强化丙酮酸合成L-亮氨酸能力的重组谷氨酸棒杆菌及应用
阅读：696发布：2020-05-11
专利汇可以提供强化丙酮酸合成L-亮氨酸能力的重组谷氨酸棒杆菌及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种强化谷 氨 酸棒杆菌中丙 酮 酸 合成L-亮氨酸能 力 的方法，属于基因工程领域。本发明应用基因工程方法，为调控L-亮氨酸合成代谢通量，在ilvBNC操纵子和leuA基因的启动子序列位点替换为Ptuf启动子；同时为进一步强化 丙酮酸 合成亮氨酸代谢通量，过表达关键酶基因异丙基苹果酸合成酶IPMS。构建了高效的L-亮氨酸合成途径并弱化了谷氨酸棒杆菌L-亮氨酸产生菌中L-缬氨酸的合成通量。重组菌经 发酵 摇瓶实验，重组菌株WL-14产28.47±0.36g/L亮氨酸，比出发菌株WL-8的亮氨酸产量提高56.8％，而菌株WL-14中缬氨酸积累量降低到1.78±0.21g/L。，下面是强化丙酮酸合成L-亮氨酸能力的重组谷氨酸棒杆菌及应用专利的具体信息内容。
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述重组谷氨酸棒杆菌为ilvBNC操纵子和leuA基因的启动子序列位点替换为Ptuf启动子的谷氨酸棒杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述Ptuf启动子的插入载体为pK18mobsacB或pK19mobsacB。
3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述重组谷氨酸棒杆菌中还过表达了异丙基苹果酸合成酶IPMS。
4.根据权利要求3所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述重组谷氨酸棒杆菌中通过过表达ilvBNC操纵子和leuA基因过表达异丙基苹果酸合成酶IPMS。
5.根据权利要求4所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：过表达是以pECXK99E、pXMJ19、pDXW-8、pDXW-10、pJYW-4或pJC1作为表达载体。
6.根据权利要求1或3所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌为敲除了丙酮酸羧化酶编码基因pyc、丙氨酸转氨酶编码基因avtA且在丙氨酸转氨酶编码基因alaT插入T3终止子的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT。
7.根据权利要求6所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT的构建方法包括以下步骤：
以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR的基因组为模板，分别构建丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框、丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框及包含T3终止子及alaT基因的替换框，利用质粒载体将所述丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框、丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框及包含T3终止子及alaT基因的替换框依次电转化谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbR，筛选出所述谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT。
8.根据权利要求7所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述质粒载体为pK18mobsacB或pK19mobsacB。
9.权利要求1或3所述的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-亮氨酸中的应用。
强化丙酮酸合成L-亮氨酸能力的重组谷氨酸棒杆菌及应用
技术领域
背景技术
