线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的功能及应用
阅读：584发布：2020-05-08
专利汇可以提供线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的功能及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种线粒体抗病毒 信号 蛋白MAVS在保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的功能及应用。通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，发现MAVS基因敲除小鼠的体重、空腹血糖均显著高于对照组野生型小鼠。肝脏重量、肝重体重比、H&E及油红O 染色 结果均表明高脂饮食诱导后MAVS KO小鼠脂肪肝恶化，脂质累积增加。 葡萄糖 耐量、胰岛素耐量、丙 酮 酸 耐量结果均表明与WT相比，MAVS KO组对葡萄糖的耐受和调控能 力 明显减弱。综上，MAVS可作为 治疗 脂肪肝和/或II型糖尿病的药物靶标，其促进剂可用于制备治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物。，下面是线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的功能及应用专利的具体信息内容。
1.一种线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在制备保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在制备保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的应用，其特征在于：所述MAVS基因作为药物靶标用以筛选保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物。
3.根据权利要求1或2所述的线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在制备保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的应用，其特征在于：所述药物是促进MAVS基因表达的药物。
4.一种线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中的应用，其特征在于：所述MAVS基因作为药物靶标用以筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物。
6.根据权利要求4或5所述的线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中的应用，其特征在于：所述药物是促进MAVS基因表达的药物。
线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在保护肝脏及维持糖代谢稳态的
药物中的功能及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因的功能与应用领域，具体是指一种线粒体抗病毒信号蛋白 (mitochondrial antiviral signaling protein)即MAVS在保护肝脏及维持糖代谢稳 态的药物中的功能及应用。技术背景
[0002] 随着社会经济的发展，都市化生活和饮食结构的改变，肥胖导致的脂肪肝、 糖尿病、代谢综合征等代谢类疾病在全世界广泛流行，已成为人类健康的巨大威 胁。
[0003] 中国是全球糖尿病患者最多的国家，并且发病率呈急剧上升趋势。根据 Diabetes最新发表的统计数据表明，中国糖尿病发病率从1980年不到1％，到2013 年增加至10.9％，糖尿病前期患病率更是高达35.7％。其中，II型糖尿病(胰岛 素非依赖性糖尿病)占糖尿病总数的90％[1]。II型糖尿病的发病机制尚不明确， 胰岛素抵抗和β细胞功能障碍被认为是主要机制，而更深一层的分子机制仍亟待 挖掘。糖尿病可通过饮食控制、运动治疗、药物治疗和血糖检测进行控制和改善。 药物治疗方面，除了注射胰岛素，口服降糖药主要通过促进胰岛素分泌(格列奈 类)、增加胰岛素敏感性(噻唑烷二酮类)、抑制肝糖元转化为血糖(二甲双胍) 等途径实现改善血糖的效果。尽管治疗方式很多，目前中国的II型糖尿病控制仍 不容乐观。中国城市居民的糖尿病治疗比例仅为41.8％，农村居民仅为27.6％。 并且，在接受治疗的患者中，仅有一半患者的血糖得到了充分的控制。
[0004] 肝脏是人体物质代谢的中枢，也是调控血糖的最主要器官之一。脂肪肝是目 前最常见的慢性肝脏疾病，根据其致病因素分为酒精性脂肪肝(ALD)和非酒精 性脂肪肝(NAFLD)，其中NAFLD的发生多与肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗相 关，提示NAFLD与II型糖尿病有着密切联系。NAFLD是一种以肝实质细胞脂 肪变性、气球样变、肝小叶炎症反应、轻度胶原沉积为病理特征的综合征。全球 流行病学调查结果显示，西方发达国家NAFLD患病率达20～30％。中国一线城 市上海、广州NALFD患病率达15％。NAFLD已成为我国仅次于病毒性肝炎的 第二大肝脏疾病。与NAFLD高发病率相对的，是其治疗方法的匮乏。除了控制 体重和生活干预，NAFLD尚无临床药物。虽然近年胰岛素增敏剂、抗氧化剂等 药物在NAFLD治疗上的尝试不断，但治疗效果都差强人意。
