主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法
阅读：1027发布：2020-05-21
专利汇可以提供主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法，本发明首先提供了一种用于检测酶活性浓度的分子组合，包括DNA-肽分子和葫芦脲，所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，肽分子的羧基端共价连接于双链DNA分子的5’端或3’端；所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变 氨 基端芳香族氨基酸的暴露状态。当待测酶通过酶促反应将部分肽链 切除 后，暴露出(或丢失掉)的芳香族氨基酸能够(不能)与葫芦脲发生主客体作用而形成(无法形成)DNA主客体探针。这种DNA主客体探针穿越纳米孔时将产生特征 电流 信号 ，通过检测电流信号即可实现对酶活性浓度的高灵敏度、特异性检测。，下面是主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测酶活性浓度的分子组合，其特征在于，所述分子组合包括DNA-肽分子和葫芦脲；
所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；
所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；
所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；
所述DNA-肽分子和葫芦脲的摩尔比为1:10-250。
2.如权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述双链DNA分子的长度为20-60bp。
3.如权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。
4.如权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸数目小于等于20。
5.如权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述葫芦脲选自下组：葫芦[6]脲，葫芦[7]脲，葫芦[8]脲。
6.一种用于检测酶活性浓度的主客体探针，其特征在于，由DNA-肽分子和葫芦脲共孵育形成；
所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；
所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；
所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；
当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(i)时，所述主客体探针由经待测酶作用后的DNA-肽分子与所述葫芦脲共孵育形成，所述葫芦脲与经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基端芳香族氨基酸通过主客体超分子作用连接；
当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(ii)时，所述主客体探针由未经待测酶作用的DNA-肽分子与所述葫芦脲共孵育形成，所述葫芦脲与DNA-肽分子中的氨基端芳香族氨基酸通过主客体超分子作用连接；
所述DNA-肽分子和葫芦脲的摩尔比为1:10-250。
7.如权利要求6所述的主客体探针，其特征在于，所述双链DNA分子的长度为20-60bp；
优选地，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；
优选地，所述经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸数目小于等于20；
优选地，所述葫芦脲选自下组：葫芦[6]脲，葫芦[7]脲，葫芦[8]脲；
优选地，所述DNA-肽分子和所述葫芦脲共孵育的反应条件为4℃，反应时间为1-3h。
8.一种系统，包括权利要求1-5任一项所述的分子组合和样品池，或权利要求6-7任一项所述的主客体探针和样品池；
所述样品池包括两个隔室，两个隔室被绝缘膜分隔；所述绝缘膜上具有一个直径为
100-150μm的通孔，所述通孔被磷脂双分子层充满，在所述磷脂双分子层中存在一个由α-溶血素蛋白形成的纳米孔；样品池中应用Ag/AgCl电极形成闭合回路。
