SHP2的基于羟基吲哚羧酸的抑制剂
阅读：639发布：2024-01-01
专利汇可以提供SHP2的基于羟基吲哚羧酸的抑制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 公开了蛋白酪 氨 酸 磷酸 酶的 抑制剂 。该抑制剂包括具有连接基和胺骨架的羟基吲哚 羧酸 ，其为包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶-2的有效抑制剂。，下面是SHP2的基于羟基吲哚羧酸的抑制剂专利的具体信息内容。
1.用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸，该羟基吲哚羧酸包括式(I)：
其中L1选自单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、-(C0-6烷基)-(C3-6环烷基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环芳族或脂族环、未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取代选自氮、氧和硫；
L2选自键， 其中n为0-3；且
R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
2.权利要求1的羟基吲哚羧酸，其具有的IC50值小于1μM。
3.权利要求1的羟基吲哚羧酸，其中该蛋白酪氨酸磷酸酶选自包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)，蛋白酪氨酸磷酸酶μ(PTPμ)，蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPε)，蛋白酪氨酸磷酸酶α(PTPα)，蛋白酪氨酸磷酸酶σ(PTPσ)，蛋白酪氨酸磷酸酶γ(PTPγ)，胞质蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)，包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)，蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)，造血酪氨酸磷酸酶(HePTP)，富含纹状体的蛋白酪氨酸磷酸酶(STEP)，蛋白酪氨酸磷酸酶PEZ，双特异性磷酸酶，牛痘H1-相关的磷酸酶(VHR)，VH1-样磷酸酶Z(VHZ)，MAP激酶磷酸酶5(MKP5)，蛋白磷酸酶CDC14A，包含泛素样结构域的CTD磷酸酶1(UBLCP1)，痫蛋白，低分子量PTP(LMWPTP)，和蛋白磷酸酶SSu72。
4.用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸，该羟基吲哚羧酸包括式(II)：
其中L1选自单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、-(C0-6烷基)-(C3-6环烷基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环芳族或脂族环、未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取代选自氮、氧和硫；且
R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
5.权利要求4的羟基吲哚羧酸，包括选自以下的式
6.权利要求4的羟基吲哚羧酸，其具有的IC50值小于1μM。
7.权利要求4的羟基吲哚羧酸，其中该蛋白酪氨酸磷酸酶选自包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)、蛋白酪氨酸磷酸酶μ(PTPμ)、蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPε)、蛋白酪氨酸磷酸酶α(PTPα)、蛋白酪氨酸磷酸酶σ(PTPσ)、蛋白酪氨酸磷酸酶γ(PTPγ)、胞质蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)、包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)、蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)、造血酪氨酸磷酸酶(HePTP)、富含纹状体的蛋白酪氨酸磷酸酶(STEP)、蛋白酪氨酸磷酸酶PEZ、双特异性磷酸酶、牛痘H1-相关的磷酸酶(VHR)、VH1-样磷酸酶Z(VHZ)、MAP激酶磷酸酶5(MKP5)、蛋白磷酸酶CDC14A、包含泛素样结构域的CTD磷酸酶1(UBLCP1)、痫蛋白、低分子量PTP(LMWPTP)、和蛋白磷酸酶SSu72。
8.用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸，该羟基吲哚羧酸包括式(III)：
其中L1选自单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、-(C0-6烷基)-(C3-6环烷基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环芳族或脂族环、未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取代选自氮、氧和硫；
n为0-3；且
R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