[0005] 线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)是宿主抗感染天然免疫信号通路中的一个 重要接头蛋白。在病毒天然免疫过程中，RIG-I,MDA5等模式识别受体(PRR) 识别病毒来源的dsRNA并将细胞传递给定位于线粒体外膜的MAVS，MAVS通 过自身CARD结构域多聚化，激活下游免疫事件。线粒体是细胞能量代谢工厂， MAVS定位于线粒体，但其在代谢中的功能，尤其是在脂肪肝和II型糖尿病中的 作用尚未见报道。本发明主要集中在研究MAVS基因表达与脂肪肝和II型糖尿 病之间的关系，以期为脂肪肝和II型糖尿病的治疗找到新的靶点。
发明内容
[0006] 为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种线粒体抗病 毒信号蛋白MAVS的表达与脂肪肝和II型糖尿病之间的关系，提供一个用于治 疗脂肪肝和II型糖尿病的新靶基因MAVS，进而将MAVS基因应用于脂肪肝和 II型糖尿病的治疗。
[0007] 为实现上述目的，本发明的方案如下：
[0008] 第一方面，本发明提供一种线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在制备保护肝脏及 维持糖代谢稳态的药物中的应用。
[0009] 作为优选方案，所述MAVS基因作为药物靶标用以筛选保护肝脏及维持糖代 谢稳态的药物。
[0010] 进一步地，所述药物是促进MAVS基因表达的药物。
[0011] 第二方面，本发明提供了一种线粒体抗病毒信号蛋白MAVS在制备预防、缓 解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中的应用。
[0012] 作为优选方案，所述MAVS基因作为药物靶标用以筛选预防、缓解和/或治 疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物。
[0013] 进一步地，所述药物是促进MAVS基因表达的药物。
[0014] 本发明以MAVS基因敲除小鼠(MAVS KO)和野生型小鼠(Wild type,WT) 为实验对象，通过高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠模型研究MAVS在脂肪肝和 II型糖尿病中功能。结果发现，MAVS KO小鼠表现出肥胖，体重和空腹血糖明 显高于WT小鼠。进一步通过腹腔注射葡萄糖、胰岛素或丙酮酸耐量实验，发现 MAVS KO小鼠的葡萄糖耐受能力、血糖控制能力都明显减弱。小鼠肝重、肝重 体重比、肝脏H&E和油红O染色结果均表明MAVS KO小鼠脂肪肝病变更严重。 以上结果表明MAVS基因敲除会恶化脂肪肝和II型糖尿病，MAVS具有抑制脂 肪肝和II型糖尿病的作用。进一步的，分离原代肝细胞并在其中过表达MAVS， 经过PA/OA刺激后进行油红O染色发现，与未过表达MAVS的对照组相比， MAVS过表达组肝细胞中细胞着色减轻，即细胞中脂质的积累减少，说明MAVS 过表达可以抑制脂肪肝和II型糖尿病的进程。
[0015] 本发明的研究证明：MAVS具有抑制肥胖，减轻肝脂变性；降低血糖，改 善胰岛素抵抗的功能。
[0016] 针对MAVS的上述功能，提供MAVS作为药物靶点在筛选保护肝脏及维持 糖代谢稳态的药物中的应用。
[0017] 针对MAVS的上述功能，提供MAVS作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或 治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中的应用。
[0018] 以上药物是指能够促进MAVS基因表达的药物。
[0019] 相对于现有技术，本发明具有如下的优点及有益效果：
[0020] (1)本发明发现MAVS基因的新功能，即MAVS基因具有抑制脂肪肝和II 型糖尿病的作用。
[0022] 图1是MAVS KO小鼠构建策略。
[0023] 图中：A为C57BL/6J小鼠MAVS基因结构及sgRNA靶向序列示意图。
[0024] 图2是F2代小鼠野生型(WT)、MAVS敲除纯合子(KO)及杂合子(HZ) 小鼠的基因结构测序图
[0025] 其中CRISPR-Cas9技术构建的MAVSKO小鼠MAVS基因有20bp缺失。
[0026] 图3是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 16周的体重结果图；
[0027] 图中：**:p<0.01,***:p<0.001MAVSKO-HFDv.s.WT-HFD组,N＝20～24/组；###:p<0.001WT-HFDv.s.WT-NC,N＝20～24/组。
[0028] 图4是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 16周的肝重结果图；
[0029] 图中：n.s.表示没有显著性,***:p<0.001,N＝20～24/组。
[0030] 图5是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 16周的肝重比体重结果图；
[0031] 图中：n.s.表示没有显著性,***:p<0.001,N＝20～24/组。
[0032] 图6是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 16周的HE染色及油红O染色结果图；
