具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备方法
专利汇可以提供具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有抗 真菌 和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽（Trp-Ser-Val-Val-Leu环肽）及制备方法，属于 生物 制品的提取制备技术领域。所述环色-丝-缬-缬-亮肽是由色 氨 酸、丝氨酸、缬氨酸、缬氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽。这是一个新型化合物，尚无文献报道。本发明化合物可通过培养蛙粪霉，然后提取分离得到。环色-丝-缬-缬-亮肽纯品为白色粉末，对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为：1.17 mg/mL，在200μg/mL的浓度下对白色链珠菌的抑菌圈直径为14.62 mm。该化合物具有制备抗菌药物和抗 氧 化抗衰老保健品的潜 力 。，下面是具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备方法专利的具体信息内容。
1.具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽，其特征在于：所述环色-丝-缬-缬-亮肽的结构式如下：
所述环色-丝-缬-缬-亮肽是由色氨酸、丝氨酸、缬氨酸、缬氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽；
所述环色-丝-缬-缬-亮肽具有清除自由基活性和抗白色链珠菌活性；
对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：1.17mg/mL，在200 μg /mL的浓度下对白色链珠菌的抑菌圈直径为14.62mm。
2.权利要求1所述具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽的制备方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）菌种培养
将蛙粪霉（Basidiobolussp.）经过斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；
所述蛙粪霉（Basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种；
（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制
用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤（1）的具体操作如下：
（1.1）斜面种子培养
将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；
（1.2）二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在全温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250 rpm条件下，培养3～
7d，即得到二级菌种；
液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麦芽提取物10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～
6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化钾（KCl2）0.3～2.0 g/L、七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）
0.3～2.0 g/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3～2.0 g/L；
（1.3）三级液体种子培养
将二级菌种接种到大于等于5L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；
（1.4）四级培养
四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基步骤（1.2）中的液体培养基。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：所述步骤（1.4）中，四级培养为固体培养，将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3～10%， 25～36℃恒温培养5～15天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麦芽提取物
10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化钾（KCl2）0.3～2.0 g/L、七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.3～2.0 g/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3～2.0 g/L、琼脂15.0～30.0 g/L和水混合均匀制成。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤（2）的具体操作如下：
（2.1）最终发酵物的预处理
将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000-12000转/分钟条件下离心得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，得到过20～120目筛的预处理物；
或，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目的预处理物；
（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化
（2.2.1）提取
将预处理物，用甲醇或乙醇提取；料液比为1:2～20（W:V）、超声波功率10～100KHz,提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000转/分钟条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；取滤液或离心上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；
（2.2.2）分离纯化
采用反相色谱方法纯化，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为3～50微米；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的色谱流份；将收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。
具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备
方法
技术领域
背景技术
发明内容
所述环色-丝-缬-缬-亮肽具有清除自由基活性和抗白色链珠菌活性；
对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：1.17mg/mL，在200 μg /mL的浓度下对白色链珠菌的抑菌圈直径为14.62mm。
将蛙粪霉（Basidiobolussp.）经过斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；
所述蛙粪霉（Basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种。
（1.1）斜面种子培养
将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；
（1.2）二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在全温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250 rpm条件下，培养3～
7d，即得到二级菌种；
液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麦芽提取物10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～
6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化钾（KCl2）0.3～2.0 g/L、七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）
0.3～2.0 g/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3～2.0 g/L；
（1.3）三级液体种子培养
将二级菌种接种到大于等于5L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；
（1.4）四级培养
四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基步骤（1.2）中的液体培养基。
将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000-12000转/分钟条件下离心得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，得到过20～120目筛的预处理物；