[0002] 作为八种必需氨基酸之一，L-亮氨酸因与L-缬氨酸和L-异亮氨酸同具有甲基侧链分支结构而统称为支链氨基酸。L-亮氨酸具有多种生理功能，广泛应用于食品工业，饲料工业和制药等工业。同时，L-亮氨酸在氨基酸静脉输液等方面的用量日益增长，是应用于临床氨基酸复合输液中不可缺少的原料之一，对维持病危病人的营养需求，抢救患者生命起着积极的作用。
[0003] L-亮氨酸的生产方法主要有提取法，化学合成法，微生物发酵法。其中发酵法具有反应条件温和，环境污染小，产品质量稳定等优点。谷氨酸棒状杆菌是一种环境友好的非致病性革兰氏阳性菌，已广泛应用于多种有机酸和氨基酸的工业生产。
[0004] 在谷氨酸棒杆菌中，以丙酮酸为直接前体，涉及七步酶促反应合成亮氨酸，L-缬氨酸和L-异亮氨酸是在平行途径中合成的，并且由相同的酶催化，而L-亮氨酸是从L-缬氨酸合成的直接前体α-酮异戊酸分支出来，经过四步特定的反应生成。其中乙酰羟酸合成酶和乙酰羟酸还原异构酶组成操纵子，是支链氨基酸合成过程中重要的调控元件，α-异丙基苹果酸合成酶(IPMS)是L-亮氨酸合成过程中真正的限速酶。需要指出的是，IPMS对α-酮异戊酸的亲和力比支链氨基酸转氨酶对α-酮异戊酸的亲和力高10倍，所以L-亮氨酸的合成优于L-缬氨酸。由葡萄糖生物合成亮氨酸的代谢途径如图1所示。由于L-亮氨酸的合成途径长，与其他支链氨基酸部分重叠的代谢途径，反馈调控机制严格，所以其生产菌株的产量和转化率仍然较低，现阶段其产量已经无法满足日益增长的市场需求。因此，迫切需要研发构建高产量高生产强度高效价的L-亮氨酸高产菌株。
[0005] 启动子是细胞转录调控中的重要元素，通过启动子工程技术精确调控基因转录已成为一种非常重要的代谢工程研究策略。众多文献表明，几种强启动子(如Ptuf，Psod和PgapA等)常被用于增强关键酶在目标产物合成途径中的表达，并且Ptuf启动子具有更高的表达强度。此外，表达强度稍微低启动子(如Ptac和Ptrc)也经常用于调节不同基因的表达水平，从而调控代谢途径。然而一味地提高关键基因的表达水平并不一定能实现目标产量的持续提高，其合成途径中需要各个基因的相互协调和配合，要实现各个基因表达水平的平衡。
[0006] “微生物发酵法生产L-亮氨酸的研究进展，食品与生物技术学报，2015,34(2)”中公开了提高IPMS的产量和活力，是提高亮氨酸产量的关键性因素，但是具体通过何种方法提高IPMS的产量，该文献中并未涉及。张跃等将黄色短杆菌ATCC14067的ilvBNC基因和leuA基因导入到模式菌株C.glutamicum ATCC13032中，构建基因工程菌C.glutamicum ATCC13032/pDXW-8-leuA-ilvBNC，摇瓶发酵72h后亮氨酸产量为4.75g/L(L-亮氨酸生物合成关键酶基因的克隆和表达，食品工业科技，2013，34(11)：170-173)，该菌株的L-亮氨酸产量仍有待提高。“ilvBNC操纵子协同cimA基因过表达提高Corynebacterium glutamicum YILW L-异亮氨酸产量的研究，现代食品科技，2016，32(2)”中，采用基因重组手段将L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILWilvBNC操纵子中的启动子替换为强启动子Ptac获得C.glutamicum YILWPtac。摇瓶发酵结果显示该菌株L-异亮氨酸产量和转化率分别较出发菌株提高了14.8％和18.6％，但是其亮氨酸产量最高仅为7g/L左右。
发明内容
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种强化丙酮酸合成L-亮氨酸能力的重组谷氨酸棒杆菌及应用，以强启动子Ptuf替换ilvBNC操纵子和leuA基因原启动子，进而调控L-亮氨酸合成途径中操纵子ilvBNC和关键基因leuA的转录和翻译水平，构建了高效的L-亮氨酸合成途径并弱化了谷氨酸棒杆菌L-亮氨酸产生菌中L-缬氨酸的合成通量。
[0008] 本发明的一种重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌为ilvBNC操纵子和leuA基因的启动子序列位点替换为Ptuf启动子的谷氨酸棒杆菌。
[0009] 进一步地，Ptuf启动子的插入载体为pK18mobsacB或pK19mobsacB。优选地，Ptuf启动子的插入载体为pK18mobsacB。
[0010] 进一步地，重组谷氨酸棒杆菌中还过表达了异丙基苹果酸合成酶IPMS。
[0011] 进一步地，重组谷氨酸棒杆菌中通过过表达ilvBNC操纵子和leuA基因过表达异丙基苹果酸合成酶IPMS。过表达基因ilvBNC和leuA可进一步提高亮氨酸合成能力。
