一种利用甲醛还原NAD类似物的方法
阅读：369发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种利用甲醛还原NAD类似物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用甲 醛 还原NAD类似物的方法及其应用。该方法以甲醛脱氢酶为催化剂，以NAD类似物为 电子 受体，将甲醛特异性 氧 化成 甲酸 ，起到解毒作用，同时将NAD类似物转化为其还原态。该方法可用于生产还原态的NAD类似物，为消耗还原态NAD类似物的酶促反应提供还原 力 ，应用于苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、酿酒 酵母 醇脱氢酶等酶催化的还原反应，有利于NAD类似物的广泛应用。该方法也可在胞内或胞外的复杂反应体系中以NAD类似物为电子受体，以甲醛脱氢酶为催化剂特异性氧化甲醛，实现解毒作用，同时不干扰体系中其他反应的正常进行。，下面是一种利用甲醛还原NAD类似物的方法专利的具体信息内容。
1.一种NAD类似物的的还原方法，其特征在于：以NAD类似物为介导物，在可利用甲醛的酶催化下，以甲醛为还原剂，在pH 5-8的缓冲体系中，10-40℃下，反应2-120min，获得甲醛氧化产物甲酸，同时获得还原型NAD类似物。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述可利用甲醛的酶以甲醛为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述甲醛底物为甲醛、氘代甲醛中的一种或两种的任意比组合。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征还在于：所还原的NAD类似物为NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD中的一种或两种以上，它们的化学结构如下：
5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征还在于：所述可利用甲醛的酶为经过基因工程改造的甲醛脱氢酶突变体，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S，pFADH-A192S/A261N，pFADH-A192T/R267N，pFADH-P220C，pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-H270S，aFADH-G264S/A267L，aFADH-V219K/G264S，aFADH-V283I/V219R，aFADH-H270S，aFADH-G298V或aFADH-V263S/E266C中的一种或两种以上。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征还在于：当所用NAD类似物为NCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S，aFADH-H270S或aFADH-G264S/A267L中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NFCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-H270S，aFADH-G264S/A267L或aFADH-V219K/G264S中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NClCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192T/R267N，pFADH-P220C或aFADH-V263S/E266C中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NBrCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为aFADH-V219K/G264S，aFADH-V283I/V219R或aFADH-G298V中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NMeCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为aFADH-H270S，aFADH-G264S/A267L或aFADH-V283I/V219中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NUD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-V219K/G264S或aFADH-V283I/V219R中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NTD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-V219K/G264S或aFADH-V263S/E266C中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NGD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-H270S，aFADH-V219K/G264S或aFADH-V283I/V219R中的一种或两种以上。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征还在于：所述甲醛氧化的产物为甲酸、氘代甲酸的一种或两种的任意比组合。
8.按照权利要求1所述的酶催化氧化甲醛的方法，其特征还在于：缓冲体系中甲醛脱氢酶的终浓度为4μg/mL-1500μg/mL、NAD类似物的终浓度为0.01mM-20mM、甲醛的终浓度为
0.4mM-100mM；所述的缓冲体系包括但不限于磷酸缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液或PIPES缓冲液中的一种或两种以上。
9.按照权利要求1所述的酶催化氧化甲醛方法，其特征还在于：所述NAD类似物还原得到的还原态产物，可被其他酶用作辅酶应用于还原反应，所述其他酶包括但不局限于下述中的一种或二种以上：催化丙酮酸还原为苹果酸的苹果酸酶ME-L310R/Q401C，催化丙酮酸还原为乳酸的乳酸脱氢酶DLDH-V152R，催化乙醛还原为乙醇的酿酒酵母醇脱氢酶，催化二乙酰还原为羟基丁酮的羟基丁酮脱氢酶，催化D-木糖还原为木糖醇的D-木糖脱氢酶；
反应采用pH 5-8的缓冲体系，反应温度10-40℃。
10.按照权利要求1所述的酶催化氧化甲醛方法，其特征还在于：所述甲醛脱氢酶可用带有NAD类似物转运子、表达甲醛脱氢酶的微生物细胞代替，在上述缓冲体系添加微生物细胞、NAD类似物和甲醛，生成还原型NAD类似物；所述微生物细胞包括但不局限于下述中的一种或二种以上：原核微生物，如大肠杆菌，乳酸乳球菌或真核微生物，如酿酒酵母、红酵母或里氏木霉。
