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用于神经细胞培养的培养基组合物

阅读：846发布：2020-05-11

专利汇可以提供用于神经细胞培养的培养基组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文在其他之外特别提供可用于培养神经细胞的培养基组合物。具体而言，本文提供的组合物模拟活脑中的重要生理条件并保持神经活性。本文提供的培养基组合物改进长期体外培养中人神经元成熟的效率并促进突触功能。，下面是用于神经细胞培养的培养基组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于培养神经细胞和用于维持神经细胞的存活和神经功能性的细胞培养基，包含：
(a)氯化钠，浓度为70mM～150mM；
(b)选自氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化镁、硝酸铁、硫酸锌及其组合的神经活性无机盐，所述神经活性无机盐的浓度为0.000001mM～10mM；
(c)浓度在0-0.0005mM之间的硫酸铜；
(d)浓度在0-0.05mM之间的硫酸铁；
(e)甘氨酸，浓度为0.0001mM～0.05mM；
(f)L-丙氨酸，浓度为0.0001mM～0.05mM；和
(g)L-丝氨酸，浓度为0.001mM～0.03mM，
其中(a)至(g)各自以维持培养基中培养的神经细胞的存活和神经功能性的浓度存在，其中所述培养基还包含：
浓度为0或0.00001～0.003mM的L-天冬氨酸；
浓度为0或0.00001～0.02mM的L-谷氨酸；
至少一种pH调节剂，所述pH调节剂选自无机盐、pH缓冲剂及其组合；
至少一种氨基酸，所述氨基酸选自L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺-H2O、L-半胱氨酸盐酸盐-H2O、L-胱氨酸2HCl、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸及其组合，其中氨基酸的浓度为0.001～5mM；
至少一种维生素，所述维生素选自氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、氰钴胺素、核黄素及其组合，其中维生素的浓度为0.00001～1mM；
胆固醇，浓度低于15μg/ml；和
至少一种能量基质，所述能量基质选自糖、丙酮酸钠及其组合，其中所述能量基质浓度为0.001～10mM。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述pH调节剂是选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠或其组合的无机盐，
其中，磷酸氢二钠浓度为0.001～1mM，磷酸二氢钠的浓度为0.001～1mM，或者碳酸氢钠浓度为1mM～35mM。
3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述pH缓冲剂包含浓度为0.1～30mM的HEPES。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基，还包含选自硫酸盐矿物、有机化合物及其组合的补充剂，其中所述有机化合物是蛋白质、类固醇、激素、脂肪酸、单糖或核苷。
5.根据权利要求4所述的细胞培养基，其中所述蛋白质是神经营养因子。
6.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述维生素是浓度为0.0001mM～0.0006mM的核黄素。
7.根据权利要求3所述的细胞培养基，其中HEPES的浓度是1mM～10mM。
8.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基不包含血清。
9.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基的摩尔渗透压浓度为
280mOsm/L～330mOsm/L。
10.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基还包含pH指示剂。
11.一种培养神经元细胞的方法，包括使神经元细胞与权利要求1～10中任一项所述的培养基接触。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述神经元细胞为原代神经元细胞。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述神经元细胞为iPSC来源的神经元细胞。
14.一种组合物，其包含：
(1)权利要求1-10中任一项所述的培养基；和
(2)在所述培养基中培养的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞为神经元细胞。

说明书全文

用于神经细胞培养的培养基组合物

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2013年4月17日提交的美国申请第61/813,034号的优先权及其权益，其全部内容通过引用的方式全部并入。

背景技术

[0003] 对干细胞和体细胞重编程以对人类疾病进行建模并找到迫切需要的疗法投入大量希望和努力。最近的诺贝尔医学及生理学奖在人类体细胞重编程为多能干细胞的革命性方法发表5年后就授予给Yamanaka博士，说明有多少希望给予在诱导多能干细胞(IPSC)技术上(Takahashi等人,2007)。之后不久，即表明得自患者皮肤细胞的IPSC可以在体外转变为神经元(Dimos等人,2008)。神经科学的科学家们涌入这个前所未有的机会以在体外获得得自神经和精神障碍患者的活神经元培养物并证实与特定障碍相关的主要表型可以在培养皿上显现(Marchetto等人.,2010；Brennand等人2011；Marchetto等人2011；Nguyen等人2011；Seibler等人2011；Bellin等人2012；Egawa等人2012；Israel等人2012；Shi等人
2012)。

[0004] 然而还没有用完整的神经生理学方法建立使神经元体外生长的基本培养条件。当前，几乎所有人类神经元培养物均在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中生长(Cattaneo and McKay,1990；Okabe等人,1996；Soldner等人,2009；Vierbuchen等人,2010；Brennand等人,2011；Caiazzo等人,2011；Eiraku等人,2011；Marchetto等人,2011；Nguyen等人,2011；Pang等人,2011；Pfisterer等人,2011；Qiang等人,2011；Soldner等人,2011；Son等人,
2011；Boyer等人,2012；Bráz等人,2012；Giorgetti等人,2012；Israel等人,2012；Shao等人,2012；Vilchez等人,2012)，偶有在Neurobasal培养基(Hermann等人,2004；Li等人,
2005；Johnson等人,2007)或DMEM和Neurobasal的混合物(Koch等人,2009；Boulting等人,
2011；Kriks等人,2011；Egawa等人,2012；Shi等人,2012)中生长。之后将多种生长因子和补充物添加到基础培养基中以促进神经元分化和成活。使用膜片钳和钙成像技术，发明人发现，广泛使用的那些基础培养基完全没有针对神经生理学功能进行调整。它们严重地损害了动作电位放电以及兴奋性和抑制性突触功能，其从而使自发的神经活动急剧降低。这进而又对功能发育和体外神经元操作具有不利后果。因而，领域内需要一种培养基组合物，其密切反映体内生理条件以提供例如成熟神经细胞、神经祖细胞或原代神经细胞的体外分化、扩张或维持过程中的未被折衷的条件。

[0005] 本文在其他之外特别提供可用于培养神经细胞的培养基组合物。具体而言，本文提供的组合物模拟活脑中的重要生理条件并保持神经活性。在一些实施方式中，本文提供的培养基组合物改进长期体外培养中人神经元分化的效率并促进突触功能。

发明内容

[0006] 本申请提供一种细胞培养基，其促进在该培养基中培养的脑细胞的生长和/或保持和/或功能活性。在某些实施方式中，细胞培养基包含一种或多种神经活性无机盐、和/或一种或多种神经活性氨基酸、和/或一种或多种维生素、和/或一种或多种氨基酸、和/或一种或多种能量基质(energetic substrate)、和/或一种或多种pH调节剂。

[0007] 在某些实施方式中，培养基包含浓度为约70mM～约150mM的氯化钠、浓度为约0.000001mM～约10mM的神经活性无机盐、浓度为约0.0001mM～约0.05mM的甘氨酸、浓度为约0.0001mM～约0.05mM的L-丙氨酸、和浓度为约0.001mM～约0.03mM的L-丝氨酸。

[0008] 在某些实施方式中，培养基包含浓度低于约0.05mM的L-丙氨酸、浓度低于约0.25mM的甘氨酸、浓度低于约0.25mM的L-丝氨酸、浓度低于约0.15mM的L-脯氨酸、浓度低于约0.60mM的L-精氨酸盐酸盐、浓度低于约2.5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、浓度高于约
0.41mM的硫酸镁、浓度高于约1.05mM的氯化钙、浓度高于约4.16mM的氯化钾、浓度高于约
120.7mM的氯化钠、浓度低于约17.5mM的D-葡萄糖或浓度为约5mM的HEPES。

[0009] 在某些实施方式中，本申请提供包含一种或多种神经活性无机盐和一种或多种神经活性氨基酸的培养基。在某些实施方式中，培养基还包含一种或多种pH调节剂、一种或多种能量基质、一种或多种氨基酸、和/或一种或多种维生素、及其组合。在某些实施方式中，培养基的成分以促进在培养基中培养的神经细胞的生长、维持和神经功能性的量存在。

[0010] 在某些实施方式中，培养基不包含血清。

[0011] 在某些实施方式中，培养基包含一种或多种能量敏感型成分，其中，该成分与能量源例如光或电的接触使得在培养基中培养的神经细胞的活性增加。在某些实施方式中，该成分持续暴露于能量源引起培养基中培养的神经细胞的兴奋毒性。

[0012] 在另一方面，提供培养神经细胞的方法。该方法包括，使神经细胞与本文(包括其实施方式)提供的培养基接触，并使得神经细胞生长，从而培养神经细胞。

[0013] 在另一方面，提供在本文(包括其实施方式)提供的培养基中培养的哺乳动物细胞。附图说明

[0014] 图1A-C：DMEM或Neurobasal基培养基损害神经和突触活性。将iPS或ES细胞来源的人类神经元直接在玻璃盖玻片上铺板。将单个成熟神经元的基础神经元功能在两个经典细胞外基础培养基(DMEM/F12或Neurobasal-A)中测试并比较。将细胞外培养基的灌注从ACSF切换到DMEM/F12或Neurobasal-A，并换回ACSF以进行恢复。A.钙成像分析示出在ACSF、DMEM/F12并回到ACSF中记录的同一视野的10min视频中自发活性细胞的数量。ACSF的无机盐浓度和摩尔渗透压浓度与DMEM匹配。灰线表示各个视野。统计用Wilcoxon测试进行，**P＝0.009，*P＝0.022)。B.顶部追踪痕迹：电流钳记录揭示出在ACSF中观察到的自发动作电位在DMEM中快速消失，伴随有静息膜电位的较大增加。中间追踪痕迹：电压钳记录(于70mV，Cl-逆转电位)表明DMEM基培养基引发较大的Na+内向电流并完全阻断自发的AMPA突触活性。底部追踪痕迹：电压钳记录(于0mV，Na+逆转电位)示出DMEM基培养基引发较大的Cl-电流并完全阻断自发的GABA突触活性。C.顶部追踪痕迹(突触活性)：电位钳记录示出Neurobasal-A基培养基强烈地降低自发的AMPA突触活性。此外，其也引发较大的紧张性Cl-电流并完全阻断自发的GABA突触活性。底部追踪痕迹(动作电位)：NB-A并不影响静息膜电位但其强烈地破坏诱发动作电位(电流阶跃500ms)、电压依赖的Nav/Kv电流(IV追踪痕迹，钳-70mV，电压阶跃5mV)和自发动作电位。

[0015] 图2A-G：BrainPhys支持高效的动作电位活性。A.尽管电压门控电流的峰值可以在单个神经元之间有变化，它们在BrainPhys和ACSF中是相似的。各个神经元均在ACSF和BrainPhys中测试(黑色vs.蓝色点)。非参配对Wilcoxon检验P值以斜体示出。柱状图表示均值±标准误。B.静息膜电位、自发和诱发动作电位在ACSF和BrainPhys中相同。C.膜片钳处理的典型成熟神经元表达光基因(optogene)(突触蛋白：Cheta-YFP)并填充有若丹明。神经元活性的光基因控制可以可靠地在BrainPhys中实现。D.在BrainPhys或Neurobasal-A中以相同参数测试的单个成熟神经元表明，光基因控制在BrainPhys中得到显著改善。E.单个神经元的电压门控Nav和Kv电流的最大振幅(由IV曲线测定的，钳-70mV，阶跃5mV)与BrainPhys(蓝色点)或ACSF(黑色点)相比在Neurobasal培养基中(红色点＝Neurobasal-A，橘色点＝Neurobasal)显著减少。F.兴奋性(AMPA)和抑制性(GABA)突触活性在BrainPhys培养基中均很明显。在记录单个神经元的自发突触活性的同时灌注不同培养基表明与其他培养基例如Neurobasal-A相比，BrainPhys更好地支持突触功能。十二次扫描以灰色叠印，且为清楚起见，其中之一以黑色突出显示。G.在ACSF和BrainPhys的存在下，以钙成像在网络水平测试的自发活性。

