技术领域
[0001] 本公开涉及核苷酸技术领域，具体涉及一种环状DNA的制备方法。
背景技术
[0002] 滚环复制(环-介导的等温扩增，Loop-mediated isothermal amplification-LAMP)是具有链置换能
力的等温扩增酶利用环状DNA分子做模板，进行核酸扩增的方法。该方法与PCR(聚合酶链式反应)都能对微量的核酸模板进行序列特异的扩增，不同之处在于，滚环复制过程能够在恒定
温度下完成扩增反应，因此不需要温控精确的PCR仪，是一种既简便又经济的核酸扩增方法，且不同序列的单
链环状DNA分子通过滚环复制，能够生成不同长度的
串联重复序列。天然的基因和蛋白中存在大量的随机重复序列，这些重复序列组成特异的模序，能够急剧增加候选基因的
生物大分子的生理特异性和活性。这种模序广泛分布于启动子/增强子等核酸序列，促进反式作用因子对靶序列的识别，产生
叠加和/或者协同效用。通过构建大的随机重复序列库，是研究体内或者体外研究结构-功能之间的关系的重要策略之一。通过制备单链环状DNA分子进行滚环复制，可以制备不同长度和重复次数的随机重复序列。
[0003] 目前常用的单链环状DNA模板主要来源是病毒的单链环状DNA M13mp18(7249bp)以及酶连反应产生的的单链环状DNA分子(sscDNA,single strand circular DNA)，sscDNA分子长度一般为34-120bp，但是使用单链环状病毒DNA M13mp18，这种病毒培养的过程慢，成本高，从而导致M13mp18的价格较高，且单链M13mp18 DNA分子量(Molecular weight)大，若底物浓度过高，会抑制滚环复制反应的进行。在现有的酶连反应产生单链环状DNA分子的制备方法中，多倚赖DNA(guide DNA)做引导分子，完成目标序列的连接，这种方法会导致终产物中残留微量引导DNA分子，使得后续DNA聚合酶利用其作引物进行滚环复制，从而对结果分析造成干扰。
发明内容
[0004] 本公开的目的是提供一种环状DNA的制备方法，以达到降低成本的目的。
[0005] 为实现上述目的，技术方案如下：
[0006] 一种环状DNA的制备方法，所述环状DNA的制备方法的具体步骤为：
[0007] (1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷
酸化修饰；
[0008] (2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子两端的核苷酸互补
配对；
[0009] (3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行
退火，获得退火产物；
[0010] (4)利用连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接反应产物；
[0011] (5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸；
[0012] (6)最后回收合成的单链环状DNA分子。
[0013] 所述步骤(3)中退火的反应条件为：首先85℃反应5min，然后25℃反应3h。
[0014] 所述步骤(3)中退火的反应体系为合成的单链DNA分子：引导RNA分子：退火缓冲液：去RNA酶
水的体积比为1：2：1：7。
[0015] 所述退火缓冲液包括：100mM Tris-HCl、10mM EDTA、和1M NaCl，所述Tris-HCl的PH值为7.5。
[0016] 所述步骤(4)连接反应的条件为：首先16℃反应16h，然后65℃反应20min。
[0017] 所述步骤(4)中连接反应的体系为连接缓冲液：退火产物：连接酶：H2O的体积比为3：1：2.5：30。
[0018] 所述连接酶为SplintR连接酶或T4 DNA连接酶。
[0019] 所述步骤(5)中核酸外切酶为Exonuclease I外切酶和T7 Exonuclease外切酶的混合物。
[0020] 核酸外切酶消化的反应体系为连接产物：Exonuclease I外切酶：T7Exonuclease外切酶的体积比为7：1：2。
[0021] 所述步骤(5)中核酸外切酶消化的条件为：25℃反应16h。
[0022] 本公开的有益效果是：提供了一种环状DNA的制备方法，所述制备方法简单易操作，且在方法中不需要实用单链环状病毒DNA M13mp18，其余材料成本低，从而降低了制备环状DNA的成本。同时本公开所述的环状DNA的制备方法突破了模板序列的限制，而且在制备过程中无需添加外源DNA，而是添加了根据需要成环的单链DNA分子末端所合成的RNA分子，减少了干扰，且还利用了核酸外切酶消化了未成环的线性核苷酸，进一步的减少了副产物的产生，大大增加了单链环状DNA的产率，而且本公开所述的环状DNA的制备方法所制备的单链环状DNA还可用于检测DNA聚合酶是否具备链置换能力。
附图说明
[0023] 图1为
实施例1中退火产物、连接产物和核酸外切酶消化产物的凝胶
电泳图。
[0024] 图2为实施例2滚环复制产物的凝胶电泳图。
[0025] 图3为实施例3不同的延伸反应时间下产物的凝胶电泳图。
[0026] 图4为实施例4DNA聚合酶链置换能力检测图。
具体实施方式
[0027] 以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
[0028] 实施例1
[0029] 一种环状DNA的制备方法，具体操作步骤为：
[0030] (1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做
磷酸化修饰，其中单链DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5’-pATTGGTCTACATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCCTACGGATTGC；
[0031] (2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子的两端互补配对，其中引导RNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’-UAGACCAAU GCAAUCCGUA-3’；