一种利用甲醛还原NAD类似物的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物的酶催化还原方法及其应用，具体地说，是以NAD类似物为电子受体，在酶催化下将甲醛特异性氧化成低毒性的甲酸，同时生成的还原态NAD类似物可被其他酶用做辅酶应用于还原反应。
背景技术
[0002] 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态NADH是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的氧化还原代谢及其他一系列重要生物化学过程。由于NADH可被代谢网络中多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。使用NAD类似物传递还原力时，由于类似物只能被突变型氧化还原酶识别，从而在辅酶水平对目标氧化还原过程进行特异性调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；Wang L,et al.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。目前已经报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD)、烟酰胺5-氯胞嘧啶二核苷酸(NClCD)、烟酰胺5-溴胞嘧啶二核苷酸(NBrCD)和烟酰胺5-甲基胞嘧啶二核苷酸(NMeCD)(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；
Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，Genbank CAA68326)L6R突变体。
Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，Genbank CAA68326)L6R突变体。
[0003] 甲醛具有强还原性，能与DNA、RNA和蛋白质的亲核基团形成交联结构从而造成蛋白或核酸损伤(Woolston BM,et al.Biotechnol Bioeng,2018,115,206-215)。而甲醛的下游产物甲酸相对甲醛来说对细胞的毒性较小，利用甲醛脱氢酶对NAD类似物还原的同时能实现对甲醛的解毒作用。以NAD为辅酶将甲醛氧化为甲酸的酶分为两类，第一类甲醛脱氢酶(EC 1.2.1.1)依赖于谷胱甘肽，在甲醛和谷胱甘肽存在时，能自发生成甲醛脱氢酶的底物S-羟甲基谷胱甘肽，经甲醛脱氢酶催化生成的S-甲酰基谷胱甘肽被S-甲酰基谷胱甘肽水解酶(EC 3.1.2.12)不可逆地水解为谷胱甘肽和甲酸(BARBER RD,et al.J Bacteriol,1996,178,1386-1393)。第二类甲醛脱氢酶能直接利用甲醛和NAD+，生成甲酸和NADH。来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的甲醛脱氢酶是已鉴定的仅有的不依赖于谷胱甘肽的甲醛脱氢酶，催化甲醛的不可逆氧化(Zhang W,et al.Protein Expres Purif,2013,92,208-213；ITO K,et al.J Bacteriol,1994,176,
2483-2491)。采用不依赖于谷胱甘肽的甲醛脱氢酶可使反应简单化，使甲醛直接、不可逆地转化成甲酸，同时将还原力储存在NADH中，因此来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的甲醛脱氢酶pFADH和来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的甲醛脱氢酶aFADH在NAD类似物的还原和甲醛直接氧化的生物正交解毒体系中占有绝对优势。
2483-2491)。采用不依赖于谷胱甘肽的甲醛脱氢酶可使反应简单化，使甲醛直接、不可逆地转化成甲酸，同时将还原力储存在NADH中，因此来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的甲醛脱氢酶pFADH和来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的甲醛脱氢酶aFADH在NAD类似物的还原和甲醛直接氧化的生物正交解毒体系中占有绝对优势。
[0004] 目前通过生物正交的酶催化氧化体系氧化甲醛的文献尚未报道，尚未有研究通过改造甲醛脱氢酶的结构来实现NAD类似物的还原。利用NAD类似物及可识别它们的甲醛脱氢酶或其突变体，可以构建生物正交的酶催化氧化甲醛的反应体系。在细胞或粗酶液反应体系中，以可利用NAD类似物的甲醛脱氢酶为催化剂，在生成还原型NAD类似物的同时，可以将甲醛特异性氧化成甲酸，从而解除甲醛对细胞或反应体系中其他成分的毒性。同时，由于该反应特异性识别并利用NAD类似物，不会干扰体系中其他以NAD为辅因子的反应，可真正实现甲醛氧化的生物正交性。此外，反应生成的还原态NAD类似物可以用于依赖于还原性NAD类似物的酶反应中，例如催化丙酮酸还原为苹果酸的苹果酸酶ME-L310R/Q401C(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862)、催化丙酮酸还原为乳酸的乳酸脱氢酶DLDH-V152R等(Wang L,et al.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。因此，将甲醛的氧化和NAD类似物的利用结合的酶催化氧化方法，不仅实现了甲醛毒性的解除，同时也在酶学水平构建了独立于复杂反应体系的生物正交代谢途径，对一碳代谢途径的研究具有指导意义。
发明内容
[0005] 本发明涉及一种利用甲醛还原NAD类似物的方法，具体来说，是以甲醛为还原剂，以可利用甲醛的酶为催化剂，以NAD类似物为电子受体，生成的还原态的NAD类似物可作为其他氧化还原酶的辅酶，用于还原反应。同时将甲醛特异性氧化成毒性较低的甲酸，实现解毒作用。因此，本发明的方法可应用在生物催化和生物转化领域，具有重要价值。
[0006] 本发明涉及一种利用甲醛还原NAD类似物的方法，其特征在于：以甲醛为还原剂，以NAD类似物为电子受体，以可利用甲醛的酶为催化剂，在pH 5-8的缓冲体系中，10-40℃下，反应2-120min，生成毒性较低的甲酸。
[0007] NAD类似物包括NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(NGD)、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)和烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，他们具有如下的化学结构：
[0008]
[0009] 本发明涉及的NAD类似物参照文献方法(Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296-300)制备。