[0016] 图3A-D：健康、成熟且有活力的神经元在BrainPhys基培养基中的培养。A.在具有补充物的BrainPhys中生长超过4周的人IPSC来源的典型神经元培养物的免疫染色。B-C.在BrainPhys+补充物中成熟3～6周的典型功能性神经元的电生理活性。膜片钳记录也在BrainPhys培养基中进行。B.从左到右：由较小的500ms去极化电流阶跃或简单的闪光(syn：Cheta-YFP)诱发的一系列动作电位。IV追踪痕迹(钳-70mV，阶跃5mV)示出典型的电压依赖的Na+和钾电流。自发动作电位记录在电流钳中。C.由AMPA受体(对NBQX敏感，电压钳于-
70mV)和GABA受体(对Gabazine敏感，电压钳于0mV)介导的自发突触反应。D.钙成像示出在BrainPhys+补充物中生长并记录的神经网络的常规活性。时间序列分析对于目标活性区进行做图。

[0017] 图4A-J：与基于DMEM/f12或Neurobasal培养基相比，在BrainPhys培养基中培养的人神经元的特征。A-G.在三个并排生长的培养物中观察到的代表性免疫染色。细胞核用DAPI染色(蓝色)。尽管存在一些不同，在人神经元的存活、神经元亚型(例如，多巴胺能的、Gaba能的)的比例以及近端突触斑(synaptic puncta)的数量方面没有明显的差异。H.神经元的功能类型基于其响应于500ms电流去极化阶跃时的放电模式而进行界定。I.为将BrainPhys对功能性成熟的影响进行表征，将神经元在相同培养板中培养于BrainPhys或DMEM/F12基培养基中。膜片钳在ACSF中用盲法进行。在BrainPhys培养物中发现更高比例的成熟5型神经元。BrainPhys培养物也示出更高比例的接收功能性AMPA突触输入(NBQX敏感的)或GABA突触输入(Gabazine敏感的)的神经元(3、4和5型)，其由在电压钳(分别为-70mV或0mV)4min记录中以不同动力学具有至少5个自发突触反应而确定。J.不同iPS细胞系来源并在ACSF中膜片钳处理的较多神经元样本的进一步分析证实，在基于BrainPhys的培养基中的培养神经元在相当程度上增加获得有突触活性的神经元的机会。

[0018] 图5A-C：基于BrainPhys的神经元培养基允许有效直接的神经元转化(iN)以及人iN细胞的功能性成熟并增加ARC蛋白表达。A.实验设计：能够iN的HDF在NC培养基中转化三周。对于成熟，将iN细胞迁移至星形细胞上并进一步在NM培养基中培养。B.在3周转化后，对于β-III-微管蛋白、hTau、MAP2ab和NeuN进行免疫荧光染色。标尺：50μm。C.在星形细胞上成熟后的6周龄iN细胞中hTau和ARC的免疫荧光染色的代表性图片和分析。在ImageJ中使用ROI选择进行的定量和测量。标尺：100μm。在得自三个供体的iN培养物中的神经元ARC水平的定量。灰色点代表各个细胞(平均n＝38/组，最小n＝19/组)。条状物示出各组的均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

[0019] 图6A-C示出使用多电极阵列(MEA)在数周中对BrainPhys中人神经元的电活性的测试，并与当前所用的条件比较。BrainPhys提高长期神经元活性。A.向成熟培养基中添加血清(例如，血清替代物(knockout serum)，胎牛血清FBS)强烈地破坏神经元功能。B.与所测试的NB/DMEMF12混合物或DMEM/F12相比，BrainPhys减少由饲养循环引起的变化性并且改善和保持长期神经元功能。C.与具有相同的不含血清的补充物的iCell神经元培养基或Neurobasal相比，经补充但不含血清的BrainPhys在数周中改善并保持神经元活性。

[0020] 图7A-C：示出并在BrainPhys+补充物中培养的帕金森患者iPSC来源的神经元的活性。A.示出iPSC来源神经元的生成的图。B.帕金森患者iPSC来源的有活性的活脑细胞在于BrainPhys中培养后进行TUJ-1和GFAP染色。C.健康受试者和帕金森患者的神经元细胞的活性。

[0021] 图8A-G：健康和有活性的大鼠原代海马神经元在BrainPhys中的分化。A-G.在BrainPhys+补充物(sm1)中生长2～3周的典型功能性神经元的电生理活性。A.图表示出来自大鼠海马的原代神经元在BrainPhys+sm1中培养2周多，之后进行功能分析。B.填充有若丹明的典型膜片钳处理的神经元的图像。在右边，较亮的白色阴影为若丹明填充的膜片钳电极。C.由较小的500ms去极化电流阶跃诱发的一些列动作电位，且IV追踪痕迹(钳-70mV，阶跃5mV)示出典型的电压-依赖的Na+和K+电流。着色的追踪痕迹与不同的电压阶跃对应。D.在电流钳中记录的自发动作电位。E.在电压钳(0mV)记录的自发GABA突触反应。F.在电压钳(-70mV)中记录的自发AMPA突触反应。G.在膜片钳和免疫组化操作后固定盖玻片。用MAP2对树突染色，用突触蛋白对突触前末梢染色，并用DAPI对细胞核染色。

[0022] 图9A-C：DMEM使每一个被检测神经元的膜电位去极化，在大多数情况中，其也会使自发动作电位放电饱和并沉默。该追踪痕迹得自对ACSF或DMEM中干细胞来源的人神经元的全细胞电位钳自发记录。A.DMEM没有使动作电位放电饱和并沉默的罕见例子。B-C.两个其他常规例子，其中DMEM引发的去极化使自发动作电位放电沉默。

[0023] 图10：DMEM引发较大的Cl-电流并阻断自发的抑制性突触活性。常规神经元的电压钳记录(0mV)示出，在ACSF中的自发GABA突触活性可被DMEM阻断并且可以恢复。顶部的追踪痕迹表示常规的GABA反应，其在ACSF中但无法在DMEM中看到。底部的追踪痕迹是改变灌注时相应的连续记录，示出在DMEM灌注发生时的较大Cl-流以及后续的平稳期。

[0024] 图11A-D：移除培养基的所有维生素、所有氨基酸或所有额外组分的DMEM。通过移除大量氨基酸，DMEM引发的造成DMEM中动作电位和突触活性破坏的去极化被避免。然而，该溶液无法在长于一周的时间中保持神经元的发育和存活。

[0025] 图12：向BrainPhys基础培养基急性地(acutely)添加完整一套的常用补充物(N2、B27、视黄酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、层粘连蛋白和胆固醇)并不影响放电率或兴奋性/抑制性突触活性。

[0026] 图13A-C.小鼠脑切片(取自活体)在BrainPhys中的膜片钳记录。A-C.BrainPhys中得自成年小鼠海马的常规功能性颗粒神经元的膜片钳处理。A.自静息膜电位经500ms电流阶跃诱发的动作电位。B.示出Nav和Kv电流的增量5mV阶跃(静息-70mV)的IV追踪痕迹。C.自发AMPA突触反应(电位钳-70mV)。

[0027] 图14A-B：Neurobasal引起较大的Cl-电流并阻断自发的抑制性突触活性。

具体实施方式

[0028] 本公开至少部分基于促进在培养基中培养的神经细胞的生长和维持以及功能活性的培养基的发现。具体而言，本申请公开了，该培养基可以包含神经活性无机盐、神经活性氨基酸、pH调节剂、能量基质、氨基酸和维生素的组合。在某些实施方式中，培养基的成分以促进在培养基中培养的神经细胞的生长、维持和神经功能性的量存在。

[0029] I.定义

[0030] 除非另外指出，本文所用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见，例如，Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。与本文所述的那些相似或等同的任何方法、装置和材料可以用在本发明的实施中。
提供以下定义帮助对本文常用的某些术语的理解，并不意在限制本公开的范围。

[0031] 术语“氨基酸”是指天然存在的以及合成的氨基酸，以及以与天然存在氨基酸相似的方式进行作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及在之后进行修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基以及R基连接的α 碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构、但以与天然存在氨基酸相似的方式进行作用的化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指无法在自然界找到的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。

[0032] 氨基酸在本文中可以用它们通常已知的三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的单字母符号进行指代。同样地，核苷酸可以通过其一般认可的单字母代码进行指代。

[0033] “细胞培养物”是存在于生物体外部的体外细胞群。细胞培养物可以由分离自细胞库或动物的原代细胞建立、或由得自这些来源中的一种并在长期体外培养中永生化的次生细胞建立。

[0034] 当提及细胞培养物自身或其培养操作时，术语“培养”、“生长”、“保持”、“扩张”等可以互换地用于表示细胞在适合于成活的条件下在体外保持(例如，离体的(ex vivo))。培养的细胞可以存活，并且培养可以引起细胞生长、分化或分裂。术语并不暗示着培养物中的所有细胞均存活或生长或分裂，因为有一些可能自然衰老等。细胞通常在培养基中培养，培养基可以在培养过程中变化。

[0035] 术语“介质”、“培养基”和“培养溶液”是指细胞培养环境。培养基通常为等渗溶液，并且可以是液体、胶状或半固体，例如，提供用于细胞粘附或支持的基质。本文所用的培养基可以包含培养细胞所需的营养、化学和结构支撑的组分。

[0036] 如本文所用，在培养等中的“允许生长的条件”是指在合适的培养基中(包含盐、缓冲剂、血清)使得细胞能够进行细胞分裂或至少保持存活至少24小时、优选更长时间(例如，数天、数周或数月)的温度(对于哺乳动物细胞通常为约37℃)、湿度、CO2(通常为约5％)的条件。

[0037] 当提及细胞或生物样本时，术语“源自”表明细胞或样本在某些时间点从所述的来源获得。例如，源自个体的细胞可以表示直接从个体获得的原代细胞(即，未修饰的)，或者可以例如通过引入重组载体、通过在特定条件下培养、或永生化而修饰。在一些情况下，源自指定来源的细胞将进行细胞分裂和/或分化，从而原始细胞不再存在，但是继续中的细胞将被理解为源自相同来源。

[0038] 在提及例如细胞或核酸、蛋白质或载体时使用的术语“重组”是指细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者通过天然核酸或蛋白的改变而被修饰，或者细胞源自经如此修饰的细胞。因而，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内找不到的基因，或者以异常表达、表达过低或不表达的方式表达天然基因。转基因细胞和动物是表达异源基因或编码序列的那些，它们通常为重组方法的产物。

[0039] “体细胞”是形成生物体身体的细胞。体细胞包括构成生物体中器官、皮肤、血液、骨骼和结缔组织的细胞，但不是生殖系细胞。

[0040] “干细胞”是以经由细胞有丝分裂自更新的能力以及分化为组织或器官的潜力为特征的细胞。在哺乳动物细胞中，胚胎干细胞和成体干细胞可以区分开。胚胎干细胞位于胚泡并生成胚胎组织，而成体干细胞位于成体组织中，以用于组织再生和修复的目的。

[0041] 术语“多能的”或“多能性”是指具有以下能力的细胞，其生成能够在合适条件下分化成为一起呈现出与来自三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代。多能干细胞可以促成出生前、出生后或成人有机体的组织。领域内接受的标准测试，例如在8～12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以用于确立细胞群的多能性。然而，对于多种多能性干细胞特征的识别也可以用于识别多能性细胞。

[0042] “诱导的多能干细胞”或“iPSC”是指以人工方式(例如，非自然地，在实验室环境中)得自非多能性细胞的多能干细胞。“非多能性细胞”可以是自更新和分化的潜力比多能干细胞差的细胞。潜力更差的细胞可以是，但不限于成体干细胞、组织特异性祖细胞、原代或继代细胞。成体干细胞是在胚胎发育后全身中均可找到的未分化细胞。成体干细胞通过细胞分裂增加，以补充死亡的细胞并使损伤组织再生。成体干细胞具有分裂并产生另一相似细胞以及分裂并产生更加分化的细胞的能力。尽管成体干细胞与多能性标记物例如Rex1、Nanog、Oct4或Sox2的表达相关，它们不具有多能干细胞分化为所有三个胚层的细胞类型的能力。成体干细胞具有有限的自更新并产生不同细胞类型后代的潜能。没有限制，成体干细胞可以是造血干细胞、脐血干细胞、间质干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞或神经干细胞。组织特异性祖细胞是指分化为特异器官或组织的缺乏自更新潜能的细胞。原代细胞包括成人或胎儿有机体的除卵细胞、精子细胞和干细胞之外的任何细胞。可用的原代细胞的实例包括，但不限于，皮肤细胞、骨骼细胞、血细胞、内部器官细胞和结缔组织细胞。继代细胞得自于原代细胞并且已经永生化，以用于长时间体外细胞培养。