[0033] 图7是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 后通过腹腔注射葡萄糖耐量实验结果图。
[0034] 图中：**:p<0.01,***:p<0.001MAVSKO-HFDv.s.WT-HFD组,N＝20～24/组。
[0035] 图8是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 后通过腹腔注射葡萄糖耐量的曲线下面积结果图。
[0036] 图中：n.s.表示没有显著性,***:p<0.001,N＝20～24/组。
[0037] 图9是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 后通过腹腔注射胰岛素耐量实验结果图。
[0038] 图中：**:p<0.01,***:p<0.001MAVSKO-HFDv.s.WT-HFD组,N＝20～24/组。
[0039] 图10是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 后通过腹腔注射胰岛素耐量的曲线下面积结果图。
[0040] 图中：***:p<0.001,N＝20～24/组。
[0041] 图11是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 后通过腹腔注射丙酮酸耐量实验结果图。
[0042] 图中：**:p<0.01,***:p<0.001MAVSKO-HFDv.s.WT-HFD组,N＝20～24/组。
[0043] 图12是WT和MAVS KO小鼠在普通饮食(NC)和高脂饮食(HFD)饲养 后通过腹腔注射丙酮酸耐量的曲线下面积结果图。
[0044] 图中：***:p<0.001,N＝20～24/组。
[0045] 图13是对照组(Ad-GFP)以及MAVS过表达(Ad-MAVS)组细胞中MAVS 蛋白表达Westernblot鉴定结果图。
[0046] 图14是对照组(Ad-GFP)以及MAVS过表达(Ad-MAVS)组细胞经PA/OA 刺激后油红O染色结果图。
具体实施方式
[0047] 通过以下详细说明结合附图，可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供 的实施例仅是针对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明解释的其余内 容。
[0048] (1)实验动物及饲养：
[0049] 实验动物种属，性别，周龄及来源：野生型C57BL/6(WT)小鼠和MAVS基 因敲除(MAVS KO)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科 技有限公司；MAVS KO小鼠由本中心构建。
[0050] MAVS KO小鼠构建策略：利用CRISPR-Cas9技术构建全身性MAVS基因敲 除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)预测小 鼠MAVS的引导序列，设计2条单链oligo：
[0051] oligo1：TAGGGCTGTCTTCCAGGATCGACTGC(SEQ1)，
[0052] oligo2：AAACGCAGTCGATCCTGGAAGACAGC(SEQ2)。
[0053] oligo1和oligo2退火形成双链DNA，将双链DNA连入经BsaI限制性内切酶 酶切的pUC57-sgRNA(Addgene 51132)构建sgRNA表达载体。
[0054] 以上述构建的sgRNA表达载体为模板，使用如下引物通过PCR扩增含有T7 启动子及引导序列的DNA片段：
[0055] Forward primer：GATCCCTAATACGACTCACTATAG(SEQ3)
[0056] Reverse primer：AAAAAAAGCACCGACTCGGT(SEQ4)
[0057] 以所扩增的PCR产物为模板使用T7 Transcription Kit(Invitrogen,AM1354) 进行体外转录；Cas9质粒(Addgene 44758)通过T7 ULTRA Transcription Kit (Invitrogen,AM1345)进行转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用 Transcription Clean-Up Kit(Invitrogen,AM1908)纯化后，通过FemtoJet 5247显微 注射系统注射入C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内，并将其移植到代孕雌鼠输卵管 中，经过19天妊娠之后得到F0代小鼠。
[0058] 小鼠出生2周后，取耳部或尾部组织，提取基因组DNA进行鉴定。基因编 辑小鼠用以下引物进行基因鉴定，野生型小鼠包含一段长374bp的DNA序列， 而突变小鼠(MAVS基因敲除小鼠)该DNA序列发生切割，进行DNA修复时 造成20bp缺失，从而导致目的基因编码过程发生移码突变，实现目的基因的敲 除：。其中，PCR鉴定引物如下：
[0059] MAVS-F：5’-CCTGCAAACCTTGATGTGGC-3’(SEQ5)，
[0060] MAVS-R：5’-AGTCACTTGATCAGCCAGCC-3’(SEQ6)。
[0061] MAVS KO小鼠的构建策略见图1，实验所用小鼠为突变体纯合子，鉴定结 果见图2。
