一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法
阅读：273发布：2021-05-28
专利汇可以提供一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种基于酶促点击反应 信号 放大磁弛豫时间免疫 传感器 检测兽药残留的方法，包括以下步骤：1)用待检兽药完全 抗原 包被酶标板并进行封闭；2)加入待测样品和待检兽药单克隆 抗体 ，进行竞争免疫反应；3)加入 碱 性 磷酸 酶标记的二抗；4)加入磷 酸化 抗坏血酸 酯，反应后生成抗坏血酸；5)向反应液中加入Cu2+、叠氮-MNP偶联物和炔基-MNP偶联物，抗坏血酸将Cu2+还原为Cu+并催化叠氮和炔基发生点击反应，导致磁颗粒聚集或者磁颗粒数量发生变化，进而有两种灵敏度不同的磁信号读出方式，通过测定横向弛豫时间并计算出待测样品中的目标物含量。本发明极大地提高了传统磁免疫传感器的灵敏度，为兽药残留的检测提供了高效、准确、快速的方法。，下面是一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法专利的具体信息内容。
1.一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)用待检兽药完全抗原包被酶标板并进行封闭；
2)加入待测样品和待检兽药单克隆抗体，进行竞争免疫反应；
3)加入碱性磷酸酶标记的二抗，反应后洗涤；
4)继续向酶标板中加入磷酸化抗坏血酸酯，反应后生成抗坏血酸；
5)向反应液中加入Cu2+，叠氮-MNP偶联物和炔基-MNP偶联物，抗坏血酸将Cu2+还原为Cu+并催化叠氮和炔基发生点击反应，导致磁颗粒从分散变成聚集或者结合磁分离导致磁颗粒数量的改变，根据不同的检测对象，选择这两种灵敏度不同的磁信号读出方式即磁颗粒聚集或者磁颗粒数量的改变，最终通过测定横向弛豫时间并计算待测样品中的目标物含量。
所述叠氮-MNP偶联物的粒径为10-50nm，所述炔基-MNP偶联物的粒径为10-50nm或500-
3000nm。
2.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：对于含量很低的兽药，所述叠氮-MNP偶联物的粒径为10-50nm，所述炔基-MNP偶联物的粒径为500-3000nm，发生点击反应后进行磁分离，取上清液未反应的叠氮-MNP偶联物,测定其横向弛豫时间并计算待测样品中的目标物含量；对于含量较高的兽药，所述叠氮-MNP偶联物的粒径为10-50nm，所述炔基-MNP偶联物的粒径为10-50nm，发生点击反应后直接测定混合液的横向弛豫时间并计算待测样品中的目标物含量。
3.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：所述二抗为羊抗鼠IgG。
4.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：所述磷酸化抗坏血酸酯的浓度为20mM。
5.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：所述Cu2+的浓度为1mM，所述叠氮-MNP偶联物的浓度为40μg/mL。
6.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：步骤5)中所述的反应液为pH＝
7.4的Tris-HCl缓冲体系。
7.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：步骤4)所述的反应时间为30分钟，步骤5)中所述点击反应的时间为10分钟。
8.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：步骤5)中所述反应液、Cu2+、叠氮-MNP偶联物、炔基-MNP偶联物的体积比为4:5:5:5。
9.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：所述兽药为瘦肉精或抗生素。
一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测
兽药残留的方法
技术领域
背景技术
