一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基及其用途
阅读：83发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基，包括 基础 培养基和添加组分，所述的添加组分包括以下成分：rhPDGF-BB、rhFGF-b、rhTGF-beta1、聚乙烯醇、α- 酮 戊二酸 、脂多糖、重组纤连蛋白、重组人 白蛋白 、重组脱 铁 转铁蛋白、重组人胰岛素生长因子、氢化可的松。本发明还提供了一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基的用途。本发明成分明确、稳定，排除了血清培养的不 稳定性 ，同时各因子之间协同作用，能够高效的扩增脂肪间充质干细胞，缩短细胞周期，增殖迅速，3代次培养细胞产率达到血清培养2倍以上，而且细胞一致性好，能够高效的维持其 生物 学特性及分化潜能。，下面是一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基及其用途专利的具体信息内容。
1.一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基，包括基础培养基和添加组分，其特征在于，所述的添加组分包括以下成分：rhPDGF-BB、rhFGF-b、rhTGF-beta1、聚乙烯醇、α-酮戊二酸、脂多糖、重组纤连蛋白、重组人白蛋白、重组脱铁转铁蛋白、重组人胰岛素生长因子、氢化可的松。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，以所述添加组分的体积计，所述添加组分各成分的含量：rhPDGF-BB 0.1～10ug/mL、rhFGF-b 0.2～20ug/mL、rhTGF-beta1
0.01～1ug/mL、聚乙烯醇2.5～250mg/mL、α-酮戊二酸0.75～75ug/mL、脂多糖5～500ng/mL、重组纤连蛋白10～1000ug/mL、重组人血清白蛋白0.025～2.5g/mL、重组脱铁转铁蛋白0.75～75ug/mL、重组人胰岛素生长因子0.15～15ug/mL、氢化可的松0.025～2.5ug/mL。
3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于，所述添加组分各成分的含量：
rhPDGF-BB 2ug/mL、rhFGF-b 1ug/mL、rhTGF-beta1 0.1ug/mL、聚乙烯醇25mg/mL、α-酮戊二酸7.5ug/mL、脂多糖50ng/mL、重组纤连蛋白100ug/mL、重组人血清白蛋白0.25g/mL、重组脱铁转铁蛋白7.5ug/mL、重组人胰岛素生长因子1.5ug/mL、氢化可的松0.25ug/L。
4.根据权利要求1～3中任一项权利要求所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基与添加组分的体积比为100：0.5～4。
5.根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基与添加组分的体积比为50：1。
6.根据权利要求1～3中任一项权利要求所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM/F12。
7.权利要求1～6中任一项权利要求所述的无血清培养基用于脂肪、骨髓来源的间充质干细胞的培养的用途。
8.权利要求7所述的无血清培养基用于人脂肪间充质干细胞培养的用途。
一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞培养领域技术领域，具体地说，是关于一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基及其用途。
背景技术
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)属于中胚层的多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，具有自我更新和多向分化能力，广泛存在于脐带组织、脂肪、骨髓、骨骼肌、骨外膜、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中。间充质干细胞具有非常强的分化能力，在特定的条件培养下，它可以增殖分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌细胞等多种类型的细胞。