[0062] 实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司， 货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的 热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司， 货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的 热量质量比:3.85kcal/g。
[0063] 动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所 SPF级动物房(许可证号：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12小时交替照明，温 度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。
[0064] 实施例1 MAVS基因敲除促进脂肪肝及Ⅱ型糖尿病的发生
[0065] (1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和MAVS KO小鼠，分别 给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲 料(Normal chow，NC)饲养，即WTNC组，MAVS KO NC组，WT HFD组， MAVS KO HFD组共4个组别。
[0066] (2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：
[0067] 采用WT和MAVS KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确MAVS 基因对脂肪肝、Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和MAVS KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfat diet，HFD)和 D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WTNC组，MAVS KO NC组， WT HFD组，MAVS KO HFD组共4个组别。每4周记录小鼠空腹体重每隔4周 检测1次。实验第14周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体 对葡萄糖耐受能力。实验第15周，进行腹腔注射胰岛素实验(IPITT)，以评价 小鼠机体对胰岛素耐受能力。实验第16周，进行腹腔注射丙酮酸实验(IPPTT)， 以评价小鼠机体对丙酮酸耐受能力。第16周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然 后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰冻切片包埋剂(Tissue Freezing Medium) 包埋作为病理分析用。
[0068] (3)小鼠空腹体重检测
[0069] ①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。
[0070] ②称重：分别在第0周、4周、8周、12周、16周称重，将一塑料小桶放在 动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。
[0071] (4)葡萄糖、胰岛素、丙酮酸耐量实验
[0072] 实验第14、15、16周，分别进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)、腹腔注射 胰岛素实验(IPITT)、腹腔注射丙酮酸实验(IPPTT)、，以评价小鼠机体对糖稳 态的调控能力。
[0073] ①在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，IPGTT用10％葡萄糖溶液按 100μL/g计算葡萄糖的注射体积。IPITT用0.15IU/mL胰岛素按5μL/g计算胰岛素 注射体积。IPPTT用0.2g/ml丙酮酸溶液按10μL/g计算注射体积。
[0074] ②先检测注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡糖糖、 胰岛素或丙酮酸溶液。
[0075] ③腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠 的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。 ②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的 夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹 部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。
[0076] ④分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖 值，并记录血糖数值和检测时间。
[0077] (5)肝脏大体外观及肝脏组织脂质成分测定
[0078] 1)终末肝脏组织取材
[0079] ①小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部 毛发润湿。