9.用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸，该羟基吲哚羧酸包括式(IV)：
其中R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
10.权利要求9的羟基吲哚羧酸，其具有选自以下的式
11.权利要求9的羟基吲哚羧酸，其具有的IC50值小于1μM。
12.权利要求9的羟基吲哚羧酸，其对包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)具有的IC50值为约0.2μM至小于1μM。
13.权利要求9的羟基吲哚羧酸，其中该蛋白酪氨酸磷酸酶选自包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)，蛋白酪氨酸磷酸酶μ(PTPμ)，蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPε)，蛋白酪氨酸磷酸酶α(PTPα)，蛋白酪氨酸磷酸酶σ(PTPσ)，蛋白酪氨酸磷酸酶γ(PTPγ)，胞质蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)，包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)，蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)，造血酪氨酸磷酸酶(HePTP)，富含纹状体的蛋白酪氨酸磷酸酶(STEP)，蛋白酪氨酸磷酸酶PEZ，双特异性磷酸酶，牛痘H1-相关的磷酸酶(VHR)，VH1-样磷酸酶Z(VHZ)，MAP激酶磷酸酶5(MKP5)，蛋白磷酸酶CDC14A，包含泛素样结构域的CTD磷酸酶1(UBLCP1)，痫蛋白，低分子量PTP(LMWPTP)，和蛋白磷酸酶SSu72。
14.用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸，该羟基吲哚羧酸包括式(V)：
其中R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
15.权利要求14的羟基吲哚羧酸，包括选自以下的式
16.权利要求14的羟基吲哚羧酸，其中该蛋白酪氨酸磷酸酶选自包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)，蛋白酪氨酸磷酸酶μ(PTPμ)，蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPε)，蛋白酪氨酸磷酸酶α(PTPα)，蛋白酪氨酸磷酸酶σ(PTPσ)，蛋白酪氨酸磷酸酶γ(PTPγ)，胞质蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)，包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)，蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)，造血酪氨酸磷酸酶(HePTP)，富含纹状体的蛋白酪氨酸磷酸酶(STEP)，蛋白酪氨酸磷酸酶PEZ，双特异性磷酸酶，牛痘H1-相关的磷酸酶(VHR)，VH1-样磷酸酶Z(VHZ)，MAP激酶磷酸酶5(MKP5)，蛋白磷酸酶CDC14A，包含泛素样结构域的CTD磷酸酶1(UBLCP1)，痫蛋白，低分子量PTP(LMWPTP)，和蛋白磷酸酶SSu72。
17.用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸，该羟基吲哚羧酸包括式(VI)：
18.权利要求17的羟基吲哚羧酸，其中该蛋白酪氨酸磷酸酶选自包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)，蛋白酪氨酸磷酸酶μ(PTPμ)，蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPε)，蛋白酪氨酸磷酸酶α(PTPα)，蛋白酪氨酸磷酸酶σ(PTPσ)，蛋白酪氨酸磷酸酶γ(PTPγ)，胞质蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)，包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)，蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)，造血酪氨酸磷酸酶(HePTP)，富含纹状体的蛋白酪氨酸磷酸酶(STEP)，蛋白酪氨酸磷酸酶PEZ，双特异性磷酸酶，牛痘H1-相关的磷酸酶(VHR)，VH1-样磷酸酶Z(VHZ)，MAP激酶磷酸酶5(MKP5)，蛋白磷酸酶CDC14A，包含泛素样结构域的CTD磷酸酶1(UBLCP1)，痫蛋白，低分子量PTP(LMWPTP)，和蛋白磷酸酶SSu72。
19.权利要求17的羟基吲哚羧酸，其具有的IC50值为约0.2μM至约0.7μM。
20.权利要求17的羟基吲哚羧酸，其具有的IC50值为约0.20μM。
