一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法专利检索-磷酸酸，碱，盐，酸酐和碱专利检索查询-专利查询网

一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法

阅读：901发布：2023-12-12

专利汇可以提供一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。该方法包括：将待测单增李斯特菌菌株进行增菌培养，得到增菌培养液；提取增菌培养液的DNA，将DNA提取液、PCR引物与PCR反应物混合均匀，进行PCR反应，得到PCR反应产物；将PCR反应产物电泳，根据电泳结果判断待检测菌的血清型。本发明针对新挖掘到的单增李斯特菌血清型的特异性靶标lmo2644、LMOf2365_0118、lmo1119、lmo0733基因设计特异性引物，并建立单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法。这些靶标具有准确度高和特异性好的特点。该方法具有准确度高、特异性好、鉴定速度快、成本低廉及操作简单的特点。，下面是一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将待测单增李斯特菌菌株接种至培养基中进行增菌培养，得到增菌培养液；
（2）使用试剂盒法提取步骤（1）所述增菌培养液的基因组DNA，得到待鉴定的DNA提取液；
（3）将步骤（2）所述待鉴定的DNA提取液、所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；
（4）将步骤（3）所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现669bp和500bp条带，则判定步骤（1）所述待测单增李斯特菌菌株的血清群为IIa，其血清型为1/2a或3a；若只出现500bp的条带，则判定为血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出现669bp、243bp和500bp的条带，则判定为血清群IIc，即血清型1/2c或3c；若只出现889bp和500bp的条带，则判定为血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出现669bp、
889bp和500bp的条带，则判定为血清群L，即血清型4a或4c；如果所述电泳结果图上没有出现以上条带，则步骤（1）所述待鉴定的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。
2.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（1）所述培养基为TSB培养基；所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36 38℃，增菌培养的时间为8 12 h，所述增菌培养的摇床转速为210 230 ~ ~ ~
rpm。
3.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（2）所述待鉴定的DNA提取液中的DNA浓度为10-500 ng/μL。
4.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（3）所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物包括PCR引物lmo2644、PCR引物LMOf2365_0118、PCR引物lmo1119及PCR引物lmo0733。
5.根据权利要求4所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，所述PCR引物lmo2644包括正向引物lmo2644-F和反向引物lmo2644-R；所述正向引物lmo2644-F如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物lmo2644-R如SEQ ID NO：2所示；
所述PCR引物LMOf2365_0118包括正向引物LMOf2365_0118-F和反向引物LMOf2365_
0118-R；所述正向引物LMOf2365_0118-F如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物LMOf2365_
0118-R如SEQ ID NO：4所示；
所述PCR引物lmo1119包括正向引物lmo1119-F和反向引物lmo1119-R；所述正向引物lmo1119-F如SEQ ID NO：5所示，所述反向引物lmo1119-R如SEQ ID NO：6所示；
所述PCR引物lmo0733包括正向引物lmo0733-F和反向引物lmo0733-R；所述正向引物lmo0733-F如SEQ ID NO：7所示，所述反向引物lmo0733-R如SEQ ID NO：8所示。
6.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（3）所述PCR反应体系，按体积份数计，包含：
10×PCR反应缓冲液        5份；
dNTP溶液                 1份；
鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物溶液  1份；
待鉴定的DNA提取液          1份；
Taq酶溶液                  1份；
水                          41份；
其中，所述10×PCR反应缓冲液的pH值为8.2 8.4；所述dNTP溶液为dATP、dGTP、dTTP和~
dCTP这四种脱氧核糖核苷三磷酸等比例与水混合均匀得到的溶液，所述dNTP溶液中四种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度均为10 15 mM；所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物溶液为~
鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与水混合均匀得到的溶液，所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物溶液中引物的浓度为各8 12μM；所述Taq酶溶液为Taq酶与水混合均匀得到~
的溶液，所述Taq酶溶液的浓度为2 3 U/μL；所述水为无菌且无核苷酸的超纯水。
~
7.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（3）所述PCR反应的条件为：
先在95 98℃预变性2 4 min，然后进行扩展循环，最后在68 72℃条件下延伸4 6 min；
~ ~ ~ ~
所述扩展循环为：在95 98℃条件下变性14 16 s，52 54℃条件下退火14 16 s，68 72~ ~ ~ ~ ~
℃条件下延伸29 31 s，进行30 35个循环。
~ ~
8.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（4）所述琼脂糖凝胶的质量百分比浓度为1.5-3wt%。