[0081] ③迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝 脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。
[0083] 2)肝脏组织处理及病理染色相关实验
[0084] ①肝脏脱水，透明，浸蜡
[0085] 切取10％中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流 量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，①脱水：75％ 酒精(45分钟)→75％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→85％酒精(45 分钟)→95％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→无水酒精(1小时)→无 水酒精(1小时)；②透明：二甲苯(1小时)→二甲苯(1小时)；③浸腊(65℃)： 石蜡(1小时)→石蜡(1小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进 机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组 织，同时清洗机器备用。
[0086] ②肝脏组织切片
[0087] 使用切片机切片(切片厚度5μm)。
[0088] ③肝脏组织苏木精-伊红(HE)染色
[0089] 将肝脏组织石蜡切片放入65℃烘箱(30分钟)→二甲苯中(5分钟×3次) →100％酒精(1分钟)→90％酒精(1分钟)→70％酒精(1分钟)→蒸馏水洗→ 苏木素(5分钟)→自来水洗去切片上的浮色→1％盐酸酒精(1至3秒)→自来 水洗数下→Scott促蓝液(碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100mL)(1分钟) →自来水洗数下→伊红(1分钟)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70％酒精一下 →90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分钟×
3次)→在二甲苯 未干时封片，拍照。
3次)→在二甲苯 未干时封片，拍照。
[0090] ④肝脏组织油红O染色
[0092] b.以60％异丙醇处理1分钟。
[0093] c.用油红O(公司sigma，货号O0625，浓度0.5克/100mL 100％异丙醇)染 色30分钟。
[0094] d.之后以60％异丙醇漂洗1分钟×3次，直至背景干净。
[0095] e.用Mayer’s苏木素染液(5滴)淡染细胞核。
[0096] f.水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。
[0097] g.用甘油明胶封片，拍照。
[0098] 脂肪肝严重程度的评估指标主要包括体重、肝重、肝重体重比以及肝脏脂质 积累程度。其中小鼠体重变化结果如图3所示，从第4周开始HFD组的MAVS KO 小鼠体重明显高于HFD组的WT小鼠体重，一直持续到第16周；小鼠肝重及肝 脏重量与小鼠本身体重比值检测结果如图4、5所示，MAVS KOHFD组小鼠无 论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较WT HFD组高。进一步通过组 织切片，进行H&E和油红O染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织在高脂饮食 饲养条件下发生了显著的病理改变。通过肝脏H&E染色，可以观察到在HFD饲 养16周后，WT小鼠只有轻微的脂肪沉积，而MAVS KO小鼠肝脏组织很强的脂 肪沉积(如图6上行)。通过肝脏油红O染色来检测肝组织中脂质，可以发现 MAVS KO肝门静脉周围的脂质沉积明显高于WT组(如图6下行)。这些结果说 明MAVS基因敲除加剧小鼠肝脏脂肪化。
[0099] Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括葡萄糖耐量、胰岛素耐量和丙 酮酸耐量等。通过腹腔注射葡萄糖、胰岛素或丙酮酸耐量实验来评估各组小鼠对 葡萄糖的调控能力。注射葡萄糖后，小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰 值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高 于空腹血糖水平，在2小时时恢复至空腹血糖水平。两个基因型(MAVS KO和 WT)HFD组的各时间点血糖水平均高于NC组，说明HFD诱导II糖代谢异常 模型构建成功；MAVS KO小鼠血糖水平从15分钟至2小时一直处于高于WT 小鼠的血糖水平(图7)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(area under the curve， AUC)，发现NC饲养条件下，MAVS KO小鼠与WT无明显区别；而HFD条件 下，MAVS KO小鼠的AUC面积显著高于WT小鼠(图8)。注射胰岛素后，小 鼠血糖水平随时间下降，并在30分钟达到最低，1到2小时缓慢上升。无论在 HFD还是NC条件下，MAVS KO小鼠在各个时间点的血糖水平以及胰岛素耐量 曲线下面积(AUC)均显著高于WT组，说明MAVS基因在正常和高脂条件都 参与胰岛素对血糖稳态对调控(图9-10)。注射丙酮酸后，小鼠血糖水平随时间 上升，并在30分钟左右时达到峰值，60分钟以后开始缓慢下降，2小时降到空 腹血糖水平。HFD条件下，MAVS KO小鼠在各个时间点的血糖水平以及胰岛素 耐量曲线下面积(AUC)均显著高于WT组；而在NC条件下，MAVS KO组的 AUC显著低于WT组。说明MAVS基因在正常和高脂条件都参与胰岛素对血糖 稳态对调控(图11-12)。以上结果均表明MAVS基因对维持糖代谢稳态具有强 大的调控能力。