9.权利要求1-5任一项所述的分子组合物、权利要求6-7任一项所述的主客体探针或权利要求8所述的系统在检测酶活性浓度中的应用，所述酶为蛋白酶；
优选地，所述酶选自下组：亮氨酸氨肽酶，组织蛋白酶B，基质金属蛋白酶，羧肽酶M，甲硫氨酸氨肽酶。
10.一种检测酶活性浓度的方法，包括如下步骤，将待测酶与权利要求1中所述的DNA-肽分子混合，使待测酶对所述DNA-肽分子发生酶促反应，随后加入所述葫芦脲进行共孵育，得到待测溶液；将所述待测溶液加入本发明所述的样品池，通过分析特征电信号实现对酶活性浓度的检测。
主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及超分子化学技术领域，具体涉及一种主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法。
背景技术
[0002] 蛋白酶作为一类重要的生物标志物，对其活性的快速灵敏检测不仅对于肿瘤早期诊断意义重大，同时也是疗效观察、肿瘤分期判断及预后的重要手段。荧光光谱法是目前最为普遍的酶活性浓度检测技术。尽管荧光法具有很高的灵敏度与较好的空间分辨率，但荧光探针通常需要复杂的设计并且自体荧光现象所产生的背景干扰将导致信噪比下降进而影响方法的灵敏度及成像质量。近些年随着纳米技术的飞速发展，相继开发出各种基于纳米材料以实现高灵敏度、高选择性检测酶活性浓度的方法。但仍需要借助大型仪器且过程繁琐。因此发展简单、高效的酶活性浓度检测方法变得愈发迫切。
[0003] 由于DNA具有丰富多样的“工具箱”性质，并且碱基上或链末端上可进行多种修饰等优势而可以被设计成各种功能不同的纳米机器。2019年，Ricci等人利用修饰了花菁染料的DNA纳米机器实现了对脲酶的高灵敏度快速检测。但由于该方法依赖于光学信号，因此存在着光漂白、荧光寿命短、背景干扰高等问题，尤其是背景干扰极易得出假阳性结论。因此研究开发出基于DNA分子探针的高灵敏度、高选择性、低背景干扰的酶活性浓度检测方法对于肿瘤的早期诊断及治疗、预后有着重要意义。
[0004] 纳米孔单通道技术是自二十世纪九十年代中期起在电生理学研究的基础上发展起来的新兴检测手段。所谓纳米孔就是孔径尺寸在纳米尺度的孔道，通常为1-100纳米。当两个充满电解液的相互绝缘的隔室通过纳米级孔道连通，在外加电场作用下，溶液中的电解质离子定向迁移并穿过纳米孔从而产生电流，经膜片钳系统测量、放大和转换后被记录。当溶液中存在待检测物质时，该物质在扩散作用或电压驱动下穿越纳米孔，此时孔道内通过的离子数目由于待测物的占据而产生变化，从而导致记录到的电流发生改变，电流信号包含两个特征量：电流阻滞振幅(amplitude)和电流阻滞时间(dwell time)，从中可以分析得出丰富的物性信息：物质的种类、结构、构象变化和分子组成等。
[0005] 通常情况下，生物型纳米孔的灵敏度和信噪比要比人造材料纳米孔好得多，因此生物纳米孔更有利于实现高灵敏度检测。但是生物纳米孔是通过质粒表达得来的，其几何尺寸已经固定，因此只有大小与其匹配的分子才可以穿越。而蛋白酶的尺度通常在十纳米左右，因此无法穿越αHL纳米孔。2011年JACS发表了基于核酸适体结合αHL纳米孔检测可卡因的工作。当核酸适体结合可卡因后会形成Y型复合结构。该结构无法穿越纳米孔而发生长时间电流堵塞，也正是利用了这种堵塞电流信号实现了可卡因快速检测。但是堵塞信号非常不利于高灵敏度检测，因为其信号特征性低，背景干扰较强。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法。
[0007] 为此，本发明的第一方面，提供了一种用于检测酶活性浓度的分子组合，所述分子组合包括DNA-肽分子和葫芦脲；
[0008] 所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；
[0009] 所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；
[0010] 所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；
[0011] 所述DNA-肽分子和葫芦脲的摩尔比为1:10-250，优选为1:10-150。
[0012] 进一步，所述双链DNA分子的长度为20-60bp。
[0013] 进一步，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；优选为苯丙氨酸。
