技术领域
[0001] 本
发明涉及荧光探针，特别涉及一种可用于G-四链体DNAs检测的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 人端粒末端DNA由富含
鸟嘌呤(G)的重复序列组成，该富G序列在一价阳离子(如K+和Na+)的诱导下可以通过G
碱基间的Hoogsteen氢键作用形成平面G-四分体，并进一步堆积形成G-四链体结构。G-四链体结构也存在于原癌基因启动子区如c-myc、c-kit和bcl-2等。c-myc、c-kit和bcl-2在癌细胞中过度表达，而且其相关蛋白会影响癌细胞的增殖和凋亡。
人端粒富G单链DNA是端粒酶的作用底物，端粒酶在正常
体细胞中不表达活性或活性很低，而在85-90％的癌细胞中活性很高。有机小分子化合物可以诱导G-四链体结构的形成并使之稳定，从而可以抑制端粒酶的活性或降低癌基因的转录表达而达到抗
肿瘤的目的，而且可以作为这些G-四链体DNAs的荧光探针，辅助G-四链体DNA
生物功能的研究及与之相关
疾病的诊断。然而人体细胞核中存在大量的双螺旋DNA，所以开发能选择性识别G-四链体结构DNAs的探针分子具有重要的理论及实际意义。因此，选择性好、灵敏度高的G-四链体DNAs结构的荧光探针的设计是近年来化学生物学的重要前沿领域之一。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种可用于G-四链体DNAs检测的荧光探针及其制备方法，以及该探针在G-四链体DNAs结构检测中的应用。
[0004] 本发明提供的一种可用于G-四链体DNAs检测的荧光探针，其是3-(4-二甲
氨基苯基)-2-(N-甲基吡啶-4-基)丙烯腈碘盐(DPBAI)，结构式如下：
[0005]
[0006] 本发明提供的一种可用于G-四链体DNAs检测的荧光探针的合成路线如下：
[0007]
[0008] 本发明提供的一种可用于G-四链体DNAs检测的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)4-吡啶乙腈的合成：在室温下，用N,N-二甲基甲酰胺将4-吡啶乙腈
盐酸盐全部溶解后，按摩尔比4-吡啶乙腈盐酸盐﹕三乙胺＝1﹕3～5，逐滴加入三乙胺，滴加完后继续搅拌5～10h后，抽滤，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤
滤饼三次，旋蒸滤液除去
溶剂，得黑色油状液体和三乙胺盐酸盐的混合物，梯度洗脱法对该混合物进行柱层析，先用石油醚将残存的N,N-二甲基甲酰胺分离出去，再用体积比为1﹕6～10的乙酸乙酯和二氯甲烷的
混合液分离提纯产物，得黄色油状液体4-吡啶乙腈；
[0010] (2)4-吡啶乙腈甲基化碘盐的合成：在
冰水浴冷却下，用N,N-二甲基甲酰胺将4-吡啶乙腈全部溶解后，按摩尔比4-吡啶乙腈﹕碘甲烷＝1﹕5～7，在不断搅拌下快速逐滴加入碘甲烷，密封，继续搅拌5～10h后，将所得反应液放置于
冰箱中冷却过夜，使固体析出；抽滤，用
乙醇和乙醚依次洗涤滤饼，将所得滤饼用体积比为1﹕5～10的乙醇和水的混合液重结晶，得灰黑色固体产品4-吡啶乙腈甲基化碘盐；
[0011] (3)3-(4-二甲氨基苯基)-2-(N-甲基吡啶-4-基)丙烯腈碘盐的合成：在室温下，用无水甲醇将4-吡啶乙腈甲基化碘盐和4-二甲氨基苯甲
醛全溶后，按摩尔比4-吡啶乙腈甲基化碘盐﹕4-二甲氨基
苯甲醛﹕叔丁醇
钾＝1﹕1﹕1～2，逐滴加入叔丁醇钾的无水甲醇溶液，滴加完毕后在室温下继续搅拌5～10h，减压抽滤，用无水甲醇洗涤滤饼两次后，将所得滤饼先后用乙酸乙酯和N,N-二甲基甲酰胺作为洗脱剂进行柱层析分离，得到目标产物。
[0012] DPBAI与G-四链体DNAs的结合能
力远大于它与双螺旋DNA的结合能力，与G-四链体DNAs结合后的荧光强度显著强于与双螺旋DNA结合后的荧光强度，所以DPBAI可用于G-四链体DNAs结构的检测。
[0013] 与
现有技术相比本发明具有以下有益效果：
