引物序列为：SEQ ID NO.1：ATCGTGCTACAACTTCCTCAA和SEQ ID NO.2: TTTCTTGAACTGTTGCGACTAC，对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.3: AACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGC。
[0043] 在一个实施例中，所述试剂盒还包括内标质控及扩增引物和检测探针；内标质控扩增引物序列分别为：SEQ ID NO.4: ATGTGGCGATTGACCGA和SEQ ID NO.5: AAATTGAGGGCACTGGAAA，对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.6： ATTGTGGAGTCTTTGATAGCAGGGC。
[0044] 内标既可监测样本采集，也可监测样本提取过程，防止样本核酸提取失败导致假阴性。
[0045] 在本发明的一个优选地实施方式中，内标片段的核酸序列如下：ATGTGGCGATTGACCGAGGCCTGGCTTTTGAACTTGTCTATAGCCCTGCTATCAAAGACTCCACAATGAGAAGGTATACAATTTCCAGTGCCCTCAATTT（SEQ ID NO.:7）
在其中一个实施例中，所述试剂盒包括含N基因片段的阳性对照，以及阴性对照（灭菌生理盐水）。
在其中一个实施例中，所述试剂盒包括含N基因片段的阳性对照，以及阴性对照（灭菌生理盐水）。
[0046] 在本发明的一个优选地实施方式中，阳性对照中N基因片段的核酸序列如下：ATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAA（SEQ ID NO.:8）。
[0047] 在其中一个实施例中，所述试剂盒包括：PCR反应液A，包括： N基因和内标基因的引物、探针及PCR缓冲液；
PCR反应液B，包括：热启动Hot.Taq酶、C-MMLV酶、RNA酶抑制剂和dNTPs。
PCR反应液B，包括：热启动Hot.Taq酶、C-MMLV酶、RNA酶抑制剂和dNTPs。
[0048] 本发明还提供了一种N基因检试剂盒的使用方法，包括如下步骤：提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（货号：DA0623），得到核酸样本；取核酸样本和PCR反应液A以及PCR反应液B混合，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择FAM、和Cy5,PCR扩增程序如下：95℃ 15分钟，1个循环；
94℃ 15秒→55℃ 45秒（收集荧光），45个循环。
94℃ 15秒→55℃ 45秒（收集荧光），45个循环。
[0049] PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体DNA的阴、阳性，检测结果可用于新型冠状病毒感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，为研究提供可靠的依据。
[0050] 本发明中新型冠状病毒2019-nCoV的基因序列参见GISAID：BetaCov/Wuhan/WH01/2019|EPI_ISL_406798；关于其N基因的寡核苷酸序列信息可参考文献（Roujian Lu, Xiang Zhao, Juan Li,et.al,Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding.Lancet. 2020 Jan 30）。
[0051] 本试剂盒组成详见表1和表2，可检测新型冠状病毒2019-nCoV的N靶标基因。
[0052] 表1 试剂盒组成试剂盒所需引物、探针序列如表2：
表2 引物、探针及序列号
其中，WH-NP-P的5’端荧光发射基团为FAM，3’淬灭基团为BHQ1；P30-P2的5’端荧光发射基团为CY5，3’淬灭基团为BHQ2。
表2 引物、探针及序列号
其中，WH-NP-P的5’端荧光发射基团为FAM，3’淬灭基团为BHQ1；P30-P2的5’端荧光发射基团为CY5，3’淬灭基团为BHQ2。
[0053] 在其他实施方式中，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5。
[0054] 在其他实施方式中，所述淬灭基因选自下组：MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3。
[0055] 本发明的引物设计中，对特异性引物及探针经大量试验筛选，并对其进行组合、优化、验证，最终优选出组合后不会互相干扰、扩增效率高、特异性好的多重检测最优引探组合。
[0056] 本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。
[0057] 本发明所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：（1）提取检测样本中的总核酸，获得核酸样本。
[0058] （2）将所述核酸样本与PCR反应液A、PCR反应液B混合，制得PCR反应体系。
[0059] （3）实时荧光PCR反应，程序如下：第一阶段：50 ℃ 2-15 min，95 ℃ 10-15 min，1个循环；
第二阶段：94 ℃ 10-15 s，55-60 ℃ 45 s，45个循环。
第二阶段：94 ℃ 10-15 s，55-60 ℃ 45 s，45个循环。
[0060] PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体核酸的阴、阳性给出检测结果。
[0061] 本发明的有益效果在于：本发明通过针对性检测新型冠状病毒2019-nCoV的N基因核酸靶标，能够高效率、高特异性、高灵敏度、低成本的对新型冠状病毒2019-nCoV感染患者进行检测，显著提高了病毒鉴定的准确性。