说明书全文

一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR

方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。

背景技术

[0002] 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性致病菌。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，会导致许多食品中的污染，并可承受食品加工过程中常见的环境压力。单增李斯特菌抗盐碱、耐冷，在20％的盐浓度下仍可存活，在4℃下仍可生长繁殖。单增李斯特菌是引起李斯特菌病的唯一人类病原体，主要感染老年人、孕妇、儿童和免疫功能低下者。李斯特菌病的临床表现包括脑膜炎、脑炎、流产、发热性胃肠炎和败血症等，李斯特菌病的死亡率高达30％。因此，大多数国家都对食品中的单增李斯特菌进行严格控制，特别是在即食食品中。

[0003] 根据菌体和鞭毛抗原的血清型反应，单增李斯特菌可被分为13个血清型，分别为1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7型。其中，1/2a、1/2b、1/2c、4b这4种血清型是主要的血清型，99％的人类李斯特菌病由这四种血清型的菌株引起。1/2a血清型是食品中最为常见的血清型，但李斯特菌病的暴发性流行大多是由4b血清型的菌株引起的，这说明4b血清型可能具有更强的毒力。以上13种血清型可进一步被分为5个血清群
(serogroup)，1/2a和3a型属于IIa群，1/2b、3b和7型属于IIb群，1/2c和3c型属于IIc群，4b、
4d和4e型属于IVb群，4a和4c型属于L群。对单增李斯特菌的血清型鉴定，在其流行株的监测、食品安全性评估及暴发疫情的病原学溯源中具有重要的应用价值。

[0004] 目前，对单增李斯特菌血清型的鉴定方法主要是血清型方法(可见出入境检验检疫行业标准SN-T 2521-2010)，此种方法需要使用菌毛抗原和菌体抗原，成本较高，操作复杂，易发生交叉反应，且鉴定周期较长，完成一次鉴定需要3天以上的时间。

[0005] 现有专利中，单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法，如CN 107746890 A、CN 103602739 A等专利中使用的靶标使用Primer-BLAST进行验证，发现仍缺少准确度和特异性都较好的单增李斯特菌血清型PCR鉴定引物；然而，目前对单增李斯特菌血清型的新PCR鉴定靶标的挖掘的相关文献报道较少。对其新PCR鉴定靶标的挖掘和新的PCR鉴定方法的建立，有助于提高单增李斯特菌血清型PCR鉴定的准确度和特异性。

发明内容

[0006] 为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。

[0007] 本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

[0008] 本发明提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，是一种特异性好、鉴定速度快、成本低廉、操作简单的单增李斯特菌的PCR鉴定方法。

[0009] 本发明提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，该PCR方法使用的血清群IIa、IIc、L特异性靶标基因为lmo2644，血清群IVb、L特异性靶标基因为LMOf2365_0118、血清群IIc的特异性靶标基因为lmo1119、单增李斯特菌特异性靶标基因lmo0733。

[0010] 本发明公开了一组单增李斯特菌血清型的特异性靶标，及其对应的血清型鉴定引物和鉴定方法。本发明针对新挖掘到的单增李斯特菌血清型的特异性靶标lmo2644、LMOf2365_0118、lmo1119、lmo0733基因设计特异性引物，并建立单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法。所述特异性靶标通过比较基因组学和生物信息学挖掘获得，该组靶标具有准确度高和特异性好的特点。本发明的PCR血清型鉴定方法具有准确度高、特异性好、鉴定速度快、成本低廉、操作简单的特点。