21.式(VI)的羟基吲哚羧酸在制备用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的药物中的用途，其中该蛋白酪氨酸磷酸酶选自蛋白酪氨酸磷酸酶μ(PTPμ)、蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPε)、蛋白酪氨酸磷酸酶α(PTPα)、蛋白酪氨酸磷酸酶σ(PTPσ)、蛋白酪氨酸磷酸酶γ(PTPγ)、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)、包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)、蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)、造血酪氨酸磷酸酶(HePTP)、富含纹状体的蛋白酪氨酸磷酸酶(STEP)、蛋白酪氨酸磷酸酶PEZ、牛痘H1-相关的磷酸酶(VHR)、VH1-样磷酸酶Z(VHZ)、MAP激酶磷酸酶5(MKP5)、蛋白磷酸酶CDC14A、包含泛素样结构域的CTD磷酸酶1(UBLCP1)、痫蛋白、低分子量PTP(LMWPTP)和蛋白磷酸酶SSu72，
22.一种抑制测试的方法，包括：
在25℃在50mM3,3-二甲基戊二酸盐缓冲液，pH7.0中进行抑制测试，该缓冲液包含1mM EDTA且通过NaCl调节至离子强度为0.15M；
基于水杨酸的库在96-孔板中在10μM化合物浓度筛选；
在96-孔板通过添加50μl酶至150μl反应混合物而引发反应，该反应混合物包含最终Km值的pNPP和多种浓度抑制剂；
10分钟后通过添加50μl 5N NaOH淬灭反应，然后该反应混合物通过Spectra MAX340微板分光光度计(Molecular Devices)在405nm检测吸光度；
通过将405nm的吸光度对抑制剂浓度拟合为以下方程计算IC50值:
AI/A0＝IC50/(IC50+[I])，
其中AI为存在抑制剂时样品405nm的吸光度；A0为不存在抑制剂时405nm的吸光度；且[I]为抑制剂浓度。
SHP2的基于羟基吲哚羧酸的抑制剂
[0001] 本申请是中国发明专利申请(申请日：2014年4月25日；申请号： 201480023199.8(国际申请号：PCT/US2014/035435)；发明名称：包含Src同 源-2结构域的致癌性蛋白酪氨酸磷酸酶-2(SHP2)的基于羟基吲哚羧酸的抑制 剂)的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2013年4月26日提交的美国临时专利申请号61/816,404的 优先权，其以其整体在此引入作为参考。
[0005] 本发明在政府的支持(国立卫生研究院授予的CA152194)下完成。政府对 本发明具有一些权利。
背景技术
[0006] 本发明大体涉及蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的抑制剂。更具体地，本发明 涉及包含Src同源-2结构域的致癌性蛋白酪氨酸磷酸酶-2(SHP2)的基于羟基 吲哚羧酸的抑制剂。
[0007] 蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)在多种细胞过程，如细胞生长、增殖、细胞分 化和致癌性转化的调节中起重要作用。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)导致的脱磷酸 和其对应物酪氨酸激酶导致的磷酸化之间的平衡对于正常生理功能是关键 的。PTP越来越被视为有价值的药物靶点。例如，通过酪氨酸-蛋白磷酸酶非 受体类型11(PTPN11)编码的包含Src同源-2(SH2)结构域的蛋白酪氨酸磷酸 酶-2(SHP2)，为包含两个串联Src同源-2(SH2)结构域的非受体蛋白酪氨酸磷 酸酶(PTP)。SHP2在大多数组织广泛表达且在生长因子和细胞因子受体下游 的多种信号转导途径中起积极作用，以调节多种细胞功能。SHP2的催化活 性是完全活化Ras-ERK1/2级联所需的，该Ras-ERK1/2级联通过SHP2-催化 的底物脱磷酸介导，该底物通过酪氨酸磷酸化负调节。SHP2被识别为一种 真实的致癌基因；功能获得性SHP2突变导致了增加的磷酸酶活性导致的 Noonan综合征，以及多种形式的白血病(例如，青少年髓单核细胞白血病、 急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴白血病)和多种实体瘤(例 如，肺腺癌、结肠癌、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肝细胞癌和 前列腺癌)。因此，SHP2代表了多种癌症的有希望的靶点(例如，三阴性和 HER2+乳腺癌、受体蛋白酪氨酸激酶(PTK)异常活化导致的癌症，其中有些对 激酶抑制剂单一治疗响应较差)，并在SHP2抑制剂的开发中吸引越来越多的 关注。
[0008] 高度带正电且保守的带电荷的PTP活性位点对开发具有最佳药理学性 质的有效且选择性的PTP抑制剂提出了极大的挑战。显然，已认识到pTyr 和PTP活性位点之间的结合亲和力是适中的。而且，关于PTP底物识别，pTyr 及其侧翼残基一起做出了显著贡献。因此，提出PTP抑制剂开发的一个高度 有效策略是将活性位点和附近的非保守的口袋与连接基相连以增加活性和选 择性。已使用该策略报道了大量有效且选择性的PTP抑制剂。大多数报道的 PTP抑制剂为pTyr模拟物，其通常携带两个或更多个酸基。然而，这些之前 制备的抑制剂的多负电荷性质，导致这些抑制剂缺少细胞膜渗透性，因此不 易成药。
[0009] 之前，羟基吲哚羧酸被鉴定为pTyr模拟物。而且，细胞有效的抑制剂 IIB08(其结构示于图1中且对SHP2的IC50为5.5μM)被鉴定且确定为对SHP2 的选择性为SHP1和PTP1B的3倍。而且，IIB08阻断生长因子刺激的ERK1/2 活化和造血祖源增殖。令人鼓舞的是，相比用单独抑制剂体内治疗的小鼠， 用IIB08和PI3激酶抑制剂LY294002治疗白血病小鼠，显著延长了小鼠存活。 尽管具有有效的细胞活性和有利的体内抗白血病能力，IIB08的功效仍然在 大于1.0μM的水平。因此，需要开发改善的羟基吲哚羧酸化合物以抑制PTP。
发明内容