[0002] 兽药残留是造成我国食品安全问题的一个重要原因，过量或者不合理使用兽药会造成大量的兽药残留在环境和动物体内，并通过食物链在人体内富集，造成抗药性、过敏、人体菌群失衡等严重的安全问题，进而引发组织器官病变，人体免疫能力降低，严重者甚至可能造成药物中毒、诱发癌变等，国际组织与各国食品安全管理部门均制订了相应食品中兽药残留的最高限量标准。
[0003] 我国农业部公告的《动物性食品中兽药最高残留限量》(第235号)中，对食品中兽药残留量作了明确规定：莱克多巴胺，沙丁胺醇等“瘦肉精”是非法添加的药物，在动物性食品中不得检出。因此，对“瘦肉精”等非法添加药物的检测，需要检测方法具有很高的灵敏度和准确性。另外，有些抗生素是可以使用的，例如磺胺类抗生素是可以使用的，不超过一定的含量就是安全的，因此要求检测方法的灵敏度适中就可以，但要求方法相对简单，容易操作。
[0004] 目前，对食品中兽药残留进行定性定量检测的方法包括仪器分析法、免疫分析法和生物传感器，仪器分析方法主要通过气相色谱仪、高效液相色谱仪、高效液相色谱-质谱联用仪等大型精密仪器进行检测，具有灵敏度高、准确性好等优势，但是仪器分析的样品前处理比较复杂，仪器昂贵，检测成本较高，同时，还需要高水平的专业技术人员操作，不适合现场快速检测。免疫分析法主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)和胶体金免疫层析试纸条方法，ELISA具有操作相对简单、高通量等优势，但其灵敏度一般在ng/mL级别，线性范围较窄，且不适用于痕量检测。胶体金免疫层析试纸条具有操作简单、反应速度快、适合现场快速检测等优点，但其灵敏度比ELISA低，线性范围较窄，无法满足痕量兽药残留等小分子物质检测的需要。
[0005] 磁弛豫时间免疫传感器是一种典型的生物传感器，该免疫传感器的基本原理是：将偶联有抗体的超顺纳米磁颗粒作为磁信号探针，通过抗体-抗原的识别作用，超顺纳米磁颗粒的状态会由原来的分散状态变成聚集状态，导致磁场均匀性发生改变，进而引起周围水分子质子的横向弛豫时间(transverse relaxation time，T2)发生显著改变，然后利用磁弛豫时间共振仪获取T2值。由于磁信号(T2)的改变与超顺磁性纳米颗粒的状态改变相关，因此通过测量T2可以间接得到目标物的含量。磁弛豫时间免疫传感器的主要优势在于：(1)信号的读出不依赖光信号，避免了复杂基质的干扰，减少了样品前处理等复杂步骤；(2)检测体系是一种均相反应体系，减少了传统酶联免疫分析中多次洗板和显色等步骤，大大提高了检测效率；(3)磁弛豫时间共振仪具有便携化和小型化的潜力，在现场快速检测等领域具有很好的应用前景。但是该方法缺乏有效的信号放大系统，因此灵敏度较低，不适合检测“瘦肉精”等小分子物质。
[0006] 有效的信号放大系统是提高传统磁弛豫时间免疫传感器的关键。免疫标记酶具有很高的催化活性，可以起到很好的信号放大作用，在免疫分析中得到了广泛的应用。因此，本发明拟构建一种酶促信号放大的磁弛豫时间免疫传感器，并将其应用于兽药残留的检测。但是，怎样将酶促信号放大和磁弛豫时间免疫传感技术有机结合起来，就成为了一个关键问题。
[0007] 一价铜离子可以催化叠氮和炔基之间的点击反应，而二价铜离子可以被还原剂(抗坏血酸)还原变成一价铜离子，进而可以催化叠氮和炔之间的点击反应。如果将叠氮分子和炔基分子分别修饰在纳米磁颗粒的表面，在点击反应发生之后，就可以导致纳米磁颗粒由原来的分散状态变成聚集状态，进而导致磁信号的改变，磁信号的改变和一价铜离子的浓度成正相关。碱性磷酸酶是免疫分析中一种常用的标记酶，其具有去磷酸基团的作用，可以将没有还原性的磷酸化抗坏血酸酯去磷酸化基团，进而变成具有还原性的抗坏血酸。抗坏血酸可以将二价铜离子还原成一价铜离子，进而催化修饰有叠氮分子和炔基分子的纳米磁颗粒之间的点击反应，导致磁颗粒的聚集，横向弛豫时间(T2)随即发生改变。基于磁颗粒状态改变的这个读出方式，我们可以用来检测灵敏度要求不高的抗生素残留，例如磺胺类药物，我们称为这个方法叫做状态聚集的磁弛豫时间传感方法(aggregated magnetic relaxation swithching,aMRS)。对于禁用的兽药或者含量极低的兽药残留，我们制备一个大粒径的点击反应配体分子修饰的磁颗粒，例如1000nm的磁颗粒，因为大粒径的磁颗粒的饱和磁强度大，很容易磁分离，而小粒径的磁颗粒，例如30nm的磁颗粒则不能磁分离。因此，通过点击反应和磁分离步骤，也可以实现溶液中小粒径磁颗粒数量的改变。因为前期研究表明磁信号(T2)对磁颗粒数量的改变更为敏感，基于磁颗粒数量改变的读出方式，我们称之为数量变化的磁弛豫时间传感方法(number magnetic relaxation switching,nMRS)。