[0043] 术语“重编程”是指使非多能细胞(例如，原始细胞)去分化为展现出多能干细胞特征的细胞(例如，人诱导多能干细胞)的过程。

[0044] 合适时，可以对扩张中的转染得到的干细胞进行选择工序。选择工序可以包括在转染时引入到诱导的多能干细胞中的选择标记物。选择标记物可以是编码具有酶促活性的多肽的基因。酶促活性包括，但不限于，乙酰转移酶和磷酸转移酶的活性。在一些实施方式中，选择标记物的酶促活性是磷酸转移酶的活性。选择标记物的酶促活性可以对转染的诱导多能干细胞赋予在毒素存在下扩张的能力。该毒素通常抑制细胞扩张和/或造成细胞死亡。这些毒素的实例包括但不限于潮霉素、新霉素、嘌呤霉素和庆大霉素。在一些实施方式中，毒素为潮霉素。通过选择标记物的酶促活性，毒素可以转化为非毒素，其不再抑制扩张和引起转染的诱导多能干细胞的细胞死亡。在暴露于毒素时，缺乏选择标记物的细胞会被消除，由此阻止其扩张。

[0045] 对诱导的多能干细胞的识别可以包括，但不限于，评测前述多能干细胞特征。这些多能干细胞特征不带进一步限制地包括分子标记物的某些组合的表达或不表达。此外，与多能干细胞有关的细胞形态也可以是多能干细胞特征。

[0046] 术语“hiPSC来源的神经细胞”是指体外得自hiPSC细胞(例如，自其分化)的神经祖细胞(NPC)或成熟神经元。hiPSC可以通过任何本领域已知的合适方法进行分化(例如，Marchetto,M.C.等人,Cell Stem Cell,3,649-657(2008)；Yeo,G.W.等人,PLoS Comput Biol,3,1951-1967(2007))。

[0047] 神经祖细胞是具有分化为神经细胞的趋向且不具有干细胞的多能潜力的细胞。神经祖细胞是承担神经谱系并以表达一种或多种对神经谱系特异的标记物基因为特征的细胞。神经谱系标记物基因的实例是用于早期神经标记物(即，神经祖细胞)的N-CAM、中间丝蛋白巢蛋白、SOX2、波形蛋白、A2B5和转录因子PAX-6；用于晚期神经标记物(即，分化的神经细胞)的NF-M、MAP-2AB、突触素(synaptosin)、谷氨酸脱羧酶、βIII-微管蛋白和酪氨酸羟化酶。神经分化可以在缺少共同培养的星形胶质细胞或在其存在的情况下进行。术语“神经的”和“神经元的”根据其在领域内的通常含义使用并且可以在全文中互换使用。

[0048] 本文使用的术语“DMEM”是指Dulbecco改良的Eagle培养基(可商购自Life TechnologiesTM)，其是一种营养培养基，包含多种组分，包括但不限于无机盐、氨基酸、维生素和其他蛋白组分。

[0049] 本文所指的“改良的DMEM”培养基是包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)存在于DMEM中的组分的营养培养基。在一些实施方式中，组分以与DMEM中相同的浓度存在。在其他实施方式中，组分以与DMEM相比不同的浓度存在。在一些实施方式中，组分以相对于DMEM更高的浓度存在。在其他实施方式中，组分以相对于DMEM更低的浓度存在。

[0050] 本文提供的“HEPES”是指2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸，且是广泛用在细胞培养中的两性离子有机缓冲剂。在HEPES习惯上指CAS注册No.7365-45-9。

[0051] 本文所用的术语“神经活性”是指剧烈影响细胞的神经活性的作用剂，例如无机盐或氨基酸。例如，在包含神经活性作用剂的培养基中培养的神经细胞将表现出可测量的神经活性(例如，电生理活性)。在某些实施方式中，这些神经活性与细胞在其天然体内环境中表现的野生型神经活性类似或相同。

[0052] 本文所用的术语“能量基质”是指作为细胞参与代谢过程的能量来源的作用剂，例如，糖。在某些实施方式中，当细胞在包含能量基质的培养基中培养时，在培养基中培养时细胞可以利用能量基质来生长和/或保持。

[0053] II.培养基组合物

[0054] 在一个方面，本申请提供促进细胞的生长和/或保持和/或功能活性的培养基。在某些实施方式中，培养基包含一种或多种神经活性无机盐和一种或多种神经活性氨基酸。在某些实施方式中，培养基还包含一种或多种pH调节剂、一种或多种能量基质、一种或多种氨基酸、和/或一种或多种维生素、及其组合。

[0055] 在某些实施方式中，培养基的成分以促进培养基中培养的神经细胞的生长、保持和神经功能性的量存在。

[0056] 在某些实施方式中，培养基不包含次黄嘌呤Na、有机硫化合物(例如，硫辛酸)、DNA核苷(例如，胸苷)、必需脂肪酸(例如，亚油酸)、有机化合物(例如，腐胺2HCl)、生物素(B7)及它们的组合。

[0057] 在某些实施方式中，培养基不包含血清。

[0058] 在某些实施方式中，培养基不包含选自HEPES、酚红、丙酮酸钠、BSA、脂肪酸游离部分V、过氧化氢酶、人重组胰岛素、人转铁蛋白、皮质酮、T3(三碘-甲状腺原氨酸)、亚油酸、亚麻酸、抗坏血酸(Vit C)、生物素(B7)、DLα生育酚醋酸酯、DLα生育酚、维生素A(视黄酸)、亚硒酸盐、D-半乳糖中的一种或多种成分及它们的组合。

[0059] 神经活性无机盐

[0060] 在某些实施方式中，培养基包含选自氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)(例如，无水CaCl2)、硫酸镁(MgSO4)(例如，无水MgSO4)、氯化镁(MgCl2)(例如，无水MgCl2)、硝酸铁(Fe(NO3)3-9H2O)、硫酸锌(ZnSO4-7H2O)、硫酸铜(CuSO4-5H2O)、硫酸铁(FeSO4-7H2O)的神经活性无机盐及它们的组合。

[0061] 在某些实施方式中，神经活性无机盐的浓度为约0.000001～约10mM、或约0.000005～约8mM、或约0.00001～约6mM、或约0.00005～约4mM、或约0.00005～约2mM、或约
0.0001～约1mM、或约0.0005～约0.5mM、或约0.001～约0.05mM、或约0.01～约0.05mM。

[0062] 在某些实施方式中，氯化钠(NaCl)以约20～约200mM、或约40～约180mM、或约60～约160mM、或约70～约150mM、或约90～约130mM、或约110～约125mM的浓度存在。在某些实施方式中，氯化钠(NaCl)以约121mM的浓度存在。

[0063] 在某些实施方式中，氯化钾(KCl)以约0.001～约10mM、或约0.005～约9mM、或约0.01～约8mM、或约0.05～约7mM、或约0.1～约6mM、或约1～约5mM、或约2～约4.5mM的浓度存在。在某些实施方式中，氯化钾(KCl)以低于约5mM的浓度存在。在某些实施方式中，氯化钾(KCl)以约4.2mM的浓度存在。

[0064] 在某些实施方式中，氯化钙(CaCl2)(无水)以约0.05～约10mM、或约0.1～约8mM、或约0.5～约6mM、或约0.8～约4mM、或约0.8～约4mM、或约0.8～约2mM、或约0.9～约1.5mM、或约0.9～约1mM的浓度存在。在某些实施方式中，氯化钙(CaCl2)(无水)以约1.1mM的浓度存在。

[0065] 在某些实施方式中，硫酸镁(MgSO4)(无水)以约0.001～约10mM、或约0.005～约9mM、或约0.01～约8mM、或约0.05～约7mM、或约0.1～约6mM、或约0.5～约5mM、或约1～约
4mM、或约1.5～约3的浓度存在。在某些实施方式中，硫酸镁(MgSO4)以低于约2mM的浓度存在。在某些实施方式中，硫酸镁(MgSO4)以约1mM的浓度存在。

[0066] 在某些实施方式中，氯化镁(MgCl2)(无水)以约0.001～约10mM、或约0.005～约9mM、或约0.01～约8mM、或约0.05～约7mM、或约0.1～约6mM、或约0.5～约5mM、或约1～约
4mM、或约1.5～约3的浓度存在。在某些实施方式中，氯化镁(MgCl2)以低于约2mM的浓度存在。在某些实施方式中，氯化镁(MgCl2)不存在于培养基中。

[0067] 在某些实施方式中，硝酸铁(Fe(NO3)3-9H2O)以约0.00001～约0.005mM、或约0.00005～约0.001mM、或约0.0001～约0.0008mM、或约0.0002～约0.0007mM、或约0.0003～约0.0006mM、或约0.0004～约0.0005mM的浓度存在。在某些实施方式中，硝酸铁(Fe(NO3)3-
9H2O)以低于约0.0004mM的浓度存在。在某些实施方式中，硝酸铁(Fe(NO3)3-9H2O)以约
0.000124mM的浓度存在。

[0068] 在某些实施方式中，硫酸锌(ZnSO4-7H2O)以约0.00001～约0.05mM、或约0.00005～约0.005mM、或约0.0001～约0.004mM、或约0.0005～约0.003mM、或约0.002～约0.003mM的浓度存在。在某些实施方式中，硫酸锌(ZnSO4-7H2O)以低于约0.002mM的浓度存在。在某些实施方式中，硫酸锌(ZnSO4-7H2O)以约0.0015mM的浓度存在。

[0069] 在某些实施方式中，硫酸铜(CuSO4-5H2O)以约0.0000001～约0.0005mM、或约0.0000005～约0.00005mM、或约0.000001～约0.00004mM、或约0.000005～约0.00003mM、或约0.00001～约0.00002mM的浓度存在。在某些实施方式中，硫酸铜(CuSO4-5H2O)以低于约
0.00001mM的浓度存在。在某些实施方式中，硫酸铜(CuSO4-5H2O)不存在于培养基中。

[0070] 在某些实施方式中，硫酸铁(FeSO4-7H2O)以约0.00001～约0.05mM、或约0.00005～约0.005mM、或约0.0001～约0.004mM、或约0.0005～约0.003mM、或约0.001～约0.004mM、或约0.002～约0.003mM的浓度存在。在某些实施方式中，硫酸铁(FeSO4-7H2O)以低于约0.0015mM的浓度存在。在某些实施方式中，硫酸铁(FeSO4-7H2O)不存在于培养基中。

[0071] 神经活性氨基酸

[0072] 在某些实施方式中，培养基包含选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸中的神经活性氨基酸及它们的组合。

[0073] 在某些实施方式中，神经活性氨基酸以约0.0001～约1mM、或约0.0005～约0.5mM、或约0.001～约0.05mM、或约0.005～约0.01mM的浓度存在。

[0074] 在某些实施方式中，甘氨酸以约0.0001～约1mM、或约0.0005～约0.5mM、或约0.001～约0.1mM、或约0.005～约0.05mM、或约0.01～约0.05mM的浓度存在。在某些实施方式中，甘氨酸以低于约0.05mM的浓度存在。在某些实施方式中，甘氨酸以约0.0001～约
0.05mM的浓度存在。在某些实施方式中，甘氨酸以约0.002mM的浓度存在。

[0075] 在某些实施方式中，L-丙氨酸以约0.0001～约1mM、或约0.0005～约0.5mM、或约0.001～约0.1mM、或约0.005～约0.05mM、或约0.01～约0.05mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-丙氨酸以低于约0.05mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-丙氨酸以约0.0001～约
0.05mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-丙氨酸以约0.002mM的浓度存在。