[0014] 进一步，所述经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸数目小于等于20，优选为小于等于15。
[0015] 进一步，所述葫芦脲选自下组：葫芦[6]脲(CB[6])，葫芦[7]脲(CB[7])，葫芦[8]脲(CB[8])；优选为葫芦[7]脲。
[0016] 本发明的第二方面，提供了一种用于检测酶活性浓度的主客体探针，由DNA-肽分子和葫芦脲共孵育形成；
[0017] 所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；
[0018] 所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；
[0019] 所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；
[0020] 当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(i)时，所述主客体探针由经待测酶作用后的DNA-肽分子与所述葫芦脲共孵育形成，所述葫芦脲与经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基端芳香族氨基酸通过主客体超分子作用连接；
[0021] 当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(ii)时，所述主客体探针由未经待测酶作用的DNA-肽分子与所述葫芦脲共孵育形成，所述葫芦脲与DNA-肽分子中的氨基端芳香族氨基酸通过主客体超分子作用连接；
[0022] 所述DNA-肽分子和葫芦脲的摩尔比为1:10-250，优选为1:10-150。
[0023] 进一步，所述双链DNA分子的长度为20-60bp。
[0024] 进一步，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；优选为苯丙氨酸。
[0025] 进一步，所述经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸数目小于等于20，优选为小于等于15。
[0026] 进一步，所述葫芦脲选自下组：葫芦[6]脲(CB[6])，葫芦[7]脲(CB[7])，葫芦[8]脲(CB[8])；优选为葫芦[7]脲。
[0027] 进一步，所述DNA-肽分子和所述葫芦脲共孵育的反应条件为4℃，反应时间为1-3h，优选为2h。
[0028] 本发明的第三方面，提供了所述主客体探针的制备方法，包括，
[0029] 当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(i)时，所述主客体探针的制备方法为：
[0030] 将所述DNA-肽分子与待测酶混合，使待测酶对所述DNA-肽分子发生酶促反应，随后加入所述葫芦脲进行共孵育，得到所述主客体探针；
[0031] 当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(ii)时，所述主客体探针的制备方法为：
[0032] 将所述DNA-肽分子与所述葫芦脲进行共孵育，得到所述主客体探针。
[0033] 进一步，所述共孵育的反应条件为4℃，反应时间为1-3h，优选为2h。
[0034] 本发明的第四方面，提供了一种系统，包括本发明所述的分子组合和样品池，或本发明所述的主客体探针和样品池；
[0035] 所述样品池包括两个隔室，两个隔室被绝缘膜分隔；所述绝缘膜上具有一个直径为100-150μm的通孔，所述通孔被磷脂双分子层充满，在所述磷脂双分子层中存在一个由α-溶血素蛋白形成的纳米孔；样品池中应用Ag/AgCl电极形成闭合回路。
[0036] 进一步，所述绝缘膜为聚四氟乙烯膜。更进一步，所述聚四氟乙烯膜的厚度为20μm。
[0037] 本发明的第五方面，提供了所述分子组合物、所述主客体探针或所述系统在检测酶活性浓度中的应用，所述酶为蛋白酶。
[0038] 进一步，所述酶选自下组：亮氨酸氨肽酶，组织蛋白酶B，基质金属蛋白酶，羧肽酶M，甲硫氨酸氨肽酶。
[0039] 本发明的第六方面，提供了一种检测酶活性浓度的方法，包括如下步骤，将待测酶与本发明所述的DNA-肽分子混合，使待测酶对所述DNA-肽分子发生酶促反应，随后加入所述葫芦脲进行共孵育，得到待测溶液；将所述待测溶液加入本发明所述的样品池，通过分析特征电信号实现对酶活性浓度的检测。
[0040] 进一步，所述共孵育的反应条件为4℃，反应时间为1-3h，优选为2h。
