六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法
阅读：1048发布：2020-09-30
专利汇可以提供六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种六孔板 肝细胞 中空 纤维 反应器的构建方法，依次进行以下步骤：将中空纤维切成2～4cm长的小段后灭菌；将2倍浓缩DMEM高糖培养基与胎 牛 血清按照100:4～6的体积比混合，得含胎牛血清的培养基；将所述含胎牛血清的培养基与浓度为1.9～2.1g/L的鼠尾 胶原蛋白 Ⅰ型溶液按照1:0.95～1.05的体积比进行混合，得鼠尾胶原培养基 混合液 ；将肝癌细胞HepG2用鼠尾胶原培养基混合液稀释至5×106cells/mL注满平躺状态下的步骤1)所得的灭菌后中空纤维的内腔；于37±0.2℃放置18～22分钟；然后置于六孔细胞培养板中进行培养。，下面是六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法专利的具体信息内容。
1.六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法，其特征是依次进行以下步骤：
1)、中空纤维的灭菌：
将中空纤维切成2～4cm长的小段，浸泡于PBS缓冲溶液中，然后一同进行灭菌；
待灭菌完毕，在超净台中取出中空纤维置于平皿上铺开风干；
2)、将2倍浓缩DMEM高糖培养基与胎牛血清按照100:4～6的体积比混合，得含胎牛血清的培养基；将所述含胎牛血清的培养基与浓度为1.9～2.1g/L的鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液按照
1:0.95～1.05的体积比进行混合，得鼠尾胶原培养基混合液；
所述2倍浓缩DMEM高糖培养基是指培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳素氢钠的浓度是常规DMEM基础培养基(高糖)的2倍；所述鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液是利用体积浓度为
0.1％乙酸溶液进行配制的；
3)、将肝癌细胞HepG2用鼠尾胶原培养基混合液稀释至5×106cells/mL注满平躺状态下的步骤1)所得的灭菌后中空纤维的内腔；于37±0.2℃放置18～22分钟；
4)、将步骤3)所得的培养有细胞的中空纤维置于六孔细胞培养板中，在六孔培养板的每孔中加入2～3mL的2倍浓缩DMEM高糖培养基，将培养板放入37±0.2℃、5％CO2细胞培养箱中进行静置培养；每1～2天更换一次培养基。
2.根据权利要求1的六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法，其特征是：所述步骤4)中，六孔板的每孔内放置6-12根的中空纤维。
3.根据权利要求1或2的六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法，其特征是：所述中空纤维为聚醚砜中空纤维，孔径0.1μm，0.1MPa下纯水通量1000L/m2h，内/外径0.8/1.4mm。
六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法
技术领域
[0001] 本发明为一种肝细胞体外三维培养方法，特别地，涉及一种可用于食品毒理学评价的六孔板肝癌细胞中空纤维反应器的构建方法。
背景技术
[0002] 肝脏是负责在外源化合物体内代谢和排泄的主要器官，由此造成化合物在肝脏中的浓度往往高于体内的其他器官，且肝脏本身对外源物质的毒性非常敏感，这也导致了外源活性物质肝脏毒性是最常见的临床副反应。
[0003] 肝脏内有大量代谢酶，多数物质由体内或体外进入肝脏，其中包括由其他器官进行的物质代谢中产生的各种生物活性物质、代谢终产物以及由外界进入机体的各种异物(如药物、农药、食品添加剂以及化学物品)、毒物或从肠道吸收来的腐败产物，它们均可在肝脏中进行代谢转化。肝脏是个高度分化的负责外源物质代谢的器官，在功能食品的开发早期进行功效成分和食品加工生产过程中有毒物质的肝的器官毒性选择性评价也是必要的。