[0010] 本发明使用的甲醛脱氢酶为具有以甲醛为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。这些酶为来源于Pseudomonas putida的甲醛脱氢酶pFADH(PDB ID 1KOL，https：//www.rcsb.org/structure/1KOL)或来源于Pseudomonas aeruginosa的甲醛脱氢酶aFADH(PDB ID 4JLW，https：//www.rcsb.org/structure/4JLW)的突变体。如甲醛脱氢酶pFADH的突变体pFADH-A192S(pFADH-A192S代表甲醛脱氢酶pFADH的第192位氨基酸由A变为S，其他同理)、pFADH-A192S/A261N、pFADH-A192T/R267N、pFADH-P220C、pFADH-A192S/R267Q/V282K，甲醛脱氢酶aFADH的突变体aFADH-H270S、aFADH-G264S/A267L、aFADH-V219K/G264S、aFADH-V283I/V219R、aFADH-G298V、aFADH-V263S/E266C中的一种或两种以上。这些酶的表达和纯化参照在大肠杆菌中表达其他氧化还原酶的文献方法进行(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862)。
[0011] 本发明涉及的NAD类似物和NAD一样含有烟酰胺单核苷酸单元，该单元的还原态为1,4-二氢烟酰胺单核苷酸。因此，NAD类似物还原态产物在340nm附近的紫外光谱区有较强-1 -1
吸收，摩尔消光系数ε340约为6220M ·cm (Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems depending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc.2011,133,20857-20862)。本发明利用该性质分析NAD类似物还原过程。利用液相色谱定量NAD类似物及其还原态产物的条件为：液相色谱仪为Agilent 1100，分析柱为Zorbax
150mm×3.0mm(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁胺，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。
检测波长为260nm(辅因子及其还原态在260nm有较强的光吸收)和340nm(还原态辅酶在
340nm有较强的光吸收)。
吸收，摩尔消光系数ε340约为6220M ·cm (Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems depending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc.2011,133,20857-20862)。本发明利用该性质分析NAD类似物还原过程。利用液相色谱定量NAD类似物及其还原态产物的条件为：液相色谱仪为Agilent 1100，分析柱为Zorbax
150mm×3.0mm(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁胺，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。
检测波长为260nm(辅因子及其还原态在260nm有较强的光吸收)和340nm(还原态辅酶在
340nm有较强的光吸收)。
[0012] 所用底物甲醛为甲醛、氘代甲醛中的一种或者两种的组合。
[0013] 制备的NAD类似物还原态产物，可被其他酶用作辅酶，应用于还原反应。同时，该反应生成毒性较低的甲酸，起到解毒作用。因此，本发明可视为NAD类似物还原态再生和甲醛氧化解毒技术的结合。通过本发明的技术，将甲醛的还原力转移并贮存在NAD类似物还原态中，以便于对其他底物进行选择性还原，同时解除甲醛对细胞的毒性，使细胞的生理生化条件受到最小程度的干扰。
[0014] 所用缓冲体系中甲醛脱氢酶的终浓度为4μg/mL-1500μg/mL(优选100μg/mL-1000μg/mL，再优选100μg/mL-800μg/mL)，NAD类似物的终浓度为0.01mM-20mM(优选0.1mM-15mM，再优选1mM-15mM)，甲醛的终浓度为0.4mM-100mM(优选10mM-100mM，再优选10mM-70mM)，所述的缓冲体系包括但不限于磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，PIPES缓冲液中的一种或两种以上。
[0015] 利用所述甲醛脱氢酶还原NAD类似物，为包括但不局限于ME-L310R/Q401C，DLDH-V152R或酿酒酵母醇脱氢酶提供还原型辅酶时，采用pH 5-8的缓冲体系，反应温度10-40℃。
[0016] 所述可利用甲醛化合物的酶表达在微生物的细胞内，NAD类似物可通过NAD转运蛋白AtNDT2(Accession NO.NC_003070)或NTT4(Haferkamp I,et al.Nature,2004,432,622-625.)转入胞内；甲醛渗透进入细胞，NAD类似物还原反应在细胞内进行。
[0017] 所述表达甲醛脱氢酶并用于胞内还原NAD类似物的微生物细胞包括但不局限于原核微生物，如大肠杆菌，乳酸乳球菌等或真核微生物，如酿酒酵母等。
[0018] 本发明的优点和有益效果：利用本发明的方法，一方面甲醛氧化生成还原态NAD类似物，可以与其他酶如催化丙酮酸还原为苹果酸的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、催化丙酮酸还原为乳酸的乳酸脱氢酶DLDH-V152R等偶联，实现还原力的循环利用。另一方面，可以构建甲醛解毒的生物正交反应，实现甲醛到甲酸的特异性调控。
具体实施方式
[0019] 以下实施例将有助于本领域普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0020] 对比例1：无酶条件下甲醛与NAD类似物的反应
[0021] NAD类似物(NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD)参照文献方法(Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296-300)制备。NAD类似物用水制成浓度为20mM的溶液，备用。
[0022] 将1mM的NAD类似物底物和4mM的甲醛溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，混匀，30℃反应2h，取20μL分析。
[0023] 用HPLC检测NAD类似物底物及其还原态产物。液相色谱仪为Agilent1100，分析柱为Zorbax 150mm×3.0mm(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁胺，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。检测波长为260nm(辅因子及其还原态在260nm有较强吸收)和340nm(还原态辅酶在340nm有较强的光吸收)。
[0024] 分析发现，所有反应的样品在340nm没有特征峰，在260nm仅检测到与NAD类似物保留时间相同的特征峰。说明在无酶条件下甲醛不能直接还原NAD类似物。
[0025] 对比例2：酶失活条件下甲醛与NAD类似物的反应