[0014] 本发明提供的3-(4-二甲氨基苯基)-2-(N-甲基吡啶-4-基)丙烯腈碘盐(DPBAI)制备方法较为简单，反应条件易于控制，易于大量制备；DPBAI化合物与G-四链体DNAs的结合能力远大于与双螺旋DNA的结合能力，与G-四链体DNAs结合后的荧光强度也显著大于与双螺旋DNA结合后的荧光强度，所以DPBAI可用于G-四链体DNAs的特异检测。
附图说明
[0015] 图1DPBAI(10mM)与不同二级结构DNAs相互作用的紫外可见吸收滴定谱图，图中：箭头表示逐渐增加DNA的浓度；(A)+c-myc；(B)+c-kit；(C)+bcl-2；(D)+HTG(K缓冲体系，用HTG-K表示)；(E)+HTG(Na缓冲体系，用HTG-Na表示)；(F)+小
牛胸腺DNA。
[0016] 图2DPBAI(5mM)与不同浓度G-四链体DNAs以及
小牛胸腺DNA作用的荧光增强倍数图，图中：(A)DPBAI(5mM)与不同浓度G-四链体DNAs作用的荧光增强倍数图，其中+c-myc(·)，+c-kit(·)，+bcl-2(▲)，+HTG-K(▼)，+HTG-Na (B)DPBAI(5mM)与不同浓度小牛胸腺DNA作用的荧光增强倍数图。
[0017] 图3DPBAI(5mM)与G-四链体DNAs以及小牛胸腺DNA反应平衡时的荧光增强倍数柱状图。
[0018] 具体的实施方式
[0019]
实施例1可用于G-四链体DNAs检测的荧光探针DPBAI的制备：
[0020] (1)4-吡啶乙腈的合成
[0021] 在室温下，向250mL三口烧瓶中依次加入100mL N,N-二甲基甲酰胺和3.60g(23.46mmol)4-吡啶乙腈盐酸盐，在不断搅拌下使得4-吡啶乙腈盐酸盐全部溶解后，用恒压滴液漏斗逐滴加入12mL三乙胺，滴加完后继续搅拌5h后，抽滤，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤滤饼三次，旋蒸滤液除去溶剂，得黑色油状液体和三乙胺盐酸盐的混合物，梯度洗脱法对该混合物进行柱层析，先用石油醚将残存的N,N-二甲基甲酰胺分离出去，再用体积比为1﹕8的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液分离提纯产物，得黄色油状液体4-吡啶乙腈2.68g(22.08mmol)，产率94.1％。
[0022] (2)4-吡啶乙腈甲基化碘盐的合成
[0023] 在冰水浴冷却下，向100mL单颈烧瓶中依次加入2.68g(22.08mmol)4-吡啶乙腈和30mL N,N-二甲基甲酰胺，在不断搅拌下快速逐滴加入8mL碘甲烷，滴加完毕后塞紧空心塞，继续搅拌5h后，将反应瓶放置于冰箱中冷却过夜，使固体析出。抽滤，用乙醇和乙醚依次洗涤滤饼，将所得滤饼用体积比为1﹕5的乙醇和水的混合液重结晶，得灰黑色固体产品4-吡啶乙腈甲基化碘盐3.96g(14.84mmol)，产率67.2％。
[0024] (3)3-(4-二甲氨基苯基)-2-(N-甲基吡啶-4-基)丙烯腈碘盐DPBAI的合成[0025] 在室温下，向100mL的单口烧瓶中，依次加入50mL无水甲醇、0.98g(3.68mmol)4-吡啶乙腈甲基化碘盐和0.55g(3.69mmol)4-二甲氨基苯甲醛，适当加热使之全溶后逐滴加入15mL含有0.61g(5.44mmol)叔丁醇钾的无水甲醇溶液，滴加完毕后在室温下继续搅拌5h，溶液渐变为紫红色，紫色沉淀不断生成。减压抽滤，用无水甲醇洗涤滤饼两次后，将所得滤饼先后用乙酸乙酯和N,N-二甲基甲酰胺作为洗脱剂进行柱层析分离，得到目标产物DPBAI0.42g(1.07mmol)，产率29.1％。
[0026] DPBAI的结构式为：
[0027]
[0028] 其物理常数如下：
[0029] 紫色粉末，分子式:C17H18N3I；
[0030] ESI(+)-MS(m/z):[M-I]+，实测值264.15(计算值264.34)。
