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一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法

阅读：966发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于代谢组学技术领域，具体涉及一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法。本发明采用核磁共振技术检测二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后的尿液代谢物，通过多元统计分析方法发现二乙基亚硝胺致肝癌的生物标志物，复方苦参注射液对上述生物标志物均有回调，以此来实现复方苦参注射液治疗肝癌机制的识别及高通量分析。本发明要解决现有药理学评价方法单一，不能系统、全面地评价中药作用机制的问题。通过对生物标志物进行通路分析，可更全面、高效、快速的从整体水平无偏向性的综合评价复方苦参注射液治疗肝癌作用机制，为中药代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。，下面是一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法，其特征在于：采用核磁共振技术检测二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物；对获得的1H-NMR图谱进行代谢轮廓分析，获得数据集；对数据集利用多元变量统计分析方法筛选出具有治疗肝癌作用的潜在尿液生物标志物，利用复方苦参注射液对生物标志物含量的回调变化来实现复方苦参注射液治疗肝癌作用机制的识别及高通量分析；通过对生物标志物进行通路富集分析，筛选出复方苦参注射液治疗肝癌的主要代谢通路。
2.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述二乙基亚硝胺致肝癌大鼠模型的构建方法为：将大鼠随机分为空白对照组与二乙基亚硝胺致肝癌模型组，肝癌模型组大鼠自由饮用60mg/L由灭菌水配置的二乙基亚硝胺溶液，每天按照饮用情况更换，建立肝癌大鼠模型。
3.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述复方苦参注射液干预二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的具体方法为：对造模成功的肝癌大鼠按随机原则分为模型组和复方苦参注射液治疗组，每组10只大鼠，复方苦参注射液治疗组按2mL/kg尾静脉注射给药，空白对照组和模型组注射相同体积质量浓度为0.9％的氯化钠溶液，连续三周。
4.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述采用核磁共振技术检测干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物之前需对尿液代谢物进行处理，具体方法为：尿液代谢物中尿液的保存：在给药结束后收集各组大鼠的尿液样本，-80℃储存；尿液代谢物中尿液的前处理：4℃解冻尿液样本，取
500μL尿液样品加入200μL 磷酸盐缓冲液，0.2M NaH2PO4/NaHPO4，10％D2O，0.01％TSP，pH＝
7.4，涡旋，于4℃，13000r/min离心10min，取600μL上清液用于核磁测定。
5.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述采用核磁共振技术检测二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物的条件如下：样品于25℃600MHz NMR仪上测定，采用NOE-2D Spectroscopy脉冲序列；测定频率为600.13MHz，扫描次数为64，谱宽12
345.7Hz，脉冲时间14s，采样时间2.654s，延迟时间1.0s，采样数据点65 536，FID分辨率
0.188Hz，采样间隔40.5s，内标为TSP。
6.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述对获得的1H-NMR图谱数据进行代谢轮廓分析，获得数据集的具体过程为：采用核磁图谱专业处理软件对NMR进行傅里叶转换，并进行手动相位，基线校正后，对所有图谱中以TSP校准化学位移，以δ0.01对化学位移区间δ0.30-9.50进行分段积分，排除δ
4.70-5.00区域的水峰不进行积分，并将积分数据进行归一化；最终导出积分数据矩阵。
7.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述对数据集利用多元变量统计分析方法筛选出具有治疗肝癌作用的潜在尿液生物标志物的方法：积分数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行生物标志物的寻找：
对空白对照组与二乙基亚硝胺致肝癌模型组尿液代谢轮廓数据进行偏最小二乘法判别分析和正交偏最小二乘法判别分析，对OPLS-DA结果进行分析，得到VIP值，选出VIP＞1的代谢产物，依据S-plot图并结合独立样本t检验p＜0.05筛选出生物标志物。
8.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：利用复方苦参注射液对生物标志物含量的回调变化的具体方法为：对筛选出的生物标志物含量变化分析，得到21个潜在生物标志物，这21个潜在标志物含量在肝癌大鼠模型组中均降低，经复方苦参注射液治疗后含量升高，且复方苦参注射液对标志物异亮氨酸、甲基丙二酸、N-乙酰糖蛋白和肌酸含量有显著的回调作用。
9.根据权利要求8所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述21个潜在生物标志物具体为：丁酸、α-羟基丁酸、泛酸、异亮氨酸、3-羟基丁酸、甲基丙二酸、乳酸、2-羟基异丁酸、丙氨酸、瓜氨酸、醋酸、N-乙酰糖蛋白、丙酮、丙酮酸、琥珀酸、甲胺、二甲基甘氨酸、丙二酸二乙酯、牛磺酸、甘氨酸和肌酸。
10.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述通路富集分析的具体方法为：将复方苦参注射液显著回调的潜在生物标志物导入MetaboAnalyst、KEGG数据库分析潜在生物标志物的相关代谢通路，依据代谢通路分析所得影响值大小、代谢通路的p值和通路重要值，确定精氨酸和脯氨酸代谢与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解这两条代谢通路为复方苦参注射液治疗肝癌的重要代谢通路，参与了复方苦参注射液治疗肝癌的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了复方苦参注射液治疗肝癌的作用机制。

