一种去除FFPE样品核酸交联的洗脱液
阅读：936发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种去除FFPE样品核酸交联的洗脱液专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种去除FFPE样本核酸交联的洗脱液，具备了解交联能 力 ，可用于洗脱FFPE样品提取的核酸。本发明洗脱液可以解除DNA-DNA、DNA-蛋白的交联状态，使提取的核酸纯度高， 质量 好，从而满足下游实验的应用，对于核酸领域具有重要的意义。，下面是一种去除FFPE样品核酸交联的洗脱液专利的具体信息内容。
1.一种洗脱液，其特征在于，由酸酐、甘氨酸以及尿素组成。
2.根据权利要求1所述的洗脱液，其特征在于，由以下成分组成：0.05％～0.2％W/V酸酐、2～8mM甘氨酸以及10～20mM尿素。
3.根据权利要求1所述的洗脱液，其特征在于，所述酸酐选自乙酸酐、马来酸酐、二甲基马来酸酐、顺式乌头酸酐、琥珀酸酐、戊二酸酐的任意一种。
4.根据权利要求3所述的洗脱液，其特征在于，由以下成分组成：0.05％～0.2％W/V酸酐、2～8mM甘氨酸以及10～20mM尿素。
5.根据权利要求3所述的洗脱液，其特征在于，由以下成分组成：0.05％W/V酸酐、2mM甘氨酸以及10mM尿素。
6.根据权利要求3所述的洗脱液，其特征在于，由以下成分组成：0.2％W/V酸酐、8mM甘氨酸以及20mM尿素。
7.根据权利要求3所述的洗脱液，其特征在于，由以下成分组成：0.05％W/V乙酸酐、
10mM甘氨酸以及5mM尿素。
8.权利要求1～7任一项所述洗脱液在减少核酸交联中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述减少核酸交联为解除石蜡包埋的样品核酸交联。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述核酸为脱氧核糖核酸。
一种去除FFPE样品核酸交联的洗脱液
技术领域
[0001] 本发明属于样本核酸领域，特别涉及一种去除FFPE样品核酸交联的洗脱液。
背景技术
[0002] 甲醛可以诱导DNA-DNA交联[1-2]，或DNA-蛋白交联[3]。检测FFPE样品来源的DNA(尤其是陈旧样品)时，经常会出现检测的DNA总浓度正常，但qPCR分析实验，会发现检测的靶标基因浓度低，以至于影响后续的实验。
[0003] 甲醛所致的DNA-DNA交联分为链内交联和链间交联，主要发生在A、G、C碱基自身或三种碱基之间，但不形成C-C交联。其大致原理可能是：①甲醛主要通过活性氧自由基，特别[4]是羟自由基来介导DNA-DNA交联 ；②甲醛的羰基亲电性和较小的空间位阻，使其易于与核酸发生交联。在体内或体外甲醛先与核酸上的自由的氨基反应生成不稳定的羟甲基加合物，然后再进一步与其他核酸反应形成稳定的交联物，其主要形式是：DNA-NH-CH2-NH-DNA[2]。
[0004] 由于甲醛导致DNA交联，提取石蜡包埋的样品(FFPE)是个较为复杂的过程。需要使用有机溶剂(通常是二甲苯)脱去石蜡，再使用蛋白酶等试剂消化组织，再从组织中提取核酸。然而这些提取步骤，并不能解除核酸的交联状态，因此，需要一种解交联洗脱液，在洗脱FFPE样品提取的核酸的同时，解除核酸的交联状态，从而满足下游实验的应用。
[0005] [1]Merk O,Reiser K,Speit G.Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay[J].Mut.Res.-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis,2000,471(1):71-80.
[0006] [2]Conaway C C,Whysner J,Verna L K,et al.Formaldehyde mechanistic data and risk assessment:endogenous protection from DNAadduct formation[J].Pharmacol Ther,1996,71(1–2):29-55.
[0007] [3]Voitkun V,Zhitkovich A.Analysis of DNA-protein crosslinking activity of malondialdehyde in vitro[J].Mutation Research/fundamental&Molecular Mechanisms of Mutagenesis,1999,424(1–2):97-106.
