一种用于遗传代谢病中氨基酸含量检测方法
阅读：879发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种用于遗传代谢病中氨基酸含量检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于遗传代谢病中 氨 基酸含量检测方法，利用高效液相色谱法及 近红外 光谱 法对血清中含有的氨基酸进行检测，检测方法为：高效液相色谱条件设定、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备； 近红外光谱 采集、近红外光谱数据模型建立。该方法首次建立了近红外光谱方法检人体血清中各种氨基酸成分定量数据模型，实现了多种成分的检测，为氨基酸的含量检测提供了一种快速高效的测定方法，提供了一种氨基酸成分的 稳定性 的定量考察方法，具有专属性强、线性关系良好、误差极小等优点。，下面是一种用于遗传代谢病中氨基酸含量检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于遗传代谢病中氨基酸含量检测方法，其特征在于，利用高效液相色谱法及近红外光谱法对血清中含有的氨基酸进行检测，具体检测方法为：高效液相色谱条件设定、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备；近红外光谱采集、近红外光谱数据模型建立。
2.根据权利要求1所述的氨基酸含量检测方法，其特征在于，所述血清中含有的氨基酸进行检测具体是指以下氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸。
3.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件设定为：
Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量5～10μL，体积流量1mL/min，柱温20～30℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：0min,100％B,
0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-
80％A；30min,20％B,80％A。
4.根据权利要求3所述的含量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件设定为：
Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温25℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：0min,100％B,0％A；0-
20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；
30min,20％B,80％A。
5.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：
精密吸取血清100～200μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入400～600μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液150～250μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的30～50μL三乙胺乙腈溶液，加入
100～150μL乙腈溶液，加入100～150μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于36～40℃水浴锅中衍生1h～1.5h，然后加入350～450μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
6.根据权利要求5所述的含量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：
精密吸取血清150μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入500μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置
10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
7.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法为：
取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸
120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
8.根据权利要求8所述的含量检测方法，其特征在于，近红外光谱采集方法为：全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，以水为背景，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.00005，相关系数RMC-r为
0.9927，预测均方差RMSEP为0.00010，相关系数RMP-r为0.9984。
一种用于遗传代谢病中氨基酸含量检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于氨基酸检测领域，具体涉及一种用于遗传代谢病中氨基酸含量检测方法。
背景技术
[0003] 妊娠状态下代谢产物的浓度会异常变化，通过对代谢物的分析能够更深入了解机体妊娠状态，预防可能的出现的新生儿遗传病如苯丙酮尿症。氨基酸作为构成生物营养所需蛋白质的基本物质，是代谢组学分析常见的目物质。加强中孕期妇女氨基酸测定于遗传病防治具有重要意义
[0004] 但人体血清中成分复杂，已知的方法检测氨基酸费时费力，很难快速识别血液中氨基酸成分及含量。
[0005] 血清氨基酸的检测主要方法有氨基酸分析仪法，氨基酸分析仪的衍生化反应是发生在柱后，即氨基酸与其它物质分离之后，因而避免了其它物质对氨基酸检测的干扰。但此方法衍生反应要求苛刻，因此检测结果重复性较差，且氨基酸分析仪价格较高而检测时间长。
发明内容
[0007] 本发明目的是提供一种用于用于遗传代谢病中氨基酸含量检测方法。
[0008] 本发明所述的一种用于遗传代谢病中氨基酸含量检测方法是利用高效液相色谱法及近红外光谱法对血清中含有的氨基酸进行检测，具体检测方法为：高效液相色谱条件设定、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备；近红外光谱采集、近红外光谱数据模型建立。
[0009] 本发明所述血清中含有的氨基酸进行检测具体是指以下氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸。
[0010] 本发明所述高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量5～10μL，体积流量1mL/min，柱温20～30℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0011] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0012] 优选的，本发明所述高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温25℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；
20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0013] 本发明所述供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清100～200μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入400～600μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液150～250μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的30～50μL三乙胺乙腈溶液，加入100～150μL乙腈溶液，加入100～150μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于36～40℃水浴锅中衍生1h～1.5h，然后加入350～450μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0014] 优选的，本发明所述供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清150μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入500μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0015] 本发明所述对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0016] 本发明所述近红外光谱采集方法为：全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，以水为背景，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.00005，相关系数RMC-r为0.9927，预测均方差RMSEP为0.00010，相关系数RMP-r为0.9984。
[0017] 本发明的有益效果为：
[0018] 1.首次建立了近红外光谱方法检人体血清中各种氨基酸成分定量数据模型，实现了多种成分的检测，为氨基酸的含量检测提供了一种快速高效的测定方法，提供了一种氨基酸成分的稳定性的定量考察方法。
[0019] 2.总结了适合人体血清各种氨基酸的梯度洗脱方法以及近红外光谱方法，适合检测人体血清各种氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸。
[0020] 3.本发明所述方法与专用氨基酸分析仪相比具有简便、快速、样本无损等优点。
[0022] 图1校正集和预测集中实测值与模型预测值之间的散点图
具体实施方式
[0024] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方法作进一步地具体说明。
[0025] 实施例1血清中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的检测方法。
[0026] (1)高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量5μL，体积流量1mL/min，柱温20℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0027] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0028] (2)供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清100μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入400μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，