说明书全文

一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法

技术领域

[0001] 本发明属于代谢组学技术领域，具体涉及一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法。

背景技术

[0002] 代谢组学是对病理、生理刺激或基因改变时生物体系的动态代谢响应所进行的多参数定量分析，可通过揭示新陈代谢过程中代谢产物的变化规律，全面理解病理变化过程及机体内物质的代谢途径，现已被广泛应用于生物学和医学相关领域，如疾病诊断、药物作用机制和毒理学研究等多个方面。代谢组学研究药物引起机体内源性代谢物的整体和系统性变化规律，可直接反映体内生化过程和状态的整体轮廓，与中药研究的整体观和系统观不谋而合。目前代谢组学已经用于各类疾病病理机制和药物作用机制的研究。核磁共振(NMR)、气相色谱-质谱(GS/MS)联用、液相色谱-质谱(LC/MS)联用是三种常用的代谢组学分析技术。

[0003] 原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，目前占全世界肿瘤死亡原因的第三位，已经成为严重危害人类生命健康、制约社会经济发展的一大类疾病，且发病率呈逐年上升趋势。中药防治恶性肿瘤在缓解临床症状、提高生活质量、预防复发转移、延长生存期等方面具有良好的疗效。复方苦参注射液(Compound Kushen Injection，CKI)又名岩舒注射液，是由苦参和白土苓两味药提取精制而成的纯中药制剂，具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛等功效。现代临床和药理研究均表明，复方苦参注射液对消化系统肿瘤中的肝癌效果显著，且毒副作用小。然而，复方苦参注射液治疗肝癌的作用机制仍不甚清楚。因此，一种能够明确该药物作用机制的方法亟待研究。

发明内容

[0004] 针对现有药理学方法不能完整、全面阐释中药复方苦参注射液治疗肝癌作用机制难点的问题本发明提供了一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法。

[0005] 为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

[0006] 一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法：采用核磁共振技术检测二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物；对获得的1H-NMR图谱进行代谢轮廓分析，获得数据集；对数据集利用多元变量统计分析方法筛选出具有治疗肝癌作用的潜在尿液生物标志物，利用复方苦参注射液对生物标志物含量的回调变化来实现复方苦参注射液治疗肝癌作用机制的识别及高通量分析；通过对生物标志物进行通路富集分析，筛选出复方苦参注射液治疗肝癌的主要代谢通路。本方案从整体水平全面、快速、高效综合的评价了复方苦参注射液抗肝癌的作用机制。

[0007] 进一步，所述二乙基亚硝胺致肝癌大鼠模型的构建方法为：将大鼠随机分为空白对照组与二乙基亚硝胺致肝癌模型组，肝癌模型组大鼠自由饮用60mg/L由灭菌水配置的二乙基亚硝胺溶液，每天按照饮用情况更换，建立肝癌大鼠模型。本方案所构建的二乙基亚硝胺致肝癌大鼠模型具有与人相象的病变过程及病理学变化特征，同时具有人肝癌相似的影像学表现，是一种研究人类肝癌的理想动物模型。

[0008] 进一步，所述复方苦参注射液干预二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的具体方法为：对造模成功的肝癌大鼠按随机原则分为模型组和复方苦参注射液治疗组，每组10只大鼠，复方苦参注射液治疗组按2mL/kg尾静脉注射给药，空白对照组和模型组注射相同体积质量浓度为0.9％的氯化钠溶液，连续三周。

[0009] 进一步，所述采用核磁共振技术检测干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物之前需对尿液代谢物进行处理，具体方法为：尿液代谢物中尿液的保存：在给药结束后收集各组大鼠的尿液样本，-80℃储存；尿液代谢物中尿液的前处理：4℃解冻尿液样本，取500μL尿液样品加入200μL 磷酸盐缓冲液，0.2M NaH2PO4/NaHPO4，10％D2O，0.01％TSP，pH＝7.4，涡旋，于4℃，13000r/min离心10min，取600μL上清液用于核磁测定。