因此，通过碱性磷酸酶可以将点击反应和磁弛豫时间免疫传感器有机结合起来，基于酶促信号放大和点击反应，有效地构建一个信号放大系统，用来提高传统的磁弛豫时间免疫传感器的灵敏度和稳定性，并且用于“瘦肉精”和常用抗生素的检测。相比于传统的磁弛豫时间免疫传感器，该方法灵敏度的提高主要得益于三个方面：(1)酶促信号放大：碱性磷酸酶可以高效地催化产生具有还原性的抗坏血酸，为后面的点击反应奠定基础；(2)点击反应导致磁颗粒状态改变或者数量改变的能力更强：相比抗体等生物识别元件，点击反应配体分子要小很多，因此在相同的磁颗粒表面，点击反应配体分子偶联的密度更大，更加有利于磁颗粒状态的改变或者数量的改变；同时点击反应是一种共价键的反应，很稳定，聚集后的磁颗粒不容易重新发生分散，提高了方法的稳定性，克服了传统的基于抗体-抗原的非共价反应导致的稳定性差，灵敏度不高的难题；(3)基于纳米磁颗粒的分离作用，T2信号来源于小磁颗粒的数量改变，相比于磁颗粒状态变化，T2信号对磁颗粒数量变化更为敏感。
因此，通过碱性磷酸酶可以将点击反应和磁弛豫时间免疫传感器有机结合起来，基于酶促信号放大和点击反应，有效地构建一个信号放大系统，用来提高传统的磁弛豫时间免疫传感器的灵敏度和稳定性，并且用于“瘦肉精”和常用抗生素的检测。相比于传统的磁弛豫时间免疫传感器，该方法灵敏度的提高主要得益于三个方面：(1)酶促信号放大：碱性磷酸酶可以高效地催化产生具有还原性的抗坏血酸，为后面的点击反应奠定基础；(2)点击反应导致磁颗粒状态改变或者数量改变的能力更强：相比抗体等生物识别元件，点击反应配体分子要小很多，因此在相同的磁颗粒表面，点击反应配体分子偶联的密度更大，更加有利于磁颗粒状态的改变或者数量的改变；同时点击反应是一种共价键的反应，很稳定，聚集后的磁颗粒不容易重新发生分散，提高了方法的稳定性，克服了传统的基于抗体-抗原的非共价反应导致的稳定性差，灵敏度不高的难题；(3)基于纳米磁颗粒的分离作用，T2信号来源于小磁颗粒的数量改变，相比于磁颗粒状态变化，T2信号对磁颗粒数量变化更为敏感。
发明内容
[0008] 传统的磁弛豫时间传感器大多基于抗原-抗体相互作用、供体-受体识别作用和适配体-目标物相互作用等非共价相互作用来导致磁颗粒的聚集，从而引起磁信号的变化。这种非共价结合导致的磁颗粒状态改变的程度不大，导致方法的灵敏度不高，无法实现对痕量的小分子的检测。并且这种非共价结合的作用力导致的磁颗粒聚集体很容易在复杂基质中重新分散，进而影响整个方法的稳定性。相比于抗体-抗原这种非共价结合，点击反应诱导的共价结合反应可以很好地克服传统的磁弛豫时间传感器的缺点。本发明旨在提供一种由酶促点击化学反应介导的灵敏度高、稳定性更好、可以根据兽药残留需要，选择不同的磁信号读出模式，实现高灵敏和可操作性的统一的磁弛豫时间免疫传感器，并将其用于检测食品中的不同兽药残留的分析，为动物源性食品安全检测提供快速、灵敏、准确的检测方法。
[0009] 具体地，为达到此目的，本发明提供以下技术方案：
[0010] 一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器对兽药残留进行检测的方法，包括以下步骤：
[0011] 1)用待检兽药完全抗原包被酶标板并进行封闭；
[0012] 2)加入待测样品和待检兽药单克隆抗体，进行竞争免疫反应；
[0013] 3)加入碱性磷酸酶标记的二抗，反应后洗涤；
[0014] 4)继续向酶标板中加入磷酸化抗坏血酸酯，反应后生成抗坏血酸；
[0015] 5)向反应液中加入Cu2+，叠氮-MNP偶联物和炔基-MNP偶联物，抗坏血酸将Cu2+还原为Cu+并催化叠氮和炔基发生点击反应，导致磁颗粒从分散变成聚集或者磁颗粒数量的改变，接着根据不同的检测对象，选择这两种灵敏度不同的磁信号读出方式，最终通过测定横向弛豫时间并计算待测样品中的目标物含量。
[0016] 所述叠氮-MNP偶联物的粒径为10-50nm，所述炔基-MNP偶联物的粒径为10-50nm或500-3000nm。