[0076] 在某些实施方式中，L-天冬氨酸以约0.00001～约0.05mM、或约0.00005～约0.005mM、或约0.0001～约0.004mM、或约0.0005～约0.003mM、或约0.002～约0.003mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-天冬氨酸以低于约0.003mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-天冬氨酸以约0.00001～约0.003mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-天冬氨酸不存在于培养基中。

[0077] 在某些实施方式中，L-谷氨酸以约0.0001～约0.5mM、或约0.0005～约0.1mM、或约0.001～约0.05mM、或约0.005～约0.04mM、或约0.005～约0.02mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-谷氨酸以低于约0.02mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-谷氨酸以约0.00001～约0.02mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-谷氨酸不存在于培养基中。

[0078] 在某些实施方式中，L-丝氨酸以约0.0001～约0.5mM、或约0.0005～约0.1mM、或约0.001～约0.05mM、或约0.005～约0.04mM、或约0.01～约0.03mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-丝氨酸以低于约0.03mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-丝氨酸以约0.001～约
0.03mM的浓度存在。在某些实施方式中，L-丝氨酸以约0.02mM的浓度存在。

[0079] pH调节剂

[0080] 在某些实施方式中，培养基包含选自无机盐、pH缓冲剂、pH指示剂中的pH调节剂或它们的组合。

[0081] 在pH调节剂包含无机盐的某些实施方式中，无机盐选自碳酸氢钠(NaHCO3)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸氢二钠(NaH2PO4-H2O)及其组合。

[0082] 在某些实施方式中，各无机盐以约0.001～约10mM、或约0.005～约8mM、或约0.01～约6mM、或约0.05～约4mM、或约0.1～约2mM、或约0.5～约1mM、或约0.001～约1mM的浓度存在。

[0083] 在某些实施方式中，各无机盐以约1～约60mM、或约5～约40mM、或约10～约25mM、或约15～约20mM、或约1～约35mM的浓度存在。

[0084] 在某些实施方式中，无机盐以低于约35mM的浓度存在。在某些实施方式中，无机盐以低于约1mM的浓度存在。

[0085] 在某些实施方式中，pH调节剂包含浓度为约29mM的碳酸氢钠(NaHCO3)、浓度为约0.5mM的无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、和/或浓度为约0.5mM的磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)。

[0086] 在某些实施方式中，细胞培养基包含浓度为约0.1～约30mM、或约0.5～约25mM、或约1～约20mM、或约5～约15mM的HEPES。在某些实施方式中，HEPES以低于约10mM的浓度存在。在其他实施方式中，HEPES以约5mM的浓度存在。

[0087] 在某些实施方式中，细胞培养基包含浓度为约0.0001～约1mM、或约0.0005～约0.5mM、或约0.001～约0.1mM、或约0.005～约0.08、或约0.01～约0.07mM的酚红。在某些实施方式中，酚红以低于约0.07mM的浓度存在。在其他实施方式中，酚红以约0.0215mM的浓度存在。

[0088] 在某些实施方式中，培养基的pH为约7～约8、或约7.1～约7.8、或约7.2～约7.6、或约7.3～约7.5。在某些实施方式中，培养基的pH为约7.4。

[0089] 能量基质

[0090] 在某些实施方式中，培养基包含选自糖(例如，D-葡萄糖(右旋糖))、丙酮酸钠的能量基质及它们的组合。在某些实施方式中，能量基质以约0.001～约10mM、或约0.005～约9mM、或约0.01～约8mM、或约0.05～约7mM、或约0.1～约6mM、或约1～约5mM、或约2～约
4.5mM的浓度存在。在某些实施方式中，能量基质以低于约5mM、或低于约1mM的浓度存在。在某些实施方式中，能量基质以约0.1～约5mM的浓度存在。在某些实施方式中，能量基质以约
2.5mM或约0.5mM的浓度存在。

[0091] 促进生长/保持的氨基酸

[0092] 在某些实施方式中，培养基包含一种或多种氨基酸。在某些实施方式中，一种或多种氨基酸选自L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺-H2O、L-半胱氨酸盐酸盐-H2O、L-胱氨酸2HCl、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸及其组合。在某些实施方式中，各氨基酸以约0.001～约5mM、或约0.005～约3mM、或约0.01～约1mM、或约0.05～约0.8mM、或约0.1～约0.5mM、或约0.001～约1mM的浓度存在。

[0093] 在某些实施方式中，一种或多种氨基酸选自浓度为约0.5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、浓度为约0.5mM的L-精氨酸盐酸盐、浓度为约0.05mM的L-天冬酰胺-H2O、浓度为约0.15mM的L-半胱氨酸盐酸盐-H2O、浓度为约0.2mM的L-组氨酸盐酸盐-H2O、浓度为约0.8mM的L-异亮氨酸、浓度为约0.8mM的L-亮氨酸、浓度为约0.8mM的L-赖氨酸盐酸盐、浓度为约
0.2mM的L-甲硫氨酸、浓度为约0.4mM的L-苯丙氨酸、浓度为约0.1mM的L-脯氨酸、浓度为约
0.7mM的L-苏氨酸、浓度为约0.07mM的L-色氨酸、浓度为约0.4mM的L-酪氨酸二钠盐二水合物、浓度为约0.7mM的L-缬氨酸，及它们的组合。

[0094] 在某些实施方式中，培养基不包含L-胱氨酸2HCl。

[0095] 促进生长/维持的维生素

[0096] 在某些实施方式中，培养基包含一种或多种维生素。在某些实施方式中，一种或多种维生素选自氯化胆碱、D-泛酸钙(B5)、叶酸(B9)、i-肌醇、烟酰胺(B3)、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、维生素B12(氰钴胺素)、核黄素(B2)及其组合。在某些实施方式中，各维生素以约0.00001～约1mM、或约0.00005～约0.5mM、或约0.0001～约0.9mM、或约0.0005～约0.8mM、或约0.001～约0.7mM、或约0.005～约0.6mM、或约0.01～约0.5mM、或约0.05～约0.1mM的浓度存在。

[0097] 在某些实施方式中，一种或多种维生素选自浓度为约0.07mM的氯化胆碱、浓度为约0.006mM的D-泛酸钙(B5)、浓度为约0.006mM的叶酸(B9)、浓度为约0.07mM的i-肌醇、浓度为约0.02mM的烟酰胺(B3)、浓度为约0.010mM的盐酸吡哆醇、浓度为约0.007mM的盐酸硫胺素、浓度为约0.0006mM的维生素B12(氰钴胺素)、浓度为约0.0006mM的核黄素(B2)及其组合。

[0098] 补充剂

[0099] 在某些实施方式中，培养基还包含一种或多种选自蛋白质(例如，层粘连蛋白、BSA、脂肪酸游离部分V、过氧化氢酶、胰岛素、人重组胰岛素、胰岛素重组全链、转铁蛋白、人转铁蛋白、人转铁蛋白(Holo)、超氧化物歧化酶)、神经营养因子(例如，人脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、激素、类固醇(例如，皮质酮、孕酮)、甲状腺激素(例如，T3(三碘-甲状腺原氨酸))、脂肪酸、必需脂肪酸(例如，亚油酸、亚麻酸)、脂质(例如，胆固醇)、维生素(例如，抗坏血酸(Vit C)、生物素(B7)、DLα生育酚醋酸酯、DLα生育酚、维生素A(视黄酸))、硫酸盐矿物(例如，亚硒酸盐)、有机化合物(例如，腐胺2HCl)、单糖(例如，D-半乳糖)、核苷(例如，二丁酰cAMP钠盐)，及它们的组合。

[0100] 在某些实施方式中，各个补充剂以约0.01～约50μg/mL、或约1～约40μg/mL、或约5～约30μg/mL、或约10～约20μg/mL的浓度存在于培养基中。

[0101] 在某些实施方式中，各个补充剂以约0.01～约50mg/mL、或约1～约40mg/mL、或约5～约30mg/mL、或约10～约20mg/mL的浓度存在于培养基中。

[0102] 在其他实施方式中，各个补充剂以约0.000001～约1mM、或约0.00001～约0.5mM、或约0.0001～约0.1mM、或约0.001～约0.01mM的浓度存在于培养基中。

[0103] 其他培养基配方

[0104] 在某些实施方式中，培养基包含浓度低于约0.05mM的L-丙氨酸、浓度低于约0.25mM的甘氨酸、浓度低于约0.25mM的L-丝氨酸、浓度低于约0.15mM的L-脯氨酸、浓度低于约0.60mM的L-精氨酸盐酸盐、浓度低于约2.5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、浓度高于约
0.41mM的硫酸镁、浓度高于约1.05mM的氯化钙、浓度高于约4.16mM的氯化钾、浓度高于约
120.7mM的氯化钠、浓度低于约17.5mM的D-葡萄糖或浓度为约5mM的HEPES。在一些实施方式中，培养基不包含L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-胱氨酸2HCl、CuSO4-5H2O、FeSO4-7H2O、无水氯化镁、亚油酸、腐胺2HCl、硫辛酸、胸苷、次黄嘌呤Na或生物素。

[0105] 在一些实施方式中，L-丙氨酸以约0.001mM～约0.05mM存在。在其他实施方式中，L-丙氨酸以约0.002mM存在。在一些实施方式中，甘氨酸以约0.001mM～约0.005mM存在。在其他实施方式中，甘氨酸以约0.002mM存在。在一些实施方式中，L-丝氨酸以约0.001mM～约0.005mM存在。在一些实施方式中，L-丝氨酸以约0.002mM存在。在其他实施方式中，L-脯氨酸以约0.01mM～约0.1mM存在。在一些实施方式中，L-脯氨酸以约0.06mM存在。在其他实施方式中，L-精氨酸盐酸盐以约0.01mM～约0.5mM存在。在一些实施方式中，L-精氨酸盐酸盐以约0.3mM存在。在一些实施方式中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以约0.1mM～约1mM存在。在其他实施方式中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以约0.5mM存在。

[0106] 在一些实施方式中，硫酸镁以约0.5mM～约5mM存在。在其他实施方式中，硫酸镁以约1mM存在。在一些实施方式中，氯化钙以约1.1mM～约2mM存在。在一些实施方式中，氯化钙以约1.1mM存在。在其他实施方式中，氯化钾以约4.18mM～约4.5mM存在。在一些实施方式中，氯化钾以约4.2mM存在。在一些实施方式中，氯化钠以约121mM～约125mM存在。在其他实施方式中，氯化钠以约121mM存在。在一些实施方式中，D-葡萄糖以约1mM～约10mM存在。在其他实施方式中，D-葡萄糖以约2.5mM存在。

[0107] 在一些实施方式中，培养基包含浓度为约0.002mM的L-丙氨酸、浓度为约0.002mM的甘氨酸、浓度为约0.002mM的L-丝氨酸、浓度为约0.06mM的L-脯氨酸、浓度为约0.3mM的L-精氨酸盐酸盐以及浓度为约0.5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

[0108] 在一些实施方式中，培养基包含浓度为约1mM的硫酸镁、浓度为约1.1mM的氯化钙、浓度为约4.2mM的氯化钾以及浓度为约121mM的氯化钠。

[0109] 在一些实施方式中，培养基包含浓度低于约0.05mM的L-丙氨酸、浓度低于约0.25mM的甘氨酸、浓度低于约0.25mM的L-丝氨酸、浓度低于约0.15mM的L-脯氨酸、浓度低于约0.60mM的L-精氨酸盐酸盐、浓度低于约2.5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、浓度高于约
0.41mM的硫酸镁、浓度高于约1.05mM的氯化钙、浓度高于约4.16mM的氯化钾、浓度高于约
120.7mM的氯化钠、浓度低于约17.5mM的D-葡萄糖以及浓度为约5mM的HEPES。