[0010] 进一步，所述采用核磁共振技术检测二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物的条件如下：样品于25℃600MHz NMR仪上测定，采用2D-NOSEY脉冲序列；测定频率为600.13MHz，扫描次数为64，谱宽12 345.7Hz，脉冲时间14s，采样时间2.654s，延迟时间1.0s，采样数据点65 536，FID分辨率0.188Hz，采样间隔40.5s，内标为TSP。

[0011] 进一步，所述对获得的1H-NMR图谱数据进行代谢轮廓分析，获得数据集的具体过程为：采用核磁图谱专业处理软件对NMR进行傅里叶转换，并进行手动相位，基线校正后，对所有图谱中以TSP校准化学位移，以δ0.01对化学位移区间δ0.30-9.50进行分段积分，排除δ4.70-5.00区域的水峰不进行积分，并将积分数据进行归一化；最终导出积分数据矩阵。

[0012] 进一步，所述对数据集利用多元变量统计分析方法筛选出具有治疗肝癌作用的潜在尿液生物标志物的方法：积分数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行生物标志物的寻找：对空白对照组与二乙基亚硝胺致肝癌模型组尿液代谢轮廓数据进行偏最小二乘法判别分析(Partial least square discriminate analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal signal correction-partial least square discriminate analysis,OPLS-DA)，对OPLS-DA结果进行分析，得到VIP值，选出VIP＞1的代谢产物，依据S-plot图并结合独立样本t检验p＜0.05筛选出生物标志物。

[0013] 进一步，利用复方苦参注射液对生物标志物含量的回调变化的具体方法为：对筛选出的生物标志物含量变化分析，得到21个潜在生物标志物，这21个潜在标志物含量在肝癌大鼠模型组中均降低，经复方苦参注射液治疗后含量升高，且复方苦参注射液对标志物异亮氨酸、甲基丙二酸、N-乙酰糖蛋白和肌酸含量有显著的回调作用。

[0014] 再进一步，所述21个潜在生物标志物具体为：丁酸、α-羟基丁酸、泛酸、异亮氨酸、3-羟基丁酸、甲基丙二酸、乳酸、2-羟基异丁酸、丙氨酸、瓜氨酸、醋酸、N-乙酰糖蛋白、丙酮、丙酮酸、琥珀酸、甲胺、二甲基甘氨酸、丙二酸二乙酯、牛磺酸、甘氨酸和肌酸。

[0015] 进一步，所述通路富集分析的具体方法为：将复方苦参注射液显著回调的潜在生物标志物导入MetaboAnalyst、KEGG数据库分析潜在生物标志物的相关代谢通路，依据代谢通路分析所得影响值大小、代谢通路的p值和通路重要值，确定精氨酸和脯氨酸代谢与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解这两条代谢通路为复方苦参注射液治疗肝癌的重要代谢通路，参与了复方苦参注射液治疗肝癌的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了复方苦参注射液治疗肝癌的作用机制。

[0016] 本发明的有益效果是：

[0017] 本发明基于代谢组学技术结合多元统计方法对肝癌大鼠尿液代谢产物进行分析，发现复方苦参注射液治疗肝癌调节的尿液潜在生物标志物。通过对潜在标志物进行代谢通路分析，得到复方苦参注射液治疗肝癌的代谢通路。本发明从整体水平全面、快速、高效综合评价复方苦参注射液治疗肝癌的作用机制，为中药的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。

[0018] 本发明基于UPLC-Q-TOF/MS技术和代谢组学研究方法，对高脂血症大鼠尿液代谢物进行检测，通过代谢组学研究方法寻找差异代谢物，通过筛选排除机制，获得13种具有降脂作用机制的特异性生物标记物，利用生物标记物含量的回调变化来实现对降脂作用机制的识别及高通量分析；通过MetaboAnalyst在线分析软件对差异代谢物进行通路分析，可从整体水平综合评价广陈皮降脂作用机制，为中药的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。附图说明

[0019] 图1大鼠尿液1H-NMR代谢物指纹图谱；

[0020] 图2空白和模型组大鼠尿液PLS-DA得分图；

[0021] 图3空白和模型组大鼠尿液OPLS-DA得分图；

[0022] 图4空白和模型组大鼠尿液S-plot图；

[0023] 图5代谢通路富集图。

具体实施方式

[0024] 实施例1

[0025] 为了对本发明进行更进一步的详细描述，给出以下具体实施例，但仅作为阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0026] 本发明方法的具体实现过程如下：