[0062] 本发明适用于对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检测，为病毒鉴定和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。
[0063] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook. J等著《分子克隆实验室指南》（黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0064] 实施例 1 新型冠状病毒N基因检测试剂盒根据新型冠状病毒的序列，分析其基因组的保守区域。在这些保守区域中设计出针对
2019新型冠状病毒N基因检测的特异性引物和探针序列。另外为了对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控，还设计了内源性内标引物和探针。通过多轮筛选和优化，最终确定一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合。序列如表2所示。
2019新型冠状病毒N基因检测的特异性引物和探针序列。另外为了对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控，还设计了内源性内标引物和探针。通过多轮筛选和优化，最终确定一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合。序列如表2所示。
[0065] 为了确定检测体系，分别尝试了不同浓度的引物和探针对荧光PCR反应的影响。结果显示，当WH-NP-F1，WH-NP-R1引物浓度为10pmol，WH-NP-P探针的浓度为5pmol，P30-F2，P30-R2引物浓度为8pmol，P30-P2探针的浓度为3pmol，扩增曲线最好（图1）。
[0066] 最终，采用的荧光PCR反应体系（25μl）如下：在ABI7500荧光PCR仪上进行扩增，扩增程序为：50℃ 15分钟，1个循环；95℃ 15分钟，1个循环；94℃ 15秒→55℃ 45秒（收集荧光），45个循环。
[0067] 该试剂盒由PCR反应液A、PCR反应液B、内标、阳性对照品、阴性对照品和DEPC水构成，其中PCR反应液由5×RT-PCR Buffer、引物和探针组成；PCR反应液B由逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动DNA聚合酶和、dNTPs构成；阳性对照品由含N靶标序列的假病毒制备而成，阴性对照品为生理盐水，内标由含内标靶序列的假病毒制备而成。
[0068] 实施例2 试剂盒的操作和结果判定（1）病毒基因组DNA的提取
采用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂（货号：DA0623）在样本处理区按照说明书操作步骤提取核酸。提取前每例样本按50：1的比例加入内标进行提取。阴性对照品和阳性对照品均参与提取，作为对环境和PCR检测试剂的质控。
采用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂（货号：DA0623）在样本处理区按照说明书操作步骤提取核酸。提取前每例样本按50：1的比例加入内标进行提取。阴性对照品和阳性对照品均参与提取，作为对环境和PCR检测试剂的质控。
[0069] （2）反应体系的配制采用实施例1的试剂盒进行以下实验，待试剂盒PCR反应液在室温条件下完全溶解后，快速震荡混匀，配制25μL PCR反应体系。
[0070] （3）PCR扩增将PCR 管放入荧光PCR 仪（ABI7500）中，按照如下要求设定PCR反应程序：
程序1，50℃、15min、1次循环；
程序2，95℃、15min、1次循环；
程序3，94℃、15s，55℃、45s（收集荧光），45次循环。
程序1，50℃、15min、1次循环；
程序2，95℃、15min、1次循环；
程序3，94℃、15s，55℃、45s（收集荧光），45次循环。
[0071] （4）质量控制本试剂盒的结果判读如下；
阴性对照品： FAM 检测通道无扩增曲线；CY5 检测通道有扩增曲线；
阳性对照品： FAM 检测通道有扩增曲线， 且 Ct 值≤35；CY5 检测通道有或无扩增曲线；
以上要求需在同一次实验中同时满足， 否则， 本次实验无效， 需重新进行（5）结果判读
（5.1）若检测样品的FAM检测通道无扩增曲线，且该CY5通道有扩增曲线，可判样品为未检测到新型冠状病毒RNA；
（5.2）若检测样品的FAM检测通道有扩增曲线且Ct值≤40，CY5检测通道有或无扩增曲线，可判样品为新型冠状病毒阳性。
阴性对照品： FAM 检测通道无扩增曲线；CY5 检测通道有扩增曲线；
阳性对照品： FAM 检测通道有扩增曲线， 且 Ct 值≤35；CY5 检测通道有或无扩增曲线；
以上要求需在同一次实验中同时满足， 否则， 本次实验无效， 需重新进行（5）结果判读
（5.1）若检测样品的FAM检测通道无扩增曲线，且该CY5通道有扩增曲线，可判样品为未检测到新型冠状病毒RNA；
（5.2）若检测样品的FAM检测通道有扩增曲线且Ct值≤40，CY5检测通道有或无扩增曲线，可判样品为新型冠状病毒阳性。
[0072] 实施例3 灵敏度检测将目的片段连接到构建好的pET28a-MS2载体中并转化表达宿主菌BL21感受态细胞，挑取单克隆并测序验证后进行诱导表达,将破碎完全的表达产物以RNaseA和DNaseⅠ消化处理后即为含有目的片段的病毒样颗粒。
[0073] 将测定浓度后的假病毒稀释到合适浓度后再进行10倍倍比稀释，浓度分别为1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03、1.00E+02copies/ml。用上述确定的检测体系和循环参数对上述质粒进行检测。
[0074] 检测结果如图2所示，结果显示，在浓度低至1.00E+02copies/ml时，本发明的试剂盒仍能检出。因此，在低浓度模板时，本发明所述试剂盒仍能检出，因而具有很高的灵敏度。