[0017] 对于含量很低或者禁用的兽药(如瘦肉精，在动物源性食品中不得检出)，所述叠氮-MNP偶联物的粒径为10-50nm，所述炔基-MNP偶联物的粒径为500-3000nm，发生点击反应后进行磁分离，取上清液未反应的叠氮-MNP溶液，然后再测定横向弛豫时间并计算待测样品中的目标物含量(该方法简称nMRS)；对于含量较高的兽药(如抗生素，在动物源性食品中不得超过一定限量)，所述叠氮-MNP偶联物的粒径为10-50nm，所述炔基-MNP偶联物的粒径为10-50nm，发生点击反应后直接测定混合液的横向弛豫时间并计算待测样品中的目标物含量(该方法简称aMRS)。
[0018] 优选地，所述二抗为羊抗鼠IgG。
[0019] 优选地，所述磷酸化抗坏血酸酯的浓度为20mM。
[0020] 优选地，所述Cu2+的浓度为1mM，所述叠氮-MNP偶联物的浓度为40μg/mL。
[0021] 优选地，步骤5)中所述的反应液为pH＝7.4的Tris-HCl缓冲体系。
[0022] 优选地，步骤4)所述的反应时间为30分钟，步骤5)中所述点击反应的时间为10分钟。
[0023] 优选地，步骤5)中所述反应液、Cu2+，叠氮-MNP偶联物，炔基-MNP偶联物的体积比为4:5:5:5。
[0024] 本发明应用不同粒径大小超顺纳米磁颗粒在磁场中分离速度的差异，通过酶促点击反应构建基于小磁颗粒状态变化的磁弛豫时间免疫传感器(aMRS)和基于小磁颗粒数量变化的磁弛豫时间免疫传感器(nMRS)。其中，aMRS通过点击反应介导小磁颗粒的分散聚集，操作便捷，但灵敏度较低，可用于检测含量相对较高的小分子物质(如磺胺类抗生素)的检测。nMRS通过点击反应介导导致体系中小磁颗粒数量的变化，采用磁分离可实现含量低的小分子物质(如瘦肉精)的高灵敏度检测，该方法也可用于含量低的抗生素的检测。这两种模式的同时应用拓展了传统磁弛豫时间免疫传感器的应用范围，并且极大地提高了方法的灵敏度，同时可以根据分析对象的不同，制备相应的反应试剂，进而实现了分析方法的灵敏度可调，可同时应用于不同要求的危害因子检测，为食品安全中小分子危害物如“瘦肉精”、抗生素等的检测提供了高效、准确、快速的检测方法。附图说明
[0025] 图1示出了叠氮-MNP30、炔基-MNP30和空白MNP30的红外光谱图；
[0026] 图2示出了发生点击反应后MNP30的TEM图谱；
[0027] 图3示出了炔基-MNP1000和叠氮-MNP30发生点击反应后的SEM图谱；
[0028] 图4示出了炔基-MNP1000、叠氮-MNP30和MNP30-MNP1000复合物的粒径表征图；
[0029] 图5示出了aMRS传感器T2值的改变量与Cu2+浓度之间响应关系的示意图；
[0030] 图6示出了nMRS传感器T2值的改变量与Cu2+浓度之间响应关系的示意图；
[0031] 图7示出了对nMRS传感器的叠氮-MNP30浓度优化结果；
[0032] 图8示出了对nMRS传感器的AAP浓度优化结果；
[0033] 图9示出了对nMRS传感器的缓冲体系优化结果；
[0034] 图10示出了nMRS传感器T2值的改变量与ALP浓度之间的响应关系；
[0035] 图11示出了nMRS传感器检测克伦特罗的标准曲线和线性范围；
[0036] 图12示出了nMRS传感器检测不同小分子物质的T2值改变量；
[0037] 图13示出了aMRS方法检测克伦特罗的标准曲线和线性范围；
[0038] 图14示出了传统的MRS方法检测克伦特罗的标准曲线和线性范围；
[0039] 图15示出了传统的ELISA方法检测克伦特罗的标准曲线和线性范围；
[0040] 图16示出了aMRS传感器检测磺胺类抗生素的标准曲线和线性范围。
具体实施方式
[0041] 下面以瘦肉精克伦特罗为例通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。需要说明的是，在进行抗生素的检测时，只需按下述实施例将完全抗原和单克隆抗体替换为与待测抗生素相对应的抗原和抗体即可。
[0042] 本实施例中使用的试剂、材料、溶液和仪器如下：