[0004] 迄今为止，大部分外源物质毒性的器官选择性研究仍仅限于临床前动物实验和临床试验，但已开始有研究者将体外筛选模型用于药物毒性器官选择性的研究[1]。作为附着依赖性细胞，单层贴壁培养模型是肝细胞为最常见细胞培养模型。虽然该模型成本低、重复性好且操作简便，但作为一种二维培养模型，它无法为细胞提供类似于体内的微环境，造成细胞形态和信号传导与体内有较大差别[2]。虽然单层培养的肝细胞能在数小时内贴壁并延展成岛状，但在1-3天内就会丧失大部分的肝细胞特异性功能，其药物代谢及尿素和白蛋白的合成能力也显著下降[3-4]。因此，将单层贴壁培养的原代细胞用于药物毒性筛选时，其结果往往偏离体内情况。
[0005] 近年来，许多研究者致力于生物人工肝的开发即研究细胞的三维组织化培养模型。常见的组织化培养方式主要有三明治模型培养、聚球体培养和凝胶包埋培养等[5]。与其他三维培养模型相比，胶原凝胶包埋具有价格便宜、操作方便等特点。细胞在三维培养模型中能形成类似于组织中的结构[6]，且细胞形态和信号传导与体内情况更接近[7]。肝细胞贴壁生长于中空纤维膜的内壁，利用中空纤维膜的支架作用，肝细胞在体外形成了类似体内的管状空间三维结构，在合适的条件下形成组织化的管状结构，且细胞仍能保持特定的分化功能。对于肝细胞，凝胶包埋的肝细胞培养于中空纤维膜中有其突出的优点：(1)与体内情况保持了一致，酶量和辅助因子的水平都是正常的生理浓度，可以在接近生理状态的情况下研究药物的代谢；(2)较好保留和维持了细胞的完整形态和细胞体外代谢活性,真实反映了体内的代谢情况；(3)将凝胶包埋的肝细胞培养于中空纤维膜中可以较好地维持肝细胞的存活率和分化功能。它最初是用于生物人工肝的构建[8-9]。该装置中，中空纤维膜和胶原凝胶分别模拟了血管和肝脏结缔组织，构成类似肝脏的微环境，使肝细胞能长期维持肝合成功能。
[0006] 同时，虽然工业化生产应用的大型中空纤维人工肝反应器能够在较长时间内保持细胞功能，较好的反映体内真是情况，但其成本较高，结构复杂，并不适用于实验室研究细胞培养和获得细胞代谢产物
[0007] 参考文献：
[0008] [1]Yamada,K.M.and Cukierman,E.Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D[J).Cell，2007.130(4):601-610(Yamada,K.M.and Cukierman等.3D模拟组织构建和癌症.细胞,2007.130(4):601-610)；
[0009] [2]Sato,Y.et al.Evaluation of proliferation and functional differentiation of LLC-PK1 cells on porous polymer membranes for the development of a bioartificial renal tubule device.Tissue Eng 11,1506-1515(2005)(Sato,Y.等，基于多孔聚合物膜构建生物人工肾小管模型评价LLC-PK1细胞的增殖和分化功能.组织工程，11,1506-1515(2005))；
[0010] [3]Nakazawa,K.et al.Formation of porcine hepatocyte spherical multicellular aggregates(spheroids)and analysis of drug metabolic functions.Cytotechnology 31,61-68(1999)(Nakazawa,K等，猪肝细胞多细胞聚球的形成(球状体)和药物代谢功能的分析.细胞技术，31,61-68(1999))；
[0011] [4]O'Brien,L.E.,Zegers,M.M.P.&Mostov,K.E.Opinion-Building epithelial architecture:insights from three-dimensional culture models.Nat Rev Mol Cell Bio 3,531-537(2002)(O'Brien,L.E.,Zegers,M.M.P.&Mostov,K.E.从三维细胞培养模型构出发构建上皮细胞分子细胞组织框架.生物学自然综述.3,531-537(2002))；