[0041] 进一步，所述DNA-肽分子相对于待测酶的最大催化量过量。在具体的实施方式中，例如针对来自肿瘤患者的样品，在待测酶与所述DNA-肽分子的混合反应液中，所述DNA-肽分子的浓度可选用200nM。
[0042] 进一步，所述样品池的隔室中预先加有电解质溶液，所述电解质溶液为KCl电解质溶液或NaCl电解质溶液，K+或Na+的浓度为1-3M，优选为3M；所述电解质溶液的pH为4-6。在具体的实施方式中，所述电解质溶液用10mM Mes-Tris缓冲液配制得到。
[0044] 本发明的发明人设计了DNA主客体探针并将其与纳米孔技术相结合，通过在DNA分子末端修饰不同序列的小肽，并将修饰的小肽作为待测酶对应的底物，从而构建检测酶活性浓度所需的DNA-肽分子。之后将DNA-肽分子与待测酶共同孵育，当待测酶通过酶促反应将部分肽链切除后，暴露出(或丢失掉)的芳香族氨基酸能够(不能)与葫芦脲发生主客体作用而形成(无法形成)DNA主客体探针。这种DNA主客体探针穿越纳米孔将产生特征电流信号，由于该信号特异性极强，因此可以准确地实现分子指认，避免了背景干扰的问题，且具有极高的灵敏度。此外，本发明提供的酶活性浓度检测方法还具有操作简单，实际消耗量极少，无需借助大型仪器等优点。附图说明
[0045] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
[0046] 图1为亮氨酸氨肽酶的检测原理图；
[0047] 图2为组织蛋白酶B的检测原理图；
[0048] 图3为亮氨酸氨肽酶的酶活性浓度检测的工作曲线；
[0049] 图4为亮氨酸氨肽酶的选择性检测实验结果；
[0050] 图5为组织蛋白酶B的酶活性浓度检测的工作曲线；
[0051] 图6为组织蛋白酶B的选择性检测实验结果。
具体实施方式
[0052] 下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验。
[0053] DNA-肽分子
[0054] 本发明所述的DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端。在具体的实施方式中，可通过“点击反应”(click reaction)在DNA分子末端修饰肽分子，例如常见的点击反应包括巯基-马来酰亚胺的加成反应，氨基-羧基的缩合反应，炔基-叠氮的加成反应，醛基-氨基的缩合反应等。
[0055] 所述双链DNA分子的具体序列不影响其检测酶活性浓度的功能，在具体的实施方式中，可设计长度为20-60bp的DNA序列，其应当形成完全碱基配对的双螺旋结构而不形成其他类型的二级结构(例如茎环、发卡、内饰环、突环、多环等)。
[0056] 所述DNA-肽分子中的肽链部分可被待测酶特异性识别并进行酶切作用，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态。且所述DNA-肽分子不会被检测体系中除待测酶以外的其他分子识别或发生酶切作用。
[0057] 酶活性浓度
[0058] 酶催化活性的国际单位为IU(常简写为U)，定义为在规定条件下，每分钟催化1μmol底物的酶量为1IU。本领域常用单位体积中的酶活性来表征酶的浓度，即“酶活性浓度”，单位为U/L，这也是临床酶学分析中采用的单位。
[0059] 检测原理
[0060] 下文以亮氨酸氨肽酶和组织蛋白酶B为例，说明本发明技术方案的酶活性浓度检测的原理：
[0061] 亮氨酸氨肽酶(LAP)能水解肽链N端并由亮氨酸与其他氨基酸形成的肽键，广泛分布于肝、肾、胰等组织中，当这些组织出现病变时，可出现血清LAP水平升高，临床检测LAP的酶活性浓度对相关疾病诊断具有重要意义。本发明设计一种检测LAP的DNA-肽分子探针，其中肽分子的序列为LFGK，如图1所示，当LAP与肽分子反应后暴露出苯丙氨酸，那么经LAP作用后的DNA-肽分子将与葫芦[7]脲形成主客体探针，其穿越纳米孔将产生特征电流信号，利用特征电流信号的频率变化可进行酶活性浓度的测量。
[0062] 组织蛋白酶B(cat.B)是一种存在于溶酶体内的半胱氨酸蛋白水解酶，在肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中，cat.B的表达均成倍高于甚至3-9倍高于邻近的正常组织。cat.B可以选择性地识别并降解一些多肽片段，如Val-Cit(胍氨酸)、Phe-Lys、Gly-Phe-Leu-Gly等。本发明设计一种检测cat.B的DNA-肽分子探针，其中肽分子的序列为FGVCitK，如图2所示，当cat.B与肽分子反应后去除掉苯丙氨酸，那么经cat.B作用后的DNA-肽分子将无法再与葫芦[7]脲形成主客体探针，其穿越纳米孔将不再产生特征电流信号，利用特征电流信号的频率变化可进行酶活性浓度的测量。