[0012] 进一步地，过表达是以pECXK99E、pXMJ19、pDXW-8、pDXW-10、pJYW-4或pJC1作为表达载体。优选地，以pECXK99E作为表达载体。
[0013] 为了作为对照，本发明还构建了ilvBNC操纵子和leuA基因的启动子序列位点替换为Ptac启动子的重组谷氨酸棒杆菌。
[0014] 本发明中，基因ilvBNC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；基因leuA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，启动子Ptuf的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015] 本发明中，构建重组谷氨酸棒杆菌的基因编辑技术采用pK18mobsacB二次同源重组系统。
[0016] 进一步地，构建重组谷氨酸棒杆菌的出发菌株为敲除了丙酮酸羧化酶编码基因pyc、丙氨酸转氨酶编码基因avtA且在丙氨酸转氨酶编码基因alaT插入T3终止子的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT。
[0017] 进一步地，谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT的构建方法包括以下步骤：
[0018] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR的基因组为模板，分别构建丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框、丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框及包含T3终止子及alaT基因的替换框，利用质粒载体将所述丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框、丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框及包含T3终止子及alaT基因的替换框依次电转化谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbR，筛选出所述谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT。
[0019] 以上所使用的谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR为遗传背景清晰的L-亮氨酸产生菌，谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR为文献“Improvement of L-leucine Production in Corynebacterium glutamicum by Altering the Redox Flux,International Journal of Molecular Sciences,2019,20(8)”中所报道的菌株。
[0020] 进一步地，丙酮酸羧化酶编码基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述丙氨酸转氨酶编码基因avtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；T3终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0021] 进一步地，质粒载体为pK18mobsacB或pK19mobsacB。优选地，质粒载体为pK18mobsacB。
[0022] 本发明还公开了上述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-亮氨酸中的应用。
[0023] 在本发明一具体实施例中，重组菌经发酵摇瓶实验，重组菌株WL-14产28.47±0.36g/L亮氨酸，比出发菌株WL-8的亮氨酸产量提高56.8％，而菌株WL-14中缬氨酸积累量降低到1.78±0.21g/L。