[0012] [5]Wang,C.Z.,Hsu,Y.M.&Tang,M.J.Function of discoidin domain receptor I in HGF-induced branching tubulogenesis of MDCK cells in collagen gel.J Cell Physiol 203,295-304(2005)(Wang,C.Z.,Hsu,Y.M.&Tang,M.J.DDR I在HGF诱导的胶原凝胶包埋MDCK细胞管腔化的功能研究细胞生理学杂志.203,295-304(2005))；
[0013] [6]Maeshima,A.,Sakurai,H.&Nigam,S.K.Adult kidney tubular cell population showing phenotypic plasticity,tubulogenic capacity,and integration capability into developing kidney.J Am Soc Nephrol 17,188-198(2006)(Maeshima,A.,Sakurai,H.&Nigam,S.K.成人肾小管细胞群具有开发人工肾脏的可塑性,管腔化和集成能力.美国肾病学杂志17,188-198(2006))；
[0014] [7]Joraku,A.,Stern,K.A.,Atala,A.&Yoo,J.J.In vitro generation of three-dimensional renal structures.Methods 47,129-133(2009)(Joraku,A.,Stern,K.A.,Atala,A.&Yoo,J.J.体外生成三维肾结构.研究方法.47,129-133(2009))；
[0015] [8]Ijima H,KakeyaY.Monolayer culture of primary rat hepatocytes on an Arg-Gly-Asp(RGD)-immobilized polystyrenedish express liver-specific functions of albumin production and p-acetamidophenol metabolismthesame as for spheroid culture[J],Biochem Eng J,2008,40:387(Ijima H,KakeyaY.等.原代大鼠肝细胞在RGD(Arg-Gly-Asp)包被的塑料皿内单层贴壁培养表现出同球体培养相同的肝细胞特有功能——白蛋白分泌和对羟基乙酰苯胺代谢.生物医学工程杂志.2008,40:387)；
[0016] [9]Chong Shen,Liang Zhang,Guoliang Zhang,and Qin Meng.Polymer Membrane and Cell Models for Drug Discovery.Combinatorial Chemistry&High Throughput Screening,2012,15,3-14(Chong Shen,Liang Zhang,Guoliang Zhang,and Qin Meng.用于药物发现的聚合物膜和细胞模型.组合化学和高通量筛选.2012,15,3-14)。
发明内容
[0017] 本发明要解决的技术问题是提供一种六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法。
[0018] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法，依次进行以下步骤：
[0019] 1)、中空纤维的灭菌：
[0020] 将中空纤维切成2～4cm(较佳为3cm)长的小段，浸泡于PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，然后一同进行灭菌，具体可为：置于蒸汽高压(1.1个大气压，121℃)灭菌锅灭菌(灭菌时间为20min)；
[0022] 2)、将2倍浓缩DMEM高糖培养基与胎牛血清按照100:4～6(较佳为100:5)的体积比混合，得含胎牛血清的培养基；将所述含胎牛血清的培养基与浓度为1.9～2.1g/L(较佳为2g/L)的鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液按照1:0.95～1.05(较佳为1:1)的体积比进行混合，得鼠尾胶原培养基混合液；