[0010] 本发明大体涉及蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的抑制剂。更具体地，本发明 涉及包含Src同源-2结构域的致癌性蛋白酪氨酸磷酸酶-2(SHP2)的基于羟基 吲哚羧酸的抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂具有的IC50值小于1μM， 且在一些实施方案中，对SHP2具有的IC50值为0.20μM，选择性是超过20 种之前测试的任一种PTP的5倍以上。
[0011] 在一方面，本发明涉及用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸。该 羟基吲哚羧酸包括式(I)：
[0012]
[0013] 其中L1选自单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、-(C0-6烷基)-(C3-6环烷 基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环芳族或脂族环、未取 代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取代选自氮、氧和硫；
[0014] L2选自键、 其中n为0-3；且R1＝ NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代的烷基、未取代 或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或 取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中稠合 的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
[0015] 在另一方面，本发明涉及用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸， 该羟基吲哚羧酸包括式(II)：
[0016]
[0017] 其中L1选自单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、-(C0-6烷基)-(C3-6环烷 基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环芳族或脂族环、未取 代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取代选自氮、氧和硫； 且R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代的烷基、 未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未 取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其 中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
[0018] 在另一方面，本发明涉及用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸， 该羟基吲哚羧酸包括式(III)：
[0019]
[0020] 其中L1选自单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、-(C0-6烷基)-(C3-6环烷 基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环芳族或脂族环、未取 代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取代选自氮、氧和硫； n为0-3；且R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取 代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代 的芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族 环体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
[0021] 在另一方面，本发明涉及用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸， 该羟基吲哚羧酸包括式(IV)：
[0022]
[0023] 其中R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代 的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的 芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环 体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
[0024] 在另一方面，本发明涉及用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸， 该羟基吲哚羧酸包括式(V)：
[0025]
[0026] 其中R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代 的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的 芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环 体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