[0032] (3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物，其中退火反应的体系如表1所示，
[0033] 表1退火反应体系
[0034]
试剂 体系DNA(100uM) 1uL
RNA(100uM) 2ul
10×buffer 1uL
Rnase-free H2O 加至总体积10ul
[0035] 其中10x退火缓冲液包括：100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM EDTA和1M NaCl，退火反应的条件为：首先85℃反应5min，然后25℃反应3h，反应结束后，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1A泳道1所示；
[0036] (4)利用SplintR连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接反应产物，其中连接反应的体系如表2所示，
[0037] 表2连接反应体系
[0038]试剂 体积
10xSplintR连接酶缓冲液 3
退火产物(10μM) 1
Ligase(10.5μM) 2.5
H2O 30uL
[0039] 其中连接反应的条件为：16℃，16h；65℃，20min终止反应，反应结束后，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1A泳道2所示；
[0040] (5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸，其中核酸外切酶消化的反应体系如表3所示，
[0041] 表3核酸外切酶消化的反应体系
[0042]试剂 体积
连接反应产物 7uL
Exonuclease I 1uL
T7 gene 6exonuclease 2ul
[0043] 其中反应条件为：25℃反应16h，反应结束后，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，以检测目标产物以及线形分子是否消化完全，结果如图1B所示，可以看出线性分子已被消化完全；
[0044] (6)最后利用NEB MonarchTMPCR&DNA Cleanup Kit回收
试剂盒回收合成的单链环状DNA分子。
[0045] 实施例2
[0046] 利用实施例1所制备的单链环状DNA分子(sscDNA)进行滚环复制实验，其具体操作步骤为：首先设计引物序列，其引物DNA序列为SEQ ID NO.3：5’-aTAGACCAAT GCAATCCGTAc-3’；然后进行退火反应，最后选用Phi29 DNA聚合酶进行延伸反应。
[0047] 其中退火反应的体系如表4所示：
[0048] 表4滚环复制退火反应体系
[0049]试剂 体系
sscDNA(2.5uM) 1uL
引物DNA(2.5uM) 2ul
10×buffer 1uL
Rnase-free H2O 加至总体积10ul
[0050] 其中10x退火缓冲液包括：100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM EDTA和1M NaCl，退火反应条件为：85℃，5min；25℃，3h。
[0051] 其中利用Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNAP)进行延伸反应的体系，然后设置对照组，体系如表5所示：
[0052] 表5滚环复制延伸反应的体系
[0053]
[0054]
[0055] 其中Phi29DNA聚合酶，购自NEB，货号为M0269S；延伸反应条件是30℃，30min。
[0056] 反应结束后，采用
碱性琼脂糖凝胶电泳检测延伸产物，其中，碱性琼脂糖凝胶电泳条件为3V/CM，3h。碱性琼脂糖凝胶电泳的缓冲液为：10×碱性琼脂糖电泳缓冲液或6×碱性凝胶载样缓冲液，其中10×碱性琼脂糖电泳缓冲液包括：500mM NaOH及10mM EDTA；6×碱性凝胶载样缓冲液包括：300mM NaOH，6mM EDTA，18％(m/V)Ficoll-400(Pharmacia公司)，0.15％(m/V)溴甲酚绿及0.25％(m/V)二
甲苯氰。电泳结束后，将琼脂糖胶浸泡在SYBR Gold染液中，缓慢水平震荡约20min；然后利用Azure Biosystems成像仪检测。结果如图2所示，对照组(泳道1)没有延伸产物，而实验组(泳道2)生成大于48.5kbp的延伸产物，证明实施例
1中制备所得DNA为环形DNA。
[0057] 实施例3
[0058] 利用实施例1中制备的单链环状DNA分子做模板，生成不同大小的串联重读序列，按照实施例2的滚环复制的方法设定不同的延伸反应时间(0、5、10、20、30min)，可以生成不同长度和浓度的串联重复序列，其中退火反应的体系为实施例2表1所示，退火反应的条件为：85℃，5min；25℃，3h；其中延伸反应的体系为实施例2中表5所示的实验组体系，结果如图3所示，其中2-6泳道中反应时间分别为0、5、10、20、30min，可以看出延伸产物的长度和浓度，均随着延伸时间的延长不断增加。
[0059] 实施例4
[0060] 利用实施例1中制备的单链环状DNA分子做模板，通过实施例2中的滚环复制方法，根据DNA聚合酶的聚合能力，可以检测DNA聚合酶是否具有链置换能力，其中退火反应的体系为实施例2表1所示，退火反应的条件为：85℃，5min；25℃，3h；其中延伸反应体系如表6：
[0061] 表6检测DNA聚合酶链置换能力的延伸反应体系
[0062]
[0063] 其中Phi29DNA聚合酶，购自NEB，货号为M0269S；延伸反应条件是30℃，30min。
[0064] 将上述反应体系所产生的产物进行凝胶电泳，结果如图4所示，其中图中泳道1为不添加DNA聚合酶的空白对照组，泳道2为Phi29 DNA聚合酶延伸产物，泳道3为大肠杆菌DNA Pol I，Large(Klenow)fragment，根据图4可以看出具有链置换能力的DNA聚合酶能够利用环形DNA分子进行滚环复制，生成大
片段单链DNA产物；而不具有链置换能力的DNA聚合酶，不能生成相应的产物，因此利用单链环状DNA分子做模板，通过DNA聚合酶的聚合能力这种方法，可以用来迅速、简便鉴定未知DNA聚合酶是否具有链置换能力。