[0011] 本发明提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，使用的引物序列为：

[0012] lmo2644-F：5’-ACGGTATTACTTAGCGATGTGC-3’，

[0013] lmo2644-R：5’-CAAACTCAAAATAAACGCTTCAA-3’，

[0014] 其对应的特征DNA片段为669bp；

[0015] LMOf2365_0118-F：5’-ACCGACCAATGTCTACACGC-3’，

[0016] LMOf2365_0118-R：5’-TTCACGCATTCTGGCATCT-3’，

[0017] 其对应的特征DNA片段为889bp；

[0018] lmo1119-F：5’-GTGGTTCTGGTCTTGCCTTAG-3’，

[0019] lmo1119-R：5’-GATTGAGAAAGAGGGTTGAAAA-3’，

[0020] 其对应的特征DNA片段为243bp；

[0021] lmo0733-F：5’-AAAGCAATCAGAAAATCAAAAGG-3’，

[0022] lmo0733-R：5’-GTACGATTTTATACGTTCTTCCGC-3’，

[0023] 其对应的特征DNA片段为500bp。

[0024] 本发明提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，包括如下步骤：

[0025] (1)将待测单增李斯特菌菌株接种至培养基(优选TSB培养基)中进行增菌培养，得到增菌培养液；

[0026] (2)使用试剂盒法提取步骤(1)所述增菌培养液的基因组DNA，得到待鉴定的DNA提取液；

[0027] (3)将步骤(2)所述待鉴定的DNA提取液、所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；

[0028] (4)将步骤(3)所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现669bp和500bp条带，则判定步骤(1)所述待测单增李斯特菌菌株的血清群为IIa，其血清型为1/2a或3a；若只出现500bp的条带，则判定为血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出现669bp、243bp和500bp的条带，则判定为血清群IIc，即血清型1/2c或3c；
若只出现889bp和500bp的条带，则判定为血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出现669bp、
889bp和500bp的条带，则判定为血清群L，即血清型4a或4c；如果所述电泳结果图上没有出现以上条带，则步骤(1)所述待鉴定的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。

[0029] 进一步地，步骤(1)所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36～38℃，增菌培养的时间为8～12h，所述增菌培养的摇床转速为210～230rpm。

[0030] 优选地，步骤(1)所述培养基为TSB培养基(即胰酪大豆胨液体培养基)。

[0031] 优选地，步骤(1)所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为37℃，增菌培养的时间为10h，所述增菌培养的摇床转速为220rpm。

[0032] 进一步地，步骤(2)所述待鉴定的DNA提取液中的DNA浓度为10～500ng/μL。

[0033] 进一步地，步骤(3)所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物包括PCR引物lmo2644、PCR引物LMOf2365_0118、PCR引物lmo0733及PCR引物lmo1119。

[0034] 进一步地，所述PCR引物lmo2644包括正向引物lmo2644-F和反向引物lmo2644-R；

[0035] 所述正向引物lmo2644-F如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物lmo2644-R如SEQ ID NO：2所示；

[0036] 所述PCR引物LMOf2365_0118包括正向引物LMOf2365_0118-F和反向引物LMOf2365_0118-R；

[0037] 所述正向引物LMOf2365_0118-F如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物LMOf2365_0118-R如SEQ ID NO：4所示；

[0038] 所述PCR引物lmo1119包括正向引物lmo1119-F和反向引物lmo1119-R；

[0039] 所述正向引物lmo1119-F如SEQ ID NO：5所示，所述反向引物lmo1119-R如SEQ ID NO：6所示；

[0040] 所述PCR引物lmo0733包括正向引物lmo0733-F和反向引物lmo0733-R；

[0041] 所述正向引物lmo0733-F如SEQ ID NO：7所示，所述反向引物lmo0733-R如SEQ ID NO：8所示。

[0042] 进一步地，步骤(3)所述PCR反应体系，按体积份数计，包含：

[0043] 10×PCR反应缓冲液5份；

[0044] dNTP溶液1份；

[0045] 鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物溶液1份；

[0046] 待鉴定的DNA提取液1份；

[0047] Taq酶溶液 1份；

[0048] 水 41份；

[0049] 其中，所述10×PCR反应缓冲液的pH值为8.2～8.4；所述dNTP溶液为dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种脱氧核糖核苷三磷酸等比例与水混合均匀得到的溶液，所述dNTP溶液中四种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度均为10～15mM；所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物溶液为鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与水混合均匀得到的溶液，所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物溶液中引物的浓度为各8～12μM；所述Taq酶溶液为Taq酶与水混合均匀得到的溶液，所述Taq酶溶液的浓度为2～3U/μL；所述水为无菌且无核苷酸的超纯水(DEPC水)。