[0027] 在另一方面，本发明涉及用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的羟基吲哚羧酸， 该羟基吲哚羧酸包括式(VI)：
[0028]
[0030] 当考虑以下发明详述时，本发明将更好理解，且除了上述之外的特征、 方面和优点将变得更清楚。这些发明详述参考以下附图，其中:
[0031] 图1示出了本发明使用的基于羟基吲哚羧酸的SHP2抑制剂11a-1的策 略和设计，且描述于实施例1。
[0032] 图2示出了本发明使用的基于羟基吲哚羧酸的SHP2抑制剂库11a-d的 策略和设计，且描述于实施例1。条件:(a)FmocOSu，THF，回流，20h，81.4％； (b)Pd(PPh3)2Cl2，CuI，Na2CO3，DMF，44％；(c)I2，NaHCO3，CH2Cl2或AcCN， 室温，86％；(d)50％二乙基胺在DCM中，3h，85％；(e)5％LiOH/THF＝1:2， 80℃，2h，97.2％；(f)对应的酰基氯，Et3N，DMF，0℃，80-
90％；(g)5％ LiOH/THF＝1:2，室温，2h，80-90％；(h)192种胺，HOBT，HBTU，DIPEA， DMF，室温，过夜，60-80％。
90％；(g)5％ LiOH/THF＝1:2，室温，2h，80-90％；(h)192种胺，HOBT，HBTU，DIPEA， DMF，室温，过夜，60-80％。
[0033] 图3A和3B示出了用于本发明的羟基吲哚羧酸的示例性胺骨架。
[0034] 图4A和4B描绘SHP2与化合物11c-9的复合物的晶体结构，如实施例 2所分析。图4A描绘SHP2与化合物11c-9的复合物的总体结构。化合物11c-9 以飘带模型(stick model)显示，其具有无偏差(unbiased)Fo-Fc图，在2.5σ呈 波状，在配体和水分子添加至该模型之前计算。图4B描绘化合物11c-9和 SHP2之间详细的相互作用。极性相互作用或H-键通过短划线所示。
[0035] 图5A-5E描绘11a-1可能的SHP2结合模式，其通过实施例3分析的分 子对接揭示。图5A描绘了11a-1与SHP2的总体结合模式。显示了复合结构 中II-B08和11c-9的结合模式用于比较。图5B描绘了沿着pY识别裂缝深入 渗透至SHP2活性位点的羟基吲哚羧酸基序(球)。图5C描绘了与Y279形成 强π-π堆叠相互作用的β-苯基环(球)。图5D描绘了朝向苯基噻吩(球)的刚性 草酰胺连接基，该苯基噻吩(球)被R362和K364良好夹住。图5E描绘11a-1 与SHP2的相互作用细节。距11a-1 之内的残基以飘带示出。
[0036] 图6A-6E显示SHP2抑制剂11a-1减少肺癌细胞增殖且特异性阻断SHP2- 依赖性信号传导，如实施例4所分析。图6A显示11a-1以剂量依赖性方式抑 制H1975增殖，其IC50为0.17±0.02μM。图6B显示11a-1减少EGF诱导的 Erk磷酸化且以剂量依赖性方式增加EGF诱导的桩蛋白(Y118)磷酸化。图6C 显示结构相关的阴性对照化合物10a在2μM没有阻断SHP2依赖性信号传 导。图6D显示11a-1对PMA-刺激的Erk1/2磷酸化没有作用。图6E显示11a-1 抑制Erk1/2活化的能力在SHP2敲除的细胞中被减弱。
[0037] 图7A&B显示在3D Matrigel环境中化合物11a-1抑制Erk1/2和Akt活 性和ErbB2+乳腺癌细胞生长，如实施例5所分析。图7A描绘了接种至Matrigel 中的SKBR3细胞。然后在载体或指示浓度的11a-1的存在下监测其生长4天。 图7B描绘了在Matrigel中生长4天后回收的细胞，和免疫印迹测量的Erk1/2 和Akt的总体和磷酸化形式的水平。各组之上的数字代表磷光体(phosphor) 相对总蛋白质的比例。
[0038] 图8A示出携带野生型(WT)KIT或KITD814V的32D骨髓细胞，其缺乏 血清和生长因子达6小时且在指示浓度的II-B08或11a-1的存在或不存在下 进行增殖测试，如实施例6分析。对于携带WT KIT的细胞，测试在存在IL-3 (10ng/mL)的情况下进行，而对携带致癌性KITD814V的细胞，测试在不存 在生长因子的情况下进行。竖条表示源自四个独立实验(一式三份进行)的联 合的平均胸苷掺入(CPM±SEM)。*p<0.05。
[0039] 图8B示出携带KITD814V的WT造血干细胞和祖细胞，其缺乏血清和 生长因子达6小时且在指示浓度的II-B08或11a-1的存在或不存在下进行增 殖测试，如实施例6分析。竖条表示源自一式三份进行的一个实验的平均胸 苷掺入(CPM±SD)。*p<0.05。
[0040] 图8C示出携带KITD814V的32D骨髓细胞，其缺乏血清和生长因子达 6小时且用指示浓度的11a-1培养2小时，如实施例6分析。处理后，溶解细 胞且将相等量的蛋白质裂解产物使用指示抗体进行蛋白质印迹分析。
[0041] 图9为基于羟基吲哚羧酸的SHP2抑制剂库7’a-c的策略和设计的示意 图，如实施例7所述。
[0042] 图10为基于羟基吲哚羧酸的库7’a-c(L89，94，95)的设计和合成的示意 图。
[0043] 尽管本公开具有多种修改和替代形式，但其具体实施方案已作为实例显 示在附图中，且在下文详细描述。然而，应理解具体实施方案的描述不是用 来限制本发明，本发明涵盖所附权利要求限定的公开的精神和范围内的修改、 等价物和替代物。
[0044] 发明详述
[0045] 除非另有所述，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通 常理解的含义。尽管类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料可用 于本发明的实践或测试，但优选方法和材料在以下描述。