[0023] 所述2倍浓缩DMEM高糖培养基是指培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳素氢钠的浓度是常规DMEM基础培养基(高糖)的2倍；所述鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液是利用体积浓度为0.1％乙酸溶液进行配制的；
[0024] 3)、将肝癌细胞HepG2用鼠尾胶原培养基混合液稀释至5×106cells/mL注满(基本注满即可，可用微量进样器、通过10μL枪头注入)平躺(水平)状态下的步骤1)所得的灭菌后中空纤维的内腔；于37±0.2℃放置18～22分钟(例如为20分钟，目的是从而使胶原凝固)；
[0025] 4)、将步骤3)所得的培养有细胞的中空纤维置于六孔细胞培养板中，在六孔培养板的每孔中加入2～3mL的2倍浓缩DMEM高糖培养基，将培养板放入37±0.2℃、5％CO2细胞培养箱中进行静置培养；每1～2天更换一次培养基(每天需轻微晃动培养板)。
[0026] 备注说明：一般可连续培养7～15天。
[0027] 作为本发明的六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法的改进：所述步骤4)中，六孔板的每孔内放置6-12根的中空纤维(即，步骤3)所得的培养有细胞的中空纤维)。
[0028] 作为本发明的六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法的改进：所述中空纤维为聚醚砜(PES)中空纤维，孔径0.1μm，0.1MPa下纯水通量1000L/m2h，内/外径0.8/1.4mm。
[0029] 备注说明：在选用上述规格的中空纤维的前提下，一般而言，每3cm长的中空纤维，同理，步骤3)中加18～22μL(即20μL左右)的细胞悬液能基本注满中空纤维的内腔。
[0030] 在本发明中，凝胶包埋培养为细胞经鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包埋后在中空纤维管内进行培养。本发明的每根中空纤维含有约20ul的内腔体积(可用于包埋细胞)；
[0031] 本发明的六孔板肝细胞中空纤维反应器，肝癌细胞HepG2凝胶包埋在中空纤维管内，能够保持细胞完整形态和细胞体外代谢活性，真实的反映体内的代谢情况，可完成肝细胞的以下用途：
[0032] (1)用于研究药物代谢和毒理学的动物体外三维肝脏模型；
[0033] (2)作为功能食品功效因子的毒理学安全性评价技术；
[0034] (3)作为肾脏、小肠等其他器官细胞的体外三维培养模型构建的基础。
[0035] 即，为食品生产加工过程产生的有毒物质以及食品功能性因子的毒理学研究提供肝细胞体外培养三维模型；能为新药代谢及毒理学研究提供肝细胞体外培养三维模型；可用于实验室研究细胞培养条件以及获得代谢产物的小型装置。
[0036] 本发明可以较好保持肝细胞特性，能够对肝细胞进行长期三维培养，极大的简化了工业化应用中细胞三维培养的操作步骤。通过利用中空纤维管建立三维拟组织化细胞微型反应器模型，并与传统的单层贴壁培养作比较，证明该培养模型模拟体内细胞之间的微环境，较好地在体外维持了细胞的功能和活性，显示出评价外源化合物在体内的代谢及所引起的肝毒性评价的优越性和可行性。
[0037] 本发明主要针对现有的药物毒理学体外评价模型的不足，提出体外细胞模型如何更好和更全面用于预测体内外源化合物作用的新理念，构建一种可用于功能性成分毒性评价的细胞拟组织化模型，用于食品加工生产过程产生的有毒物质以及功能食品功效因子的毒理学安全性评价。该模型通过鼠尾胶原蛋白Ⅰ型将肝癌细胞HepG2包埋在中空纤维管内，多孔中空纤维管和胶原凝胶分别模拟了血管和肝脏结缔组织，构成类似肝脏的微环境，使肝细胞能长期维持肝合成功能。因此，本发明作为一种操作简单方便，便于扩大培养的小型化药物代谢和筛选的装置，对于动物细胞的拟组织化和药物毒理学评价的研究具有重要意义。
[0038] 综上所述，本发明公开了一种六孔板肝细胞中空纤维反应器，它包括六孔细胞培养板和中空纤维管，每孔内可放置6-12根长度约为3cm的中空纤维管；因聚醚砜(PES)材质中空纤维管具有适合细胞生存的传递氧气和物质交换能力，将肝癌细胞(HepG2)包埋在纤维管内能够形成类似于组织中的结构，能够真实的反映体内的代谢情况，可以在接近生理状态下进行药物的代谢和毒理学研究。该反应器也可用于肾脏、小肠等其他器官细胞的三维培养。同时，该模型也可用于食品加工生产过程中产生的有毒物质和食品功能性因子的毒性评价，确立快速、简便的观察指标，实现高通量筛选要求，为功能食品的早期毒理学安全性评价提供一个新的技术平台。附图说明