[0043] 试剂和材料：碱性磷酸酶(ALP)来自Sigma-Aldrich公司(USA)；1000nm(10mg/mL)和30nm(5mg/mL)羧基化磁性纳米Fe3O4颗粒(MNP)来自Invitrogen和Ocean NanoTech(USA)；磺胺类抗生素单克隆抗体(2.5mg/mL)、磺胺类抗生素完全抗原(1.5mg/mL)、克伦特罗单克隆抗体(2.5mg/mL)、克伦特罗完全抗原(1.5mg/mL)和克伦特罗ELISA试剂盒购自北京勤邦生物科技有限公司；ALP标记的羊抗鼠IgG来自Jackson ImmunoResearch；炔基四聚乙二醇氨基(alkyne-PEG4-NH2)和叠氮四聚乙二醇氨基(azide-PEG4-NH2)购自Click Chemistry Tools(USA)；牛血清白蛋白、2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐(AAP)、L-抗坏血酸、N-羟基磺酸琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐盐酸盐(EDC)购自Sigma-Aldrich公司(中国，上海)。
[0044] 溶液配制：
[0045] 磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.00g NaCl，0.20g KCl，0.20g KH2PO4和2.90g Na2HPO4·12H2O溶于1000mL水中，摇匀；
[0046] 洗涤液：在配制好的1000mL磷酸盐缓冲液中加入0.5mL吐温-20，摇匀，配成PBST洗涤液。
[0047] 仪器：磁分离架购自Ocean NanoTech(USA)，用于分离炔基-MNP复合物和叠氮-MNP复合物；场发射透射电子显微镜(JEM-2100F，日本)用于表征磁珠；激光粒度分析仪(马尔文仪器有限公司，英国)用于测量磁珠的粒径和电位；0.47T小型磁弛豫时间共振仪购自上海纽迈电子科技有限公司，用于测量横向弛豫时间(T2)信号。
[0048] 实施例1aMRS和nMRS传感器对二价铜离子的响应
[0049] 叠氮-MNP30偶联物和炔基-MNP30偶联物的制备：取两份200μL 5mg/mL的MNP30，分别加入20μL 10mg/mL的EDC和10μL 10mg/mL的sulfo-NHS，将混合溶液在室温下震荡反应30分钟进行活化。磁珠活化后在混合溶液中分别加入500μL PBS溶液(pH＝7.4,10mM)，再分别加入20μL 10mg/mL的alkyne-PEG4-NH2和azide-PEG4-NH2,混合溶液在室温下温和震荡反应1小时进行偶联。偶联结束后，磁分离三次以除去多余的alkyne-PEG4-NH2和azide-PEG4-NH2。叠氮-MNP30偶联物和炔基-MNP30偶联物分别用200μL PBS溶液重悬保存于4℃备用。我们对偶联alkyne-PEG4-NH2和azide-PEG4-NH2前后的MNP30进行了红外光谱表征，结果如图1所示，在2180cm-1和2240cm-1分别出现了N＝N＝N和C≡C的红外吸收峰，而空白磁颗粒在2500cm-1至2000cm-1处无红外吸收峰，说明叠氮-MNP30偶联物和炔基-MNP30偶联物成功制备。
[0050] 炔基-MNP1000偶联物的制备：取500μL 10mg/mL的MNP1000，加入50μL 10mg/mL的EDC和25μL 10mg/mL的sulfo-NHS，将混合溶液在室温下震荡反应20分钟进行活化。磁分离，用500μL PBS溶液重悬MNP1000，再加入80μL 10mg/mL的alkyne-PEG4-NH2，混合溶液在室温下温和震荡反应1小时进行偶联。偶联结束后将磁颗粒洗涤三次，最后偶联物用500μL PBS溶液重悬保存于4℃备用。
[0051] 在不同离心管中分别加入50μL叠氮-MNP30偶联物溶液和50μL炔基-MNP30偶联物溶液，充分混合，再将50μL不同浓度的Cu2+(0,0.5,1,2,5,10,50,100,500μM)和50μL 5mM的抗坏血酸溶液分别加入上述混合溶液中，在室温下混合反应10分钟后测量T2值。同时，对反应后30nm MNP进行TEM表征，实验结果如图2所示，表明通过点击反应导致30nm MNP之间发生了聚集。
