技术领域
[0001] 本
发明涉及一种可自组装成水凝胶的多肽、水凝胶及其应用，属于材料科学领域。
背景技术
[0002] 研究表明，多肽因为其特殊的化学结构，决定了其具有优良的
生物相容性和
生物可降解性、生物活性。选择具有特定性能的
氨基酸类型，例如疏水性以及
芳香性，可得到具有特定性能的自组装多肽水凝胶。
[0003] 因为自组装多肽水凝胶是多肽分子之间通过氢键、静电、π-π堆积相互作用等非共价键自发形成的稳定的聚集体，所以多肽水凝胶对外界微小的刺激能做出快速反应，如
温度、pH值，离子强度、
电场、
磁场等。水凝胶是以水为分散介质的凝胶材料，由于其特殊的孔结构以及三维网状结构特性。水凝胶在吸水溶胀后，能够继续保持其原有的结构而不解聚，使其可以运用到生物
支架，生物载药等领域。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种可自组装成水凝胶的多肽、水凝胶及其应用，该水凝胶具有良好的生物兼容性和可降解性，降解产物为天然氨基酸，无毒无害，能被广泛用于细胞的体外培养和体内移植、组织再生与修复等领域。
[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可自组装成水凝胶的多肽，所述多肽的氨基酸序列为
[0006] Ac-Arg-Val-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Thr-Ala-Arg-Ala-Asp-NH2，如SEQ ID NO.1所示。
[0007] 本发明还提供一种水凝胶，包括所述的多肽的。
[0008] 进一步地，所述水凝胶为网状立体结构，所述水凝胶的孔径为50～200nm。
[0009] 进一步地，所述水凝胶由所述多肽在20-30℃下，在水溶液中自组装形成。
[0010] 进一步地，所述水溶液的pH为中性。
[0011] 本发明还提供一种根据所述的水凝胶在制备用于细胞培养的培养材料中的应用，所述水凝胶含有所述多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012] 进一步地，所述培养材料包括所述水凝胶原溶液、无菌
蔗糖溶液和去离子水，所述水凝胶原溶液中含有所述多肽。
[0013] 进一步地，所述水凝胶原溶液中，所述多肽的含量为1％w/v，所述无菌蔗糖溶液的浓度为20％w/v。
[0014] 本发明还提供一种根据所述的水凝胶在制备用于组织再生与修复的再生修复材料中的应用，所述水凝胶含有所述多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015] 进一步地，所述再生修复材料由水凝胶原溶液、无菌蔗糖溶液以及
磷酸盐缓冲液混合形成；所述水凝胶原溶液中，所述多肽的含量为1％w/v；所述无菌蔗糖溶液的浓度为10％w/v。
[0016] 本发明的有益效果在于：本发明的可自组装成水凝胶的多肽、水凝胶及其应用，因该水凝胶具有良好的生物兼容性和可降解性，降解产物为天然氨基酸，无毒无害，能被广泛用于细胞的体外培养和体内移植、组织再生与修复等领域。
[0017] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照
说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳
实施例并配合
附图详细说明如后。
附图说明
[0018] 图1为本发明实施例一所示的水凝胶的SEM电镜图；
[0019] 图2和图3为本发明实施例一中1成人骨髓间充质干细胞在细胞培养水凝胶中成脂诱导培养的细胞形态学图片；
[0020] 图4和图5为本发明实施例一中
肿瘤细胞在水凝胶中的显微形态图；
[0021] 图6a至图6h为本发明实施例二中所示的仓鼠中脑视觉中枢
组织切片图。
具体实施方式
[0022] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0023] 实施例一 水凝胶在细胞培养中的应用
[0024] 采用常规液相合成或固相合成该多肽：
[0025] Ac-Arg-Val-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Thr-Ala-Arg-Ala-Asp-NH2，如SEQ ID NO.1所示。然后将其溶于超纯水，并配置成水凝胶原溶液，其多肽的含量为1％(w/v)，其pH值为2.0～2.5。请参见图1，如图所示，在适当条件下，本发明的多肽可自组装成
纳米纤维，进而形成与天然细胞外基质(ECM)相似的具有网状立体结构的水凝胶支架，其孔径为50～200nm，外观呈水凝胶状，能够为细胞的粘附、迁移、增殖和分化提供更接近体内的外环境。
[0026] 1.水凝胶工作液(2×)的制备：将将水凝胶原溶液用
超声波水浴锅或涡旋震荡仪于室温下处理30分钟，以降低水凝胶原溶液的粘性。如振荡过程中产生气泡，可将其进行离心处理(1500g，5分钟)。然后将水凝胶原溶液、无菌蔗糖原溶液和去离子水按表1所示的比例关系配制成2×水凝胶工作液，其中蔗糖溶液终浓度为10％w/v。
[0027] 2.细胞工作液(2×)的制备：离心(参考离心
力为250g)收集经胰蛋白酶消化过的细胞，移上清液后，将细胞重新悬浮在5mL无菌蔗糖工作液中。再次离心收集细胞，去上清；取适量细胞(参考浓度为1～2×10cells/mL)重新悬浮在无菌蔗糖工作液中，配制成2×细胞工作液。