[0039] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0040] 图1是六孔培养板肝细胞中空纤维反应器的结构示意图。
[0041] 图2是实验1中12孔板单层贴壁培养和中空纤维反应器培养不同时间肝细胞尿素氮含量变化。
[0042] 图3是实验1中12孔板单层贴壁培养和中空纤维反应器培养不同时间肝细胞白蛋白含量变化。
[0043] 图4是实验2中12孔板单层贴壁培养和中空纤维反应器培养肝细胞，不同浓度丙烯酰胺作用不同时间对细胞存活率的影响。其中A为作用12小时，B为作用24小时，C为作用48小时，D为作用72小时。
[0044] 图5是实验3中12孔板单层贴壁培养和中空纤维反应器培养肝细胞，不同浓度亚硝酸钠作用不同时间对细胞存活率的影响。其中A为作用12小时，B为作用24小时，C为作用48小时，D为作用72小时。
[0045] 图6是实验4中12孔板单层贴壁培养和中空纤维反应器培养肝细胞，不同浓度桑葚花色苷作用72小时对细胞尿素氮含量的影响。
具体实施方式
[0046] 实施例1、一种六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法：
[0047] 如图1所示，本发明的六孔细胞培养板肝细胞中空纤维反应器，包括六孔细胞培养板和中空纤维管，所述六孔培养板的每孔内放置6～12根3cm长的中空纤维管，肝癌细胞通过鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包埋在所述中空纤维管中。
[0048] 六孔细胞培养板为市售用于细胞单层贴壁培养板，为透明聚苯乙烯(PS)材质，该板为一次性无菌包装。中空纤维管的材料是聚醚砜(PES)材质，内径0.8mm，外径1.4mm，孔径2
为0.1μm。0.1MPa下纯水通量1000L/mh。
为0.1μm。0.1MPa下纯水通量1000L/mh。
[0049] 六孔板肝细胞中空纤维反应器的构建方法，依次进行以下步骤：
[0050] 1)、中空纤维的灭菌：
[0051] 将中空纤维切成3cm长的小段，浸泡于PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，然后一同置于蒸汽高压灭菌锅灭菌，1.1个大气压，121℃，灭菌时间为20min。
[0052] 待灭菌完毕，在超净台中取出中空纤维置于平皿上铺开风干，一般需要放置过夜。
[0053] 2)、中空纤维预先铺被胶原：
[0054] 将2倍浓缩DMEM高糖培养基与胎牛血清按照100:5的体积比混合，得含胎牛血清的培养基(即，含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基)；将含胎牛血清的培养基与浓度为2g/L的鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液按照1:1的体积比进行混合，得鼠尾胶原培养基混合液；
[0055] 所述2倍浓缩DMEM高糖培养基是指培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳素氢钠的浓度是常规DMEM基础培养基(高糖)的2倍；所述鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液是利用体积浓度为0.1％乙酸溶液(乙酸水溶液)进行配制的；
[0056] 3)、将肝癌细胞HepG2用鼠尾胶原培养基混合液稀释至5×106 cells/mL注入(可用微量进样器注入)至平躺(水平)状态下的步骤1)所得的灭菌后中空纤维的内腔，直至该中空纤维内腔充满肝癌细胞HepG2悬液(20μL左右)，于37±0.2℃放置20分钟，从而使胶原凝固；
[0057] 4)、将步骤3)所得的培养有细胞的中空纤维置于六孔细胞培养板中，在六孔培养板的每孔中加入2～3mL的2倍浓缩DMEM高糖培养基，将培养板放入37±0.2℃、5％CO2细胞培养箱中进行静置培养；每1～2天更换一次培养基(每天需轻微晃动培养板)。可连续培养7～15天。