[0026] 将来源于Pseudomonas putida的甲醛脱氢酶pFADH(PDB 1KOL)在98℃水浴加热60min，备用。参考文献测定NADH的方法(Guo Q,et al.Biochemistry,2016,55,2760-
2771)，以NAD为底物，检测表明样品失去了催化还原NAD为NADH的活性。
2771)，以NAD为底物，检测表明样品失去了催化还原NAD为NADH的活性。
[0027] 将NAD类似物NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD，逐一按照下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM甲醛和80μg灭活的甲醛脱氢酶pFADH溶解在1mL浓度50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中混匀，30℃反应2h，取20μL分析。
[0028] 按对比例1的方法分析发现，所有反应的样品在340nm没有特征峰，在260nm仅检测到与NAD类似物保留时间相同的特征峰。说明加热灭活的酶不能催化甲醛还原NAD类似物。
[0029] 实施例1：以甲醛为还原剂，甲醛脱氢酶催化还原NAD类似物
[0030] 将NAD及其类似物NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD或NUD，与甲醛脱氢酶pFADH、pFADH-A192S、pFADH-A192S/A261N、pFADH-A192T/R267N、pFADH-P220C、pFADH-A192S/R267Q/V282K、aFADH、aFADH-H270S、aFADH-G264S/A267L、aFADH-V219K/G264S、aFADH-V283I/V219R、aFADH-G298V、aFADH-V263S/E266C逐一进行NAD类似物-甲醛脱氢酶组合，按下述方法进行反应：将1mM的NAD或类似物、4mM的甲醛和80μg的甲醛脱氢酶溶解在1mL浓度50mM，pH 7.5的HEPES缓冲液中混匀，30℃反应20min，取20μL分析。
[0031] 按对比例1的分析方法分析发现，所用样品在340nm均出现了特征吸收峰，但不同组合得到的吸收峰强度有明显差别，说明甲醛脱氢酶可以催化甲醛还原NAD类似物。由于NAD类似物还原态产物的摩尔消光系数ε340约为6220M-1·cm-1，与NADH相同，用NADH标准品绘制曲线，得到定量结果(表1)。可见，pFADH的催化活性整体较低，其他几种甲醛脱氢酶具有较好的活性。可依据不同的NAD类似物，选择合适的甲醛脱氢酶。
[0032] 实施例1的结果表明，甲醛脱氢酶可以有效催化甲醛还原本发明涉及的NAD类似物，制备相应的还原态产物。综合实施例1、对比例1和对比例2的结果说明，以甲醛为还原剂，还原NAD类似物，活性甲醛脱氢酶起到了不可替代的作用。
[0033] 表1甲醛脱氢酶催化甲醛还原NAD及其类似物的实验结果
[0034]
[0035]
[0036] 实施例2：还原态NAD类似物的制备
[0037] 将实施例1的反应体系放大，可用于制备还原态NAD类似物。以NUDH为例，说明制备过程。将20mM的NUD、25mM的甲醛和5mg的甲醛脱氢酶pFADH-A192S溶解在10mL浓度为50mM，pH为7.5的磷酸钠缓冲液中混匀，30℃反应80min。反应结束后直接冷冻干燥，浓缩至总体积约为4mL，用甲酸型阴离子交换树脂柱分离，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末5.6mg，产率约44％。
[0038] 将上述白色粉末样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)+为643.1026，与NUDH的理论分子量(C20H29N4O16P2+，643.1054)一致，表明得到了还原态产物NUDH。
[0039] 按照实施例2的方法用相同用量的NUD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R生产NAD类似物，得到了还原态的NUDH，产率约35％。说明甲醛脱氢酶pFADH-A192S与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R均能催化相应的底物生产NAD类似物，且产率接近。
[0040] 实施例3：以甲醛为还原剂，甲醛脱氢酶催化还原NAD类似物
[0041] 将0.1mM的NBrCD、0.4mM的甲醛和80μg甲醛脱氢酶pFADH-A192S/A261N溶解在1mL浓度为50mM，pH 8.0的PIPES缓冲液中混匀，40℃反应3min，取20μL分析。
[0042] 按对比例1的方法分析发现，样品在340nm出现了特征吸收峰。生成的NBrCDH浓度达到60μM，即产率达到60％。
[0043] 综合实施例1和实施例3的结果表明，甲醛脱氢酶催化还原NAD类似物的反应中，采用甲醛为还原剂，可使NAD类似物还原。
[0044] 按照实施例3的方法用相同用量的NBrCD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R生产NAD类似物，生成的NBrCDH浓度达到43μM，即产率达到43％。说明甲醛脱氢酶pFADH-A192S/A261N与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R均能催化相应的底物生产NAD类似物，甲醛脱氢酶BsMDH-Y171G催化的反应产率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R。
[0045] 实施例4：以氘代甲醛为还原剂，甲醛脱氢酶催化还原NAD类似物
[0046] 将1mM的NCD、4mM氘代甲醛和40μg甲醛脱氢酶pFADH-A192T/R267N溶解在1mL浓度50mM，pH 5.0的MES缓冲液中混匀，10℃反应120min，取20μL分析。
[0047] 按对比例1的分析方法分析发现，样品在340nm出现了特征吸收峰。产物NCDH浓度达到0.61mM，即产率为61％。
[0048] 将样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M-H)-为641.1118，与NCD2H的理论分子量(C20H272HN5O15P2-，641.1125)一致，表明得到了氘代NCD还原态产物。
[0049] 实施例4的结果表明，甲醛脱氢酶可用氘代甲醛为还原剂，催化还原NAD类似物生成相应的氘代还原态产物。
[0050] 按照实施例4的方法用相同用量的NCD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C生产氘代NAD类似物，产物NCDH浓度达到0.38mM，即产率为38％。说明甲醛脱氢酶pFADH-A192T/R267N与rsPDH-I151R/E213C均能催化相应的底物生产NAD类似物，甲醛脱氢酶rsPDH-I151R/E213C催化的反应产率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C。
[0051] 实施例5：甲醛脱氢酶、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸
[0052] 参照文献(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862)方法纯化苹果酸酶ME-L310R/Q401C，备用。ME-L310R/Q401C偏好类似物NCDH而对NADH活性低，需要以NCDH为辅因子。
[0053] 苹果酸酶ME-L310R/Q401C可催化的反应为：丙酮酸+CO2+NCDH→苹果酸+NCD。甲醛脱氢酶催化的反应为：甲醛+NCD→甲酸+NCDH。将两反应合并，净反应为：甲醛+丙酮酸+CO2→苹果酸+甲酸。因此甲醛脱氢酶和苹果酸酶构成的体系可以实现以甲醛为还原剂，还原羧化丙酮酸生成苹果酸。该体系中，NAD类似物被再生循环，而且达到了固定CO2的效果，具有一定的潜力。以甲醛为底物的反应体系，在再生还原型NAD类似物的同时，将来自甲醛的碳引入到细胞代谢体系中，将甲醛转化成毒性较低的甲酸，同时实现底物的物质、能量代谢和解毒功效。其中具有代表性的实验过程如下：
[0054] 采用50mM，pH 5.0的Tris-HCl缓冲体系，100μL的反应体系组成为：4.0mM甲醛、50mM丙酮酸、0.01mM NCD、1.0mM MnCl2、10mM碳酸氢钠、0.05mg/mL pFADH-P220C和0.06mg/mL ME-L310R/Q401C。10℃反应120min，加900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应(Rabinowitz JD,et al.Anal Chem,2007,79,6167-6173)。
[0055] 利用美国戴安公司ICS-2500离子色谱系统在ED50脉冲电化学检测模式下分析测定反应溶液中苹果酸，丙酮酸和甲醛的含量。使用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(200mm×4mm)，IonPac AG11-HC阴离子交换保护住(50mm×4mm)。分析条件：流动相为24mM NaOH，流速1mL/min，柱温：30℃，进样量25μL。检测结果表明，反应液含0.1mM甲醛、46.1mM丙酮酸和3.6mM苹果酸。
[0056] 在进行上述反应时，设置了另外4组对照实验体系，分别缺少甲醛、NCD、pFADH-P220C或ME-L310R/Q401C中的一种，分析发现这些反应没有产生苹果酸。根据反应的化学计量关系可知，NCD再生循环利用360次。
[0057] 在进行上述反应时，还设置了1组实验，用氘代甲醛代替甲醛，其他成分和条件相同，分析发现反应液丙酮酸浓度降低为46.3mM同时产生3.5mM苹果酸，说明该体系可用氘代甲醛为还原剂，达到甲醛为还原剂相当的效率。
[0058] 按照实施例5的方法，用亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，反应液含有0.2mM亚磷酸、47.1mM丙酮酸和2.6mM苹果酸。说明甲醛脱氢酶、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸要高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系的催化活性。
[0059] 实施例6：甲醛脱氢酶、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸
[0060] 参照文献(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862)方法纯化D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R，备用。D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R偏好NAD类似物，需要以还原型类似物为辅因子。
[0061] 乳酸脱氢酶催化的反应为：丙酮酸+NFCDH→D-乳酸+NFCD。甲醛脱氢酶催化的反应为：甲醛+NFCD→甲酸+NFCDH。将两反应合并，总反应为：甲醛+丙酮酸→D-乳酸+甲酸。因此，甲醛脱氢酶和D-乳酸脱氢酶构成的体系可实现以甲醛为还原剂，还原丙酮酸生成D-乳酸。该体系中，NAD类似物被循环再生，具有一定的应用潜力。其中具有代表性的实验过程如下：
[0062] 采用50mM，pH 8.0的MES缓冲液体系，100μL的反应体系组成为：4.0mM甲醛、4.0mM丙酮酸、0.1mM NFCD、0.05mg/mL pFADH-A192S/R267Q/V282K和0.06mg/mL DLDH-V152R。40℃反应10min，加900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应。
[0063] 参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含有0.5mM甲醛、3.3mM D-乳酸、0.6mM丙酮酸。
[0064] 实验结果表明，该体系利用甲醛为还原剂，近定量地将丙酮酸还原为乳酸，取得了很高的原料利用效率。根据反应的化学计量关系可知，NFCD再生循环利用33次。
[0065] 按照实施例6的方法，用亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，反应液含有0.6mM亚磷酸、3.0mM D-乳酸、0.8mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸要高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物类似物体系的催化活性。
[0066] 实施例7：醇脱氢酶利用还原态NAD类似物催化醛还原反应
[0067] 参照实施例2的方法制备还原态类似物NTDH，备用。
[0068] 采用20mM、pH 7.5的磷酸钠缓冲液体系，500μL反应体系组成为：3.0mM乙醛、2.0mM NTDH、0.1mg/mL来源于酿酒酵母的醇脱氢酶(购自Sigma公司，货号：A3263)。在30℃下反应，用分光光度计在紫外波长340nm处跟踪反应。反应30min后，体系中NTDH降低为0.8mM。同时，体系中产生了1.1mM乙醇。
[0069] 在没有添加酿酒酵母醇脱氢酶的对照实验体系中，反应30min后NTDH浓度未见明显变化。实施例7的结果说明还原态NAD类似物可被氧化还原酶用作辅酶，催化还原反应。
[0070] 实施例8：甲醛脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物及其应用
[0071] 可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，对细胞造成生存压力，启动该生物催化体系迅速高效氧化甲醛。因此，应用甲醛脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物的技术，可将胞外还原力选择性、高效地传递到胞内目标氧化还原反应。下面以改造的大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X,et al.Appl Environ Microbiol,2011,77,427-434)，构建生产苹果酸的工程菌株为例予以说明。