[0024] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0025] 本发明以基因工程为手段，通过同源重组策略利用强启动Ptuf替换谷氨酸棒杆菌中的ilvBNC操纵子和leuA基因原启动子，调控L-亮氨酸合成途径中操纵子ilvBNC和关键基因leuA的转录和翻译水平，更为精细和定量的调控代谢通量对L-亮氨酸积累的影响，使代谢途径中各个基因的表达强度实现最佳组合，并实现L-亮氨酸合成途径碳代谢的通量平衡，L-亮氨酸的产率及产物转化率大大提高，L-亮氨酸产量最大可提高到28.47±0.36g/L，且缬氨酸产量最低可降低到1.78±0.21g/L。
附图说明
[0027] 图1是谷氨酸棒杆菌中L-亮氨酸的合成途径示意图；
[0028] 图2是重组菌株WL-10，WL-11、WL-12和出发菌WL-8发酵过程曲线：(A)L-亮氨酸产量；(B)葡萄糖含量；(C)菌体生长；(D)副产物产量；(E)转录水平分析；(F)启动子组合方式；
[0029] 图3是重组菌株WL-14和WL-15和对照菌WL-13发酵结果。
[0030] 图1中缩写说明：AHAS：乙酰乳酸合酶；AHAIR：乙酰乳酸还原异构酶；DHAD：二羟酸脱水酶；IPMS：异丙基苹果酸合成酶；IPMI：异丙基苹果酸异构酶；IPMD：异丙基苹果酸脱氢酶；TABCAT：支链氨基酸转氨酶；编码基因：pyc丙酮酸羧化酶PC；ppc磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC；alaT丙氨酸转氨酶AlaT；avtA丙氨酸转氨酶AvtA。
具体实施方式
[0031] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032] 实施例1谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT(WL-8)的构建[0033] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC XQ-9ΔltbR基因组为模板，分别以pyc-U-F/pyc-U-R和pyc-D-F/pyc-D-R为引物(表1)，PCR扩增后获得pyc-U和pyc-D的PCR产物，将得到的pyc-U和pyc-D片段进行融合PCR，获得同源臂片段Δpyc。将上述PCR产物与经XbaI和HindIII双酶切线性化质粒pK18mobsacB酶连，构建质粒pK18mobsacB-Δpyc。
[0034] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC XQ-9ΔltbR基因组为模板，分别以avtA-U-F/avtA-U-R和avtA-D-F/avtA-D-R为引物(表1)，PCR扩增后获得avtA-U和avtA-D片段，将得到的avtA-U和avtA-D片段与经SmaI和HindIII双酶切线性化质粒pK18mobsacB进行无缝克隆，构建质粒pK18mobsacB-ΔavtA。
[0035] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC XQ-9ΔltbR基因组为模板，以alaT-U-F/alaT3-U-R和alaT3-D-F/alaT-D-R为引物(表1)，PCR扩增alaT3-U和alaT3-D片段，然后将alaT3-U和alaT3-D片段与线性化质粒pK18mobsacB无缝克隆，构建质粒pK18mobsacB-T3-alaT，其中alaT3-U-R和alaT3-D-F引物中包含终止子序列T3，终止子序列如SEQ ID NO.7所示，其强度为40.39a.u.。
[0036] 表1.PCR扩增所需引物序列
[0037]
[0038] a互补序列斜体标出
[0039] b酶切位点下划线标出
[0040] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC XQ-9ΔltbR(命名为ΔLtbR)为出发菌株，将上述步骤中验证正确的质粒pK18mobsacB-△pyc电击转化C.glutamicumXQ-9ΔltbR感受态，并筛选出目的菌株C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔpyc，将其命名为WL-1。筛选目的重组菌株的步骤如下：经含有50μg/mL卡那霉素的LBG固体培养基于30℃培养筛选获得第一次同源重组转化子。再将经一次重组的转化子接入含100g/L蔗糖的LBGS液体培养基于30℃培养，培养基中含蔗糖会导致含sacB基因的线性化整合基因片段与基因组DNA中目的基因进行第二次同源重组，LBGS培养的菌液在LBG平板上划线分离，在平板上长出的菌落可能是回复野生型也可能是基因敲除型，菌落PCR验证单菌落，提取转化子染色体，以目标基因pyc的验证引物pyc-F/pyc-R进行PCR并对PCR产物进行测序鉴定，最终筛选出二次目的同源重组菌。