[0058] 一般而言，当六孔培养板的每孔内放置6～10根3cm长的中空纤维管时，每孔中加入2mL的2倍浓缩DMEM高糖培养基；当六孔培养板的每孔内放置11～12根3cm长的中空纤维管时，每孔中加入3mL的2倍浓缩DMEM高糖培养基。
[0059] 实验1：(单层贴壁培养同中空纤维反应器培养对比)
[0060] 如同实施例1所述，将含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基和利用体积浓度为0.1％乙酸溶液进行配制的2g/L鼠尾胶原蛋白Ⅰ型按照1:1比例混匀。收获肝癌细胞HepG2按照5*106个细胞每毫升的密度接种于该混合液中，每根3cm长纤维丝内注入20ul细胞悬液使其充满中空纤维管腔内，37℃放置20分钟使胶原凝固。将10根中空纤维管加入六孔细胞培养板一个孔内，每孔再加入2ml的2倍浓缩DMEM高糖培养基置于37℃、5％CO2细胞培养箱内静置培养，每天更换一次培养基。
[0061] 将同批肝癌细胞HepG2按照1×106个细胞每毫升的密度接种12孔板(每孔1ml细胞稀释液)，每孔加入1～2ml含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基，培养条件与上述相同。
[0062] 待12孔板细胞贴壁后(12-24h)，12孔板和6孔板每隔24h相应更换一次新鲜培养基。每组重复三次，测定肝功能指标白蛋白、尿素氮。
[0063] 根据图2所示，培养3天后的HepG2细胞的培养基中尿素氮含量增长较快，随后平皿单层培养组增长放缓趋于稳定，而中空纤维膜组在培养6天左右仍有增长，表明中空纤维培养的HepG2细胞在较长时间的培养中具有更持久的分泌能力；根据图3所示，在前3天的培养中，实验组细胞的培养基取样显示白蛋白含量均有大幅上升，说明细胞具有良好的生长能力和白蛋白合成分泌能力。培养第4天后单层贴壁培养细胞的白蛋白量开始下降，而PES中空纤维凝胶包埋组仍有上升趋势，培养一周左右开始下降。
[0064] 综上所述，本发明的中空纤维三维培养更能维持细胞的长期培养和增殖。
[0065] 实验2：(在丙烯酰胺毒性上的比较)
[0066] 如同实施例1所述，将含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基和利用体积浓度为0.1％乙酸溶液进行配制的2g/L鼠尾胶原蛋白Ⅰ型按照1:1比例混匀。收获肝癌细胞HepG2按照5×106个细胞每毫升的密度接种于该混合液中，每根3cm长纤维丝内注入20ul细胞悬液使其充满中空纤维管腔内，37℃放置20分钟使胶原凝固。将10根纤维管加入六孔细胞培养板一个孔内，每孔再加入2ml的2倍浓缩DMEM高糖培养基置于37℃、5％CO2细胞培养箱内静置培养，每天更换一次培养基。
[0067] 将同批肝癌细胞HepG2按照1×106个细胞每毫升的密度接种12孔板，每孔加入1～2ml含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基，培养条件与上述相同。
[0068] 待12孔板细胞贴壁后(12-24h)，12孔板和6孔板分别加入不同浓度的丙烯酰胺每隔24h更换一次新鲜培养基。每组重复三次，测定肝细胞活率。
[0069] 根据图4可知，对于单层贴壁培养，12h后同对照组相比丙烯酰胺处理组细胞活率均未出现显著差异，凝胶包埋三维培养在丙烯酰胺浓度为10mM和25mM时表现出显著的细胞增殖抑制作用；丙烯酰胺作24h后，单层贴壁培养在丙烯酰胺浓度为10mM时表现出显著抑制作用，而凝胶包埋三维培养在丙烯酰胺浓度为5mM时已表现出显著的细胞增殖抑制作用；随着处理时间延长，丙烯酰胺作48h和72h后，单层贴壁培养在丙烯酰胺浓度为10mM时表现出显著抑制作用，而凝胶包埋三维培养在丙烯酰胺浓度为1mM时已表现出显著的细胞增殖抑制作用。以上结果说明，凝胶包埋三维培养对于丙烯酰胺毒性较为敏感。
[0070] 实验3：(在亚硝酸钠毒性上的比较)
[0071] 如同实施例1所述，将含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基和利用体积浓度为0.1％乙酸溶液进行配制的2g/L鼠尾胶原蛋白Ⅰ型按照1:1比例混匀。收获肝癌细胞HepG26
