可有效利用丙酮酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建和应用
阅读：702发布：2020-05-11
专利汇可以提供可有效利用丙酮酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种强化丙 酮 酸 有效利用提高亮 氨 酸产量的谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程领域。本发明应用基因工程方法，敲除谷氨酸棒杆菌中参与胞内草酰乙酸回补途径的 丙酮酸 羧化酶基因pyc、参与丙氨酸合成的丙氨酸转氨酶基因avtA；同时为弱化竞争支路丙氨酸合成能 力 ，在alaT基因前添加T3终止子弱化其表达 水 平，实现重组菌胞内丙酮酸的有效利用，获得了L-亮氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌。该重组谷氨酸棒杆菌的亮氨酸产量比出发菌株提高了15.3％。此发明成功强化了丙酮酸的利用，提高了丙酮酸到L-亮氨酸的合成通量，这也为选育丙酮酸族氨基酸高产菌提供了新的思路。，下面是可有效利用丙酮酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建和应用专利的具体信息内容。
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述重组谷氨酸棒杆菌为敲除了丙酮酸羧化酶编码基因pyc、丙氨酸转氨酶编码基因avtA且在丙氨酸转氨酶编码基因alaT插入T3终止子的谷氨酸棒杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述丙酮酸羧化酶编码基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述丙氨酸转氨酶编码基因avtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述T3终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、黄色短杆菌或钝齿棒杆菌。
4.一种权利要求1-3中任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
以谷氨酸棒杆菌的基因组为模板，分别构建丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框、丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框及包含T3终止子及alaT基因的替换框，利用质粒载体将所述丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框、丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框及包含T3终止子及alaT基因的替换框依次电转化谷氨酸棒杆菌，筛选出所述重组谷氨酸棒杆菌。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述质粒载体为pK18mobsacB或pK19mobsacB。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、黄色短杆菌或钝齿棒杆菌。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框的构建方法包括以下步骤：
根据所述谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶编码基因pyc的上下游序列，设计并扩增敲除同源臂引物pyc-U和pyc-D，将pyc-U和pyc-D融合PCR后获得pyc基因同源臂片段Δpyc，并与所述质粒载体酶连。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框的构建方法包括以下步骤：
根据所述谷氨酸棒杆菌的丙氨酸转氨酶编码基因avtA的上下游序列，设计并扩增敲除同源臂引物avtA-U和avtA-D，将avtA-U和avtA-D与所述质粒载体进行无缝克隆。
9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述包含T3终止子及alaT基因的替换框的构建方法包括以下步骤：
以所述谷氨酸棒杆菌基因组为模板，以alaT-U-F/alaT3-U-R和alaT3-D-F/alaT-D-R为引物，PCR扩增alaT3-U和alaT3-D片段，alaT3-U和alaT3D片段与所述质粒载体进行无缝克隆。
10.权利要求1-3中任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-亮氨酸中的应用。