[0008] [4]Singh N,Lai H.60Hz magnetic field exposure induces DNA crosslinks in rat brain cells[J].Mutat Res,1998,400(1-2):313-320.
发明内容
[0009] 本发明的首要目的在于提供一种具备解交联功能洗脱液。
[0010] 为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
[0011] 本发明的第一方面，提出了一种洗脱液。一种洗脱液，由酸酐、甘氨酸以及尿素组成。
[0012] 根据本发明的实施例，所述洗脱液由以下成分组成：0.05％～0.2％W/V酸酐、2～8mM甘氨酸以及10～20mM尿素。
[0014] 根据本发明的实施例，由以下成分组成：0.05％～0.2％W/V酸酐、2～8mM甘氨酸以及10～20mM尿素。
[0015] 根据本发明的实施例，由以下成分组成：0.05％W/V酸酐、2mM甘氨酸以及10mM尿素。
[0016] 根据本发明的实施例，由以下成分组成：0.2％W/V酸酐、8mM甘氨酸以及20mM尿素。
[0017] 根据本发明的实施例，由以下成分组成：0.05％W/V乙酸酐、10mM甘氨酸以及5mM尿素。
[0018] 本发明的第二方面，提出了前面所述洗脱液在解除核酸交联中的应用。
[0019] 根据本发明的实施例，所述洗脱液减少核酸交联从而解除。
[0020] 根据本发明的实施例，解除石蜡包埋的样品核酸交联。
[0021] 根据本发明的实施例，所述核酸为脱氧核糖核酸。
[0022] 本发明的有益效果是：
[0023] 本发明公开了一种具备解交联功能的洗脱液，可用于洗脱FFPE样品提取的核酸。本发明洗脱液一定程度上可以解除DNA-DNA、DNA-蛋白的交联状态，使提取的核酸纯度高，质量好，有利于后续qPCR扩增或其它基于DNA杂交的检测方法，对于核酸领域研究具有重要的意义。
具体实施方式
[0024] 下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
[0025] 实施例1：
[0026] 使用Roche公司的High Pure FFPET DNA Isolation Kit进行肝组织FFPE样品的DNA提取，但本实施例核酸提取中的洗脱液为0.1％w/v马来酸酐、2mM甘氨酸、5mM尿素，pH 6.9，并且在98℃下加热45min。提取的FFPE样品为制备时间48h。
[0027] 结果：
[0028] 提取的核酸经NanoDrop 2000仪器检测，核酸浓度正常，尽管制备的FFPE已室温存放48h，但qPCR测的β-actin的拷贝数也接近于正常值。说明本实施例1的洗脱液除了洗脱核酸，还能有效地解除一部分核酸的交联(表1)。
[0029] 表1使用含马来酸酐、甘氨酸、尿素的洗脱液洗脱的核酸质量
[0030]
[0031] 注：实施例1提取的核酸，其A260/A280、A260/A230比值略有下降，但不会抑制qPCR扩增反应。
[0032] 实施例2：
[0033] 使用Roche公司的High Pure FFPET DNA Isolation Kit进行肝组织FFPE样品的DNA提取，但本实施例核酸提取的洗脱液为0.5％乙酸酐、1mM甘氨酸、20mM尿素，pH 7.2进行洗脱，并且在98℃下加热45min。，提取的样品为制备后保存9d的FFPE。
[0034] 结果：
[0035] 实施例2样品交联时间比实施例1的交联时间多1周，提取的核酸经Nano Drop 2000仪器检测，核酸浓度正常，但qPCR测的β-actin的拷贝数也接近于正常值。(表2)[0036] 除了实施例1马来酸酐以外，实施例2的乙酸酐搭配特定浓度的甘氨酸和尿素，能够有效地去除核酸交联。其A260/A280、A260/A230比值略有下降，但不会抑制qPCR扩增反应。
[0037] 表2使用含乙酸酐、甘氨酸、尿素的洗脱液洗脱的核酸质量
[0038]
[0039]
[0040] 实施例3：
[0041] 使用Roche公司的High Pure FFPET DNA Isolation Kit进行肝组织FFPE样品的DNA提取，但本实施例核酸提取的洗脱液为0.05％乙酸酐、10mM甘氨酸、5mM尿素，pH 7.2进行洗脱，并且在98℃下加热45min。提取的样品为制备后保存3个月的FFPE。
