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一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸并获得a-氨基己二酸的方法

阅读：98发布：2023-12-27

专利汇可以提供一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸并获得a-氨基己二酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种制备7-ACA并同时获得α- 氨基己二酸的方法，所述方法，经过以下步骤：步骤1，头孢菌素C 发酵液的处理；步骤2，头孢菌素C在头孢菌素C酰基转移酶的作用下进行酶解反应得到7-ACA；步骤3，对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理；步骤4，分离出7-ACA；步骤5，从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸。，下面是一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸并获得a-氨基己二酸的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种制备7-ACA并同时获得α-氨基己二酸的方法，所述方法，经过以下步骤：
步骤1，头孢菌素C 发酵液的处理；
步骤2，头孢菌素C在头孢菌素C酰基转移酶的作用下进行酶解反应得到7-ACA；
步骤3，对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理；
步骤4，分离出7-ACA；
步骤5，从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤1中所述头孢菌素C发酵液的处理是用碱调pH到碱性，并浓缩到适当浓度及纯度。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2中酶解反应过程要控制反应PH、酶用量等参数。
4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤3所述对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理是对7-ACA裂解液采用浓缩，脱炭、过滤，使其达到结晶前的良好状态。
5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤4所述分离出7-ACA采用析晶并分离的方法。
6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤5所述从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸是用等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述的等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来的方法，经过以下三个步骤：
步骤1，对一步酶法分离出7-ACA后的裂解液进行处理；
步骤2，分离出α-氨基己二酸；
步骤3，精制α-氨基己二酸；
其中，步骤1所述对裂解液进行处理，包括加碱并浓缩的步骤；步骤2所述分离α-氨基己二酸的方法选自树脂吸附法或者等电点法；步骤3所述精制α-氨基己二酸是重结晶法。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述的等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来的方法，经过以下三个步骤：
步骤1，裂解液加入氢氧化钠溶液，调整PH值为6.0，随后将裂解液浓缩到原来体积的
30%；
步骤2，把浓缩液用酸调节PH值到3.0，析出α-氨基己二酸；
步骤3，将过滤得到的α-氨基己二酸粗品加入水和乙醇的混合溶媒中重结晶一次，结晶用丙酮洗涤，干燥即得精品α-氨基己二酸；
其中，步骤1所述加入氢氧化钠溶液为2mol/L的氢氧化钠溶液2mol/L浓度的氢氧化钠溶液，其配制方法如下：每500毫升水中溶解的氢氧化钠质量为40g，其中将裂解液浓缩采用的方法如下：把裂解液通过纳滤装置进行浓缩；其中，步骤2所述用酸调节PH值是用盐酸溶液调节，所述盐酸溶液浓度为：2mol/L左右，其配制方法如下：36-38%浓盐酸和水的配比1：5体积进行混合；其中，步骤3所述的重结晶，是用无水乙醇和水1：1等量混合成为
50%的乙醇溶液进行重结晶。
9.如权利要求1所述的方法，经过以下步骤：
步骤1，取头孢菌素C发酵滤液，调pH到9-10；
步骤2，头孢菌素C酰基转移酶(NRB103)和头孢菌素C在室温下反应，直到用高效液相仪鉴测7-氨基头孢霉烷酸完全生成，控制反应pH在9-10；
步骤3，向上一步得到的7-氨基头孢霉烷酸反应液中加入Na2S2O4,调pH6-7，加吐温80和二氯甲烷，分相，在水相中加入活性炭和EDTA，过滤得7-氨基头孢霉烷酸液体；
步骤4，7-氨基头孢霉烷酸液体调pH值使成为酸性，析出结晶后，滤出结晶，用丙酮洗涤，干燥；
步骤5，通过等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来，方法如下：裂解液加入氢氧化钠溶液，调整PH值为6.0，随后将裂解液浓缩到原来体积的30%，把浓缩液用酸调节PH值到3.0，析出α-氨基己二酸，将过滤得到的α-氨基己二酸粗品加入水和乙醇的混合溶媒中重结晶一次，结晶用丙酮洗涤，干燥即得精品α-氨基己二酸。10、如权利要求1所述的方法，经过以下步骤：
取头孢菌素C(CPC)发酵滤液10升（750mM,相当于纯CPC311克），过1μm膜滤，用氨水调PH到10；
向反应器中加入（NRB-103）酶1800克，水洗二次，加入CPC液后，快速搅拌下，用氨水控制PH为8-10，反应30分钟，7-ACA转化率98%；
向得到的15升7-ACA液中加入100克Na2S2O4,用氨水调PH为7，加吐温80，10毫升，加入二氯甲烷2000毫升，搅拌10分钟，分相，在水相中加入活性炭20克，加入EDTA10克，搅拌15分钟，过滤除炭得7-ACA处理液；
向7-ACA处理液中滴加3摩尔的盐酸,使PH为5，结晶完全后，滤出结晶，收集过滤母液，之后300毫升丙酮洗涤结晶，真空干燥至干，重量收率63.7%，纯度99.5%；
取经过一步酶法制备7-ACA的废液15升，用氢氧化钠调节PH值到6，经过纳滤浓缩到
5升，滴加3摩尔的盐酸,使PH为3.0，使α-氨基己二酸结晶，过滤100毫升丙酮洗涤，真空干燥，烘干，干燥后α-氨基己二酸结晶加入水200毫升加入乙醇200毫升搅拌过滤得到纯度99%淡黄色α-氨基己二酸大约100克。