可有效利用丙酮酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建和应用
技术领域
背景技术
[0002] L-亮氨酸是人和动物所需的八种必需氨基酸之一，因与L-缬氨酸和L-异亮氨酸同具有甲基侧链分支结构而统称为支链氨基酸。L-亮氨酸具有多种生理功能，广泛应用于食品工业，饲料工业和制药等工业。同时，L-亮氨酸在氨基酸静脉输液等方面的用量日益增长，是应用于临床氨基酸复合输液中不可缺少的原料之一，对维持病危病人的营养需求，抢救患者生命起着积极的作用。谷氨酸棒状杆菌是目前微生物发酵生产L-亮氨酸的主要工业菌株。
[0003] 亮氨酸属于丙酮酸族氨基酸，由丙酮酸衍生而来。以丙酮酸为直接前体，亮氨酸合成途径涉及七步酶促反应，分别是乙酰羟酸合成酶，乙酰羟酸还原异构酶，二羟酸脱水酶，支链氨基酸转氨酶，α-异丙基苹果酸合成酶，α-异丙基苹果酸异构酶和β-异丙基苹果酸脱氢酶。由葡萄糖生物合成亮氨酸的代谢途径如图1所示。由于L-亮氨酸的合成途径长，与其他支链氨基酸部分重叠的代谢途径，反馈调控机制严格，所以其生产菌株的产量和转化率仍然较低，现阶段其产量已经无法满足日益增长的市场需求。因此，迫切需要研发构建高产量高生产强度高效价的L-亮氨酸高产菌株。
[0004] 丙酮酸是糖酵解终产物也是L-亮氨酸合成的前体，丙酮酸的有效利用直接影响到L-亮氨酸的合成代谢。而磷酸烯醇丙酮酸(PEP)-丙酮酸-草酰乙酸(OAA)节点是糖酵解/糖异生与三羧酸(TCA)循环之间最重要的联系之一，在此节点上发生的一系列反应将碳通量引导到适当的方向，使其成为代谢途径中与碳通量分布高度相关的转换点。在此节点中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)催化PEP不可逆地形成OAA，丙酮酸羧化酶(PC)催化丙酮酸形成OAA，而PEPC和PC是在谷氨酸棒状杆菌中再生OAA的两种重要的过氧化物酶。因此，弱化PEPC和PC参与的TCA循环回补途径,改造PEP和丙酮酸的代谢流向，对丙酮酸族氨基酸代谢流量的影响。
[0005] L-丙氨酸和L-缬氨酸是L-亮氨酸合成途径中的主要副产物。由于L-缬氨酸与L-亮氨酸共用同一支链氨基酸转氨酶，在L-亮氨酸合成过程中L-缬氨酸的产生是不可避免的。此外，L-丙氨酸也是以丙酮酸为前体，只需一步反应即可合成，但在谷氨酸棒杆菌中有两种合成方式，即：①以谷氨酸为氨基供体时，由alaT基因编码的转氨酶催化，且为合成L-丙氨酸的主要途径；②以缬氨酸为氨基供体时，在avtA基因编码的转氨酶催化下合成，且为合成L-丙氨酸的次要途径。为了进一步提高丙酮酸的利用，可以减少竞争支路丙氨酸的合成。但是，有研究报道在支链氨基酸合成过程中，单一敲除alaT或avtA转氨酶基因都只能在一定程度上减少L-丙氨酸的积累，而同时敲除两个转氨酶会抑制菌体生长进而影响产量。因此，在不影响菌体生长和产酸水平的情况下，如何实现弱化竞争支路丙氨酸的合成通量，降低副产物丙氨酸的积累，进而期望优化L-亮氨酸合成途径的碳流量是关键。文献“代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌合成及分泌途径生产L-缬氨酸，生物工程学报，2018，34(10)”及论文“代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-缬氨酸，江南大学，2015年，陈诚”等公开了改造谷氨酸棒状杆菌合成L-缬氨酸的方法，但均未涉及改造谷氨酸棒状杆菌合成L-亮氨酸的方法。文献“代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生成丙酮酸，生物技术通报，2016,32(8):226-232”中利用同源重组的方法，敲除了丙酮酸代谢过程中支流代谢途径的关键基因：丙酮酸醌氧化还原酶pqo基因、丙酮酸脱氢酶pdh基因和乳酸脱氢酶lldh基因，获得了基因缺失工程菌株；并提及编码生成乙酰乳酸的乳酸合成酶ilvbn基因、编码生成L-丙氨酸的丙氨酸转氨酶alat基因和缬氨酸丙酮酸氨基转移酶avta基因、编码生成草酰乙酸的丙酮酸羧化酶pyc基因等会影响丙酮酸的积累。但这些基因对丙酮酸的合成是起到促进还是抑制作用，根据该文献还未可知。
发明内容
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种可有效利用丙酮酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建和应用，本发明的重组谷氨酸棒杆菌敲除了pyc和avtA基因提高丙酮酸的利用，且在alaT基因前添加终止子弱化丙氨酸合成途径，强化谷氨酸棒杆菌胞内丙酮酸的有效利用，提高其L-亮氨酸的产量。
[0007] 本发明的一种重组谷氨酸棒杆菌，该重组菌为敲除了丙酮酸羧化酶编码基因pyc、丙氨酸转氨酶编码基因avtA且在丙氨酸转氨酶编码基因alaT插入T3终止子的谷氨酸棒杆菌。