[0063] 实施例1DNA-肽分子探针的制备
[0064] 本实施例制备了两种DNA-肽分子探针，所用到的DNA分子和肽分子均委托生工生物工程(上海)合成。DNA分子的序列为5’-CATATTACACTCTCAC GACTC-3’(SEQ ID NO：1)，其5’端经巯基修饰；肽分子1的序列为LFG K(SEQ ID NO：2)，肽分子2的序列为FGVCitK(SEQ ID NO：3)，肽分子羧基端的赖氨酸残基侧链修饰有3-马来酰亚胺基丙酸。
[0065] 取100μL DNA(100M)，100μL肽分子1(5mM)，将二者混合均匀并用氨水将pH调至8.0左右；在室温下涡旋4h。利用制备型阴离子交换色谱对反应液进行分离纯化得到所需的DNA-肽分子1，命名为DNA-KGFL探针。
[0066] 取100μL DNA(100M)，100μL肽分子2(5mM)，将二者混合均匀并用氨水将pH调至8.0左右；在室温下涡旋4h。利用制备型阴离子交换色谱对反应液进行分离纯化得到所需的DNA-肽分子2，命名为DNA-KCitVGF探针。
[0067] 实施例2样品池系统的构建
[0068] 样品池系统包括两个隔室(cis和trans)，两个隔室的体积均为1.0mL，两个隔室采用20μm厚的聚四氟乙烯薄膜隔开(薄膜中间有一个直径约为100-150μM的小孔)，用玻璃毛细管将1体积份正十六烷和10体积份正戊烷组成的混合溶液滴入聚四氟乙烯薄膜的小孔周围(滴加量约为2至3μL)，然后将两个隔室中加入电解质缓冲液(3M KCl，10mM Tris，pH 5.0)和1,2-二植烷酰卵磷脂(lipids)(1，2-二植烷酰卵磷脂以磷脂原液的形式加入，磷脂原液的浓度为10mg/mL，加入量约为15μL；电解质缓冲液的加入量为1mL)，并用移液枪混匀，使其自组装形成磷脂双分子层。然后向cis隔室的溶液中加入1μLα-溶血素蛋白溶液(蛋白浓度约为0.3mg/mL)，蛋白自发插入磷脂双分子层形成纳米孔，应用Ag/AgCl电极(连接有高频采样探头，高频采样探针连接有膜片钳放大器)在样品池系统中形成闭合回路。
[0069] 上述α-溶血素蛋白溶液的制备方法如下：
[0070] 1、野生型α-溶血素质粒(WT-D8H6)：参考文献：Bhakdi,S.；Fiissle,R.；Tranum-Jensen,J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1981,78,5475–5479.；公众可以从中国科学院化学研究所获得。
[0071] 2、将步骤1中的野生型α-溶血素质粒(WT-D8H6)导入大肠杆菌系统内(E.coli BL21(DE3)pLysS strain)(参考文献Bhakdi,S.；Fiissle,R.；Tranum-Jensen,J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1981,78,5475–5479.)进行表达，将表达的利用SDS变性的
8％聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后得到单体，之后将单体加入至兔血红细胞中，单体将自发聚合成七聚体；最后对蛋白进行纯化，用8％SDS-PAGE变性胶进行纯化，得到纯化后的野生型α-溶血素蛋白溶液(α-溶血素蛋白溶液的具体制备方法可参照文献：卓丽霞,王莹,张春萍,等.α-溶血素的表达及其纳米孔的制备[J].中国生物工程杂志,2017,37(1):53-57.)。
8％聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后得到单体，之后将单体加入至兔血红细胞中，单体将自发聚合成七聚体；最后对蛋白进行纯化，用8％SDS-PAGE变性胶进行纯化，得到纯化后的野生型α-溶血素蛋白溶液(α-溶血素蛋白溶液的具体制备方法可参照文献：卓丽霞,王莹,张春萍,等.α-溶血素的表达及其纳米孔的制备[J].中国生物工程杂志,2017,37(1):53-57.)。
[0072] 实施例3亮氨酸氨肽酶的酶活性浓度检测
[0073] 本实施例对亮氨酸氨肽酶(Leucine aminopeptidase，LAP)的酶活性浓度进行检测，LAP购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，10U/mg。