[0003] 间充质干细胞中，来源于脂肪组织的脂肪间充质干细胞(Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)，组织来源丰富，含量丰富，UC-MSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力；具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，并且表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。正是由于拥有这些特性，使得间充质干细胞能够提供一种理想的生物学平台，用于科学研究与临床应用，如细胞治疗、再生医学、药物筛选、基因治疗载体的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、组织工程种子细胞等。2004年，Le Blanc等报道了首例半相合异基因间充质干细胞移植治疗GVHD获得成功，其后又报道了异基因配型不合的间充质干细胞移植治疗GVHD的有效性，并且认为在应用间充质干细胞治疗GVHD不需要严格的配型，其后又有多篇异基因未经配型的MSC治疗GVHD、促进造血重建的报道，其MSC来源涉及骨髓、脂肪、牙周等。目前，美国FDA已批准了近60项间充质干细胞的临床试验，主要包括：组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤；肝脏损伤；脊髓损伤和神经系统疾病；自身免疫性疾病治疗：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等；作为基因治疗的载体。
[0004] 脂肪组织存在于人体的各个部分，来源丰富，已经被广泛引用于，临床医疗研究、美容等领域。随着对干细胞的认识越来越深入，形成一种观点认为“靠近移植”更有优势：以靠近病患部位组织来源的干细胞，进行细胞移植及组织修复效果更佳。而脂肪作为人体分布最广泛地组织，其中含有的间充质干细胞极为丰富，是唯一一种能够满足“靠近移植”的组织。尽管组织来源丰富，但是如何获得高产量、高活性、高一致性、更安全的脂肪间充质干细胞，用于进一步的应用研究，仍然是间充质干细胞研究应用的重要课题。传统的脂肪间充质干细胞培养需要添加胎牛血清，培养的间充质干细胞通过胞吞摄取牛血清蛋白而携带牛血清蛋白，能够引起受体免疫反应，同时有引入异源血清携带的细菌、病毒的风险，再者血清培养的细胞产率、传代次数有限，极大限制了间充质干细胞的应用。以及现有无血清培养基，添加人血清白蛋白、纤连蛋白等成分，受原料来源影响，有感染艾滋病、乙肝等传染疾病的风险，极大地提高了对于产品质控的要求。
发明内容
[0005] 本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基。
[0006] 本发明的第二个目的是，提供间充质干细胞化学成分限定无血清培养基的用途。
[0007] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基，包括基础培养基和添加组分，其特征在于，所述的添加组分包括以下成分：rhPDGF-BB、rhFGF-b、rhTGF-beta1、聚乙烯醇、α-酮戊二酸、脂多糖、重组纤连蛋白、重组人白蛋白、重组脱铁转铁蛋白、重组人胰岛素生长因子、氢化可的松。
[0008] 作为本发明的一种优先实施方案：以所述添加组分的体积计，所述添加组分各成分的含量：rhPDGF-BB 0.1～10ug/mL、rhFGF-b 0.2～20ug/mL、rhTGF-beta10.01～1ug/mL、聚乙烯醇2.5～250mg/mL、α-酮戊二酸0.75～75ug/mL、脂多糖5～500ng/mL、重组纤连蛋白10～1000ug/mL、重组人血清白蛋白0.025～2.5g/mL、重组脱铁转铁蛋白0.75～75ug/mL、重组人胰岛素生长因子0.15～15ug/mL、氢化可的松0.025～2.5ug/mL。
[0009] 作为本发明的一种优先实施方案：所述添加组分各成分的含量：rhPDGF-BB 2ug/mL、rhFGF-b 1ug/mL、rhTGF-beta10.1ug/mL、聚乙烯醇25mg/mL、α-酮戊二酸7.5ug/mL、脂多糖50ng/mL、重组纤连蛋白100ug/mL、重组人血清白蛋白0.25g/mL、重组脱铁转铁蛋白7.5ug/mL、重组人胰岛素生长因子1.5ug/mL、氢化可的松0.25ug/L。
[0010] 作为本发明的一种优先实施方案：所述基础培养基与添加组分的体积比为100：0.5～4。
[0011] 作为本发明的一种优先实施方案：所述基础培养基与添加组分的体积比为50：1。
[0012] 作为本发明的一种优先实施方案：所述基础培养基为DMEM/F12。
[0013] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0014] 间充质干细胞化学成分限定无血清培养基用于脂肪、骨髓来源的间充质干细胞的培养的用途。
[0015] 作为本发明的一种优先实施方案：间充质干细胞化学成分限定无血清培养基用于人脂肪间充质干细胞培养的用途。
[0016] 本发明优点在于：