[0072] NAD转运蛋白AtNDT2(Accession NO.NC_003070)具有较宽泛的底物谱(Palmieri F,et al.J Biol Chem,2009,284,31249-31259)，可以转运NCD。将表达转运蛋白的AtNDT2的基因由gapAP 1启动子(Charpentier B,et al.J Bacteriol,1994,176,830-839)控制表达。将编码aFADH-H270S的基因和编码ME-L310R/Q401C的基因，由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒获得工程质粒。
[0073] 将上述工程质粒导入敲除内源甲醛脱氢酶基因frmA的E.coli XZ654获得工程菌株E.coli GXJ 001。在LB培养基中诱导工程菌株E.coli GXJ 001表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
[0074] 用pH 7.5的MOPS培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入10mM碳酸氢钠、10mM丙酮酸、5mM甲醛、0.1mM的NCD，分别在16℃、30℃、42℃的200rpm摇床中厌氧反应4h，取100μL加900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应。
[0075] 参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明16℃反应液含1.8mM甲醛、2.8mM苹果酸、7.1mM丙酮酸。30℃反应液含0.2mM甲醛、4.3mM苹果酸、5.4mM丙酮酸。42℃反应液含0.5mM甲醛、3.8mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。
[0076] 在只添加甲醛和NCD中的一种及不添加甲醛和NCD的对照实验中，苹果酸浓度分别为2.2mM、1.9mM和1.9mM。
[0077] 实验结果表明在全细胞催化过程中，甲醛脱氢酶aFADH-H270S通过氧化甲醛为ME-L310R/Q401C提供NCDH，催化丙酮酸还原羧化成苹果酸，使苹果酸产量由1.9mM提高到4.3mM。只添加甲醛时苹果酸产量没有明显增加，只添加NCD时苹果酸不增加。
[0078] 实施例8说明，在全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态NAD类似物，被ME-L310R/Q401C用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内苹果酸的代谢强度的方式。
[0079] 按照实施例8的方法，将表达rsPDH-I151R/E213C的基因和ME-L310R/Q410C的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明16℃反应液含1.8mM亚磷酸、2.8mM苹果酸、7.1mM丙酮酸。30℃反应液含0.1mM亚磷酸、4.2mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。42℃反应液含0.5mM亚磷酸、3.8mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶aFADH-H270S参与的上述催化体系与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C参与的类似的催化体系比，前者催化效率在30℃时稍高，在16℃和
42℃时二者效率相当。
42℃时二者效率相当。
[0080] 实施例9：甲醛脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物及其应用
[0081] 可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。下面以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X,et al.Appl Environ Microbiol,2011,77,427-434)，构建生产乳酸的工程菌株为例予以说明。
[0082] NAD转运蛋白NTT4(Haferkamp I,et al.Nature,2004,432,622-625)可以转运NGD。将上述三种表达转运蛋白NTT4的基因由gapAP 1启动子控制表达。将编码aFADH-G264S/A267L的基因和编码DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。
[0083] 将上述工程质粒导入敲除内源甲醛脱氢酶基因frmA的E.coli XZ654获得工程菌株E.coli GXJ 002。在LB培养基中诱导工程菌E.coli GXJ 002表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
[0084] 用pH 8.0的M9培养基洗涤重悬菌体，将密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲醛、0.1mM NUD，分别在30℃的200rpm摇床中厌氧反应3h，取100μL加900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应。
[0085] 参照实施例5的方法利用离子色谱系统进行分析，结果表明30℃反应液含0.1mM甲醛、4.9mM乳酸、4.7mM丙酮酸。
[0086] 在只添加甲醛和NUD中的一种及不添加甲醛和NUD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.9mM、0.9mM和0.6mM。
[0087] 实验结果表明在全细胞催化过程中甲醛脱氢酶aFADH-G264S/A267L通过氧化甲醛为DLDH-V152R提供NUDH，催化丙酮酸还原成乳酸，使乳酸产量由0.6mM提高到4.9mM。只添加甲醛或NUD时乳酸产量没有明显增加。
[0088] 实施例9说明，在全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
[0089] 按照实施例9的方法，将表达rsPDH-I151R/I218F的基因和DLDH-V152R的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明30℃反应液含0.1mM亚磷酸、4.8mM乳酸、4.6mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶aFADH-G264S/A267L参与的上述催化体系与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/I218F参与的类似的催化体系效率接近。
[0090] 实施例10：甲醛脱氢酶介导的透性化细胞内还原NAD类似物及其应用
[0091] 可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在宿主细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，对细胞造成生存压力，促使细胞迅速启动该生物催化体系。