说明书全文

一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸并获得a-氨基己二酸的

方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种酶裂解法的应用，具体而言是涉及一种获制备7-氨基头孢霉烷酸并获得α-氨基己二酸的一步酶法应用。背景技术：

[0002] 7-氨基头孢霉烷酸（7—aminocephalosporanic acid，7-ACA）， [0003] 结构式：

[0004] 是目前半合成头孢菌素的重要基础原料，目前工业上通常由头孢菌素C(CephalosporinC,CPC)，通过化学法或二步酶法裂解，脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链得到7-ACA。

[0005] α-氨基己二酸

[0006] α-氨基己二酸（α-Aminoadipic acid），分子量161.16，分子式C6H11N1O4，白色结晶体或者白色结晶粉末。最早发现于玉米种子或者人、天竺鼠的尿中。属于氨基酸的一种，广泛用于医药、食品饲料、化妆品工业等领域，也可以用于合成特殊化学物质的中间体。如低热质甜味剂，螯合物及多肽等。

[0007] 化学法生产7-ACA，有着大量排泄环境污染物质的致命缺陷，这与今日的环境保护概念格格不入，在制备7-ACA后生成大量的α-氨基己二酸甲酯，水解后形成α-氨基己二酸残存在废液中，可以采用树脂或者等电点吸附的方式提取回收，但是处理过程相对的繁琐不经济。后发展出二步酶法生产7-ACA，头孢菌素C通过两个酶，即D-氨基酸氧化酶及戊二酰7-ACA酰化酶的作用，可以生成7-ACA。如1990年《中国科学报》报导了中国科学院植物生理研究所，以头孢菌素C为原料，二步酶法制备7-ACA获得成功。1986年日本有了一步酶法制备7-ACA的专利申请。二步酶法虽然解决了化学法的污染环境问题，但是二步酶法在收率、纯度及成本方面显得有些不足，并且前一步GL-7-ACA的工艺过程较难控制。 [0008] 中国专利CN200510089965提供了一种从头孢菌素Ｃ制备7－氨基头孢霉烷酸的两步酶法，其中所用的Ｄ－氨基酸氧化酶为一种经纯化的三角酵母Ｄ－氨基酸氧化酶突变体。

[0009] 中国专利CN94112285提供一种一步两酶法从头孢菌素Ｃ制造7－氨基头孢霉烷酸的方法。即在一个反应器的水相系统中加入Ｄ－氨基酸氧化酶、ＧＬ－7ＡＣＡ酰化酶。 [0010] 中国专利CN200410016825.9以D-氨基酸氧化酶（DAAO）氧化头孢菌素C生产戊二酰-7-氨基头孢酶烷酸（GL-7-ACA），再由GL-7-ACA酰化酶催化脱酰生产7-ACA。以及中国专利CN200410039573一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，CN200310113563一种生产7-氨基头孢烷酸的方法及其专用重组酶公开的方法也存在同样的问题。

[0011] 这些方法虽然一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸比二步酶法优越，但采用不同的酶其效率具有很大的不同，其具体的处理方法也会对产物的收率和纯度产生影响，并没有涉及α-氨基己二酸的回收和处理，本发明通过现有的工业化的固定化酶，找到一种法兼有了化学法（高收率和高纯度）和二步酶法（环保和高收益）的优点，同时给出了一种可以简单高效的回收α-氨基己二酸的方法，比现有一步酶法获得的7-ACA更加简洁，产物收率更高，纯度更高，反应条件更加温和快速，排放的废水几乎没有污染，不但节省了生产成本，保护了环境还创造了新的效益。发明内容：

[0012] 本发明的目的是提供一种制备7-ACA并同时获得α-氨基己二酸的方法。 [0013] 本发明的方法，经过以下步骤：

[0014] 步骤1，头孢菌素C 发酵液的处理；

[0015] 步骤2，头孢菌素C在头孢菌素C酰基转移酶的作用下进行酶解反应得到7-ACA； [0016] 步骤3，对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理；

[0017] 步骤4，分离出7-ACA；

[0018] 步骤5，从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸。

[0019] 其中，步骤1中所述头孢菌素C发酵液的处理是用碱调pH到碱性，并浓缩到适当浓度及纯度。

[0020] 步骤2中酶解反应过程要恰当控制反应PH、酶用量等参数，优选的头孢菌素C酰基转移酶购买自山东鲁抗立科药业有限公司。

[0021] 步骤3所述对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理是对7-ACA裂解液采用浓缩，脱炭、过滤等措施处理，使其达到结晶前的良好状态。