[0008] 进一步地，丙酮酸羧化酶编码基因pyc的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述丙氨酸转氨酶编码基因avtA的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述T3终止子的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。
[0009] 为了作为对照，本发明还敲除了谷氨酸棒杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还敲除了谷氨酸棒杆菌中的丙氨酸转氨酶编码基因alaT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 进一步地，谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、黄色短杆菌或钝齿棒杆菌。
[0011] 优选地，谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR，谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR为遗传背景清晰的L-亮氨酸产生菌，谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR为文献“Improvement of L-leucine Production in Corynebacterium glutamicum by Altering the Redox Flux,International Journal of Molecular Sciences,2019,20(8)”中所报道的菌株。
[0012] 进一步地，本发明的重组谷氨酸棒杆菌构构建过程中，基因编辑技术采用pK18mobsacB二次同源重组系统。
[0013] 本发明还提供了一种上述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：
[0014] 以谷氨酸棒杆菌的基因组为模板，分别构建丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框、丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框及包含T3终止子及alaT基因的替换框，利用质粒载体将所述丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框、丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框及包含T3终止子及alaT基因的替换框依次电转化谷氨酸棒杆菌，筛选出所述重组谷氨酸棒杆菌。
[0015] 进一步地，质粒载体为pK18mobsacB或pK19mobsacB。
[0016] 进一步地，谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、黄色短杆菌或钝齿棒杆菌。优选地，谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbR。
[0017] 进一步地，丙酮酸羧化酶编码基因pyc的基因敲除框的构建方法包括以下步骤：
[0018] 根据所述谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶编码基因pyc的上下游序列，设计并扩增敲除同源臂引物pyc-U和pyc-D，将pyc-U和pyc-D融合PCR后获得pyc基因同源臂片段Δpyc，并与所述质粒载体酶连。
[0019] 进一步地，丙氨酸转氨酶编码基因avtA的基因敲除框的构建方法包括以下步骤：
[0020] 根据所述谷氨酸棒杆菌的丙氨酸转氨酶编码基因avtA的上下游序列，设计并扩增敲除同源臂引物avtA-U和avtA-D，将avtA-U和avtA-D与所述质粒载体进行无缝克隆。
[0021] 进一步地，包含T3终止子及alaT基因的替换框的构建方法包括以下步骤：
[0022] 以所述谷氨酸棒杆菌基因组为模板，以alaT-U-F/alaT3-U-R和alaT3-D-F/alaT-D-R为引物，PCR扩增alaT3-U和alaT3-D片段，alaT3-U和alaT3D片段与所述质粒载体进行无缝克隆。
[0023] 本发明还公开了上述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-亮氨酸中的应用。
[0024] 进一步地，本发明的重组谷氨酸棒杆菌L-亮氨酸的产量为18.13±0.34g/L，比出发菌株C.glutamicumXQ-9ΔltbR的L-亮氨酸的产量提高了15.3％。