或，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目的预处理物；
（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化
（2.2.1）提取
将预处理物用甲醇或乙醇提取；料液比为1:2～20（W:V）、超声波功率10～100KHz,提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000转/分钟条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；
取滤液或离心上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；
（2.2.2）分离纯化
采用反相色谱方法纯化，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为3～50微米；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的色谱流份；将收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。
（1）甲醇提取物对白色链珠菌的抑制活性测定：配制提取物浓度为1.0 mg/ml 20% DMSO溶液，以两性霉素B为阳性对照，以20% DMSO溶液为空白对照，进行抑制白色链珠菌试验，经计算得出提取物对白色链珠菌的平均抑菌圈直径11.58 mm。
20% DMSO溶液，以两性霉素B为阳性对照，以20% DMSO溶液为空白对照，进行抑制白色链珠菌试验，经计算得出提取物对白色链珠菌的平均抑菌圈直径14.62 mm。
高分辨液质联用分析显示纯化的活性化合物正离子585.3440(M+H)、607.3261(M+Na+)，623.3000(M+K+)， 计算出的分子式为 C30H44N6O6。
在此发明基础上可望进一步克隆出相关基因，构建高产量菌株。
具体实施方式
1.1蛙粪霉菌种选择
所用的蛙粪霉为蛙生蛙粪霉；
1.2菌株培养
培养方法为液体培养，具体工序如下：
1.2.1斜面种子培养
将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于25℃恒温、培养4d，得到一级菌种；
1.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖25.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母浸出粉
1.0g/L，氯化钾（KCl2）0.3g/L，七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.3g/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g/L；
在100 ml三角瓶中加入30%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度25℃、转速150 rpm，培养3d，即得到二级菌种；
1.2.3三级液体种子培养
将二级菌种接种到5L的发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量3%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，25℃恒温通气培养2天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
1.3最终发酵物中有效成分的提取和精制
1.3.1最终发酵物的预处理
将液体的最终发酵物经0.20μm滤膜过滤得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎到20目备用。
2，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。
100℃温度以下浓缩到粘稠状，在170℃条件下干燥；得到白色粉末的环色-丝-缬-缬-亮肽。
2.1蛙粪霉菌种选择
所用的蛙粪霉为裂孢蛙粪霉；
2.2菌株培养
培养方法为液体培养，具体工序如下：
2.2.1斜面种子培养
将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于36℃恒温、培养8d，得到一级菌种；
2.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖50.0 g/L，麦芽提取物30.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，酵母浸出粉
4.0 g/L，氯化钾（KCl2）0.3g/L，七水硫酸镁（MgSO4.7H2O） 0.3g/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g/L。
80%，接种量10%，通气量按体积比1:2（v/v），压力0.2MP，36℃恒温通气培养15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
将液体的最终发酵物经1.0μm滤膜过滤得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎到120目备用。
1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。
100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的目标峰；收集物在30℃温度以下浓缩到粘稠状，在-30℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。
3.1蛙粪霉菌种选择
所选用的菌种为固孢蛙粪霉；
3.2菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
3.2.1斜面种子培养
将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于30℃恒温、培养6d，得到一级菌种；
3.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖35.0 g/L，麦芽提取物20.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，酵母浸出粉
2.0 g/L，氯化钾（KCl2）0.3g/L，七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.3g/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g/L。
1.5（v/v），压力0.15MP，30℃恒温通气培养3天，得到三级菌种。
将固体的最终发酵物在30℃干燥到含水率等于20%，然后粉碎到20目备用。
3.3.3 分离纯化
采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为25微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按0～
100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的目标峰；收集物在40℃温度以下浓缩到粘稠状，在10℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。
4.1蛙粪霉菌种选择
所用的蛙粪霉蛙生蛙粪霉；
4.2菌株培养
培养方法为液体固体混合培养，具体工序如下：
4.2.1斜面种子培养
将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于29℃恒温、培养5d，得到一级菌种；
4.2.2二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
液体摇瓶培养基：葡萄糖40.0 g/L，麦芽提取物25.0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，酵母浸出粉
3.0 g/L，氯化钾（KCl2）0.3g/L，七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.3g/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.2 g/L。
1.2（v/v），压力0.12MP，32℃恒温通气培养3天，得到三级菌种。
10%，36℃恒温通气培养8天，得到固体的最终发酵物；
固体培养基为：葡萄糖50.0 g/L，麦芽提取物30.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，酵母浸出粉
4.0 g/L，氯化钾（KCl2）0.3g/L，七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.3g/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g/L，琼脂30.0 g/L。
将固体的最终发酵物在130℃干燥到含水率10%，然后粉碎到120目备用。
4.3.3 分离纯化
采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为10微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按0～
100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的目标峰；收集物在100℃温度以下浓缩到粘稠状，在170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。
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