[0022] 步骤4所述分离出7-ACA采用析晶并分离的方法。

[0023] 步骤5所述从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸是用等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来。

[0024] 本发明优选的方法，经过以下步骤：

[0025] 步骤1，取头孢菌素C发酵滤液，调pH到9-10。

[0026] 步骤2，头孢菌素C酰基转移酶(NRB103)和头孢菌素C在室温下反应，直到用高效液相仪鉴测7-氨基头孢霉烷酸完全生成，控制反应pH在9-10。

[0027] 步骤3，向上一步得到的7-氨基头孢霉烷酸反应液中加入Na2S2O4,调pH6-7，加吐温80和二氯甲烷，分相，在水相中加入活性炭和EDTA，过滤得7-氨基头孢霉烷酸液体。 [0028] 步骤4，7-氨基头孢霉烷酸液体调pH值使成为酸性，析出结晶后，滤出结晶，用丙酮洗涤，干燥。

[0029] 步骤5，通过等电点结晶方式分离出α-氨基己二酸。

[0030] 本发明的一步酶法兼有了化学法，二步酶法和现有一步酶法的优点，比较结果如下：

[0031] 表1.现有技术与本发明一步酶法比照表

[0032]

[0033]

[0034] 本发明所述的等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来的方法，经过以下三个步骤：

[0035] 步骤1，对一步酶法分离出7-ACA后的裂解液进行处理；

[0036] 步骤2，分离出α-氨基己二酸；

[0037] 步骤3，精制α-氨基己二酸。

[0038] 其中，

[0039] 步骤1所述对裂解液进行处理，包括加碱并浓缩的步骤。

[0040] 步骤2所述分离α-氨基己二酸的方法选自树脂吸附法或者等电点法。 [0041] 步骤3所述精制α-氨基己二酸是重结晶法。

[0042] 优选的所述的等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来的方法，步骤如下：

[0043] 步骤1，裂解液加入氢氧化钠溶液，调整PH值为6.0，随后将裂解液浓缩到原来体积的30%，

[0044] 步骤2，把浓缩液用酸调节PH值到3.0，析出α-氨基己二酸，

[0045] 步骤3，将过滤得到的α-氨基己二酸粗品加入水和乙醇的混合溶媒中重结晶一次，结晶用丙酮洗涤，干燥即得精品α-氨基己二酸。

[0046] 其中，步骤1所述加入氢氧化钠溶液为2mol/L的氢氧化钠溶液2mol/L浓度的氢氧化钠溶液，其配制方法如下：每500毫升水中溶解的氢氧化钠质量为40g，其中将裂解液浓缩采用的方法如下：把裂解液通过纳滤装置进行浓缩。

[0047] 其中，步骤2所述用酸调节PH值是用盐酸溶液调节，所述盐酸溶液浓度为：2mol/L左右，其配制方法如下：36-38%浓盐酸和水的配比1：5体积进行混合。。 [0048] 其中，步骤3所述的重结晶，是用无水乙醇和水1：1等量混合成为50%的乙醇溶液进行重结晶。

[0049] 用本发明的方法制备α-氨基己二酸即可消除废液污染(浓缩液析出结晶后可以调节废液PH中性7左右排放到污水处理站处理)，又可获得一种有用的产品α-氨基己二酸，可谓一举两得，其成本及其低廉。

[0050] 表2.现有技术与本发明一步酶法废液处理法比照表

[0051]

[0052]

[0053] 表3.α-氨基己二酸从废液中分离方法筛选

[0054]

[0055] 本发明工艺收率高，纯度高，步骤少，设备简单，转化率高，反应条件更加温和安全快速，大大节省了生产成本。具体实施方式：

[0056] 以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1.头孢菌素C(CPC)液的预处理：

[0057] 取头孢菌素C(CPC)发酵滤液10升（750mM,相当于纯CPC311克），过1μm膜滤，用氨水调PH到10。

[0058] 实施例2反应条件控制：

[0059] 向反应器中加入（NRB-103）酶1800克，水洗二次，加入CPC液后，快速搅拌下，用氨水控制PH为8-10，反应30分钟，7-ACA转化率98%。

[0060] 实施例3裂解液（7-ACA液）的处理：

[0061] 向得到的15升7-ACA液中加入100克Na2S2O4,用氨水调PH为7，加吐温80，10毫升，加入二氯甲烷2000毫升，搅拌10分钟，分相，在水相中加入活性炭20克，加入EDTA10克，搅拌15分钟，过滤除炭得7-ACA处理液。

[0062] 实施例47-ACA结晶

[0063] 向7-ACA处理液中滴加3摩尔的盐酸,使PH为5，结晶完全后，滤出结晶，收集过滤母液，之后300毫升丙酮洗涤结晶，真空干燥至干，重量收率63.7%，纯度99.5%。 [0064] 实施例5α-氨基己二酸结晶

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