[0031] 1H NMRδ/ppm(600MHz,DMSO)：8.848～8.837(d,2H,J＝6.6Hz),8.489(s,1H),8.219～8.209(d,2H,J＝6.0Hz),8.079～8.065(d,2H,J＝8.4Hz),6.945～6.931(d,2H,J＝
8.4Hz),4.252(s,3H),3.144(s,6H)。
[0032] 13C NMRδ/ppm(150MHz,DMSO)：154.37,151.11,145.37,134.47,121.45,120.02,118.45,112.57,95.24,47.12,40.54,0.58。
[0033] 实施例2 DPBAI和不同二级结构DNAs结合能力的研究
[0034] 应用紫外可见吸收滴定实验测试了DPBAI与不同二级结构DNAs的相互作用，结果如图1和表1所示。图中：箭头表示逐渐增加DNA的浓度；(A)+c-myc；(B)+c-kit；(C)+bcl-2；(D)+HTG(K缓冲体系，用HTG-K表示)；(E)+HTG(Na缓冲体系，用HTG-Na表示)；(F)小牛胸腺DNA。表1列出了氰乙烯基丙烯腈甲基化碘盐DPBAI与不同二级结构DNAs相互作用的结合常数(Kb)、最大吸收带的减色率(％)和红移值(nm)。结果表明，DPBAI既可以和G-四链体DNAs作用又可以和小牛胸腺DNA作用，但是DPBAI和G-四链体DNAs的结合常数远大于它和小牛胸腺DNA的结合常数。
[0035] 本实验所用双螺旋DNA为小牛胸腺DNA。
[0036] 本实验所用的G-四链体DNAs序列分别为：
[0037] bcl-2(5'-GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG-3')；
[0038] c-kit(5'-CGGGCGGGCGCGAGGGAGGGG-3')；
[0039] c-myc(5'-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3')；
[0040] HTG(5'-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3')。
[0041] 本实验所用缓冲体系为：K缓冲体系(10mM K2HPO4/KH2PO4,100mM KCl,pH 7.4)和Na缓冲体系(10mM Na2HPO4/NaH2PO4,100mM NaCl,pH 7.4)。
[0042] 本实验中双螺旋DNA使用的是小牛胸腺DNA，其浓度用碱基对表示，G-四链体DNAs的浓度用G-四分体表示。
[0043] 表1DPBAI与不同二级结构DNA相互作用的结合常数(Kb)、最大吸收带的减色率(％)和红移值(nm)
[0044]
[0045] 实施例3 DPBAI和不同二级结构DNAs作用后的荧光变化研究
[0046] 应用荧光滴定实验研究了DPBAI(5uM)和不同二级结构DNAs作用后的荧光强度变化，结果分别如图2和图3所示。荧光滴定实验发现，将不同二级结构的DNAs逐滴加入DPBAI溶液中后，五种G-四链体DNAs与DPBAI作用的荧光增强倍数明显大于小牛胸腺DNA与DPBAI作用的荧光增强倍数，其中c-myc G-四分体与DPBAI作用的荧光增强倍数最大，几乎达107倍。而当DPBAI与小牛胸腺DNA作用后荧光强度仅增加约16倍，其余G-四链体DNAs c-kit、、bcl-2、HTG(K缓冲体系)、HTG(Na缓冲体系)和DPBAI作用后荧光强度分别增加约87、89、71和56倍。
[0047] 本发明制备的荧光探针(DPBAI)与G-四链体DNAs和双螺旋DNA的结合常数差异较大，其中DPBAI与c-myc G-四链体DNA和双螺旋DNA作用的结合常数差异最大，前者是后者的85.3倍。DPBAI与G-四链体DNAs作用后的荧光增强倍数明显大于与双螺旋DNA作用后的荧光增强倍数，其中DPBAI与c-myc G-四链体DNA和双螺旋DNA作用的荧光增强倍数差异也最大，前者是后者的6.6倍。利用探针DPBAI与G-四链体DNAs和双螺旋DNA作用后的亲合力大小和荧光增强倍数的差异性，可用于G-四链体DNAs结构的检测。