[0074] (1)取实施例1制备得到的DNA-KGFL探针(1.23μL，163.9μM)，再分别取各种浓度的LAP在缓冲液(10mM PB，pH 7.4)中混合均匀，并调整总体积为20μL，使得待测的LAP的终浓-6 -5 -4 -3 -2度分别为：3.1×10 ，3.1×10 ，3.1×10 ，3.1×10 ，3.1×10 ，0.31，3.1，15.6，31.2，
46.8，62.4nM；在37℃下共同孵育3h，随后加入10μL葫芦[7]脲(5.0mM)，并在4℃下孵育2h，制备得到待测溶液。
46.8，62.4nM；在37℃下共同孵育3h，随后加入10μL葫芦[7]脲(5.0mM)，并在4℃下孵育2h，制备得到待测溶液。
[0075] (2)将步骤(1)得到的待测溶液加入实施例2制备得到的样品池的cis隔室，在室温25±2℃的条件下利用膜片钳放大器(Axopatch 200B；Axon instruments,Foster City,CA)进行信号采集，信号采样频率为100kHz，Bessel低通滤波截至频率设置为10kHz。膜片钳电流信号分析应用Clampfit 10.2软件进行分析，特征信号手动提取并手动测量，使用Origin 8.5对数据进行处理及拟合。
[0076] LAP的酶活性浓度检测的工作曲线如图3所示，对LAP的检测限为10-5U/L。
[0077] 实施例4亮氨酸氨肽酶的选择性检测
[0078] 本实施例对实施例1制备得到的DNA-KGFL探针对亮氨酸氨肽酶的选择性进行检测。
[0079] 步骤同实施例3，区别在于，实施例3加入各浓度的LAP，而本实施例共设置13组，分别加入以下试剂：50U/L(15.6nM)LAP；100U/L GGT；100U/L cat.B；200U/L胰蛋白酶；200U/L CPB；25mg/L溶菌酶；100μM Cys；100μM Glu；2.5mM GSH；10mM葡萄糖；2.5mM Mg2+；2.5mM Ca2+；control为不加入试剂。
[0080] 检测结果如图4所示，由图4可知，实施例1制备得到的DNA-KGFL探针对LAP的检测具有极高的选择性，其他常见的干扰物或临床检测中可能存在的酶类或试剂对LAP的检测干扰极小。
[0081] 实施例5组织蛋白酶B的酶活性浓度检测
[0082] 本实施例对组织蛋白酶B(cat.B)的酶活性浓度进行检测，cat.B购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，5U/mg。
[0083] (1)取实施例1制备得到的DNA-KCitVGF探针(1.31μL，152.7μM)，再分别取各种浓度的cat.B在缓冲液(10mM PB，2.0mM DTT，1.0mM EDTA，pH 6.0)中混合均匀，并调整总体积为20μL，使得待测的cat.B的终浓度分别为：7.2×10-6，7.2×10-5，7.2×10-4，7.2×10-3，7.2-2×10 ，0.36，0.72，1.44，2.17μM；在37℃下共同孵育3h，随后加入10μL葫芦[7]脲(5.0mM)，并在4℃下孵育2h，制备得到待测溶液。
[0084] (2)将步骤(1)得到的待测溶液加入实施例2制备得到的样品池的cis隔室，在室温25±2℃的条件下利用膜片钳放大器(Axopatch 200B；Axon instruments,Foster City,CA)进行信号采集，信号采样频率为100kHz，Bessel低通滤波截至频率设置为10kHz。膜片钳电流信号分析应用Clampfit 10.2软件进行分析，特征信号手动提取并手动测量，使用Origin 8.5对数据进行处理及拟合。
[0085] cat.B的酶活性浓度检测的工作曲线如图5所示，对cat.B的检测限为10-3U/L。
[0086] 实施例6组织蛋白酶B的选择性检测
[0087] 本实施例对实施例1制备得到的DNA-KCitVGF探针对组织蛋白酶B的选择性进行检测。
[0088] 步骤同实施例5，区别在于，实施例5加入各浓度的cat.B，而本实施例共设置5组，分别加入以下试剂：10U/L(72.2nM)cat.B；100μg/L cat.B；100μg/L cat.S；10μg/L cat.B+200μg/L抑制剂(CA-074-Me)；control为不加入试剂。
[0089] 检测结果如图6所示，由图6可知，实施例1制备得到的DNA-KCitVGF探针对cat.B的检测具有极高的选择性，其他常见的干扰物或临床检测中可能存在的酶类或试剂对cat.B的检测干扰极小。
[0090] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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