[0017] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0018] 本发明通过在基础培养基中添加rhPDGF-BB、rhFGF-b、rhTGF-beta1、聚乙烯醇、α-酮戊二酸、脂多糖、重组纤连蛋白、重组人白蛋白、重组脱铁转铁蛋白、重组人胰岛素生长因子、氢化可的松等多种营养因子替代血清功能，成分明确、稳定，排除了血清培养的不稳定性，同时各因子之间协同作用，能够高效的扩增脂肪间充质干细胞，缩短细胞周期，增殖迅速，3代次培养细胞产率达到血清培养2倍以上，而且细胞一致性好，能够高效的维持其生物学特性及分化潜能。细胞免疫表型分析说明：阳性标志物CD90和CD105表达率达98％以上；阴性标志物CD45表达率1％以下。细胞分化检测说明，以此培养基培养的脂肪间充质干细胞能够有效地维持其分化潜能，能够向软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞分化。通过本发明培养基获得的脂肪间充质干细胞适合于进一步的科学研究及临床应用研究。
[0019] 本发明的培养基通过在基础培养基中添加成分明确的添加组分，制备的化学成分限定无血清培养基具有高效、稳定、安全的优点，且适合大规模制备、培养脂肪间充质干细胞。
[0020] 本发明的培养基不含动物来源血清及动物来源蛋白成分，排除了动物源蛋白污染，排除异源蛋白可能引起的免疫反应，同时排除动物来源的细菌、病毒感染等风险。
[0021] 本发明的培养基不含人源提取蛋白成分，排除了人源提取物可能存在的诸如艾滋病、乙肝等传染性疾病的致病风险。
[0022] 本发明的培养基在细胞培养效果上能够接近或超过含胎牛血清培养基的水平，适用于无血清培养体系，培养基化学成分限定，更安全可控，同时成本低廉，打破进口培养基价格高昂，供应不及时，价格垄断等状况。附图说明
[0023] 图1(a)、(b)分别为人脂肪间充质干细胞在实施例1的化学成分限定无血清培养基和胎牛血清培养基培养条件下连续传代3次的细胞形态观测示意图；
[0024] 图2为人脂肪间充质干细胞在实施例1的化学成分限定无血清培养基和胎牛血清培养基培养条件下连续传代3次的细胞产率对比示意图；
[0025] 图3为人脂肪间充质干细胞在实施例1的化学成分限定无血清培养基培养条件下连续传代3次细胞标志物的检测结果示意图；
[0026] 图4为人脂肪间充质干细胞在实施例1的化学成分限定无血清培养基培养条件下连续传代3次细胞分化测试结果示意图。
具体实施方式
[0027] 正如背景技术中介绍的，如何获得高活性、高一致性、更安全的脂肪间充质干细胞，是间充质干细胞研究应用的重要课题。为了提高间充质干细胞体外培养质量，降低风险，需要研发高效的间充质干细胞化学成分限定无血清培养基，本发明通过在基础培养基中添加多种细胞生长因子，多种重组蛋白等成分，替代血清功能，以期实现无动物源成分，同时还能够高效的扩增间充质干细胞，并获得细胞一致性好，能有效维持其生物学特性及分化潜能，还减少血清培养带来的不稳定性，排除异源血清、人源提取蛋白成分等带来的生物安全风险等。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例提供的间充质干细胞化学成分限定无血清培养基由以下成分组成：基础培养基和添加组分，基础培养基为DMEM/F12，添加组分记为MAX1组分，MAX1组分和DMEM/F12的具体物质组成如下：
[0031] (1)MAX1组分中含有的组分及各组分的含量为(以MAX1组分的体积计)：
[0032]
[0033] (2)DMEM/F12组分中含有的组分(各种组分均可从Sigma、阿拉丁等试剂公司购得)及各组分含量为(以DMEM/F12组分的体积计)：
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] 本例中，基础培养基DMEM/F12，也可以直接从试剂公司购买。
[0039] 本例中，间充质干细胞化学成分限定无血清培养基以DMEM/F12与MAX1按体积比1000mL：20mL配制而成。
[0040] 实施例2
[0041] 本实施例提供实施例1的间充质干细胞化学成分限定无血清培养基的效果验证。
[0042] 本实施例的实验中采用人脂肪间充质干细胞，该细胞来源于ATCC标准细胞库(PCS-500-011，Lot 80622175，ATCC)，此细胞用于下述所有实验。
[0043] 一、实验方法
[0044] 1、细胞培养
[0046] 添加间充质干细胞化学成分限定无血清培养基及对照组含牛血清培养基(DMEM/F12培养基(Sigma,M2906)加入10％胎牛血清(ExCellBio，FND500))，进行连续培养，添加量约为15ml，每48～72h更换一次培养基，脂肪间充质干细胞生长至约85％丰度(约72～96h)时2
进行传代培养，同时记录细胞数。继代培养仍以8000/cm 密度接种于6孔细胞培养板，连续传代培养3次，每样本设置3个重复实验组。
进行传代培养，同时记录细胞数。继代培养仍以8000/cm 密度接种于6孔细胞培养板，连续传代培养3次，每样本设置3个重复实验组。
[0047] 实验设置2组，分别采用实施例1的间充质干细胞化学成分限定无血清培养基及对照组含牛血清培养基(DMEM/F12培养基(Sigma,M2906)加入10％胎牛血清(ExCellBio，FND500))。
[0048] 二、细胞鉴定