[0100] 上述结果显示MAVS KO小鼠在HFD的诱导下发生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝 病变显著加重。这些结果表明MAVS基因对改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有显著的 作用。本发明结果说明MAVS基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着重要的 保护作用。
[0101] 实施例2 MAVS基因过表达抑制肝脏脂质沉积
[0102] (1)MAVS过表达腺病毒的构建：由上海和元生物定制。
[0103] (2)原代小鼠肝细胞的分离与培养：
[0104] 采用IV型胶原酶消化分离小鼠原代肝细胞。小鼠乙醚吸入麻醉，留置针穿 刺门静脉，肝脏原位灌流(SC-1和SC-2轮流灌注)至肝脏消化完全，取下肝脏， 反复吹打并过滤，收集肝细胞悬液。
[0105] 配适量的IX鼠尾胶(现用现配)：用灭菌的超纯水将无水乙醇稀释为30％乙 后，0.22μΜ滤器过滤，然后将100×的鼠尾胶稀释为1×。
[0106] 六孔板中每孔加入稀释后鼠尾胶200μl,旋转六孔板，使胶铺满整个板底。 开盖,在超净台吹风过夜。铺细胞之前要将吹干的板子打开,紫外照射30min。
[0107] 台盼蓝染色进行细胞计数后，每个六孔板5×105/well铺细胞。铺板后2小 时进行换液。
[0108] (3)腺病毒感染及鉴定
[0109] 铺板第二天加以感染系数(m.o.i.)＝50加入Ad-GFP(对照)或Ad-MAVS (MAVS过表达)腺病毒。腺病毒感染小鼠原代肝细胞48h后，收集细胞，提蛋白， 进行Western Blotting检测，检测MAVS蛋白的表达。
[0110] (4)Western Blotting检测：
[0111] 1)蛋白提取
[0112] 原代肝细胞蛋白提取：小鼠原代肝细胞加入裂解液，裂解完成后离心取上清， 运用BCA Protein Assay Kit(PierecTM，23225)定量收集蛋白样品。
[0113] 2)上样与电泳
[0114] 配置好电泳凝胶，并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE 胶加样孔内，点样完成后开始电泳。
[0115] 3)转膜
[0116] ①配制转膜液，于4℃预冷。
[0117] ②将PVDF在甲醇中浸泡15s后放入转膜液中备用。
[0119] ④将夹板放入转膜槽中，灌满转膜液以淹没凝胶。
[0121] ⑥转移结束后，取出PVDF膜。
[0122] 4)封闭
[0123] 把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封 闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1-4h。
[0124] 5)一抗孵育
[0125] ①用TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min。
[0126] ②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗。
[0127] ③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。
[0128] 6)二抗孵育
[0129] ①将薄膜取出用TBST洗涤3次，每次5min，回收一抗。
[0130] ②将膜放入对应的加有二抗的二抗稀释液中，避光孵育1h。
[0131] 7)蛋白检测
[0132] 孵育后用TBST洗涤3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像 系统检测目的条带。
[0133] (5)PA/OA刺激及油红O染色
[0134] 细胞经腺病毒感染完成后，换成含PA 0.5mM和OA 1mM的脂性培养基，刺激 24h以后进行油红O染色。
[0135] PBS轻柔洗涤六孔板内细胞两次；4％多聚甲醛固定常温半小时或4℃过夜； 弃多聚甲醛，并用PBS洗涤2次；60％异丙醇洗一次；在通风橱内风干，务必不留 水分；加入400-500uL已用0.22mm过滤好的60％的油红O(当天用当天配)，细胞 染色时间大约5min，以能看到明显的红色脂滴为宜；弃油红O，PBS洗三次；镜 下观察拍照。
[0136] MAVS过表达对脂滴累积的效果如图13所示。Ad-MAVS显著上调MAVS表达 水平。油红O染色结果如图14所示，与Ad-GFP对照组相比，Ad-MAVS组原代肝 细胞上PA+OA诱导的脂滴明显减少。这一结果说明MAVS表达上调可显著抑制肝 细胞脂质沉积。
[0137] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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