技术领域
[0001] 本
发明属于多肽药物合成的技术领域，特别涉及一种索玛鲁肽的固相合成方法。
背景技术
[0002] 中文名称：索玛鲁肽
[0003] 英文名称：Sermaglutide
[0004] 序列：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
[0005] 分子式：C187H291N45O59
[0006] 分子量：4113.64
[0007] 索玛鲁肽(Sermaglutide)一种新的长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，每周皮下注射一次，可使2型糖尿病患者血糖
水平大幅改善，并且低血糖
风险较低。同时，索玛鲁肽还能够通过降低食欲和减少食物摄入量，诱导减肥。与利拉鲁肽相比，索玛鲁肽的脂肪连更长，疏水性强，但是索玛鲁肽经过短链的PEG修饰，亲水性大大增强。PEG修饰后不但可以与
白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶
水解位点，还能降低肾排泄，可延长
生物半衰期，达到长循环的效果。索
马鲁肽与
艾塞那肽相比，提供了更好的血糖控制及体重减轻。索玛鲁肽具有降低血糖、减轻体重、促进胰岛细胞再生以及心血管系统保护等多种效应，临床应用前景广阔。
[0008] 现有的索玛鲁肽合成方法多为固液合成法，CN201410573312.1的合成方法，合成周期长，生产成本高，不利于索玛鲁肽的大规模生产。本发明提供一种合成索玛鲁肽的优化工艺以造福于人类健康。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种索玛鲁肽的固相合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产索玛鲁肽粗肽产品的广泛应用前景，以用于大规模生产索玛鲁肽。
[0010] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0011] 一种索玛鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：
[0012] (1)以Dde-Lys(Fmoc)-OH为原料，脱除赖
氨酸的Fmoc保护基，然后依次偶联2-(2-(2-氨乙
氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，进行赖氨酸的改造缩合反应，得到如下肽链：
[0013] Dde-K(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin
[0014] (2)以2-Cl-Resin为起始
树脂载体，通过固相合成法依次连接索玛鲁肽序列中相对应的氨基酸，并采用特异性
微波技术反应，得到索玛鲁肽-2-Cl-Resin如下：
[0015] H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAK(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)EFIAWLVRG RG-2-Cl-Resin
[0016] (3)进行切割沉降反应，冻干，得到索玛鲁肽粗肽如下：
[0017] H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAK(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)EFIAWLVRG RG[0018] 上述固相合成方法中，步骤(1)所述赖氨酸的改造缩合反应指的是：脱除赖氨酸的
侧链保护基Fmoc，通过固相合成法，在赖氨酸侧链依次偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸；然后脱除赖氨酸的Dde保护基，Dde的脱除
试剂为水合肼：DMF＝1:15体积比的混合溶液，得到改造后的赖氨酸肽链。
[0019] 步骤(2)所述氯树脂优选为2-Cl(Trt)-Cl Resin，反应中以DIC/HOBt为缩合剂和活化试剂，以20％Pip/DMF溶液为脱保护试剂，所述特异性微波技术指在氨基酸缩合反应15min后，将索玛鲁肽-2-Cl Resin置于微波化学反应器中微波反应20s，得到索玛鲁肽-2-Cl-Resin。
[0020] 步骤(3)所述切割沉降反应，切割试剂为TFA：茴香硫醚：水：EDT：
苯酚＝35：2：2：1：2体积比，切割液体积为反应器容积的1/2，树脂切割两次，将切割液分别吹入到
冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次，得到索玛鲁肽粗肽产品。
[0021] 本发明的有益效果：本发明采用Fmoc固相合成法，以2-Cl Resin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，对赖氨酸原料进行了改造，大大简化了工艺流程，缩合反应中采用特异性微波合成技术，提高了缩合效率；本发明大大缩短了反应时间，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
具体实施方式
[0022] 通过下述
实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单替换或推演，都视为属于本发明的保护范围。
[0023] 一种索玛鲁肽的固相合成方法，采用固相合成法，起始载体选用2-Cl-Resin为载体，经活化剂和缩合剂的缩合反应，并采用特异性微波技术反应，以保护氨基酸为缩合原料，依次缩合索玛鲁肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，其中赖氨酸采用Dde-Lys(Fmoc)-OH，脱除赖氨酸侧链保护基Fmoc，进行原料的改造，然后通过固相合成法缩合到肽链上；进行切割、沉降反应，冻干得到索玛鲁肽产品。
[0024] 实施例一 赖氨酸原料的改造
[0025] (1)侧链氨基酸的连接