[0042] 结果：
[0043] 实施例3样品交联时间3个月，提取的核酸经Nano Drop 2000仪器检测，核酸浓度正常，且qPCR测的β-actin的拷贝数也接近于正常值。(表3)
[0044] 实施例3的乙酸酐搭配特定浓度的甘氨酸和尿素，能够有效地去除核酸交联。其A260/A280、A260/A230比值略有下降，但不会抑制qPCR扩增反应。
[0045] 表3使用含乙酸酐、甘氨酸、尿素的洗脱液洗脱的核酸质量
[0046]
[0047] 对比例1：
[0048] 使用Roche公司的High Pure FFPET DNA Isolation Kit进行肝(穿刺)组织FFPE样品的DNA提取，提取过程中的洗脱步骤，使用试剂盒附带的洗脱缓冲液。
[0049] 提取的核酸经NanoDrop 2000仪器检测，核酸浓度正常。
[0050] qPCR mix配制反应液：
[0051]
[0052]
[0053] 其中引物、探针的序列如下：
[0054] 上游引物：CGTGGACATCCGCAAAGAC(SEQ ID NO.1)；
[0055] 下游引物：GCATCCTGTCGGCAATGC(SEQ ID NO.2)；
[0056] 荧光探针：5’Fam-CCAACACAGTGCTGTCTGGCGGC-3’BHQ1(SEQ ID NO.3)；
[0057] qPCR反应程序为：95℃2min；95℃10s，60℃40s，循环40次。
[0058] 使用中国计量科学研究院的人基因组DNA标准品作为定量标准品(BW 4035-1～4035-2)的溯源，对提取的核酸进行定量。
[0059] 结果：
[0060] 从细胞数角度而言，石蜡包埋组织，qPCR测得β-actin的拷贝数比正常样品低2个数量级。由此可见，制备3个月的FFPE样品，其核酸发生了严重的交联，尽管核酸浓度没有明显下降，但是核酸质量难以满足qPCR实验的要求。(表4)
[0061] 表4使用High Pure FFPET DNA Isolation Kit提取的核酸影响下游qPCR应用[0062]
[0063] 对比例2
[0064] 使用Roche公司的High Pure FFPET DNA Isolation Kit进行肝组织FFPE样品的DNA提取，但此次提取的FFPE样品为制备时间小于48h，提取的洗脱步骤使用试剂盒附带的洗脱缓冲液。
[0065] 提取的核酸经NanoDrop 2000仪器检测，核酸浓度正常，qPCR(方法同实施例1)测的β-actin的拷贝数约为正常肝切除组织的1/10～1/5。
[0066] 结果：核酸交联的程度，和FFPE包埋的时间有关。随着FFPE包埋时间越长，核酸交联的程度越高，越难进行qPCR扩增实验。(表5)
[0067] 表5使用High Pure FFPET DNA Isolation Kit提取的核酸影响下游qPCR应用[0068]
[0069] 对比例3：
[0070] 使用Roche公司的High Pure FFPET DNA Isolation Kit进行肝组织FFPE样品(使用的样品与实施例1一样，样品号分别为303712和303713的肝组织)的DNA提取，提取的FFPE样品制备时间为3个月，本实施例提取的洗脱液为基因组DNA提取常用的洗脱液：1×TE(10mM Tris-Cl pH 7.5，1mM EDTA)，并在98℃加热45min。
[0071] 结果：
[0072] 提取的核酸经Nano Drop 2000仪器检测，核酸浓度低于商品化的High Pure FFPET DNA Isolation Kit中的洗脱液。提取的核酸A260/A280、A260/A230比值有所下降，与核酸浓度的下降有关，qPCR检测结果发现细胞数显著下降，说明1×TE不适合FFPE组织提取后的DNA洗脱，High Pure FFPET DNA Isolation Kit(Roche公司)使用的洗脱液优于1×TE。(表6)
[0073] 表6替换1xTE洗脱的核酸影响下游qPCR应用
[0074]
[0075] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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