[0075] 实施例4 重复性检测将制备的含新型冠状病毒N靶标序列的假病毒稀释至5.00E+04copies/ml和1.00E+
03copies/ml，使用实施例1所述的试剂盒对上述稀释后的假病毒分别进行扩增，每个浓度梯度重复检测10次。
03copies/ml，使用实施例1所述的试剂盒对上述稀释后的假病毒分别进行扩增，每个浓度梯度重复检测10次。
[0076] 根据实施例2中的结果判定标准进行判定，本发明试剂盒对新型冠状病毒检测重复性结果如图3所示。结果表明本发明的试剂盒重复性较好。
[0077] 实施例5 特异性检测选取冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒样本进行检测。
[0078] 检测结果如图4所示，结果表明本发明的检测体系对冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒样本的检测均为阴性，而对新型冠状病毒阳性样本检出为阳性。表明本发明试剂盒具有较高的特异性。
[0079] 实施例6 临床样本检测检测样本核酸的提取：
（1）临床待测样本核酸模板提取
采集22例疑似咽拭子临床样本，提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（货号：DA0623），得到核酸样本（阳性质控和阴性质控同步参与提取）；取5μL核酸样本配制PCR反应体系，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择VIC、FAM,PCR扩增程序如下；
50℃，15min，95℃，15min；1个循环
94℃，15sec，55℃，45sec（收集荧光）；45个循环。
（1）临床待测样本核酸模板提取
采集22例疑似咽拭子临床样本，提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（货号：DA0623），得到核酸样本（阳性质控和阴性质控同步参与提取）；取5μL核酸样本配制PCR反应体系，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择VIC、FAM,PCR扩增程序如下；
50℃，15min，95℃，15min；1个循环
94℃，15sec，55℃，45sec（收集荧光）；45个循环。
[0080] PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体核酸的阴、阳性。
[0081] 在所检测的22例疑似临床样本中，共检出17例新型冠状病毒2019-nCoV核酸阳性临床样本。典型检测结果如图5所示。
[0082] 测序验证结果表明本发明检测体系检测准确率达到了100%，进一步证明了本发明体系检测的临床检测准确性。
[0083] 对比例1本发明人在研究过程中，针对新型冠状病毒2019-nCoV目标核酸序列筛选了数十组PCR引物和探针，经过大量测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。
[0084] 针对新型冠状病毒2019-nCoV的N基因检测靶标，本发明人经过了大量的筛选、组合。设计的部分典型引物序列如下：对照上游引物N-F2：TGCTGCAATCGTGCTACAAC（SEQ ID NO.9）
对照下游引物N-R2：TGAACTGTTGCGACTACGTGAT（SEQ ID NO.10）
对照上游引物N-F3：GAGGGAGCCTTGAATACACC（SEQ ID NO.11）
对照下游引物N-R3：CTGCCTGGAGTTGAATTTCTT（SEQ ID NO.12）
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，进行PCR检测测试。
对照下游引物N-R2：TGAACTGTTGCGACTACGTGAT（SEQ ID NO.10）
对照上游引物N-F3：GAGGGAGCCTTGAATACACC（SEQ ID NO.11）
对照下游引物N-R3：CTGCCTGGAGTTGAATTTCTT（SEQ ID NO.12）
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，进行PCR检测测试。
[0085] 使用N-F2和N-R2的检测结果如图6所示，检测结果表明该引物对特异性较差。与冠状病毒OC43和NL63核酸存在交叉反应。
[0086] 使用N-F3和N-R3的检测结果表明该引物对在单一检测体系中对N基因靶核酸的特异性和灵敏度较佳，但是在多重检测体系中N基因靶低浓度核酸扩增受到明显抑制，单重和多重体系检测结果如图7所示。表明对照引物对N-F3和N-R3无法应用于多重检测体系中。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种高效环保消毒组合物及其制备方法 | 2020-06-25 | 2 |
| 用于产生视黄酸的试剂 | 2020-10-18 | 2 |
| 一种用于化纤织物的低温除油剂及其制备方法 | 2021-09-13 | 2 |
| 一种水溶液中铷、铯的沉淀浮选分离体系及其应用 | 2022-10-07 | 0 |
| 一种二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用 | 2022-06-12 | 1 |
| 一种基于环保水胶和废旧橡胶再生制备橡胶地垫的方法 | 2020-05-29 | 0 |
| 用于扩增造血干细胞的组合物、培养基、方法和试剂盒 | 2021-07-22 | 2 |
| 一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂 | 2020-09-25 | 2 |
| 方便安装试纸条的试剂卡 | 2020-06-28 | 2 |
| 一种压铸铝合金脱模剂自动配液装置 | 2020-12-04 | 0 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