[0049] 1、检测脂肪间充质干细胞细胞形态及增殖效率
[0050] 按上述细胞培养的实验方法连续传代三次，同时追踪各代次细胞形态，如图1所示，结果显示，采用实施例1的化学成分限定无血清培养基的培养条件，连续传代三次，细胞形态均匀一致，符合脂肪间充质干细胞经典的长梭形形态。
[0051] 按上述细胞培养的实验方法连续传代三次，同时追踪各代次细胞产率，如图2所示，结果显示，采用实施例1的化学成分限定无血清培养基的培养条件，脂肪间充质干细胞在无血清条件下产率更高，传代三次达到血清培养2倍以上(如图2中Passage 3细胞总产量，达到血清培养2倍以上)。
[0052] 2、脂肪间充质干细胞细胞表面标志物检测
[0053] 脂肪间充质干细胞在实施例1的化学成分限定无血清培养基和胎牛血清培养基的培养条件下连续培养传代3次，以常规方法进行细胞免疫染色，通过细胞流式术进行标志物分析。
[0054] 细胞染色：阳性染色以APC/Cy7 anti-human CD90和PE anti-human CD105抗体染色；阴性以PerCP anti-human CD45进行染色；同时分别以对应的同型对照作为参照。
[0055] 使用BD FACSCanto II进行细胞流式术分析。
[0056] 检测结果参见图3所示，结果显示，采用本实施例1的无血清培养基培养的脂肪间充质干细胞能够很好的保证脂肪间充质干细胞的生物特性不改变，且无血清培养条件下阳性标志物CD90和CD105表达率达98％以上；阴性标志物CD45表达率1％以下。
[0057] 3、脂肪间充质干细胞细胞分化测试
[0058] 脂肪间充质干细胞在实施例1的化学成分限定无血清培养基培养条件下连续培养3代，然后分别成脂分化培养基(StemCell，05465)进行细胞分化培养，以常规方法进行细胞分化测试，以油红染色鉴定。
[0059] 细胞染色后结果如图4所示，结果显示，无血清培养条件下，脂肪间充质干细胞能够较好的保持干细胞向脂肪细胞分化的潜能。
[0060] 实施例3
[0061] 本实施例提供多种培养基的效果验证。本实施例的实验中采用人脂肪间充质干细胞，该细胞来源于ATCC标准细胞库(PCS-500-011，Lot 80622175，ATCC)，此细胞用于下述所有实验。
[0062] 一、实验方法
[0063] 1、培养基的配制：
[0064] 根据实施例1的技术方法配制以下培养基
[0065] 编号 培养基溶液体积配比(DMEM/F12与MAX1按体积比)M1 100:0.3
M2 100:0.5
M3 100:1
M4 100:2
M5 100:3
M6 100:4
M7 100:5
M2 100:0.5
M3 100:1
M4 100:2
M5 100:3
M6 100:4
M7 100:5
[0066] 二、实验方法和结果
[0067] 1、细胞培养
[0068] 人脂肪间充质干细胞，以8000/cm2密度接种于100mm细胞培养皿，实验所用细胞培养皿皆为康宁CellBinding表面处理培养板(Corning，3335)。按上述细胞培养的实验方法连续传代三次，同时追踪各代次细胞产率。
[0069] 实验设置8组，实验组分别采用M1，M2,M3,M4,M5,M6,M7，对照组培养基采用含牛血清培养基(参照实施例2)。
[0070] 添加以上培养基，进行连续培养，添加量约为15ml，每48～72h更换一次培养基，脂肪间充质干细胞生长至约85％丰度(约72～96h)时进行传代培养，同时记录细胞数。继代培养仍以8000/cm2密度接种于6孔细胞培养板，连续传代培养3次，每样本设置3个重复实验组。
[0071] 2、细胞鉴定
[0072] (1)、检测脂肪间充质干细胞细胞形态及增殖效率，参见实施例2。
[0073] 按上述细胞培养的实验方法连续传代三次，同时追踪各代次细胞形态。脂肪间充质干细胞在无血清条件下产率更高，传代三次达到血清培养2倍以上(其中M4组的Passage 3细胞总产量，达到血清培养2倍以上，见表1)。
[0074] (2)、脂肪间充质干细胞细胞表面标志物检测，参见实施例2。
[0075] 细胞染色：阳性染色以APC/Cy7 anti-human CD90和PE anti-human CD105抗体染色；阴性以PerCP anti-human CD45进行染色；同时分别以对应的同型对照作为参照。
[0076] 使用BD FACSCanto II进行细胞流式术分析。
[0077] 检测结果见表1，M2,M3,M4,M5，M6组条件下阳性标志物CD90和CD105表达率达95％以上；阴性标志物CD45表达率2％以下。
[0078] 表1：试验后数据表
[0079]
[0080]
[0081] M4配制方案优于M3配制方案。M3配制方案优于M2、M5、M6配制方案。M1、M7方案细胞增殖量较少，差于M2、M5、M6配制方案。
[0082] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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