[0027] 一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法，采用核磁共振技术对二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后的尿液代谢物进行检测，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出4个复方苦参注射液治疗肝癌的潜在尿液标志物，利用metaboanalyst在线分析软件筛选出复方苦参注射液治疗肝癌的两条代谢通路。

[0028] 获得复方苦参注射液治疗肝癌的尿液潜在标志物代谢通路的具体操作步骤如下：

[0029] 1.动物模型的制备：

[0030] 将大鼠随机分为空白对照组与二乙基亚硝胺致肝癌模型组，肝癌模型组大鼠自由饮用60mg/L的二乙基亚硝胺溶液(由灭菌水配置)，每天按照饮用情况更换，建立原发性肝癌大鼠模型；造模成功的肝癌大鼠按随机原则分为模型组和复方苦参注射液治疗组，每组10只大鼠，复方苦参注射液治疗组按2mL/kg尾静脉注射给药，空白对照组和模型组注射相同体积质量浓度为0.9％的氯化钠溶液，连续三周。

[0031] 2.大鼠尿液的保存和前处理：

[0032] 尿液的保存：在给药结束后收集各组大鼠的尿液样本，储存于-80℃冰箱中；尿液的前处理：4℃解冻尿液样本，取500μL尿液样品中加入200μL磷酸盐缓冲液(0.2M NaH2PO4/NaHPO4，10％D2O，0.01％TSP，pH＝7.4)，涡旋，于4℃，13000r/min离心10min，上清液600μL用于核磁测定。

[0033] 3.核磁共振检测：

[0034] 样品于600MHz NMR(25℃)仪上测定，采用2D-NOSEY脉冲序列。测定频率为600.13MHz，扫描次数为64，谱宽12 345.7Hz，脉冲时间14s，采样时间2.654s，延迟时间
1.0s，采样数据点65 536，FID分辨率0.188Hz，采样间隔40.5s，内标为TSP。

[0035] 4.核磁共振图谱数据预处理：

[0036] 采用核磁图谱专业处理软件对NMR图谱进行傅里叶转换，并进行手动相位，基线校正后，对所有图谱中以TSP校准化学位移(图1)，以δ0.01对化学位移区间δ0.30-9.50进行分段积分，排除δ4.70-5.00区域的水峰不进行积分，并将积分数据进行归一化，最终导出积分数据矩阵。

[0037] 5.利用多元变量统计分析并筛选潜在差异代谢物：

[0038] 将上述所得的数据矩阵，导入SIMCA-P软件寻找生物标志物：对空白对照组与二乙基亚硝胺致肝癌模型组尿液代谢轮廓数据进行偏最小二乘法判别分析(Partial least square discriminate analysis,PLS-DA)(图2)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal signal correction-partial least square discriminate analysis,OPLS-DA)(图3)，对OPLS-DA结果进行分析，得到VIP值，选出VIP＞1的代谢产物，依据S-plot图(图4)并结合独立样本t检验p＜0.05筛选出生物标志物。

[0039] 6.生物标志物的含量变化分析：

[0040] 对上述筛选出的生物标志物含量变化分析，得到21个潜在生物标志物：其中丁酸、α-羟基丁酸、泛酸、异亮氨酸、3-羟基丁酸、甲基丙二酸、乳酸、2-羟基异丁酸、丙氨酸、瓜氨酸、醋酸、N-乙酰糖蛋白、丙酮、丙酮酸、琥珀酸、甲胺、二甲基甘氨酸、丙二酸二乙酯、牛磺酸、甘氨酸和肌酸这21个潜在标志物含量在肝癌大鼠模型组中均降低，经复方苦参注射液治疗后含量升高，且复方苦参注射液对标志物异亮氨酸、甲基丙二酸、N-乙酰糖蛋白和肌酸含量有显著的回调作用。

[0041] 7.代谢通路分析：

[0042] 将4个复方苦参注射液显著回调的潜在生物标志物导入MetaboAnalyst、KEGG数据库构建分析疾病相关代谢通路(图5)，通过代谢通路分析后所得影响值大小，依据代谢通路的p值和通路重要值，确定精氨酸和脯氨酸代谢和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解这两条代谢通路为复方苦参注射液治疗肝癌的重要代谢通路，参与了复方苦参注射液治疗肝癌的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了复方苦参注射液治疗肝癌的作用机制。

[0043] 本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。

[0044] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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