[0092] 将编码aFADH-V219K/G264S的基因和编码DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述两种表达盒通过替换pUC18的lacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。
[0093] 将上述工程质粒导入敲除内源甲醛脱氢酶基因frmA的E.coli XZ654获得工程菌株E.coli GXJ 003。在LB培养基中诱导工程菌E.coli GXJ 003表达上述两种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM，pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9，按文献方法使细胞透性化(Zhang W,et al.Appl Environ Microbiol,2009,75,687-694)，制备方式为，取5mL的冻存细胞室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度50mM、pH 5.0的Tris-Cl，获得透性化细胞。
[0094] 上述用浓度50mM、pH 5.0的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲醛、0.1mM的NCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应0.5h。取100μL样品，加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应。
[0095] 参照实施例5的方法用离子色谱系统分析，结果表明反应液含2.1mM甲醛、2.6mM乳酸和7.1mM丙酮酸。
[0096] 在只添加甲醛和NCD的一种及不添加甲醛和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.6mM、0.4mM和0.3mM。
[0097] 实验结果表明在全细胞催化过程中甲醛脱氢酶aFADH-V219K/G264S通过氧化甲醛为DLDH-V152R提供NCDH，催化丙酮酸还原生成乳酸，使乳酸产量由0.3mM提高到2.6mM。只添加甲醛或NCD时苹果酸产量没有明显增加。
[0098] 实施例10说明，在全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
[0099] 按照实施例10的方法，将表达rsPDH-I151R的基因和ME-L310R/Q401C的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明30℃反应液含2.4mM亚磷酸、2.5mM乳酸和7.8mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶aFADH-V219K/G264S参与的上述催化体系效率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R参与的类似的催化体系。
[0100] 实施例11：甲醛脱氢酶介导的透性化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)AS1.2829细胞内还原NAD类似物及其应用
[0101] 可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在乳酸乳球菌中表达，形成一种依赖于NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
[0102] 将编码aFADH-V283I/V219R的基因和编码DLDH-V152R的基因，由组成型表达启动子P32控制，将上述两种表达盒通过替换pMG36e的P32表达盒(GUCHTE MV,et al.Appl Environ Microbiol,1989,55,224-228.)获得工程质粒。
[0103] 将上述工程质粒导入乳酸乳球菌获得工程菌株L.lactis GXJ 004。用pH 6.8的含有10g/L蔗糖、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L的KH2PO4、2g/L的MgSO4和5mg/L红霉素的培养基诱导工程菌L.lactis GXJ 004表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整至9。参照实施例10的方法使细胞透性化，制备方式为：取5mL的冻存细胞在室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床中温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度
50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
[0104] 上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲醛。0.1mM的NFCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应1h。取100μL反应液，加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应。
[0105] 参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液中含有1.9mM甲醛、2.7mM乳酸和7.1mM丙酮酸。
[0106] 在只添加甲醛和NFCD的一种及不添加甲醛和NFCD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.4mM、0.4mM和0.2mM。
[0107] 实施例11说明，在乳酸乳球菌全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲醛和NFCD的对照实验相比提高了13.5倍，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸代谢强度的方式。
[0108] 实施例12：甲醛脱氢酶介导的透性化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741细胞内还原NAD类似物及其应用
[0109] 可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在酿酒酵母细胞中表达，形成一种依赖于NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
[0110] 将编码aFADH-G298V的基因和编码DLDH-V152R的基因，由TEF组成型启动子、CYC1终止子控制，将上述两种表达盒整合到p416酵母游离型穿梭表达载体获得工程质粒。