[0110] 摩尔渗透压浓度

[0111] 在一些实施方式中，培养基具有低于约315mOsmol/L的摩尔渗透压浓度。在其他实施方式中，摩尔渗透压浓度为约200～约400mOsmol/L、或约220～约380mOsmol/L、或约240～约360mOsmol/L、或约260～约340mOsmol/L、或约280～约330mOsmol/L、或约300～约320mOsmol/L。在某些实施方式中，摩尔渗透压浓度为约300mOsmol/L～约310mOsmol/L。在一些实施方式中，摩尔渗透压浓度为约310mOsmol/L。

[0112] III.培养方法和细胞组合物

[0113] 在另一方面，提供培养神经元细胞的方法。该方法包括，使神经元细胞与本文(包括其实施方式)提供的培养基接触，并使得神经元细胞生长，从而培养神经元细胞。在一些实施方式中，神经元细胞是原代神经元细胞。在其他实施方式中，神经元细胞为iPSC来源的神经元细胞。

[0114] 在另一方面，提供在本文(包括其实施方式)所提供的培养基中培养的哺乳动物细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞为神经元细胞。

[0115] 在某些实施方式中，培养基包含一种或多种对能量源例如光和/或电敏感的成分。在某些实施方式中，使成分与能量例如光或电接触会引起培养基中所培养的细胞例如神经细胞的活性增加。在某些实施方式中，对培养基持续施以能量可以在培养基中培养的细胞中产生兴奋毒性作用。在某些实施方式中，对能量敏感的成分选自核黄素(B2)、HEPES及其组合。在某些实施方式中，作用剂以约0.0000001～约1mM、或约0.0000005～约0.5mM、或约
0.000001～约0.05mM、或约0.000005～约0.01mM、或约0.00001～约0.005mM、或约0.00005～约0.001mM、或约0.0001～约0.0006mM的浓度存在。在某些实施方式中，作用剂以低于约
0.00006mM的浓度存在。在某些实施方式中，作用剂以约0.01～约50mM、或约0.05～约25mM、或约0.1～约20mM、或约0.5～约15mM、或约1～约10mM、或约2～约8mM的浓度存在。在某些实施方式中，作用剂以低于约10mM的浓度存在。

[0116] IV.实施例

[0117] 支持人脑细胞在体外的突触活性和功能的神经生理学培养基

[0118] 概要

[0119] 诱导多能干细胞(iPSC)技术使得可以触及患者来源的存活的人神经元，并提供对神经学和精神疾病进行体外建模的新的可选方法。神经环路的有效模型需要保持神经元功能的生理条件。因而，申请人具体地检验了在当前用于培养神经元的不同培养基中的神经元活性。来自啮齿目和人类的神经元常规地在具有多种补充物的基础培养基中体外生长。已发现，标准的基础培养基(例如，DMEM、Neurobasal)和血清强烈地破坏基本的神经元功能，包括动作电位放电和突触通讯。为克服这些限制并更好地在体外复制人脑的生理条件，设计出新的基础培养基(BrainPhys)，其与化学上成分明确的补充物结合，并对其在多种人神经元培养物上进行彻底测试。该新培养基最优地支持通常在体内观察到的电生理活性的类型，但除此之外还保持体外长期存活。BrainPhys基本上设计成培养患者或健康受试者来源的功能性成熟人神经元，但也可以用于啮齿目神经元。总而言之，其提供更加逼真的功能性体外条件，以对人类神经学疾病进行建模。

[0120] 本实施例描述以下：

[0121] ○经典基础培养基(DMEM和Neurobasal)和血清强烈地破坏人神经元在体外的基本功能(动作电位和兴奋性/抑制性突触活性)

[0122] ○不加血清的BrainPhys基培养基支持最佳的神经元功能(动作电位/突触通讯)并还保持体外的神经元成熟和脑细胞成活

[0123] ○BrainPhys基培养基使得具有有效功能突触联系的成熟神经元的比例增加[0124] ○含有无血清补充物的BrainPhys可以在数周中保持稳定和健康的神经元活性并减少在DMEM基培养基中观察到的与饲喂循环相关的波动

[0125] ○BrainPhys组合物更好地模拟CSF神经生理条件并对人神经和精神疾病的体外模型提供更逼真的条件，以增加转译成功的机会。

[0126] 结果

[0127] 为评测培养中神经元的神经网络活性，使用得自iPSC或胚胎干细胞(ESC)的人神经祖细胞(NPC)。使人NPC在具有补充有N2、B27、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP和层粘连蛋白的多种基础培养基的玻璃盖玻片上经2～8周而分化为神经元。在灌注室中将神经元转移至盖玻片，以急性地检测细胞在多种胞外溶液中的自发钙活性或电生理特性。

[0128] DMEM/F12基培养基破坏人神经元中的钙活性、自发动作电位放电和突触活性[0129] 首先对DMEM基培养基中人神经元的钙活性成像，它们在该培养基中培养了数周。几乎没有找到有活性的人神经元，但是当相同视野在ACSF中成像时，更多的细胞变得自发有活性。ACSF溶液的组成在实验室间可能微有不同，例如，钙浓度经常高于生理水平从而人为地增加突触释放，这可能潜在地增加网络活动。为弄清该问题，将我们的ACSF的无机盐浓度、pH和摩尔渗透压浓度与DMEM中的那些匹配，并重复那些钙成像实验。尽管有那些预防措施，已证实DMEM中的活性细胞的数量显著低于ACSF(图1a)。

[0130] 之后使用膜片钳方法来确定DMEM如何降低人神经元在体外的总体自发活性。已发现，DMEM总是使神经元的静息电位去极化(n＝22/22细胞，23±3mV)。之后检测在ACSF中的自发活性神经元，并且发现，在罕有的情况下，由DMEM诱导的去极化使放电频率增加而不会饱和(n＝2/14，图9a)，但是在大多数情况下，其使细胞的放电饱和并沉默(n＝12/14，图1b、图9b)。

[0131] 为调查DMEM对突触功能的影响，在Cl-(-70mV)或Na+(0mV)的逆转电位进行电压钳实验，并发现，可以在ACSF中记录到的自发AMPA和GABA突触反应在DMEM中完全消失(图1b)。该效果是可逆的，并在每个被测试神经元中发生(n＝6/6细胞)。

[0132] 同时，也观察到，DMEM的灌注一致地引起较大去极化Na+和Cl-流进入细胞(例如，图10)。因而，怀疑存在于DMEM而非ACSF中的组分可以活化神经元上的Na+和Cl-通道。因而，除去DMEM的所有维生素、所有氨基酸或所有额外组分，并且发现，通过除去大量氨基酸，可以避免DMEM中造成动作电位和突触活性破坏的由DMEM诱导的去极化。然而，该溶液无法在多于一周的时间内保持神经元的发育和存活(图11)。从这些实验清楚的是，DMEM中的神经活性氨基酸破坏基本神经元功能，包括动作电位传播和突触通讯。

[0133] Neurobasal基培养基减少突触通讯和动作电位放电

[0134] 早先已对DMEM进行改良，以使大鼠原代神经元在培养中的存活最佳[Brewer等人,1993]。在该改良的称为Neurobasal培养基的版本中，开发者基本上除去了一些兴奋性氨基酸和硫酸亚铁，并降低摩尔渗透压浓度；他们发现，Neurobasal与DMEM相比改善大鼠神经元的体外存活[Brewer等人,1993]。尽管细胞存活是细胞培养的关键参数，但未在Neurobasal中测试基础的电生理特性。因而，将得自人iPSC和ESC的神经元(在神经成熟培养基中2～8周)用于检视Neurobasal对神经元功能的作用。不像DMEM，Neurobasal并不使静息膜电位去极化，并偶尔地可以观察到至少一些兴奋性突触反应。然而，Neurobasal强烈地减少或消除在ACSF中观察到的自发兴奋性突触活性(n＝5/5成熟神经元，ACSF对照：21.3±12.5Hz，Neurobasal-A：0.44±0.17Hz，ACSF恢复：15.1±10.5Hz；图1c)。Neurobasal的无机盐浓度和摩尔渗透压浓度与神经元在脑中自然情况下所处的那些不同[Davson and Segal，
1996]。作为很可能的后果，发现Neurobasal显著地减少电压依赖的钠电流并快速失活钾电流，并影响诱发的和自发的动作电位的幅度和频率(n＝8/8细胞；图1c)。首先试验在Neurobasal中增加NaCl的浓度，然而，尽管在电压依赖的钠电流的幅度中有一些轻微改善，该改良足以优化人神经元的电活性和突触活性。因而怀疑，同在DMEM中那样，Neurobasal中的一些神经活性组分防止神经生理活性。由于DMEM或Neurobasal均无法维持必要的电生理神经元特性例如动作电位放电和突触功能，设计出更好地适应神经元功能的新的基础培养基。

[0135] 新的BrainPhys基础培养基支持功能性动作电位放电

[0136] 神经元功能在根本上基于动作电位的产生和传播。电压依赖的钠(Nav)和钾(Kv)通道对于实现动作电位的高发放率是关键的。动作电位反映出顺序激活Nav和Kv通道，其引发在很大程度上取决于离子梯度的较大钠流出和钾电流流入。因而，BrainPhys的首次改进是将无机盐浓度调整为接近神经生理水平(例如，Na+、Cl-、K+、Ca2+)。在电压钳中的测试示出，在ACSF和BrainPhys中的Nav和Kv电流的幅度没有不同(图2a)。结果，在BrainPhys中测试的单个神经元中，自发的和诱发的动作电位也在相当程度上得以改进，达到ACSF中测量的相似水平(n＝3细胞；图2b)。相似地，在ACSF和BrainPhys中进行钙成像以网络水平测定的自发活性是相当的。

[0137] 此外，已示出，光基因例如视紫红质通道蛋白(ChR2)或Cheta可以在人神经元中高效地表达，并使我们在BrainPhys中通过简短的闪光来远端控制神经元的放电活性(图2c)。在强烈的对比中，在BrainPhys中成功诱发反应的神经元LED刺激无法在Neurobasal或DMEM中诱发明显的动作电位(图2d)。与放电活性的整体改进一致，当在BrainPhys或ACSF中记录时，与Neurobasal相比，Nav和快速失活Kv电流的振幅整体上较大(图2e)。

[0138] 新的BrainPhys支持功能兴奋性和抑制性突触活性

[0139] 整合的神经网络活性和根本的脑功能通过神经元之间的突触通讯实现。因而，我们设计BrainPhys以保持兴奋性和抑制性突触功能两者。兴奋性和抑制性突触神经递质的总和确定神经元发放动作电位的可能性。因而，简单地通过支持最优的动作电位放电，BrainPhys间接作用于促进突触活性。此外，特定的离子例如钙在突触中起到引发快速囊泡释放的关键作用。为设定尽可能逼真的体外条件，我们将BrainPhys中的钙水平调整为接近于人体内脑脊液中报道的那些水平(Ca2+～1.1mM)。然而，基于示出在灌注DMEM或Neurobasal时较强Na+和/或Cl-电流的电压钳实验，我们强烈怀疑，突触功能也因为神经活性组分的存在而破坏。

[0140] 脑中主要的兴奋性突触联系通过谷氨酸介导，而大多数突触抑制通过GABA介导。因而，排除或减少经典培养基中可以直接影响谷氨酸能和gaba能突触活性的神经活性元素。为控制那些改良改进突触功能，在电压钳中测试由AMPA或GABAa受体介导的自发的谷氨酸能和GABA能突触活性的水平(通过用它们各自的拮抗剂NBQX或SR95531进行可逆阻断而示出)。尽管细胞间的自发活性会不同，但配对分析清楚地示出，在BrainPhys中，自发的AMPA突触活性的水平没有显著不同于ACSF中的那些(n＝5细胞，ACSF：11.0±10Hz，BrainPhys：12.8±10Hz)，因而与DMEM或甚至Neurobasal相比，在较大程度上有改善(图
2f)。

[0141] 在整体上发现，Neurobasal和DMEM均完全地阻断突触抑制性阶段性活性(在Neurobasal中，n＝4/4细胞；图1c)。由于GABA突触活性的阻断伴随有较大的氯电流流入(图14)，怀疑该阻断是由于使氯离子型通道饱和的神经活性组分的存在而引起。