[0028] 3.细胞培养皿预处理：将3D细胞培养皿置于细胞培养板的培养孔中，将一定体积(参见表2)的细胞培养液加入到3D细胞培养皿底部作为下层细胞培养液，润湿细胞培养皿内膜。
[0029] 4. 5水凝胶-细胞
混合液制备：将等体积配制好的2×细胞工作液加到配制好的2×水凝胶工作液中，然后轻轻将两者混合均匀制成水凝胶-细胞混合液。
[0030] 5.细胞接种：将一定体积(参见表2)的水凝胶-细胞混合液轻轻加入到3D 细胞培养皿中；用200μL移液器将细胞培养液沿着3D细胞培养皿边缘轻轻注入到水凝胶-细胞混合液上部，作为上层细胞培养液。
[0031] 6.细胞培养：将步骤5制备的载有3D细胞培养皿的细胞培养板置于二
氧化
碳培养箱中进行培养；培养10分钟后，用200μL移液器更换2/3～3/4体积的新鲜细胞培养液，30分钟内更换两次培养液即可，如果细胞培养液中含有酚红指示剂，其
颜色将由淡黄色(偏酸性)转为红色(偏中性)；为了更好地促进细胞生长，每2天更换一次新鲜细胞培养液，更换时应小心操作，以免破坏胶体结构。
[0032] 表1不同浓度2×水凝胶工作液的配置比例关系
[0033]
[0034] 表2不同浓度2×水凝胶工作液的配置比例关系
[0035]
[0036] 请参见图2和图3，为根据上述的方法来将本发明的水凝胶用于骨髓间充质干细胞的培养。本实施例为成人骨髓间充质干细胞(MSCs)在细胞培养水凝胶中成脂诱导培养，图2是接种3D细胞水凝胶后成脂诱导10天后的成人骨髓间充质干细胞，图3是采用油红O
试剂对左图细胞进行
染色，红色染色代表诱导成功的间充质干细胞产生的脂肪滴。图片刻度尺均为200μm。图示表明间充质干细胞在水凝胶材料中可以成功诱导成为脂肪细胞，形成大量的脂肪滴，水凝胶材料不会影响干细胞的多分化潜能，可以使干细胞自我更新或分
化成特定细胞系的能力得以保持，因此,该水凝胶产品具有成为新一代组织或器官修复再生材料的潜力。
[0037] 请参见图4和图5，为根据上述的方法来将本发明的水凝胶用于肿瘤细胞培养。肿瘤多细胞球体是由多个肿瘤细胞聚集而成的、以三维结构生长的球样细胞团
块。传统二维培养方式培养的肿瘤细胞难以形成球状细胞团块。本实施例采用上述的3D培养方式来培养肿瘤细胞，肿瘤细胞在水凝胶中的显微形态图。图4和图5分别是表达GFP基因的293细胞与乳腺肿瘤细胞在适用于肿瘤细胞的3D细胞培养水凝胶中培养一周后的显微图片，可看到两种肿瘤细胞均已形成球状细胞团块。本实施例表明适用于肿瘤细胞培养的水凝胶为肿瘤细胞提供了与体内相似的三维环境，可促进肿瘤细胞形成三维结构的多细胞球体。
[0038] 实施例二 水凝胶在细胞培养中的应用
[0039] 1.水凝胶预处理：将水凝胶原溶液用
超声波水浴锅或涡旋震荡仪于室温下处理30分钟，以降低水凝胶原溶液的粘性。如振荡过程中产生气泡，可将本产品离心处理(
离心力1500g，5分钟)。
[0040] 2.细胞工作液(4×)制备：将细胞悬液低速离心(参考离心力250g)后去除上清；在收集的细胞中加入5mL 10％无菌蔗糖工作液重悬细胞；再次离心并弃上清以除去原细胞沉淀中残余的离子成分；然后加入50μL 10％无菌蔗糖工作液重悬细胞，制备成无盐离子的等渗细胞悬液，即为4×细胞工作液。
[0041] 3.水凝胶-细胞混合液制备：将50μL经预处理后的水凝胶溶液与50μL步骤2制备的4×细胞工作液快速轻微吹打混合，操作时应避免产生气泡；轻微地将100μL的1×PBS加入到上述混合液的上层，然后用移液器轻微地将PBS层和水凝胶层均匀混合，最终得到200μL水凝胶-细胞混合液，其中水凝胶终浓度为0.25％。
[0042] 4.体内注射：注射前先用型号20G的针头将水凝胶-细胞混合液吸进
注射器中，注意避免产生气泡；然后更换型号为30G的针头，进行注射。
[0043] 请参见图6a至图6h，本实施例采用上述方法将水凝胶用于仓鼠脑神经再生修复仓鼠中脑视觉中枢组织损伤的愈合实验。图6a，仓鼠大脑背部结构示意图，蓝色线为中脑视觉神经
位置，表明外科手术创伤的位置和宽度；图6b，仓鼠中脑纵剖面示意图，箭头指示方向表明外科手术创伤的深度；图6c，暗
视野下注射生理盐水24小时后的脑部伤口组织切片图；图6d，暗视野下注射水凝胶24 小时后的脑部伤口组织切片图；图6e，暗视野下注射生理盐水30天后的神经组织切片图；图6f暗视野下注射水凝胶30天后的神经组织切片图；图6g，暗视野下注射水凝胶60天后的神经组织切片图；图6h，明视野下注射水凝胶60天后的神经组织切片图。白色箭头指示了伤口的位置与深度。图a-b刻度尺为 500μm，图c-h刻度尺为100μm。实验表明采用组织再生与修复水凝胶有助于脑部组织损伤的愈合。
[0044] 综上所述：本发明的可自组装成水凝胶的多肽、水凝胶及其应用，因该水凝胶具有良好的生物兼容性和可降解性，降解产物为天然氨基酸，无毒无害，能被广泛用于细胞的体外培养和体内移植、组织再生与修复等领域。
[0045] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0046] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明
专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附
权利要求为准。