[0041] 然后将验证正确的质粒pK18mobsacB-△avtA电击转化菌株WL-1感受态，按照上述方法以目标基因avtA的上下游引物avtA-U-F/avtA-D-R进行PCR并对PCR产物进行测序鉴定，最终获得目的菌株C.glutamicumXQ-9ΔltbRΔpycΔavtA(命名为WL-4)。
[0042] 最后将验证正确的质粒pK18mobsacB-T3-alaT电击转化菌株WL-4感受态，按照上述方法以目标基因alaT前插入终止子的验证引物AlaT3-F/alaT-D-R进行PCR，并对PCR产物进行测序鉴定，最终获得验证正确的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT(WL-8)。
[0043] 实施例2启动子替换质粒的构建
[0044] 分别以菌株WL-8基因组，pDXW-8质粒为模板，分别以Ptac-AU-F/Ptac-AU-R，Ptac-AD-F/Ptac-AD-R和A-Ptac-F/A-Ptac-R为引物PCR(表2)，获得leuA-U和leuA-D和PtacDNA片段，与线性化质粒pK18mobsacB无缝克隆构建重组质粒pK18mobsacB-Ptac-leuA。
[0045] 以菌株WL-8基因组为模板，Ptuf-AU-F/Ptuf-AU-R，Ptuf-AD-F/Ptuf-AD-R和A-Ptuf-F/A-Ptuf-R为引物PCR(表2)，获得leuA-U和leuA-D和PtufDNA片段，与线性化质粒pK18mobsacB无缝克隆构建重组质粒pK18mobsacB-Ptuf-leuA。
[0046] 分别以菌株WL-8基因组，pDXW-8质粒为模板，分别以Ptac-BU-F/Ptac-BU-R，Ptac-BD-F/Ptac-BD-R和B-Ptac-F/B-Ptac-R为引物PCR(表2)，获得ilvBNC-U和ilvBNC-D和PtacDNA片段，与线性化质粒pK18mobsacB无缝克隆构建重组质粒pK18mobsacB-Ptac-ilvBNC。
[0047] 以菌株WL-8基因组为模板，Ptuf-BU-F/Ptuf-BU-R，Ptuf-BD-F/Ptuf-BD-R和B-Ptuf-F/B-Ptuf-R为引物PCR(表2)，获得ilvBNC-U和ilvBNC-D和PtufDNA片段，与线性化质粒pK18mobsacB无缝克隆构建重组质粒pK18mobsacB-Ptuf-ilvBNC。
[0048] 表2.本实施例所涉及的引物
[0049]
[0050]
[0051] a互补序列斜体标出
[0052] b酶切位点下划线标出
[0053] 实施例3重组菌株WL-10的构建
[0054] 将实施例3中验证正确的启动子替换质粒pK18mobsacB-Ptac-leuA及pK18mobsacB-Ptac-ilvBNC依次电击转化WL-8感受态细胞，依次替换leuA基因及ilvBNC基因启动子均为Ptac启动子，用引物A-Ptac-F/PtacAD-R、B-Ptac-F/PtacBD-R菌落PCR验证单菌落，筛选正确的转化子。筛获得重组菌株命名为WL-10。
[0055] 实施例4重组菌株WL-11的构建
[0056] 将实施例3中验证正确的启动子替换质粒pK18mobsacB-Ptac-ilvBNC及pK18mobsacB-Ptuf-leuA依次电击转化WL-8感受态细胞，依次替换leuA基因启动子为Ptuf启动子、并替换ilvBNC基因启动子为Ptac启动子，用引物B-Ptac-F/PtacBD-R、A-Ptuf-F/PtufAD-R菌落PCR验证单菌落，筛选正确的转化子。筛获得重组菌株命名为WL-11。
[0057] 实施例5重组菌株WL-12的构建
[0058] 将实施例3中验证正确的启动子替换质粒pK18mobsacB-Ptuf-ilvBNC及pK18mobsacB-Ptuf-leuA电击转化WL-8感受态细胞，替换ilvBNC和leuA基因启动子均为Ptuf启动子，用引物B-Ptuf-F/PtufBD-R、A-Ptuf-F/PtufAD-R菌落PCR验证单菌落，筛选正确的转化子。筛获得重组菌株命名为WL-12。
[0059] 实施例6重组菌WL-10、WL-11、WL-12和出发菌株WL-8发酵产L-亮氨酸[0060] 本实施例中，所使用的培养基包括：