[0050] 优选地，步骤(3)所述PCR体系的体积为50μL。

[0051] 优选地，步骤(3)所述PCR体系(以体积50μL计)包含：

[0052] 10×PCR反应缓冲液5μL，dNTP 0.25mM，引物lmo2644-F、lmo2644-R、LMOf2365_0118-F、LMOf2365_0118-R、lmo1119-F、lmo1119-R、lmo0733-F、lmo0733-R各0.2μM，模板DNA
1μL，Taq酶2.5U，余者为DEPC水。

[0053] 进一步地，步骤(3)所述PCR反应的条件为：

[0054] 先在95～98℃预变性2～4min，然后进行扩展循环，最后在68～72℃条件下延伸4～6min；

[0055] 所述扩展循环为：在95～98℃条件下变性14～16s，52～54℃条件下退火14～16s，68～72℃条件下延伸29～31s，进行30～35个循环。

[0056] 优选地，步骤(3)所述PCR反应的条件为：

[0057] 先在95℃预变性3min，然后进行扩展循环，最后在72℃条件下延伸5min；

[0058] 所述扩展循环为：在95℃件下变性15s，53℃条件下退火15s，72℃条件下延伸30s，进行35个循环。

[0059] 进一步地，步骤(4)所述琼脂糖凝胶的质量百分比浓度为1.5～3.0wt％。

[0060] 优选地，所述琼脂糖凝胶电泳，可以取体积为5μL的PCR反应产物进行电泳。

[0061] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

[0062] (1)本发明提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其利用PCR方法进行单增李斯特菌血清型的鉴定，其具有成本低、周期短、操作简单、鉴定结果容易判读的特点；

[0063] (2)本发明提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，具有准确度高和特异性强的特点，对单增李斯特菌的血清型鉴定，尤其是在其流行株的监测、食品安全性评估及暴发疫情的病原学溯源中具有重要的应用价值。附图说明

[0064] 图1a为实施例2中一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法的特异性评价的部分电泳结果图；

[0065] 图1b为实施例2中一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法的特异性评价的另一部分电泳结果图。

具体实施方式

[0066] 以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

[0067] 实施例1建立单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法(所述基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法)

[0068] 通过对不同血清型的单增李斯特菌的全基因组序列进行比对，筛选得到单增李斯特菌血清群IIa、IIc、L特异性靶标基因lmo2644，血清群IVb、L特异性靶标基因LMOf2365_0118，血清群IIc的特异性靶标基因lmo1119，并对单增李斯特菌和其他细菌的全基因组序列进行比对，筛选得到单增李斯特菌特异性靶标基因lmo0733。使用软件Primer Premier 6进行引物设计，确定引物序列如下：

[0069] lmo2644-F：5’-ACGGTATTACTTAGCGATGTGC-3’，如SEQ ID NO：1所示；

[0070] lmo2644-R：5’-CAAACTCAAAATAAACGCTTCAA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

[0071] LMOf2365_0118-F：5’-ACCGACCAATGTCTACACGC-3’，如SEQ ID NO：3所示；

[0072] LMOf2365_0118-R：5’-TTCACGCATTCTGGCATCT-3’，如SEQ ID NO：4所示；

[0073] lmo1119-F：5’-GTGGTTCTGGTCTTGCCTTAG-3’，如SEQ ID NO：5所示；

[0074] lmo1119-R：5’-GATTGAGAAAGAGGGTTGAAAA-3’，如SEQ ID NO：6所示；

[0075] lmo0733-F：5’-AAAGCAATCAGAAAATCAAAAGG-3’，如SEQ ID NO：7所示；

[0076] lmo0733-R：5’-GTACGATTTTATACGTTCTTCCGC-3’，如SEQ ID NO：8所示。

[0077] 使用在线工具Primer-Blast将设计的引物与NCBI的NT数据库进行比对，以验证本发明鉴定引物的准确性。本发明的PCR鉴定引物在NT数据库的217个单增李斯特菌基因组中，正确地鉴定了其中216个基因组对应菌株的血清型。使用陈健舜等(CN 103602739A)，以及陆兆新等(CN 107746890A)的发明中的引物进行相同的验证，两项发明分别可以正确地鉴定NR数据库中207个和86个基因组对应菌株的血清型，如表1所示，表1为本发明的血清型鉴定引物的准确性评价表。由表1可见，本发明的单增李斯特菌血清型鉴定引物相比于现有的血清型鉴定引物，有更高的准确率。