10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液150μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的30μL三乙胺乙腈溶液，加入100μL乙腈溶液，加入100μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于36℃水浴锅中衍生1h，然后加入350μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液150μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的30μL三乙胺乙腈溶液，加入100μL乙腈溶液，加入100μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于36℃水浴锅中衍生1h，然后加入350μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0029] (3)所述对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0030] (4)全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.00013，相关系数RMC-r为0.9641，预测均方差RMSEP为0.00017，相关系数RMP-r为0.9878。
[0031] 实施例2血清中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的检测方法。
[0032] (1)高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温30℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0033] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0034] (2)供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清200μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入600μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，
10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液250μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的50μL三乙胺乙腈溶液，加入150μL乙腈溶液，加入150μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于40℃水浴锅中衍生1.5h，然后加入450μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液250μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的50μL三乙胺乙腈溶液，加入150μL乙腈溶液，加入150μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于40℃水浴锅中衍生1.5h，然后加入450μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0035] (3)所述对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0036] (4)全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.00014，相关系数RMC-r为0.9609，预测均方差RMSEP为0.00021，相关系数RMP-r为0.9357。。
[0037] 实施例3血清中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的检测方法。
[0038] (1)高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温25℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0039] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0040] (2)供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清150μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入500μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，
10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置
1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置
1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0041] (3)对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0042] 检测结果显示，检测基线平稳，样品分离度良好，所得物质含量结果可进一步参与建模。
[0043] (4)近红外光谱采集方法：全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，以水为背景，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导-1 -1函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm ，5561-5735cm ，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.00005，相关系数RMC-r为0.9927，预测均方差RMSEP为0.00010，相关系数RMP-r为0.9984。
[0044] 采集光谱质量较好，建模结果显示，模型线性相关系数均在0.99左右，所建模型良好，见图1，图2，表1。
[0045] 为了进一步验证本发明的可行性，发明人进行了以下试验：
[0046] 一、方法学验证
[0047] 实验例1血清中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的检测方法。
[0048] (1)高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量5μL，体积流量1mL/min，柱温20℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0049] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0050] (2)供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清100μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入400μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，
10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液150μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的30μL三乙胺乙腈溶液，加入100μL乙腈溶液，加入100μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于36℃水浴锅中衍生1h，然后加入350μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液150μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的30μL三乙胺乙腈溶液，加入100μL乙腈溶液，加入100μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于36℃水浴锅中衍生1h，然后加入350μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0051] (3)所述对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0052] 检测结果显示，检测基线平稳，样品分离度一般，根据所得物质含量结果尝试参与建模。
[0053] (4)全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.00013，相关系数RMC-r为0.9641，预测均方差RMSEP为0.00017，相关系数RMP-r为0.9878。
[0054] 采集光谱质量一般，建模结果显示，线性关系一般，所建模型稳定性需要进一步提高。
[0055] 实验例2血清中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的检测方法。
[0056] (1)高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温30℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0057] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0058] (2)供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清200μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入600μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，
10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液250μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的50μL三乙胺乙腈溶液，加入150μL乙腈溶液，加入150μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于40℃水浴锅中衍生1.5h，然后加入450μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
10000r/min转速离心25-30min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液250μL，置1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的50μL三乙胺乙腈溶液，加入150μL乙腈溶液，加入150μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于40℃水浴锅中衍生1.5h，然后加入450μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0059] (3)所述对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0060] 检测结果显示，检测基线平稳，样品分离度一般，所得物质含量结果尝试参与建模[0061] (4)全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.00014，相关系数RMC-r为0.9609，预测均方差RMSEP为0.00021，相关系数RMP-r为0.9357。。