[0142] 遵循该假设，已证实降低作用于氯离子通道的特定神经活性组分的浓度大幅度地改善GABA能突触活性。作为那些改良的结果，证明自发的GANA突触活性在BrainPhys中起作用(n＝7细胞；图2f)并与ACSF中的活性水平相当(n＝3细胞)。

[0143] 总而言之，这些结果示出，DMEM和Neurobasal中存在的神经活性组分的非生理浓度强烈破坏兴奋性和抑制性突触活性。因而，在BrainPhys的配制中，确定该关键的告诫，并且已经示出，突触通讯在BrainPhys中是有活性和起作用的。综上，在BrainPhys中做出的支持生理静息膜电位、动作电位放电和突触功能的改良也通过与ACSF相当的健康钙网络活性的存在而体现出来。

[0144] BrainPhys更好地模拟人脑生理环境

[0145] 主要目的是设计更好地支持体外神经元功能和活性的培养基。但是，设计将更好模拟人脑中基本条件的培养基也是目的。那些改进不仅对于直接聚焦于神经元活性的研究而言是重要的，而且对于疾病建模研究也是潜在关键的，因为更逼真的环境模型将增加患者的转译成功。

[0146] 为达到该目标，已经报道过，提供在健康人脑中通常严格保持的相似活力水平是必要的[Zilberter等人，2010]。自从将一些神经疾病与线粒体机能失调相关依赖，这尤为重要[Knott等人,2008；Cooper等人，2012；Itoh等人，2012]。然而，令人惊讶地，DMEM和Neurobasal中的葡萄糖水平至少比高血糖患者脑中的那些高出至少2～5倍[Gruetter等人，1992]。因而平衡BrainPhys中的活力组分来提供与报道的健康患者脑中的那些相似的血糖水平(～2.5mM)。

[0147] 此外，在将无机盐浓度调整为生理水平并避免神经活性组分的饱和的同时，摩尔渗透压浓度也设定成接近于常规人脑脊液中的摩尔渗透压浓度(～305mOdmol/L)。相比而言，Neurobasal的摩尔渗透压浓度低于神经生理水平～30％(Neurobasal-A为～220或250mOsmol/L)。

[0148] 尽管已经示出那些改良引起更好的神经元功能并接近于神经生理条件，在保持还能够使脑细胞在人工体外环境中存活持续数周或者也许数月的条件的同时做出那些改进是关键的。因而，测试BrainPhys中使人神经元成熟的影响。

[0149] 在没有饲养层的情况下在不含血清的BrainPhys基培养基中生长数周的健康活性神经网络的特征

[0150] 可以将不同类型的神经元用于体外研究人神经元(例如，皮层，多巴胺能)，而获得那些神经元的方法论的变型不计其数。但在获得特定类型的神经元祖细胞后，通常，细胞在具有补充物的基础培养基中长成。通常而言，DMEM、Neurobasal或两者的混合物被挑选为基础培养基。添加到基础培养基中的补充物可以基于实验者的需要或偏好而调整。我们首先测试，向BrainPhys基础培养基急性地添加一套完整的常用补充物(N2、B27、视黄酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、层粘连蛋白和胆固醇)并不影响放电率或兴奋性/抑制性突触活性(n＝6细胞，图12)。然而，我们发现，偶尔添加到神经元培养基中的血清(例如，胎牛血清、FBS或化学成分明确的血清)强烈地破坏神经元活性(图6a)。因而，所有实验均在无血清培养基中进行。此外，血清会引入批次-批次间的变化性。相似地，不使用抗生素，实验在无菌条件下进行，并对上清液每周进行支原体检测。

[0151] 检测到BrainPhys基神经元培养基可以熟练地用于很多种神经元，包括例如人ES和IPS细胞来源的神经元、直接从人成纤维细胞重编程的iN、原代神经元、以及甚至离体脑切片。为了在具有补充物(N2、B27、视黄酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、和层粘连蛋白)的BrainPhys基培养基中长成数周后使用膜片钳、钙成像和共聚焦IHC测试细胞生理特性，几乎所有神经元在可转移的涂覆玻璃盖玻片上培养，但是BrainPhys也可以用于饲养铺板在塑料上的可以改善细胞附着的神经元。添加胶质细胞饲养层也可以改善神经元的长期附着并提供其他有利之处，但选择在大多数测试中省略饲养层，因为注意到胶质祖细胞经常在神经成熟培养基中转变为神经元。这在一些疾病建模研究中可能有问题，因为其可能使神经元样本被来自另一患者或甚至在使用啮齿目星形胶质细胞时被另一物种污染。

[0152] 对于BrainPhys(具有补充物)可以用于在玻璃盖玻片上将人iPSC和ESC来源的NPC分化为神经元网络进行了大量测试。已经发现，铺在BrainPhys上的人NPC在3～5周内高效地分化为成熟和有突触活性的神经元(图3)，尽管这可能根据细胞系和重编程操作指南而有不同。对于最好的细胞系，神经元在玻璃盖玻片上成活数周或甚至数月(测试长达4个月)。在～4周长成后，培养物形成致密的神经元网络，并较好地对树突/轴突标记物(MAP2和TUJ1)、突触标记物(突触素)和神经元标记物(TH、GABA、VGlut)染色(图3a)。与之前的观察一致，人NPC不仅分化为神经元，而且分化为GFAP染色阳性的星形胶质细胞群(图7)。

[0153] 在BrainPhys(具有补充物)中的膜片钳记录显示出，在BrainPhys(具有补充物)长成数周的iPSC或ESC来源的神经元发放健康的动作电位序列(图3b)并同时接收自发的AMPA和GABA突触活性(图3c)。钙成像实验还表明，BrainPhys基神经培养物生成功能上有活性的神经网络(图3d)。

[0154] BrainPhys改善人iPSC和ESC来源的NPC的功能成熟

[0155] 对DMEM和Neurobasal培养基特别地优化成促进细胞体外存活。为测试细胞在不同基础培养基DMEM、Neurobasal和BrainPhys(均具有同一套不含血清的补充物)中的存活性，使用以相似密度同时铺板的相同细胞系进行匹配实验，但是用不同的基础培养基饲养数周。发现在任一培养基中1个月后，凋亡细胞(活性半胱天冬酶)的比例、总的细胞密度(DAPI)或死亡细胞在上清液中释放的LDH的浓度在三个组之间并没有显著改变(图4a～d)。在GABA神经元、多巴胺能神经元(TH)或NeuN阳性神经元的比例方面也没有找到显著差异(图4a、e)。相似地，在基于任一的培养基中长成4周后，没有观察到在近端树突上的突触斑密度的明显差异(图4f～g)。

[0156] 由于Brainphys似乎并不影响细胞的存活或命运，那么考虑细胞在活性BrainPhys基培养基中生长2～6周是否可以改善神经元的功能成熟度。为评测功能成熟的程度，首先在并排生长在DMEM或BrainPhys(具有补充物)的培养物中随机对65个突触素-GFP-阳性神经元的同源样本进行膜片钳操作(图4)。为避免任何由组织培养变化性引起的可能的偏差，以相同密度(每孔～2x105细胞；190mm2)在相同板上同时铺下相同的NPC，并丢弃各个组中由于细胞从盖玻片分离和/或较大细胞簇而具有较低细胞密度的少数盖玻片。在BrainPhys或DMEM(具有补充物)中生长并被选择进行膜片钳的神经元平均上具有相同数量的主要神经突(BrainPhys：3.5±0.2um，DMEM：3.5±1.2um)。在BrainPhys或DMEM中培养的神经元的膜片钳处理以盲法交替进行；从而，神经元的年龄在两个组中基本相同(平均分别为28vs.29天，范围从17～45天)(表4)。膜片钳处理的神经元在DMEM或BrainPhys基培养基中分化，但是对于这些实验，它们在ACSF中的功能特性进行急性评测。在这些条件下存在合理的置信度，选择用于分析的盖玻片(n＝22)之间仅有的差别为用于饲喂的培养基。尽管努力使所记录神经元的取样均匀化，在BrainPhys培养物中获得更多的成熟神经元。为对该结果定量，基于响应于500ms电流去极化阶跃的放电模式来界定不同功能类型的神经元(图4h，参见分类方法细节)。在各个培养基中长成2～6周并在ACSF中进行电生理测定后，BrainPhys基培养基中分化的一半(47％)神经元被分类为功能5型神经元，其比匹配的DMEM基培养物多出两倍多的5型神经元(图4i)。也一致地测定到，Nav和快速失活Kv电流在BrainPhys基培养的神经元中显著较高，但是其电压激活阈值相似(表4)。此外，比起DMEM中生长的神经元，BrainPhys中生长的神经元的膜电阻显著较低，且电容显著较高，这些为通常与更成熟样特性相关的特征(表4)。

[0157] 尽管在经IHC测定的突触斑的数量方面没有明显增加，但发现，在BrainPhys中分化的神经元中，有功能活性的突触的数量大大增加。实际上，在BrainPhys培养物中接收活性兴奋性AMPA突触输入的神经元数量要高约3倍(3～5型神经元，67％vs.23％，图4i)。相似地，在BrainPhys培养物中接收功能抑制性GABA突触输入的神经元的数量要高约2倍(42％vs.24％，图4i)。为进一步支持这些结果，还在膜片钳处理神经元的大量未匹配样本中检验接收活性兴奋性突触的神经元的比例。为清除样本，仅有在ACSF中进行膜片钳处理之前在不同基础培养基中历时约1个月的3、4和5型神经元(n＝223个在BrainPhys中成熟的神经元，69个在DMEM中成熟的神经元)被包括其中。大量样本使得可以使各个类型相互之间进行比较并确证细胞在BrainPhys中成熟～4周会使具有活性兴奋性突触输入的神经元的比例比翻倍还高(图4j)。

[0158] 随后示出，BrainPhys基培养基还可以用于由成纤维细胞直接重编程的人神经元(hiN)(图5)。在那些实验中，具体比较使用具有相同补充物(N2、B27、抗坏血酸、视黄酸、层粘连蛋白、BDNF、GDNF)的BrainPhys基或DMEM/F12与Neurobasal的混合物(50:50)的iN成熟。如同其他情况，发现不管基础培养基如何，将纯化的iN神经元铺在人或小鼠原代星形胶质细胞层上改善培养物的总形态质量。然而，清楚的是，BrainPhys显著增加人IN中的ARC蛋白表达的水平(图5c～d)。ARC是已经显示为与神经元的功能活性相关并对记忆形成较为关键的即刻早期基因。

[0159] 为进一步表征不同培养基对人神经元培养的影响，使用48孔板(Axion)的包含每孔16个电极的多电极阵列(MEA)系统。该方法使得可以研究BrainPhys对同一神经元在数周中的神经元功能的影响，与研究团体用来体外培养神经元的一些其他条件相比较。

[0160] 对于这些实验，使用市售的纯的经完全表征的人iPSC神经元(Cellular Dynamics的iCell神经元)。由于这些神经元的冷冻储备液已经推定为成熟神经元，细胞可以直接在MEA板上解冻并仅在之后没几天进行记录。

[0161] 首先注意到，不管所用的基础培养基如何(例如，BrainPhys、NB-A、DMEM/F12、DMEM/F12与NB-A的混合物)，添加血清将急剧地破坏神经元活性。这可以通过使用不含血清的补充物(血清替代物(knockout serum)或用膜片钳测试的补充物混合物)而改善。但是注意到，当用无血清补充物以及Neurobasal-A或NB与DMEM/f12的混合物测试时，神经元活性相对低，并在约一周内变差，而DMEM中的活性随饲养周期同步地高度波动。相反，不含血清的BrainPhys在数天内显著地改善人神经元的神经生理活性，但最重要的是，神经元功能在数周中保持稳定。最后，在大多数情况中，在经典培养基中较差的神经元性能可以在用BrainPhys基培养基替换时在数天内得到明显拯救(图6)。