[0025] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0026] 本发明应用基因工程方法，敲除谷氨酸棒杆菌中参与胞内草酰乙酸回补途径的丙酮酸羧化酶基因pyc、参与丙氨酸合成的丙氨酸转氨酶基因avtA；同时为弱化竞争支路丙氨酸合成能力，在alaT基因前添加T3终止子弱化其表达水平，实现重组菌胞内丙酮酸的有效利用，获得了L-亮氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌。经发酵摇瓶实验，该重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumXQ-9ΔltbRΔpycT3-alaT(WL-8)产18.13±0.34g/L亮氨酸，比出发菌株提高15.3％。此发明成功强化了丙酮酸的利用，提高了丙酮酸到L-亮氨酸的合成通量，这也为选育丙酮酸族氨基酸高产菌提供了新的思路。
附图说明
[0028] 图1是谷氨酸棒杆菌中L-亮氨酸的合成途径示意图；
[0029] 图2是重组菌株WL-1、WL-2、WL-3和出发菌ΔLtbR发酵过程曲线：(A)L-亮氨酸产量；(B)葡萄糖含量；(C)菌体生长；(D)副产物产量；
[0030] 图3是重组菌株WL-6、WL-7、WL-8、WL-9和对照菌WL-4和WL-5发酵结果；
[0031] 图1中缩写说明：AHAS：乙酰乳酸合酶；AHAIR：乙酰乳酸还原异构酶；DHAD：二羟酸脱水酶；IPMS：异丙基苹果酸合成酶；IPMI：异丙基苹果酸异构酶；IPMD：异丙基苹果酸脱氢酶；TABCAT：支链氨基酸转氨酶；编码基因：pyc丙酮酸羧化酶PC；ppc磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC；alaT丙氨酸转氨酶AlaT；avtA丙氨酸转氨酶AvtA。
具体实施方式
[0032] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0033] 实施例1重组质粒的构建
[0034] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC XQ-9ΔltbR基因组为模板，分别以pyc-U-F/pyc-U-R和pyc-D-F/pyc-D-R为引物(表1)，PCR扩增后获得pyc-U和pyc-D的PCR产物，将得到的pyc-U和pyc-D片段进行融合PCR，获得同源臂片段Δpyc。将上述PCR产物与经XbaI和HindIII双酶切线性化质粒pK18mobsacB酶连，构建质粒pK18mobsacB-Δpyc。
[0035] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCCXQ-9ΔltbR基因组为模板，分别以avtA-U-F/avtA-U-R和avtA-D-F/avtA-D-R为引物(表1)，PCR扩增后获得avtA-U和avtA-D片段，将得到的avtA-U和avtA-D片段与经SmaI和HindIII双酶切线性化质粒pK18mobsacB进行无缝克隆，构建质粒pK18mobsacB-ΔavtA。
[0036] 按照质粒pK18mobsacB-Δpyc的构建方法，分别以ppc-U-F/pyc-U-R和ppc-D-F/ppc-D-R为引物(表1)，构建质粒pK18mobsacB-Δppc；以alaT-U-F/alaT-U-R和alaT-D-F/alaT-D-R为引物(表1)，构建质粒pK18mobsacB-ΔalaT。
[0037] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC XQ-9ΔltbR基因组为模板，以alaT-U-F/alaT1-U-R和alaT1-D-F/alaT-D-R为引物(表1)，PCR扩增alaT1-U和alaT1-D片段，然后将alaT1-U和alaT1-D片段与线性化质粒pK18mobsacB无缝克隆，构建质粒pK18mobsacB-T1-alaT，其中alaT1-U-R和alaT1-D-F引物中包含终止子序列T1，终止子序列如表2所示。按照以上方法，分别以alaT-U-F/alaT2-U-R和alaT2-D-F/alaT-D-R、alaT-U-F/alaT3-U-R和alaT3-D-F/alaT-D-R、alaT-U-F/alaT4-U-R和alaT4-D-F/alaT-D-R为引物，构建质粒pK18mobsacB-T2-alaT、pK18mobsacB-T3-alaT、pK18mobsacB-T4-alaT。
[0038] 表1.PCR扩增所需引物序列
[0039]
[0040]
[0041] a互补序列斜体标出
[0042] b酶切位点下划线标出
[0043] 表2.终止子序列及其强度
[0044]
[0045] 实施例2重组菌株WL-1的构建