[0046] 用于治疗开发的靶向蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)历史上具有两个主要挑 战。首先，它们的活性位点(即，pTyr-结合口袋)的相似性使得几乎不可能开 发以下小分子，其能抑制人基因组编码的100多个PTP中唯一一个，但不抑 制其它密切相关的家族成员。第二，寻找具有对带正电荷的PTP-活性位点高 亲和力，同时具有有利的细胞渗透性的化合物，也似乎是不可能超越的高山。 为增强抑制剂的功效和选择性二者，本发明旨在获得不仅与pTyr-结合口袋相 互作用，而且在外周位点附近的抑制剂化合物，所述外周位点是具体的PTP 所特有的。为进一步解决生物利用度问题，本发明试图鉴定不可水解的pTyr 模拟物，其具有足够的极性以结合PTP活性位点，而且仍然能穿透细胞膜。 发现双环水杨酸可用作不含磷的pTyr模拟物，且具有双环水杨酸骨架的PTP 抑制剂具有优异的细胞功效。
[0047] 根据本发明，已发现羟基吲哚羧酸出人意料地选择性抑制PTP。被本发 明的羟基吲哚羧酸选择性抑制的合适的PTP包括，例如，包含Src同源-2结 构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)，蛋白酪氨酸磷酸酶μ(PTPμ)，蛋白酪氨 酸磷酸酶ε(PTPε)，蛋白酪氨酸磷酸酶α(PTPα)，蛋白酪氨酸磷酸酶σ(PTPσ)， 蛋白酪氨酸磷酸酶γ(PTPγ)，胞质蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)，淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)，包含Src同源-2结构域的蛋白酪氨 酸磷酸酶1(SHP1)，蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)，造血酪氨酸磷酸酶 (HePTP)，富含纹状体的蛋白酪氨酸磷酸酶(STEP)，和蛋白酪氨酸磷酸酶PEZ， 双特异性磷酸酶，牛痘H1-相关的磷酸酶(VHR)，VH1-样磷酸酶Z(VHZ)， MAP激酶磷酸酶5(MKP5)，蛋白磷酸酶CDC14A，包含泛素样结构域的CTD 磷酸酶1(UBLCP1)和痫蛋白，低分子量PTP(LMWPTP)和蛋白磷酸酶SSu72。
[0048] 更具体地，已发现本发明的羟基吲哚羧酸特异性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶 的IC50为约0.2μM至约100μM，包括约2μM至约56μM，包括约4.5μM 至约20μM，还包括约0.2μM至约16μM，和约2μM至约10μM。在特别 合适的实施方案中，已发现该羟基吲哚羧酸特异性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的 IC50为小于1μM，包括约0.2μM至小于1μM，包括约0.2μM至约0.7μM， 包括约0.2μM至约0.5μM，且包括约0.25μM。
[0049] 通常，本发明涉及羟基吲哚羧酸，其包括2位的连接基和胺骨架。
[0050] 合适的连接基包括脂族和芳族连接基，如以下式I所示。在一个具体实 施方案中，所述连接基为芳族草酸连接基。
[0051] 合适的胺骨架包括图3A和3B所示的那些。
[0052] 在一方面，本发明涉及式(I)的羟基吲哚羧酸：
[0053]
[0054] 其中所述连接基包括L1和L2。L1可为单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、 -(C0-6烷基)-(C3-6环烷基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环 芳族或脂族环、未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取 代选自氮、氧和硫。L2可选自键、其中n 的范围可为0至3。R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取 代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代 或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族 或脂族环体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和 硫。
[0055] 在另一方面，本发明涉及式(II)的羟基吲哚羧酸：
[0056]
[0057] 其中L1可为单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、-(C0-6烷基)-(C3-6环烷 基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环芳族或脂族环、未取 代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取代选自氮、氧和硫， 且R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代的烷基、 未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未 取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其 中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