[0078] 表1

[0079]

[0080] 采用以上所述的引物对(所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物)，建立单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法。

[0081] 所述的PCR反应体系总体积为50μL，所述PCR反应体系包含10×PCR反应缓冲液5μL，模板DNA1μL，余者为DEPC水；其中在PCR反应体系中含有dNTP0.25mM，引物lmo2644-F、lmo2644-R、LMOf2365_0118-F、LMOf2365_0118-R、lmo1119-F、lmo1119-R、lmo0733-F及lmo0733-R各0.2μM，Taq酶2.5U。

[0082] 所属的PCR反应程序为：95℃预变性3min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性15s、53℃退火15s、72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min。

[0083] 鉴定结果的判定：取5μL的PCR反应产物在质量百分比浓度为2wt％的琼脂糖凝胶中进行电泳，若只出现669bp和500bp条带，则判定步骤(1)所述待测单增李斯特菌菌株的血清群为IIa，其血清型为1/2a或3a；若只出现500bp的条带，则判定为血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出现669bp、243bp和500bp的条带，则判定为血清群IIc，即血清型1/2c或3c；
若只出现889bp和500bp的条带，则判定为血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出现669bp、
889bp和500bp的条带，则判定为血清群L，即血清型4a或4c；若无以上条带，则判定为非单增李斯特菌。

[0084] 实施例2本发明的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法的特异性评价

[0085] 对本发明的单增李斯特菌血清型PCR鉴定方法的特异性评价共使用了10株单增李斯特菌，分别为血清群IIa的CICC 21633、CICC 21662，血清群IIb的242-2、CICC 21632，血清群IIc的CICC 21634、CMCC 54002，血清群IVb的GIM 1.347，以及血清群L的ATCC 19114、2006-1和3877-1。

[0086] 特异性评价共使用了20株非单增李斯特菌，分别为英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、谷氨酸棒杆菌
(Corynebacterium glutamicum)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、维德曼氏芽胞杆菌(Bacillus wiedmannii)、雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)、格拉纳达假单胞菌(Pseudomonas granadensis)、东洋芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus)、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、解酪蛋白巨大球菌(Macrococcus caseolyticus)、格式乳球菌(Lactococcus garvieae)。

[0087] 将10株单增李斯特菌和20株非单增李斯特菌分别接种到10mL的LB液体培养基中，放入摇床中振荡培养，摇床的转速为220rpm，在37℃增菌12h后，分别取菌悬液1mL，得到30份菌悬液，使用天根生化科技(北京)有限公司的细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，得到30份基因组DNA。

[0088] 将提取得到的30份基因组DNA分别取1μL做PCR反应，PCR反应体系和反应程序如实施例1中所述。将PCR反应产物进行电泳，并如实施例1中所述判断单增李斯特菌血清型的方法来鉴定结果。实施例2中的PCR鉴定结果如表2、图1a及图1b所示；其中，表2为PCR反应体系特异性评价实验采用的菌株及其鉴定结果，图1a和图1b的M均表示为DL 1,000DNA Marker，泳道1-10为单增李斯特菌，泳道11-24为非单增李斯特菌，每个泳道对应的菌种和菌株名称见表2所示。实验结果表明，本发明的PCR血清型鉴定方法对10株不同血清型的单增李斯特菌菌株，皆可正确地鉴定其所属的血清群，具有较高的准确度；对20株非单增李斯特菌的菌种，实施例2提供的基于多重靶标鉴定单增李斯特菌血清型的PCR方法皆鉴定为阴性，因此，本方法也具有较高的特异性。

[0089] 表2

[0090]

[0091]

[0092] 表2中“-”表示鉴定结果为非单增李斯特菌。

[0093] 以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

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