[0046] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC XQ-9ΔltbR(命名为ΔLtbR)为出发菌株，将上述步骤中验证正确的质粒pK18mobsacB-Δpyc电击转化C.glutamicumXQ-9ΔltbR感受态，并筛选出目的重组菌株C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔpyc，将其命名为WL-1。筛选目的重组菌株的步骤如下：经含有50μg/mL卡那霉素的LBG固体培养基于30℃培养筛选获得第一次同源重组转化子。再将经一次重组的转化子接入含100g/L蔗糖的LBGS液体培养基于30℃培养，培养基中含蔗糖会导致含sacB基因的线性化整合基因片段与基因组DNA中目的基因进行第二次同源重组，LBGS培养的菌液在LBG平板上划线分离，在平板上长出的菌落可能是回复野生型也可能是基因敲除型，菌落PCR验证单菌落，提取转化子染色体，以目标基因pyc的验证引物pyc-F/pyc-R进行PCR并对PCR产物进行测序鉴定，最终筛选出二次目的同源重组菌。
[0047] 实施例3重组菌株WL-2的构建
[0048] 以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC XQ-9ΔltbR(命名为ΔLtbR)为出发菌株，将上述步骤中验证正确的质粒pK18mobsacB-Δppc电击转化C.glutamicumXQ-9ΔltbR感受态，并筛选出目的重组菌株C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔppc，将其命名为WL-2。筛选目的重组菌株的方法与实施例2相同，不同之处在于，以目标基因ppc的上下游引物ppc-U-F/ppc-D-R分别进行PCR并对PCR产物进行测序鉴定，分别进行PCR。
[0049] 实施例4重组菌株WL-3的构建
[0050] 将质粒pK18mobsacB-Δppc电击转化实施例2构建的重组菌株WL-1感受态，并按照实施例2的方法筛选目的重组菌株C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔpycΔppc，将其命名为WL-3。筛选目的重组菌株的方法与实施例3相同。
[0051] 实施例5重组菌株WL-1、WL-2、WL-3和出发菌株ΔLtbR发酵产L-亮氨酸[0052] 本实施例中，所使用的培养基包括：①种子培养基(g/L)：葡萄糖30，玉米浆30-40，酵母膏5-10，硫酸铵5，柠檬酸钠10，尿素2，KH2PO4·3H2O 2，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.02，蛋氨酸0.4，生物素0.00005，硫胺素0.0004，CaCO3 20，pH 7.3-7.5，121℃20min。②发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，玉米浆20-30，硫酸铵15，醋酸铵15，柠檬酸钠2，尿素2-3，KH2PO4·3H2O 2，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.06，蛋氨酸0.7，异亮氨酸0.06，谷氨酸
0.5，盐酸盐甜菜碱1，生物素0.00008，硫胺素0.0006，CaCO3 30，pH 7.3-7.5，115℃10min。
0.5，盐酸盐甜菜碱1，生物素0.00008，硫胺素0.0006，CaCO3 30，pH 7.3-7.5，115℃10min。
[0053] 将上述经验证的重组菌株WL-1，WL-2和WL-3和出发菌株ΔLtbR分别进行摇瓶发酵实验。从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环谷氨酸棒杆菌(出发菌和重组菌)接种到50mL装液量500mL摇瓶种子培养基中，4层纱布封口，30℃100r/min往复式摇床培养16h，将种子液按接种量10％接入50/500mL摇瓶发酵培养基，30℃100r/min往复式摇床培养72h；分时间段测定L-亮氨酸，残糖及其生物量，结果如图2所示。
[0054] 从图2A中可以表观地看出L-亮氨酸的产量由出发菌的15.72±0.72g/L提升到16.86±0.50g/L(WL-3)，说明敲除草酰乙酸回补途径中的丙酮酸羧化酶能够提高L-亮氨酸的产量。此外，敲除草酰乙酸回补途径中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶明显减少L-亮氨酸的产量，但副产物L-谷氨酸产量有所增加(WL-3)。而在双敲除菌株WL-3中，菌体生长受限，几乎不产亮氨酸(图2D)。结果表明，在出发菌株中敲除草酰乙酸回补途径的丙酮酸羧化酶利于丙酮酸的利用合成亮氨酸。
[0055] 实施例6重组菌株WL-4的构建