[0052] 在不同离心管中分别加入50μL叠氮-MNP30偶联物溶液和50μL炔基-MNP1000偶联物溶液，充分混合，再将50μL不同浓度的Cu2+(0,0.05,0.1,0.5,1,2,5,10,50,100,500μM)和50μL 5mM的抗坏血酸溶液分别加入上述混合溶液中，混合液在室温下反应10分钟，磁分离后所得清液用于测量T2值。同时，对反应后的1000nm MNP进行SEM表征，实验结果如图3所示，表明通过点击反应可以使30nm小磁颗粒聚集在1000nm大磁颗粒表面，并且通过粒径表征也得到了证明(图4)。而两者对Cu2+的响应结果如图5和图6所示，T2值的改变量与Cu2+浓度之间存在良好的响应关系，随着Cu2+浓度的升高，ΔT2逐渐增大，其中nMRS比aMRS对Cu2+有着更灵敏的响应信号。
[0053] 实施例2对nMRS免疫传感器反应条件的优化
[0054] 将碱性磷酸酶稀释至不同浓度(100,80,10,5,2,1U/L)，在50μL不同浓度的碱性磷酸酶溶液中分别加入50μL 20mM的AAP溶液，混合溶液在37℃下温和涡旋反应30分钟，反应结束后，向混合溶液中依次加入50μL 1mM Cu2+溶液、50μL 400μg/mL炔基-MNP1000偶联物和50μL不同浓度的(20,40,80μg/mL)叠氮-MNP30偶联物溶液后，在室温下震荡反应10分钟，反应结束后磁分离，取未能磁分离的含有MNP30的溶液测量T2值以优化叠氮-MNP30偶联物的浓度，结果如图7所示。
[0055] 将碱性磷酸酶稀释至不同浓度(50,10,5,2,1,0.5,0.1U/L)，在50μL 40μg/mL碱性磷酸酶溶液中分别加入50μL不同浓度(50,20,10mM)的AAP溶液，混合溶液在37℃下温和涡2+
旋反应30分钟，反应结束后，向混合溶液中依次加入50μL 1mM Cu 溶液、50μL 400μg/mL炔基-MNP1000偶联物和50μL 40μg/mL叠氮-MNP30偶联物溶液后，在室温下震荡反应10分钟，反应结束后磁分离，取未能磁分离的含有MNP30的溶液测量T2值以优化AAP的浓度，结果如图8所示。
旋反应30分钟，反应结束后，向混合溶液中依次加入50μL 1mM Cu 溶液、50μL 400μg/mL炔基-MNP1000偶联物和50μL 40μg/mL叠氮-MNP30偶联物溶液后，在室温下震荡反应10分钟，反应结束后磁分离，取未能磁分离的含有MNP30的溶液测量T2值以优化AAP的浓度，结果如图8所示。
[0056] 将碱性磷酸酶稀释至不同浓度(10,5,2,1,0.5,0.1,0.05U/L)，在50μL不同浓度的碱性磷酸酶溶液中分别加入50μL 20mM的AAP溶液，混合溶液在37℃下温和涡旋反应30分钟，反应结束后，向混合溶液中依次加入50μL 1mM Cu2+溶液、50μL 400μg/mL炔基-MNP1000偶联物和50μL 40μg/mL叠氮-MNP30偶联物溶液后，在室温下震荡反应10分钟，反应结束后磁分离，取未能磁分离的含有MNP30的溶液测量T2值，其中反应体系分别以PBS(pH＝7.4,10mM)、Tris-HCl(pH＝7.4,10mM)和超纯水为缓冲液以优化缓冲液的种类，结果如图9所示。
[0057] 条件优化结果如图7-9所示，表明在以Tris-HCl为缓冲液、叠氮-MNP30偶联物浓度为40μg/mL和AAP浓度为20mM时nMRS免疫传感器具有最优的响应效果。
[0058] 实施例3nMRS传感器对碱性磷酸酶的响应
[0059] 首先，将碱性磷酸酶稀释至不同浓度(1000,500,100,50,10,5,1,0.5,0.1,0.05,0.01,0.005,0U/L)，在50μL不同浓度的碱性磷酸酶溶液中分别加入50μL 20mM的AAP溶液，混合溶液在37℃下温和涡旋反应30分钟，反应结束后，向混合溶液中依次加入50μL 1mM Cu2+溶液、50μL 40μg/mL叠氮-MNP30偶联物溶液和50μL 400μg/mL炔基-MNP1000偶联物溶液后，在室温下震荡反应10分钟，反应结束后磁分离，取未能磁分离的含有MNP30的溶液测量T2值。实验结果如图10所示，T2值的变化量随着ALP的浓度增加而逐渐增大，表明T2值的变化量与ALP浓度之间存在良好的响应关系。
[0060] 实施例4nMRS传感器对克伦特罗的检测