[0111] 将上述工程质粒导入酿酒酵母获得工程菌株S.cerevisiae GXJ 005。用pH6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基培养工程菌S.cerevisiae GXJ 005表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。参照实施例11的方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
[0112] 上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲醛、0.1mM NGD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应1h。取100μL加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应。
[0113] 参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含有0.6mM甲醛、3.7mM乳酸和6.1mM丙酮酸。
[0114] 在只添加甲醛和NGD中的一种及不添加甲醛和NGD的对照实验中，乳酸的浓度分别为0.4mM、0.6mM和0.4mM。
[0115] 实施例12说明，在酿酒酵母全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用做辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲醛和NGD的对照实验相比提高了9.3倍，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
[0116] 实施例13：甲醛脱氢酶介导的里氏木霉(Trichoderma reesei)胞内还原NAD类似物及其应用
[0117] 可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在里氏木霉细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
[0118] 将编码pFADH-A192S的基因和编码DLDH-V152R的基因，由启动子Pcbh1和终止子Tcbh1控制，将上述两种表达盒整合到pCAMBIA1300载体上获得工程质粒。
[0119] 将上述工程质粒导入里氏木霉获得工程菌株T.reesei GXJ 006，用pH 4.8的含有15g/L乳糖、10g/L酵母提取物、1g/L(NH4)2SO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的MgSO4、0.6g/L的CaCl2、0.05g/L的FeSO4·7H2O、0.0016g/L的MnSO4·H2O、0.0014g/L的ZnSO4·7H2O、
0.0037g/L的CoCl2·6H2O的培养基诱导工程菌T.reesei GXJ 006表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例11方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
0.0037g/L的CoCl2·6H2O的培养基诱导工程菌T.reesei GXJ 006表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例11方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
[0120] 上述浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲醛、0.1mM的NCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应2h。取100μL样品，加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应。
[0121] 参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含1.5mM甲醛、3.3mM乳酸、6.4mM丙酮酸。
[0122] 在只添加甲醛和NCD中的一种及不添加甲醛和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为1.2mM、0.9mM和0.6mM。
[0123] 实施例13说明，在里氏木霉全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲醛和NCD的对照实验相比提高了5.5倍，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸代谢强度的方式。
[0124] 实施例14：甲醛脱氢酶介导的圆红冬胞酵母(Rhodosporidium toruloides)胞内还原NAD类似物及其应用
[0125] 可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在圆红冬胞酵母中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
[0126] 将编码aFADH-V263S/E266C的基因和编码DLDH-V152R的基因，分别由启动子GPD、PGK和终止子Hspt、Tnos控制，将上述两种表达盒整合到pZPK载体上获得工程质粒。
[0127] 将上述工程质粒通过ATMT转化导入圆红冬胞酵母获得工程菌株R.toruloides GXJ 007，用pH 6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基培养工程菌GXJ 007表达上述两种功能蛋白，在28℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例11方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
[0128] 上述浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲醛、0.1mM的NTD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应2h。取100μL样品，加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4∶1)终止反应。
[0129] 参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含1.2mM甲醛、3.0mM乳酸、6.0mM丙酮酸。
[0130] 在只添加甲醛和NTD中的一种及不添加甲醛和NTD的对照实验中，乳酸浓度分别为1.2mM、0.7mM和0.6mM。
[0131] 实施例14说明，在圆红冬胞酵母催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲醛和NTD的对照实验相比提高了5倍，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸代谢强度的方式。
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