[0026] 加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min，脱除赖氨酸的Fmoc侧链保护基，按固相氨基酸的缩合方法，在赖氨酸侧链依次偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，缩合成功后用DMF洗5次，抽干。
[0027] (2)脱除Dde保护基
[0028] 按照水合肼：DMF＝1:15配置脱除溶液，每次用三倍树脂体积的混合溶液洗脱，震荡反应5min后用DMF洗涤3次，第3次水合肼溶液脱Dde后，DMF洗涤5次，得到改造后的赖氨酸肽链。
[0029] 实施例二 索玛鲁肽-2-Cl-Resin的合成
[0030] 1.2-Cl-Resin的溶胀
[0031] 称量取代度为0.64mmol/g的2-Cl-Resin 1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM
溶剂中，与溶剂充分
接触，溶胀0.5h。
[0032] 2.索玛鲁肽-2-Cl-Resin的合成
[0033] 索玛鲁肽-2-Cl-Resin为：
[0034] H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAK(Octadecanedioic-Glu-PEG2-PEG2)EFIAWLVRG RG-2-Cl-Resin
[0035] 本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-31个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示：
[0036]
[0037] 本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
[0038] Fmoc：芴甲氧羰基
[0039] DMF：N,N-二甲基甲酰胺
[0040] DCM：二氯甲烷
[0041] Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
[0042] Pip：六氢吡啶
[0044] tBu：叔丁基
[0046] DIEA：N,N-二异丙基乙胺
[0047] HOBt：1-羟基苯并三唑
[0048] (1)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的合成
[0049] 称取120mg Fmoc-Gly-OH和130mg HOBt放于10ml离心管中，加3ml DCM将其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均匀。最后将
混合液加到抽干的反应器中反应1h。
[0050] (2)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的封头反应
[0051] 配制甲醇：DIEA＝1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于20-30r/min的摇床上摇20min。
[0052] (3)树脂的洗涤方法
[0053] 用
真空泵将反应器中的脱保护溶液抽干，然后加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，抽干反应器中溶液再加入DMF洗涤，重复操作3次。
[0054] (4)脱除Fmoc保护基
[0055] 加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。
[0056] (5)保护氨基酸的活化方法
[0057] 以Fmoc-Arg(pbf)-Gly-2-Cl-Resin的缩合为例，称取585mg Fmoc-Arg(pbf)-OH和130mg HOBt放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀得到活化的保护氨基
酸溶液。
[0058] (6)索玛鲁肽-2-Cl-Resin的合成
[0059] 将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于25℃的恒温震荡器中反应20-30min，然后将反应器置于微波化学反应器中微波反应20s后洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第2-31个保护氨基酸，即得到索玛鲁肽-2-Cl-Resin。
[0060] 实施例三 索玛鲁肽粗肽产品的切割沉降
[0061] (1)配置切割试剂
[0062] 100ml配方为:87.5mlTFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5mlEDT+5g苯酚，置于棕色试剂瓶中。现配备用，配制量一般为1g树脂加10ml切割试剂。
[0063] (2)索玛鲁肽-2-Cl-Resin的切割
[0064] 向抽干的反应器中加入切割试剂，置于脱色摇床上摇晃反应1h，速度20r/min。切割结束后，加入约35ml冰乙醚至50ml离心管中，将反应器中溶液经砂芯过滤到冰乙醚中，盖上离心管
盖子，上下震荡离心管，混合均匀。将离心管放入离心机中，3000r/min，3min，离心弃上清，重复操作3次得到索玛鲁肽粗肽产品。
[0065] 实施例四 索玛鲁肽粗肽产品的收率
[0066] 切割沉降后的粗品呈乳胶状态，其中含有较多的TFA盐和切割试剂，本发明采用C18色谱柱进行除盐，以便计算粗品得率。
[0067] 将样品溶解并过滤，采用流动相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下梯度程序进样分析：
[0068]
[0069] 称量冻干后的索玛鲁肽粗肽产品，
质量为1045mg，经计算粗品收率为82.5％，比
现有技术仅50-70％的收率有大幅度提高。
[0070] 以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属
本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的
修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本
权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