[0061] (1)96孔板中包被100μL 10μg/mL的克伦特罗完全抗原，4℃过夜。采用0.05％Tween-20溶解于Tris-HCl缓冲液中作为洗涤液，然后用150μL 3％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)。
[0062] (2)采用洗涤液洗涤孔板后加入50μL不同浓度梯度的(0,0.01,0.02,0.05,0.1,1,2,5,10,50,100,500,1000ng/mL)克伦特罗和50μL克伦特罗的单克隆抗体(2.5μg/mL)，37℃反应60分钟。
[0063] (3)反应之后洗涤4次，向孔板中加入50μL ALP标记的羊抗鼠IgG(0.5μg/mL)，37℃反应30分钟，洗涤3次，继续向孔板中加入50μL AAP(20mM)，37℃反应30分钟。
[0064] (4)取40μL反应液加入含有50μL Cu2+(1mM)、50μL叠氮-MNP30偶联物(40μg/mL)和50μL炔基-MNP1000偶联物(400μg/mL)的离心管中，室温下反应10分钟。
[0065] (5)反应结束后，磁分离，收集上清液测定T2值。实验结果如图11所示，T2值的改变量随着克伦特罗的浓度增加而逐渐增大，并且该方法对克伦特罗的检测具有很好的灵敏度和线性范围。
[0066] 实施例5nMRS传感器对检测克伦特罗的特异性
[0067] (1)96孔板中包被100μL 10μg/mL的克伦特罗完全抗原，4℃过夜。采用0.05％Tween-20溶解于Tris-HCl缓冲液中作为洗涤液，然后用150μL 3％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)。
[0068] (2)采用洗涤液洗涤孔板后分别加入50μL克伦特罗(5ng/mL)、莱克多巴胺(50ng/mL)、新霉素(50ng/mL)、沙丁胺醇(50ng/mL)和氯霉素(50ng/mL)，并分别加入50μL克伦特罗的单克隆抗体(2.5μg/mL)，37℃反应60分钟。
[0069] (3)反应之后洗涤4次加入50μL ALP标记的羊抗鼠IgG(0.5μg/mL)，37℃反应30分钟，洗涤3次，加入50μL AAP(20mM)，37℃反应30分钟。
[0070] (4)取40μL反应液加入含有50μL Cu2+(1mM)、50μL叠氮-MNP30偶联物(40μg/mL)和50μL炔基-MNP1000偶联物(400μg/mL)的离心管中，室温下反应10分钟。
[0071] (5)反应结束后，磁分离，收集上清液测定T2值。实验结果如图12所示出了检测不同小分子物质所对应的T2值的改变量，表明该方法对克伦特罗的检测具有良好的特异性。
[0072] 实施例6nMRS传感器检测克伦特罗的加标回收率
[0073] (1)96孔板中包被100μL 10μg/mL的克伦特罗完全抗原，4℃过夜。同时将克伦特罗加入猪尿液中至浓度为0.1,0.5,1,5,10,50,100ng/mL，过夜孵化12小时。
[0074] (2)采用0.05％Tween-20溶解于Tris-HCl缓冲液中作为洗涤液，然后用150μL 3％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)。
[0075] (3)采用洗涤液洗涤孔板后分别加入50μL猪尿液(加入不同浓度的克伦特罗0.1,0.5,1,5,10,50,100ng/mL)，并分别加入50μL克伦特罗的单克隆抗体(2.5μg/mL)，37℃反应
60分钟。
60分钟。
[0076] (4)反应之后洗涤4次加入50μL ALP标记的羊抗鼠IgG(0.5μg/mL)，37℃反应30分钟，洗涤3次，加入50μL AAP(20mM)，37℃反应30分钟。
[0077] (5)取40μL反应液加入含有50μL Cu2+(1mM)、50μL叠氮-MNP30偶联物(40μg/mL)和50μL炔基-MNP1000偶联物(400μg/mL)的离心管中，室温下反应10分钟。
[0078] (6)反应结束后，磁分离，收集上清液测定T2值。实验结果如表1示出了猪尿液中不同克伦特罗加标水平的加标回收率和变异系数，表明该方法对克伦特罗的检测具有良好的准确性和精密度。
[0079] 表1猪尿液中不同克伦特罗加标水平的加标回收率和变异系数
[0080]
[0081] 实施例7nMRS、aMRS、MRS传感器和ELISA方法检测克伦特罗灵敏度的比较[0082] (一)aMRS传感器检测克伦特罗