[0162] 综上，已经显示出，新设计的基础培养基接近活脑条件，因而使得神经元可以在体外有神经生理学活性。已经示出，那些变化对体外神经元分化和存活没有害处。相反，已经发现，在BrainPhys更为生理学的条件下看到的神经活性和突触活性可以随时间推移促进人神经元的体外成熟和功能并将其保持。

[0163] 培养中的细胞密度

[0164] 为评测BrainPhys是否可以改变数周后培养物中的总细胞密度，将包含在任一介质中并排生长平均35天(范围为21～54天)的神经元的36个盖玻片进行固定和染色。在两个组中发现DAPI细胞核的密度相同(DMEM＝1657±239/mm2，BrainPhys＝1745±252/mm2，Mann Whitney P值＝0.75)。为查明BrainPhys是否可以改变多巴胺能神经元的比例，对在12个盖玻片上酪氨酸羟化酶(TH)染色阳性的细胞数量进行定量，但是没有发现有显著差异(TH+/DAPI：DMEM＝8.7±2.7％，BrainPhys12±2.5％，P＝0.26)。

[0165] BrainPhys也适用于啮齿目神经元

[0166] 尽管BrainPhys是开发用于培养人神经元，但证明其可以用于在急性小鼠脑切片和大鼠原代神经元培养物中进行电生理记录。在BrainPhys中进行膜片钳处理的小鼠海马粒细胞是完全功能化的(图13)，且在BrainPhys中记录的特性也几乎与ACSF中的那些相同(n＝4细胞)。还示出，大鼠原代神经元可以在体外在BrainPhys(补充有sm1)中健康地生长，并在两周内形成有活性的功能化神经网络(图8)。

[0167] 讨论

[0168] 在该实施例中，已经针对基础培养基对于基础神经元功能的影响进行了完全的测试。已发现，在广泛使用的DMEM和Neurobasal培养基中，很多关键的神经生理特性被显著改变(表1)。因此，设计出新的基础培养基，将其在人和啮齿目神经元上测试。BrainPhys克服了在DMEM和Neurobasal中发现的问题。在合适的补充物下，BrainPhys可以用于将NPC分化为神经元并提供成熟神经元在体外有活性地发挥作用的条件。BrainPhys也可以在补充物或无补充物的情况下用于急性地评测在体外培养或离体脑切片中的人和啮齿目神经元的电生理功能特性。

[0169] BrainPhys设计成模拟人脑生理环境

[0170] 在BrainPhys中的大多数组分对于基本的细胞作用是必要的。BrainPhys是9种无机盐、18种氨基酸、9种维生素和5种额外组分(包括右旋糖、丙酮酸钠、HEPES、胆固醇和酚红)的混合物(表2)。为使神经元在体外有功能，如同它们在活脑中一样，对DMEM或Neurobasal中存在的很多组分的浓度进行调整。例如，DMEM中的20种组分和Neurobasal中的39种，在BrainPhys中移除、添加或改变10％以上。BrainPhys中的无机盐的浓度类似于在脑脊液中报道的浓度。Neurobasal摩尔渗透压浓度低于神经生理水平～30％(对于Neurobasal-A，～220或250mOsmol/L)。相比之下，BrainPhys的摩尔渗透压浓度设定为匹配生理脑脊液的摩尔渗透压浓度(～305mOsmol/L)。将存在于DMEM或Neurobasal中的被报道为对神经元有潜在毒性的一些额外组分减少或完全移除(例如，可能引起氧化应激的硫辛酸、可能减少Na+K+ATP酶并引起氧化应激的次黄嘌呤、HEPES、可能有光毒性的核黄素、可能有神经毒性并与NMDA受体相互作用的L-半胱氨酸盐酸盐、可能破坏神经元中DNA修复并使其对淀粉状蛋白敏感的叶酸和同型半胱氨酸缺陷、可能阻断额外突触GABAa受体的铜、和硫酸铁)。改变一些氨基酸和维生素的浓度来改善神经生理功能。将BrainPhys的pH调整成生理pH(～7.3至7.5)而不扰乱重要的无机盐浓度。pH用对CO2水平敏感的pH缓冲剂和低浓度的HEPES稳定保持。

[0171] 在DMEM和Neurobasal中，葡萄糖水平比高血糖患者脑中的那些高出至少2～5倍[Gruetter等人，1992]。为逼真地在培养皿中对神经疾病建模，已经报道尝试模拟脑中典型的生理活力活性很重要[Zilberter等人，2010]。这特别重要，因为一些神经疾病与线粒体功能失调相关联[Knott等人,2008；Cooper等人,2012；Itoh等人,2012]。在BrainPhys中，使活力组分平衡以提供与健康患者脑中报道的那些相似的血糖水平。也已注意到DMEM和Neurobasal中离子流(Ca2+、Na+、K+和Cl-)的不正常水平。配体激活的(例如，AMPA或GABA)或电压依赖的(例如，Nav、Kv、Cav)离子通道经常与离子泵串联工作，以重建胞内离子的静息浓度。离子泵使用能量(ATP)逆渗透梯度工作。如果大量的突触和突触外被动离子通常经慢性打开，如在DMEM和Neurobasal中报道的，泵将无力与梯度抗争，这很可能会浪费相当的细胞能量。

[0172] 当前的实施例示出，BrainPhys通过结合多个水平的神经生理学改善(包括突触功能、动作电位产生和活力保持)而显著改善了细胞到功能神经元的分化。

[0173] 将BrainPhys的pH调整为生理pH(～7.3至7.4)而不扰乱重要无机盐的浓度。pH用对环境CO2水平(碳酸氢盐)敏感的pH缓冲剂和低浓度的HEPES稳定保持。

[0174] 一些存在于DMEM或Neurobasal中的被报道为对神经元有潜在毒性的额外组分被减少或完全去除(例如，硫辛酸、次黄嘌呤、HEPES、核黄素、L-半胱氨酸盐酸盐、硫酸铁、硫酸铜)。改变一些氨基酸和维生素的浓度，以改善神经生理功能。

[0175] 本实施例还示出在DMEM和Neurobasal两者中的离子电流(Ca2+、Na+、K+和Cl-)的不正常水平。配体激活的(例如，AMPA或GABA)或电压依赖的(例如，Nav、Kv、Cav)离子通道经常与离子泵串联工作，以重建胞内离子的静息浓度。离子泵使用能量(ATP)逆渗透梯度工作。如果大量的突触和突触外被动离子通常经慢性打开，如此处针对DMEM和Neurobasal中报道的，泵将无力与梯度抗争，这很可能会浪费相当量的细胞能量。

[0176] 在BrainPhys中的大多数组分对于基本的细胞作用是必要的。BrainPhys是9种无机盐、18种氨基酸、9种维生素和5种额外组分(包括右旋糖、丙酮酸钠、胆固醇、HEPES和酚红)的混合物(表2)。为使神经元在体外有功能，如同它们在活脑中一样，对DMEM或Neurobasal中存在的很多组分的浓度进行调整。例如，DMEM中的20种组分和Neurobasal中的39种，在BrainPhys中移除、添加或改变10％以上。已示出，BrainPhys通过结合多个水平的神经生理学改善(包括突触功能、动作电位产生和活力保持)而显著改善了细胞到功能神经元的分化。

[0177] BrainPhys适合于人和啮齿目神经元

[0178] BrainPhys在不同的人神经元系上(包括通过使用不同操作指南获得iPSC和ESC来源的神经元)大量并成功地测试。还示出，BrainPhys适用于小鼠海马切片的电生理记录，和培养大鼠原代海马神经元。BrainPhys也应当支持来自多种多样的脑区和来自其他物种的神经元。

[0179] 在培养皿中对神经疾病建模：没有使用Brainphys的前期工作和未来实验[0180] 本实施例记载了，用于分化人神经元的现有基础培养基与活脑条件非常不同，因而，对于神经元培养的电活性不是最适宜。用BrainPhys同时优化神经元在体外的生长和持续性的一个重要方面是，找到成熟的功能性神经元的可能性在当前条件下非常低。此外，大多数神经疾病是慢性且渐进式的，并且与神经元活性和突触功能紧密相关；因而当对人类神经和精神疾病体外建模时，缺少生理条件和活性可能引入伪假象或蒙蔽真正的发病机理。尽管在当前培养基中分化的患者和对照iPSC来源的神经元培养物中发现了相关表型(Marchetto等人,2010；Brennand等人,2011；Nguyen等人,2011；Seibler等人,2011；Bellin等人,2012；Egawa等人,2012；Israel等人,2012；Shi等人,2012)，可能会从在促进电生理活性的条件下的神经元研究中揭示出新的表型。密切地模拟活脑的神经模型将更可能概略再现在患者脑中发生的机能失调，并反过来引出对针对神经和精神疾病的更有效治疗的发现。BrainPhys通过在体外保持生理神经活性而有利于该用途。

[0181] 材料和方法

[0182] 人神经元：人真皮成纤维细胞在逆转录病毒载体或非整合性Sendai病毒载体中用四种Yamanaka因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc)重编程为多能细胞。人iPSC和ESC如之前所述般分化为神经祖细胞(NPC)(Brennand等人,2011；Boyer等人,2012)。对于神经成熟，NPC铺在涂覆有多鸟氨酸(Sigma P3655)和层粘连蛋白(Invitrogen23017-015)的玻璃盖玻片上(Fisher Scientific 12-545-80)并在24孔板的神经元成熟培养基中(NM，参见以下“培养基和胞外溶液”)培养。温和地更换一半的培养基，一周2～3次。将板保持在37℃具有5％CO2的孵育箱中。

[0183] 人真皮成纤维细胞直接转化为诱导神经元(iN)：

[0184] 从来自健康供体的皮肤活检切片建立原代人真皮成纤维细胞HDF并将其在含有15％FBS和0.1％NEAA(均为Gibco)的DMEM培养基中培养。从ATCC(BJ-CRL-2522TM包皮成纤维细胞)获得成纤维细胞系#1；从Coriell研究所获得#2和#3(目录ID为GM22159和AG08498)。

[0185] 在与Ladewig等人之前记载的相似且稍作修改的基于Ngn2/Ascl1的操作指南进行直接转化(Ladewig等人，2012)。将人Ascl1和Ngn2的编码序列经2A肽序列连接并克隆到pLVX-Tight-Puro构建体中(Clontech)，生成pLVXTP-N2A。在HEK-293FT细胞中生成用于pLVX-EtO和pLVXTP-N2A的慢病毒颗粒，并通过离心进行富集。在转导后48小时，在含有FBS且不含四环素的培养基中在G418(200μg/ml Gibco)和嘌呤霉素(1μg/ml；Sigma-Aldrich)的存在下使转基因的能转化iN的成纤维细胞进行进一步传代。

[0186] 为生成诱导神经元，将培养基改变成基于DMEM:F12/Neurobasal(DN；1:1v/v)或(BP)的诱导神经元转化(iNC)培养基，持续3周。NC包含以下补充物：N2补充物和B27补充物(均为1x；Gibco)、多西环素(2μg/ml，Sigma-Aldrich)、层粘连蛋白(1μg/ml，life technologies)、二丁酰环-AMP(500μg/ml，Sigma-Aldrich)、人重组noggin(150ng/ml；Preprotech)、LDN-193189(5μM；Cayman Chemical Co)和A83-1(5μM；Stemgent)、CHIR99021(3μM，LC Laboratories)、Forskolin(5μM，LC Laboratories)和SB-431542(10μM；Cayman Chemical Co)。这得到两种iNC培养基DN-iNC和BP-iNC，每3天更换。

[0187] 为测试是否可以在基培养基中进行直接的iN转化，将在DN-iNC或BP-iNC中转化3周的iN培养物用4％PFA固定，并对于神经元标记物β-III-微管蛋白(兔，1:
3000，Millipore)、hTau(PHF1，小鼠，1:500，Peter Davies的馈赠)、NeuN(小鼠，1:100，Millipore)和Map2ab(鸡，1:300，Abcam)进行染色。