[0056] 将验证正确的质粒pK18mobsacB-ΔavtA电击转化实施例2构建的重组菌株WL-1感受态，经含有50μg/mL卡那霉素的LBG固体培养基于30℃培养筛选获得第一次同源重组转化子。再将经一次重组的转化子接入含100g·L-1蔗糖的LBGS液体培养基于30℃培养，培养基中含蔗糖会导致含sacB基因的线性化整合基因片段与基因组DNA中目的基因进行第二次同源重组，LBGS培养的菌液在LBG平板上划线分离，在平板上长出的菌落可能是回复野生型也可能是基因敲除型，菌落PCR验证单菌落，提取转化子染色体，以目标基因avtA的上下游引物avtA-U-F/avtA-D-R进行PCR并对PCR产物进行测序鉴定，最终获得目的重组菌株C.glutamicumXQ-9ΔltbRΔpycΔavtA(命名为WL-4)。
[0057] 实施例6重组菌株WL-5的构建
[0058] 将验证正确的质粒pK18mobsacB-ΔalaT电击转化实施例6构建的重组菌株WL-4感受态，按照实施例6的方法筛选目的重组菌株C.glutamicumXQ-9ΔltbRΔpycΔavtAΔalaT，将其命名为WL-5。筛选目的重组菌株的方法与实施例6相同，不同之处在于，以目标基因avtA和alaT基因的上下游引物avtA-U-F/avtA-D-R和alaT-U-F/alaT-D-R分别进行PCR并对PCR产物进行测序鉴定。
[0059] 实施例7重组菌株WL-6的构建
[0060] 将验证正确的质粒pK18mobsacB-T1-alaT电击转化C.glutamicumXQ-9ΔltbRΔpycΔavtA(WL-4)感受态，经含有50μg/mL卡那霉素的LBG固体培养基于30℃培养筛选获得第一次同源重组转化子。再将经一次重组的转化子接入含100g·L-1蔗糖的LBGS液体培养基于30℃培养，培养基中含蔗糖会导致含sacB基因的线性化整合基因片段与基因组DNA中目的基因进行第二次同源重组，LBGS培养的菌液在LBG平板上划线分离，在平板上长出的菌落可能是回复野生型也可能是基因敲除型，菌落PCR验证单菌落，提取转化子基因组，以目标基因alaT前插入终止子的验证引物AlaT1-F/alaT-D-R进行PCR，并对PCR产物进行测序鉴定，最终获得验证正确的重组菌株C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT1-alaT，将其命名为WL-6。
[0061] 实施例8重组菌株WL-7的构建
[0062] 按照实施7的方法构建重组菌株C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT2-alaT，将其命名为WL-7。区别在于，将验证正确的质粒pK18mobsacB-T2-alaT电击转化C.glutamicumXQ-9ΔltbRΔpycΔavtA(WL-4)感受态，以目标基因alaT前插入终止子的验证引物AlaT2-F/alaT-D-R进行PCR，并对PCR产物进行测序鉴定。
[0063] 实施例9重组菌株WL-8的构建
[0064] 按照实施7的方法构建重组菌株C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT3-alaT，将其命名为WL-8。区别在于，将验证正确的质粒pK18mobsacB-T3-alaT电击转化C.glutamicumXQ-9ΔltbRΔpycΔavtA(WL-4)感受态，以目标基因alaT前插入终止子的验证引物AlaT3-F/alaT-D-R进行PCR，并对PCR产物进行测序鉴定。
[0065] 实施例10重组菌株WL-9的构建
[0066] 按照实施7的方法构建重组菌株C.glutamicum XQ-9ΔltbRΔavtAT4-alaT，将其命名为WL-9。区别在于，将验证正确的质粒pK18mobsacB-T4-alaT电击转化C.glutamicumXQ-9ΔltbRΔpycΔavtA(WL-4)感受态，以目标基因alaT前插入终止子的验证引物AlaT4-F/alaT-D-R进行PCR，并对PCR产物进行测序鉴定。
[0067] 实施例11重组菌株WL-4、WL-5、WL-6、WL-7、WL-8和WL-9发酵产L-亮氨酸[0068] 按照实施例5的方法，将实施例6-10中经验证的重组菌株WL-4、WL-5、WL-6、WL-7、WL-8和WL-9分别进行摇瓶发酵实验。分别测定各重组菌株的L-亮氨酸产量，残糖及其生物量，结果如图3所示。
[0069] 从图3中可以表观地看出，重组菌株WL-4产17.08±0.53g/L亮氨酸，而重组菌株WL-5菌体生长受限，L-亮氨酸产量急剧减少。结果表明双敲除两个丙氨酸转氨酶不利于L-亮氨酸积累。而重组菌WL-8中L-亮氨酸的产量提升到18.13±0.34g/L，菌体生长未受到明显影响，同时L-丙氨酸产量降低至2.78±0.21g/L。
[0070] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
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