[0061] ①摇瓶发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖30，玉米浆30-40，酵母膏5-10，硫酸铵5，柠檬酸钠10，尿素2，KH2PO4.3H2O 2，MgSO4.7H2O 0.5，MnSO4.H2O 0.02，蛋氨酸0.4，生物素0.00005，硫胺素0.0004，CaCO3 20，pH 7.3-7.5，121℃20min。
[0062] ②摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖130，玉米浆20-30，硫酸铵15，醋酸铵15，柠檬酸钠2，尿素2-3，KH2PO4.3H2O 2，MgSO4.7H2O 0.5，MnSO4.H2O 0.06，蛋氨酸0.7，异亮氨酸0.06，谷氨酸0.5，盐酸盐甜菜碱1，生物素0.00008，硫胺素0.0006，CaCO3 30，pH 7.3-7.5，115℃10min。
[0063] 将上述经验证的重组菌WL-10、WL-11和WL-12和出发菌株WL-8分别进行摇瓶发酵实验。从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环谷氨酸棒杆菌(出发菌和重组菌)接种到50mL装液量500mL摇瓶种子培养基中，4层纱布封口，30℃100r/min往复式摇床培养16h，将种子液按接种量10％接入50/500mL摇瓶发酵培养基，30℃100r/min往复式摇床培养72h；每12h测定L-亮氨酸，残糖，生物量及其副产物产量，结果如图2所示。
[0064] 从图2A中可以直观地看出，菌株WL-10中L-亮氨酸的产量是22.38±0.53g/L，比出发菌株WL-8的亮氨酸产量16.86±0.50g/L提高23％。如图2E所示，所涉及的各基因转录表达水平与对照组相比，都超过了1.5倍。此外，葡萄糖消耗量和菌体生长都有提高(2B和2C)。表明强启动子诱导表达利于亮氨酸的合成。相同的趋势也在菌株WL-11和WL-12发现。菌株WL-11和WL-12中亮氨酸产量分别为24.73±0.34g/L和26.83±0.42g/L。值得注意的是，WL-
11菌株中副产物缬氨酸产量最低为2.74±0.23g/L，表明Ptuf启动子诱导表达leuA有利于碳代谢向亮氨酸合成方向减少缬氨酸积累。而Ptuf启动子诱导表达leuA和ilvBNC更有利于提高亮氨酸产量。
11菌株中副产物缬氨酸产量最低为2.74±0.23g/L，表明Ptuf启动子诱导表达leuA有利于碳代谢向亮氨酸合成方向减少缬氨酸积累。而Ptuf启动子诱导表达leuA和ilvBNC更有利于提高亮氨酸产量。
[0065] 实施例7重组菌株WL-13、WL-14、WL-15的构建
[0066] 以菌株WL-8基因组为模板，分别以leuA-F/leuA-R为引物PCR(表2)，获得leuADNA片段，经EcoRI和KpnI双酶切，与经同样酶切线性化质粒pECXK99E酶连，构建重组质粒pECXK99E-leuA。
[0067] 以菌株WL-8基因组为模板，分别以ilvBNC-F/ilvBNC-R为引物PCR(表2)，获得ilvBNC DNA片段，经EcoRI和KpnI双酶切，与经同样酶切线性化质粒pECXK99E酶连，构建重组质粒pECXK99E-ilvBNC。
[0068] 将验证正确的质粒pECXK99E、pECXK99E-leuA和pECXK99E-ilvBNC分别电击转化菌株WL-12，其中空载质粒pECXK99E作为对照，以目标基因上下游引物进行菌落PCR，筛选正确的转化子，最终分别获得的重组菌株WL-13，WL-14和WL-15。
[0069] 实施例8重组菌WL-13，WL-14和WL-15发酵产L-亮氨酸
[0070] 将实施例7中经验证的重组菌WL-14和WL-15和对照菌WL-13分别按照实施例6中的方法进行摇瓶发酵实验。测定L-亮氨酸，残糖，生物量及其副产物积累，结果如图3所示。从图3中可以表观地看出，重组菌株WL-14和WL-15分别产28.47±0.36g/L和27.13±0.48g/L亮氨酸，都高于对照菌株WL-13的亮氨酸产量。而重组菌株WL-14中缬氨酸积累量降低到1.78±0.21g/L，但重组菌株WL-14和WL-15的生长都略低于对照菌株WL-13。
[0071] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
[0072]
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