[0083] (1)96孔板中包被100μL 10μg/mL的克伦特罗完全抗原，4℃过夜。采用0.05％Tween-20溶解于Tris-HCl缓冲液中作为洗涤液，然后用150μL 3％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)。
[0084] (2)采用洗涤液洗涤孔板后加入50μL不同浓度梯度的(0,0.01,0.02,0.05,0.1,1,2,5,10,50,100,500,1000ng/mL)克伦特罗和50μL克伦特罗的单克隆抗体(2.5μg/mL)，37℃反应60分钟。
[0085] (3)反应之后洗涤4次加入50μL ALP标记的羊抗鼠IgG(0.5μg/mL)，37℃反应30分钟，洗涤3次，加入50μL AAP(20mM)，37℃反应30分钟。
[0086] (4)取40μL反应液加入含有50μL Cu2+(1mM)、50μL叠氮-MNP30偶联物(40μg/mL)和50μL炔基-MNP30偶联物(40μg/mL)的离心管中，室温下反应10分钟。
[0087] (5)反应结束后，测定混合液的T2值。实验结果如图13所示。
[0088] (二)传统MRS传感器检测克伦特罗
[0089] (1)将30nm羧基磁颗粒表面分别偶联上克伦特罗抗体和完全抗原。
[0090] (2)在离心管中分别加入50μL不同浓度梯度的(0,0.01,0.02,0.05,0.1,1,2,5,10,50,100,500,1000ng/mL)克伦特罗、50μL MNP30-抗体和50μL MNP30-完全抗原，37℃反应
30分钟。
30分钟。
[0091] (3)反应结束后测定反应液的T2值。实验结果如图14所示。
[0092] (三)ELISA方法检测克伦特罗
[0093] (1)96孔板中包被100μL 10μg/mL的克伦特罗完全抗原，4℃过夜。采用0.05％Tween-20溶解于Tris-HCl缓冲液中作为洗涤液，然后用150μL 3％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)。
[0094] (2)采用洗涤液洗涤孔板后加入50μL不同浓度梯度的(0,0.01,0.02,0.05,0.1,1,2,5,10,50,100,500,1000ng/mL)克伦特罗和50μL克伦特罗的单克隆抗体(2.5μg/mL)，37℃反应60分钟。
[0095] (3)反应之后洗涤4次加入50μL ALP标记的羊抗鼠IgG(0.5μg/mL)，37℃反应30分钟，洗涤3次，加入100μL Tris-HCl缓冲液。
[0097] 对比实验结果可以得出nMRS传感器比其它几种方法具有更高的灵敏度和更宽的线性范围。
[0098] 实施例8aMRS传感器对磺胺类抗生素的检测
[0099] (1)96孔板中包被100μL 10μg/mL的磺胺类抗生素完全抗原，4℃过夜。采用0.05％Tween-20溶解于Tris-HCl缓冲液中作为洗涤液，然后用150μL 3％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)。
[0100] (2)采用洗涤液洗涤孔板后加入50μL不同浓度梯度的(0,0.1,0.5,1,2,5,10,50,100,500,1000,2000ng/mL)磺胺类抗生素和50μL磺胺类抗生素的单克隆抗体(2.5μg/mL)，
37℃反应60分钟。
37℃反应60分钟。
[0101] (3)反应之后洗涤4次加入50μL ALP标记的羊抗鼠IgG(0.5μg/mL)，37℃反应30分钟，洗涤3次，加入50μL AAP(20mM)，37℃反应30分钟。
[0102] (4)取40μL反应液加入含有50μL Cu2+(1mM)、50μL叠氮-MNP30偶联物(40μg/mL)和50μL炔基-MNP30偶联物(40μg/mL)的离心管中，室温下反应10分钟。
[0103] (5)反应结束后，直接测定反应液的T2值。实验结果如图16所示，T2值的改变量随着磺胺类抗生素的浓度增加而逐渐增大，并且该方法可以满足磺胺类抗生素的快速检测的需要。
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