专利汇可以提供一株多效植物促生菌及分离筛选方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且一株多效 植物 促生菌及分离筛选方法。本 发明 属于农业 微 生物 领域,具体地说是一株具有解磷、产NH3、产植物生长 激素 和产嗜 铁 素的多效 根际 促生菌,包括所述的多效 植物促生菌 保藏编号为CGMCCNo.14664,所述的多效植物促生菌在 肥料 中和 微生物接种 剂的应用,本发明所述的分离筛选方法包括 采样 、培养菌株、菌株鉴定及选择、菌株初选、菌株复选、菌株性能签定和多效菌株确定。,下面是一株多效植物促生菌及分离筛选方法专利的具体信息内容。
1.一种多效植物促生菌,其特征在于,所述的多效植物促生菌保藏编号为
CGMCCNo.14664。
2.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌,其特征在于所述的多效植物促生菌在肥料中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌,其特征在于所述的肥料为微生物肥料。
4.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌,其特征在于所述的多效植物促生菌在促进农作物生长的微生物接种剂的应用。
5.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌,其特征在于根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征,利用其16S rDNA序列在NCBI数据库上进行核酸序列比对,并参照伯杰氏细菌鉴定手册,该菌株确认为属阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai。
6.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌,其特征在于保藏菌株的形态、培养、生理、生化特征为:细胞杆状、在LB培养基中生长良好,在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培养时菌落为白色,不透明,呈圆形,表面干燥,边缘不整齐。
7.根据权利要求1所述的多效植物促生菌,其特征在于所述的多效植物促生菌生长性能中不同接种量对所述菌株的生长的影响:在相同体积的液体LB液体培养基中,分别接种
0.1%、0.5%、1.0%和2.0%的活化种子液,置于30℃摇床上,每隔1h,利用分光光度计测定OD600值,连续测定44h,设置1个空白对照;测定发现菌株的生长速率较快,接种后4h就进入对数生长期,10h时已经进入稳定期;不同接种量对菌株2-2生长的影响较小,菌株进入对数生长期和稳定期的时间无显著差异;在培养28h后,2%高接种量的处理出现菌体密度下降;
培养结果说明,菌株2-2的代谢能力较强、生长速率较快,在定殖中快速的占领生态位;
所述的LB液体培养基:蛋白胨10g,酵母膏5g,氯化钠5g,pH7.0,121℃灭菌20min,冷却后用于接种菌种。
8.根据权利要求1所述的多效植物促生菌,其特征在于所述的多效植物促生菌生长性能中不同pH对菌株生长的影响:调整初始LB液体培养基的pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,121℃灭菌20min后,并接种0.5%菌株种子液,置于30℃摇床上,每隔1h,利用分光光度法测定OD600值,连续测定44h,设置1个空白对照;pH对菌株的生长影响较大,pH为4.0时,菌株生长速率较低,在培养结束时都没有生长;菌株在初始pH6.0时的生长速率最高,后期未出现菌体浓度下降,初始pH为8.0时初始生长速率较快与pH6.0时接近,但是26h后出现菌体浓度下降的情况。
9.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌的分离筛选方法,其特征在于所述的分离筛选方法至少包括如下步骤:
A、采样:从浙江金华辣椒连作基地采集植株长势较好的根际土样6袋,所述的采样时间为2016年;
B:菌株分离:采用LB固体培养基分离法进行分离,所述的LB固体培养基分离法为:从每袋土样中称取5克的样品,分别置于45ml无菌水中,在摇床上振荡30min,然后吸取振荡均匀的土壤溶液0.5ml 至9.5ml的无菌水中,如此稀释直至10-6,吸取稀释倍数为10-4、10-5、10-6的溶液各0.1ml,涂布于LB固体培养基平板;涂布后的该平板在30度培养箱中培养24h,根据菌落形态差异,最后挑取46株菌株,用进一步的筛选;
所述的LB固体培养基:蛋白胨10g,酵母膏5g,氯化钠5g,琼脂2.0g,pH 7.0,121℃灭菌