按照5×10个细胞每毫升的密度接种于该混合液中，每根3cm长纤维丝内注入20ul细胞悬液使其充满中空纤维管腔内，37℃放置20分钟使胶原凝固。将10根纤维管加入六孔细胞培养板一个孔内，每孔再加入2ml的2倍浓缩DMEM高糖培养基置于37℃、5％CO2细胞培养箱内静置培养，每天更换一次培养基。
按照5×10个细胞每毫升的密度接种于该混合液中，每根3cm长纤维丝内注入20ul细胞悬液使其充满中空纤维管腔内，37℃放置20分钟使胶原凝固。将10根纤维管加入六孔细胞培养板一个孔内，每孔再加入2ml的2倍浓缩DMEM高糖培养基置于37℃、5％CO2细胞培养箱内静置培养，每天更换一次培养基。
[0072] 将同批肝癌细胞HepG2按照1×106个细胞每毫升的密度接种12孔板，每孔加入1～2ml含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基，培养条件与上述相同。
[0073] 待12孔板细胞贴壁后(12-24h)，12孔板和6孔板分别加入不同浓度的亚硝酸钠每隔24h更换一次新鲜培养基。每组重复三次，测定肝细胞活率。
[0074] 根据图5可知，对于单层贴壁培养和凝胶包埋三维培养，细胞在培养12h和24h后同对照组相比亚硝酸钠处理组细胞活率均在浓度为10mg/ml时表现出显著的细胞增殖抑制作用；随着处理时间延长，亚硝酸钠作48h和72h后，单层贴壁培养在亚硝酸钠浓度为5mg/ml时表现出显著抑制作用，而凝胶包埋三维培养在亚硝酸钠浓度为0.01mg/ml时已表现出显著的细胞增殖抑制作用。以上结果说明，凝胶包埋三维培养对于亚硝酸钠毒性较为敏感。
[0075] 实验4：(桑葚花色苷护肝作用)
[0076] 如同实施例1所述，将含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基和利用体积浓度为0.1％乙酸溶液进行配制的2g/L鼠尾胶原蛋白Ⅰ型按照1:1比例混匀。收获肝癌细胞HepG2按照5×106个细胞每毫升的密度接种于该混合液中，每根3cm长纤维丝内注入20ul细胞悬液使其充满中空纤维管腔内，37℃放置20分钟使胶原凝固。将10根纤维管加入六孔细胞培养板一个孔内，每孔再加入2ml的2倍浓缩DMEM高糖培养基置于37℃、5％CO2细胞培养箱内静置培养，每天更换一次培养基。
[0077] 将同批肝癌细胞HepG2按照1×106个细胞每毫升的密度接种12孔板，每孔加入1～2ml含5％胎牛血清的2倍浓缩DMEM高糖培养基，，培养条件与上述相同。
[0078] 待12孔板细胞贴壁后(12-24h)，12孔板和中空纤维管分别加入不同浓度的桑葚花色苷每隔24h更换一次新鲜培养基。每组重复三次，花色苷作用72h后测定肝功能指标尿素氮。
[0079] 桑葚花色苷作为一种食品功能性因子，具有一定护肝作用。根据图6可知，不同浓度的花色苷作用72h后同12孔板单层贴壁培养相比，在花色苷浓度为0.2mg/ml,0.5mg/ml和1mg/ml时凝胶包埋三维培养均能够增加尿素氮分泌了，增强了肝脏分泌功能。以上结果表明凝胶包埋三维培养具有更为显著护肝作用。
[0080] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 | 2020-05-08 | 263 |
| 一种通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法 | 2020-05-08 | 225 |
| 一种间充质干细胞培养的补料及培养方法 | 2020-05-08 | 277 |
| 用于神经细胞培养的培养基组合物 | 2020-05-11 | 846 |
| 食品和餐饮具中金黄色葡萄球菌快速检测冷水凝胶试纸片制备方法 | 2020-05-11 | 298 |
| 用于治疗血液病症的丙酮酸激酶激活剂 | 2020-05-08 | 199 |
| 一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法 | 2020-05-08 | 129 |
| 一种利用甲醛还原NAD类似物的方法 | 2020-05-11 | 369 |
| 一种含脐带提取物的祛斑精华液及其制备方法 | 2020-05-11 | 34 |
| 一种玉米秸秆保温混凝土砌体材料制作方法 | 2020-05-08 | 378 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