[0062] 采集光谱质量一般，建模结果显示，线性关系一般，所建模型稳定性需要进一步提高。
[0063] 实验例3血清中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的检测方法。
[0064] (1)高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温25℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0065] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0066] (2)供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清150μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入500μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，
10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置
1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置
1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0067] (3)对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0068] 检测结果显示，检测基线平稳，样品分离度一般，所得物质含量结果可进一步参与建模。
[0069] (4)近红外光谱采集方法：全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为16cm-1，扫描次数为128次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，以水为背景，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.181e-3，相关系数RMC-r为0.8581，预测均方差RMSEP为0.763e-3，相关系数RMP-r为0.7984。
[0070] 采集光谱质量较差，建模结果显示，线性关系较差，所建模型不稳定。
[0071] 实验例4血清中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的检测方法。
[0072] (1)高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温25℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0073] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0074] (2)供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清150μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入500μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，
10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置
1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置
1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0075] (3)对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0076] 检测结果显示，检测基线平稳，样品分离度一般，所得物质含量结果可进一步参与建模。
[0077] (4)近红外光谱采集方法：全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将2mm比色皿放入透射模块样品池中，以空气为背景，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正-3 -3
集均方差RMSEC为0.229e ，相关系数RMC-r为0.7852，预测均方差RMSEP为0.891e ，相关系数RMP-r为0.7778。
集均方差RMSEC为0.229e ，相关系数RMC-r为0.7852，预测均方差RMSEP为0.891e ，相关系数RMP-r为0.7778。
[0078] 采集光谱质量较差，建模结果显示，线性关系较差，所建模型不稳定。
[0079] 实验例5血清中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的检测方法。
[0080] (1)高效液相色谱条件设定为：Agilent C18柱规格为：250mm×4.6mm，5μm，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温25℃，检测波长254nm；流动相A相乙腈，B相水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序为：
[0081] 0min,100％B,0％A；0-20min,100-70％B,0-30％A；20min,70％B,30％A；20-30min,70％-20％B,30％-80％A；30min,20％B,80％A。
[0082] (2)供试品溶液的制备方法为：精密吸取血清150μL置于1.5mL离心管中，准确加入30μL0.63mg/mL的γ-氨基丁酸储备液，加入500μL 3％磺基水杨酸溶液，漩涡混匀60s，
10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置
1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
10000r/min转速离心28min，上清液待用，衍生化反应精密吸取处理后血清上清液200μL，置
1.5mL离心管中，准确加入20μL浓度0.63mg/mL茶氨酸储备液，加入V/V＝1:1的40μL三乙胺乙腈溶液，加入120μL乙腈溶液，加入120μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于38℃水浴锅中衍生1h，然后加入400μL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，过0.22μm滤膜，即得。
[0083] (3)对照品溶液的制备方法为：取天冬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取谷氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丝氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取甘氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取精氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苏氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取脯氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取酪氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取缬氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取蛋氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取异亮氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取亮氨酸对照品，加
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取苯丙氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取色氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取赖氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；取组氨酸对照品，加0.1mol/ml盐酸溶解至浓度为1mg/ml，备用；将制备的对照品溶液取冬氨酸20ul、谷氨酸65ul、丝氨酸60ul、甘氨酸80ul、组氨酸
330ul、精氨酸220ul、苏氨酸40ul、丙氨酸120ul、脯氨酸60ul、酪氨酸50ul、缬氨酸60ul、蛋氨酸65ul、异亮氨酸28ul、亮氨酸270ul、苯丙氨酸65ul、色氨酸50ul及赖氨酸125ul的混合对照品储备液的混合对照品储备液配成多种成分的混合对照品溶液。
[0084] 检测结果显示，检测基线平稳，样品分离度良好，所得物质含量结果可进一步参与建模。
[0085] (4)近红外光谱采集方法：全光谱波数范围10000～4000cm-1，光学分辨率为8cm-1，扫描次数为64次，采集光谱时，将5mm比色皿放入透射模块样品池中，以水为背景，每个样本重复采集3次光谱，求其平均值作为原始光谱.以天冬氨酸为例简述模型建立，采用二阶导函数和Norris滤波对光进行预处理，之后选择4173-4694cm-1，5561-5735cm-1，7798-7967cm-1，8646-8816cm-1四个区间，选用联合区间偏最小二乘法siPLS建立数据模型，校正集均方差RMSEC为0.00005，相关系数RMC-r为0.9927，预测均方差RMSEP为0.00010，相关系数RMP-r为0.9984。
[0086] 采集光谱质量较好，建模结果显示，模型线性相关系数均在0.99左右，所建模型良好，见图1，图2及表1。
[0087] 所有建模方式及评价结果
[0088]
[0089]
[0090] 实验例6方法学考察：
[0091] 1.方法专属性评价定量模型的专属性是通过马氏距离来体现的，以马氏距离与限定值相比的方法来检验样品的异常性，通过淘汰掉异常样本，使得所建立方法稳定，专属性良好。
[0092] 2.线性模型线性相关系数均在0.99左右，即表明模型在相关范围内具有线性良好。
[0093] 3.准确度将校正集的近红外方法测定结果和HPLC的测定结果作相关性比较，误差极小。见表2。
[0094] 表2准确度测定结果
[0095]
[0096]
[0097] 4.精密度取同一份样品重复扫描4次，通过建立的NIR定量分析模型计算其含量，分别为：0.001500、0.001513、0.001500、0.001513其相对标准偏差RSD值为0.49％[0098] 5重复性对同一样品平行取四次，分别采集对应，通过建立的NIR定量分析模型计算其含量：0.002154,0.002141,0.002256,0.002256其相对标准偏差RSD为2.8％。
[0099] 通过上述方法验证，本发明专属性强、线性关系良好、误差极小。
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