[0188] 对于完全功能成熟，使用TrypLE将iN细胞轻轻地从其转化板中移出并再置于小鼠星形胶质细胞的单层培养物的顶部(参见Mertens等人.AJP 2013)，并进一步在含有补充物GDNF、BDNF(均为20ng/ml，R&D)、二丁酰环-AMP(500μg/ml，Sigma-Aldrich)、多西环素(2μg/ml，Sigma-Aldrich)、和层粘连蛋白(1μg/ml，life technologies)的诱导神经元成熟(iNM)培养基中培养。含有NM的培养基再次基于DMEM:F12/Neurobasal(DN；1:1v/v)或(BP)，得到DN-iNM或BP-iNM，每3天更换。在成熟3周后(总共6周转化)，将培养物用4％PFA固定，并针对hTau和ARC染色(兔，1:200，xyz)。

[0189] 啮齿目神经元：在胚胎第18天制备大鼠海马分离培养物。将海马解剖标本用木瓜蛋白酶简单处理，然后柔和地分离并铺在涂覆有多聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片上的Neurobasal+Neurocult sm1神经元补充物(Cat#07511,Stem Cell Technologies,USA)中。为直接在离体脑上而非在人工培养物上测试BrainPhys，我们制备了小鼠海马(C57B16)的
300μm厚的切片。

[0190] 培养基和胞外溶液：神经成熟培养基(NM)由基础培养基和无血清补充物构成。我们使用以下基础培养基：BrainPhys(BP，定制)、DMEM/F12(DMEM，Gibco，Cat No.10565-018)、Neurobasal-A(NB,Gibco,Cat#10888-022)或DMEM/F12与Neurobasal-A(DM，50:50)的混合物。用在这些实验中的大多数DMEM得自Life Technologies；一些批次为内部定制。
Neurobasal总是购自Life Technologies。ACSF和BrainPhys为内部定制。

[0191] 神经元的成熟在添加有以下补充物的基础培养基中进行：1x N2(Gibco,Cat No.17502-048)、1x B27(Gibco,Cat No.17504-044)、脑来源的神经营养因子(BDNF,20ng/ml；Peprotech,Cat No.450-02)、胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF,20ng/ml；Peprotech,Cat No.450-10)、抗坏血酸(AA,200nM；Sigma,Cat No.A0278)、二丁酰基环AMP(cAMP,1mM Sigma,Cat No.D0627)和层粘连蛋白(1μg/ml；Invitrogen,Cat No 23017-
015)。在ACSF中或在具有或不具有补充物的基础培养基中进行用于测定功能活性的急性实验。

[0192] 膜片钳：对于全细胞膜片钳记录，将各个载玻片转移到加热的记录箱中并用经CO2(5％)和O2(95％)的混合物进行起泡并保持在25℃的基础培养基或人工脑脊液(ACSF)持续-1灌注(1ml min )。将ACSF的组成调整为在准确比较时与DMEM和BrainPhys的无机盐浓度和摩尔渗透压浓度相匹配。ACSF包含(单位为mM)121NaCl、4.2KCl、1.1CaCl2、1MgSO4(或
0.4MgSO4和0.3MgCl)、29NaHCO3、0.45NaH2PO4-H2O、0.5Na2HPO4和20葡萄糖(均为Sigma的化学品)。

[0193] 对于靶向的全细胞记录，我们使用40X浸水物镜、微分干涉差显滤片(均为Olympus)、红外数码相机(Rolera XR-Qimaging)、digidata1440A/Multiclamp 700B和Clampex 10.3(Molecular devices)。膜片电极的电阻为3～5MOhm。膜片电极填充有含130mM K-葡糖酸盐、6mM KCl、4mM NaCl、10mM Na-HEPES、0.2mM K-EGTA；0.3mM GTP、2mM Mg-ATP、0.2mM cAMP、10mM D-葡萄糖、0.15％生物胞素和0.06％若丹明的内部溶液。内部溶液的pH和摩尔渗透压浓度接近生理条件(pH 7.3，290～300mOsmol/L)。数据均对于液接电位(10mV)进行校正。电极电容以细胞粘附模式进行实时补偿(～7pF)。记录在2kHz低通滤波、数字化、并以50ms间隔(20kHz)取样。为控制整个实验中记录的质量和稳定性，持续地在线监控并记录接入电阻、电容和膜电阻。我们使用的玻璃膜片钳电极的电阻为～5MOhm。我们样本中的细胞的接入电阻为～40MOhm。各个测试溶液的膜片钳结果通过恢复到与对照相当的水平而进行证实。自发的突触AMPA反应在Cl-逆转电位记录，并且可以通过AMPA受体拮抗剂而可逆地阻断(10uM NBQX，Sigma Ref#N183)。自发的突触GABA反应在Na+的逆转电位记录，并且可以用GABAa受体拮抗剂(10uM SR95531，Sigma Ref#S106)进行可逆地阻断。在所有实验中，292个神经元进行膜片钳处理并分析。

[0194] 多孔MEA板：微电极阵列(MEA)板由48个孔构成，各个孔含有16个独立包埋的纳米结构金微电极(～40至50μm直径；350μm中心-中心间距)且具有4个一体的接地电极的阵列，总共为768个通道(Axion Biosystems)。在培养之前，在室温下，各个孔用200μl 过滤器灭菌的硼酸盐缓冲液(3.10g硼酸(Fisher Scientific)和4.75g四硼酸钠(Sigma Aldrich)于1l蒸馏水中)中的0.1％聚乙烯亚胺溶液(Sigma Aldrich)涂覆。在1h后除去溶液，并用无菌水将孔清洗4次，并在无菌生物安全柜中空气干燥过夜。

[0195] 在MEA上的细胞培养：根据制造商的操作指南，将一小瓶冻存的人iPSC来源的iCell神经元(Cellular Dynamics International)解冻，并通过离心成团，并以28,000存活神经元/μl的浓度再混悬在具有10μg/ml层粘连蛋白(Sigma Aldrich)的iCell神经元维持培养基中。将5μl细胞混悬液液体(140,000个神经元)添加到MEA各个孔的中央，直接跨越电极区域。将无菌水添加到孔周围的区域来减少蒸发，并将MEA与接种的神经元一起孵育在37℃和5％CO2的细胞培养孵育器中1小时。之后，将300μl的iCell神经元保持培养基柔和地添加至各个孔，并除去围绕孔的水。在细胞铺板后2天(体外天数(DIV 2))，将培养基用8种不同培养基中的一种替换：具有10％规定的胎牛血清(FBS；HyClone)的Neurobasal-A(Life Technologies)；具有10％FBS的BrainPhys；具有10％FBS的DMEM/F12(Life
Technologies)；补充有N2(Gibco)、B27(Gibco)、BDNF(20ng/ml；Peprotech)、GDNF(20ng/ml；Peprotech)、抗坏血酸(200nM；Sigma)、cAMP(1mM；Sigma)、和层粘连蛋白(1ug/ml；Life Technologies)的Neurobasal-A；具有前述补充物的BrainPhys；具有前述补充物的DMEM/F12(Life Technologies)；具有前述补充物的Neurobasal-A/DMEM的1:1混合物；或新配制的iCell神经元保持培养基(各培养为6孔)。在DIV 6、9和13，将各个孔中的50％培养基用新配制培养基更换。在DIV 16，所有培养基用补充的BrainPhys更换。

[0196] MEA记录和数据分析：在DIV 2和21之间，使用Maestro MEA系统(Axion Biosystems)和关联的Axion集成工作室(AxIS 1.8.1.5)于37℃每天记录10min的自发活性。MEA的768个通道用1200X的增益和12.5kHz/通道的取样速率同时取样。对于所有记录，应用巴特沃斯带通滤波器(200Hz～3kHz)与设定在6x标准差的自适应阈值放电检测器。将记录中的数据同时保存到3个不同文件类型；包括所有数据的原始数据文件(*.raw file)、包括1s合并时间(bin time)的单位电极放电数的放电计数文件(*.csv file)、包括放电时点和概况信息的α映射(*.map file)。在分析中报道的频率表示各个测试条件下96～192个电极(6～12个孔)的平均频率。活性电极的百分比表示放电频率>0.005Hz的电极数量。

[0197] 分析和统计：用Clampfit 10.3、Matlab 2011b、Igor Pro 6、Prism 5、MiniAnalyis和Microsoft Excel辅助电生理数据和钙成像的统计分析。报告均值的标准误。用双尾非参配对(Wilcoxon)或非配对(Mann Whitney)检验评测统计显著性。

[0198] 功能类型分类：“0型细胞”并不表现电压依赖的钠电流并被从分析中排除。“1型神经元”表现小的Nav电流，但是无法发放高于-10mV的动作电位。选择-10mV的专制阈值，是因为其接近Na+的逆转电位(0mV)。健康的动作电位通常达到或超过Na+的逆转电位。“2型神经元”发放高于-10mV的一个动作电位，其后接平稳期。“3型神经元”也发放高于-10mV的一个动作电位以及低于-10mV的一个或极少量的中止的放电。“4型神经元”发放多于一个的高于-10mV的动作电位，但频率低于10Hz。“5型神经元”以10Hz或更高发放高于-10mV的动作电位。我们对神经元功能类型的分类按照可能与神经元成熟度阶段相关的时间线(continuum)进行。1型神经元被考虑为非成熟，而5型神经元可能被考虑为更加成熟和有功能性。有趣的是，我们在我们观察的大多数分化时间点(2～6周时间的范围)均发现每种功能类型的细胞。该发现揭示了神经元功能成熟度中的高度变化性，即使在相同年龄的培养物内也如此。明显的是，在我们的样本中，接收活性兴奋性突触的大多数细胞均为5型神经元，且我们没有在1～2型神经元中发现自发活性的AMPA和GABA突触输入。

[0199] 钙成像：将粘附在玻璃盖玻片上的神经元在神经分化培养基中用4uM钙敏感染料Fluo-4AM(Invitrogen，Cat No.F14201)孵育～20min(37℃、5％CO2和95％湿度)。冲洗Fluo-4并将盖玻片转移到加热的记录箱中并用经CO2(5％)和O2(95％)的混合物起泡并保持在35℃箱中的基础培养基或ACSF持续灌注(1ml/min)。我们在盖玻片转移后、在开始任何记录前等待至少15min。钙成像影片用471nm的激光扫描显微镜(Olympus，Fluoview FV1000MPE)和25X物镜(Olympus，XLPLN NA 1.05)拍摄。在各个条件下(对照、测试培养基、恢复)记录至少连续两段的5min影片。在很多情况下，定义为对照和恢复培养基的胞外培养基为ACSF，但是当改变培养基灌注的顺序时(例如，对照＝BrainPhys，测试＝ACSF，恢复＝BrainPhys)获得相似的结果。当必要时，在影片之间调整增益灵敏度和聚焦。不改变激光功率(～2％)。在改变各个灌注液时，我们还等待至少5min来保证整个浴液在记录前更换掉。我们对每个盖玻片分析不多于3个视野。

[0200] 当在体内检测到至少一个清楚的神经元钙反应时，将目标区域(ROI)分类为有自发活性。将神经元钙反应定义为荧光强度的急剧瞬时增加(Fluo-4AM，dF/F>5％，快速上升，较慢衰退)。各个ROI的时间序列用Olympus Fluoview FV1000 软件进行计算。

[0201] 免疫组化：免疫组化实验在铺在24孔板玻璃盖玻片上的神经元上进行。在以相同原始细胞密度并排生长在相同板的同一细胞系上做出培养基条件间的比较。使用标准的免疫组化操作指南。用DAPI和以下抗体的组合来对盖玻片染色：小鼠-Map2(2a+2b)(1:500，Sigma)、小鼠-TUJ1(1:1000，Covance)、兔-突触素1(1:500，Calbiochem)、兔-TH(1:500，Pel-Freez)、兔-GFAP(1:200，Dako)、兔-GABA(1:500，Sigma)、山羊-DCX(1:500，Santa Cruz)。

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[0245] 表2.BrainPhys(CB2)基础培养基中的组分

[0246] 表2.BrainPhys中的组分

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