20min,冷却至60℃;用于平板或者斜面的制备;
C:菌株鉴定及选择:用提取菌株的基因组DNA,扩增16S rDNA序列,在NCBI数据库进行比对,对得到的菌株进行初步鉴定,选择不同种属、生长速率较快的8株菌株;所述的初步鉴定方法为:采用基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA,采用16S rDNA通用引物上游引物【27F):5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’下游引物(1492R):5’TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3’】PCR扩增16S rDNA序列,在NCBI数据库进行比对,所述的属性差异选择的原则是:根据序列比对选择不同种的菌株;
D、菌株初筛:采用平板法初筛,对上述分离选出的8株菌株通过其溶磷能力的比较进行初筛选;初筛选择采用改良的PVK固体培养基进行:所述的PVK固体培养基葡萄糖10g,Ca3(PO4)25g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.2g,MgSO4·7H2O 0.1g,KCl 0.2g,酵母粉0.5g,MnSO4·H2O 0.002g,FeSO4·7H2O 0.002g,琼脂25g,0.4%溴酚蓝(pH 6.7)6mL,蒸馏水1000mL,pH
7.0-7.2;
平板法进行初筛过程是:用灭菌的牙签将8株菌株分别点接在改良的PVK培养基上,30℃温度下培养3d,测量溶磷圈的直径(D)和菌落的直径(d),计算溶磷圈与菌落直径比(D/d);平板初筛发现其中的四株菌株溶磷圈大于其它菌株,溶磷效果好;
E、菌株复筛:采用摇瓶法对菌株的溶磷能力进行复筛,所述的复筛采用NBRIP培养基,所述的NBRIP培养基组份:葡萄糖10g,Ca3(PO4)2 5g,MgCl2·6H2O 5g,MgSO4·7H2O 0.25g,KCl 0.2g,(NH4)2SO40.1 g,蒸馏水1000mL,其pH 7.0;
所述的摇瓶法对菌株的溶磷能力进行复筛步骤为:于250mL三角瓶中装入NBRIP培养基
50mL,115℃、30min高压灭菌备用;将在LB液体培养基中过夜培养的8株细菌离心收集菌体,用无菌水悬浮制成菌悬液1×106CFU·mL-1,取0.5mL菌悬液接种于上述灭菌的NBRIP培养基中,以接入等体积无菌水为对照CK;每个处理重复3次,30℃、170r·min-1摇床培养7d,发酵液经10000g离心10min,上清液分别用钼锑抗比色法和雷兹PHS-3D pH计测定磷含量和pH值;通过摇瓶法定量筛选发现欺其中的二株菌株有好的溶磷作用;
F、菌株产NH3能力测定
将选择的8株菌株在LB液体培养基活化后,将菌株转接到含10mL蛋白胨水(10g/L)试管中,28℃±2℃培养48-72h,每管加入0.5mLNessler’s试剂,颜色由褐色转为黄色的表明有NH3产生;
G、菌株产植物激素吲哚乙酸IAA能力测定
采用Salkow ski比色法测定植物促生菌分泌IAA的能力:将8 株菌株接种在LB液体培养基中培养12h(37℃、170r/min)后,用无菌水调节OD600值为0.05,取100μLPGPR菌悬浮液分别接到含有100mg/L色氨酸的King培养液中,每三角瓶盛有50mL的培养液,重复2次,以加
100μL无菌水的培养液为空白对照,一起置于30℃、转速为170r/min的控温振荡器中培养
4d;分别取菌悬浮液和空白对照200μL,10000rpm高速离心去除菌体后,向所得上清液中各加入200μL的比色液,,置室温下避光静置,30min内观察其颜色变化,2个重复均变红为阳性,表示能分泌IAA,颜色越深表示分泌数量多;2个重复均不变色为阴性,表示不分泌IAA;
比色液根据IAA产生的浓度选择PC比色液或者S2比色液其中一种加入;
所述的PC比色液的配制:称取FeCl3 12g溶于300mL蒸馏水,然后缓慢加入429.7mL 98%H2SO4,待冷却后定容至1L,测定范围0.3~20mg/L;
所述的S2比色液的配制:将4.5gFeCl3溶于300mL蒸馏水,然后缓慢加入587.4mL 98%H2SO4,待冷却后定容至1L,测定IAA范围5~200mg/L;
所述的King培养基,含100mg/L色氨酸:蛋白胨20g,甘油10mL,K2HPO4 1.5g,MgSO4·7H2O
1.5g,色氨酸100mg,去离子水定容1000mL;
H、多效菌株的确定:综合比较8个菌株在溶磷、产氨和产植物激素吲哚乙酸的能力,其中的一个菌株的多效效果明显,得到的该菌株即为多效植物促生菌。
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