一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法
专利汇可以提供一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法，在含10%FBS的DMEM培养基 基础 上，通过加入少量白血病抑制因子和MK2-IN-1两种小分子化合物来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新状态。在此种培养条件下，细胞生长情况良好，能够维持自我更新的状态，可多次传代，不出现分化现象，该发明扩大了胚胎干细胞的自我更新机制，对于促进干细胞基础用研究的顺利开展具有重要作用。，下面是一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法专利的具体信息内容。
1.一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法，其特征在于，在含10% FBS的DMEM培养基基础上，通过加入少量白血病抑制因子和MK2-IN-1两种小分子化合物来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新状态。
2.根据权利要求1所述的维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下具体步骤：
（1）取1毫升0.1%的明胶于孔板中，放置于5%的CO2、37℃的培养箱中培养30min；
（2）取生长至70-80%密度的小鼠胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，除去残留的培养液；
（3）吸净磷酸盐缓冲液PBS，并加入1毫升胰蛋白酶消化2-3min，待细胞边缘开始出现浮起，用枪头轻轻吹打细胞，使细胞呈一个个的单细胞状态，准备一个新的15毫升离心管，加入2毫升的血清培养液，将吹打下来的细胞悬液加入其中；
（4）以1000rpm离心3min，吸去上清后，加入适量培养液重悬细胞，在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；
（5）取已包被好的培养皿，弃明胶，向培养皿孔内加入2ml DMEM培养基；
（6）向培养基中加入5×104个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；
（7）依次添加10U/ml白血病抑制因子和2μM MK2-IN-1，水平十字形晃动，使其混合均匀；
（8）将细胞培养皿置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内培养。
3.根据权利要求1或2所述的维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法，其特征在于，所述DMEM培养基具体包括以下比例成分：450ml DMEM高糖，10% FBS，1% MEM非必须氨基酸，
2 mM L-Glutamin，0.1 mM β-巯基乙醇，1 mM丙酮酸钠，100单位的青霉素和100 µg的链霉素。
一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）取生长至70-80%密度的小鼠胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，除去残留的培养液；
（3）吸净磷酸盐缓冲液PBS，并加入1毫升胰蛋白酶消化2-3min，待细胞边缘开始出现浮起，用枪头轻轻吹打细胞，使细胞呈一个个的单细胞状态，准备一个新的15毫升离心管，加入2毫升的血清培养液，将吹打下来的细胞悬液加入其中；
（4）以1000rpm离心3min，吸去上清后，加入适量培养液重悬细胞，在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；
（5）取已包被好的培养皿，弃明胶，向培养皿孔内加入2ml DMEM培养基；
（6）向培养基中加入5×104个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；
（7）依次添加10U/ml白血病抑制因子和2μM MK2-IN-1，水平十字形晃动，使其混合均匀；
（8）将细胞培养皿置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内培养。
具体实施方式
（2）取生长至70-80%密度的小鼠胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，除去残留的培养液；
（3）吸净磷酸盐缓冲液PBS，并加入1毫升胰蛋白酶消化2-3min，待细胞边缘开始出现浮起，用枪头轻轻吹打细胞（切记不可吹打过猛，以免污染其他孔细胞），使细胞呈一个个的单细胞状态，准备一个新的15毫升离心管，加入2毫升的血清培养液，将吹打下来的细胞悬液加入其中；
（4）以1000rpm离心3min，吸去上清后，加入适量培养液重悬细胞，在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；
（5）取已包被好的培养皿，弃明胶，向培养皿孔内加入2ml DMEM培养基，所述DMEM培养基具体包括以下比例成分：450ml DMEM高糖，10% FBS，1% MEM非必须氨基酸，2 mM L-Glutamin，0.1 mM β-巯基乙醇，1 mM丙酮酸钠，100单位的青霉素和100 µg的链霉素。
同时设置一组实验组：实验组在添加10U/ml白血病抑制因子的基础上再添加2μM MK2-IN-1；
（8）将细胞培养皿置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内培养。
将细胞多次传代后，观察不同代数细胞的培养形态：实验组小鼠胚胎干细胞保持自我更新的特征；对照组细胞出现大部分分化情况。
a、首先配置染色剂，将一个8523R胶囊（SIGMA-ALDRICH）溶入48ml的水中放在3-5℃避光保存，取适量，将其与SLBJ6060V(SIGMA-ALDRICH)按25：1的比例充分混合成染色剂；
b、将不同培养条件下培养好的干细胞，弃培养液，加PBS洗一遍，加0.9-1.2ml的3.8-
4.2% 多聚甲醛固定细胞1.5-2.5分钟；
c、弃多聚甲醛，加PBS洗两遍，把多聚甲醛残留洗掉，每个培养孔2ml的染色剂，避光静置38-43分钟；
d、弃染色液，用PBS洗两遍，加适量PBS后放在Leica DMIL倒置相差显微镜观察拍照，观察的着色状态，判断细胞的自我更新状态；
如图2所示，观察的着色状态，可以观察到对照组细胞无色，说明已经分化，实验组细胞被染成红色，符合自我更新的特征。
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