[0058] 示例性式(II)的羟基吲哚羧酸选择性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，如表1所 示。
[0059] 表1.式(II)的羟基吲哚羧酸(7’a(L89)和7’c(L95))对SHP2的IC50值 (μm)。
[0060]
[0061]
[0062] 在另一方面，本发明涉及式(III)的羟基吲哚羧酸：
[0063]
[0064] 其中，L1选自单键、-(C1-6烷基)-、-(C2-6链烯基)-、-(C0-6烷基)-(C3-6环烷 基)-(C0-6烷基)-、邻苯基、间苯基、对苯基、3-7元单环芳族或脂族环、未取 代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环体系，其中所述取代选自氮、氧和硫； n的范围可为0至3；且R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、 未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未 取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元 芳族或脂族环体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、 氧和硫。
[0065] 在另一方面，本发明涉及式(IV)的羟基吲哚羧酸：
[0066]
[0067] 其中R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代 的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的 芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环 体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
[0068] 示例性式(IV)的羟基吲哚羧酸选择性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，其IC50值 如表2和3所示。
[0069] 表2.式(IV)的羟基吲哚羧酸库(11a(L97))系列对SHP2的IC50值(μM)。
[0070]
[0071] 表3. 11a-21至11a-26(L97L02-08)系列对SHP2的IC50值(μM)。
[0072]
[0073] 在另一方面，本发明涉及式(V)的羟基吲哚羧酸：
[0074]
[0075] 其中R1＝NRaRb，其中Ra或Rb可各自独立地选自氢、未取代或取代 的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的 芳基、未取代或取代的杂芳基、和未取代或取代的稠合5-12元芳族或脂族环 体系，其中稠合的5-12元芳族或脂族环体系上的取代选自氮、氧和硫。
[0076] 示例性式(V)的羟基吲哚羧酸对SHP2可具有的IC50值如表4所示。
[0077] 表4.式(V)的羟基吲哚羧酸库11c(L88)系列对SHP2的IC50值(μM)。
[0078]
[0079] 在另一方面，本发明涉及式(VI)的羟基吲哚羧酸：
[0080]
[0081] 如表5所示，式(VI)的羟基吲哚羧酸选择性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，该 蛋白酪氨酸磷酸酶包括，例如，SHP2、LYP、mPTPA、SHP1、PTP1B、LMWPTP、 VHR和痫蛋白。更具体地，式(VI)的羟基吲哚羧酸对PTP可具有的IC50值为 约0.2μM至大于100μM，包括约0.2μM至小于1μM，包括约0.2μM至约 0.7μM，包括约0.2μM至约0.5μM，且包括约0.25μM。
[0082] 表5.式(VI)的羟基吲哚羧酸对PTP的选择性。
[0083]
[0084] 本公开在考虑以下非限制性实例后将更充分理解。实施例
[0085] 以下化合物和方法用于实施例1-6。
[0086] 材料和通用步骤.对硝基苯基磷酸酯(pNPP)购自ThermoFisher Scientific (Rockford，IL)。对于有机合成，试剂按购买的原样使用(Aldrich，Acros，Alfa Aesar，TCI)，除了另有所述。兔抗-磷酸化-Akt，抗-总Akt，抗-磷酸化-Erk1/2， 抗-总Erk1/2，抗-磷酸化-桩蛋白(Tyr118)和抗-磷酸化-SHP2抗体购自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。抗Paxilin抗体购自BD Transduction Laboratories。重组鼠白介素-3(IL-
3)，鼠干细胞因子(SCF)，鼠血小板生成素 (TPO)，鼠FLT3配体(FLT3-L)购自Peprotech(Rocky Hill，NJ)。Iscove修饰的 Dulbecco培养基(IMDM)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
[3H]胸苷购自 PerkinElmer(Boston，MA)。
3)，鼠干细胞因子(SCF)，鼠血小板生成素 (TPO)，鼠FLT3配体(FLT3-L)购自Peprotech(Rocky Hill，NJ)。Iscove修饰的 Dulbecco培养基(IMDM)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
[3H]胸苷购自 PerkinElmer(Boston，MA)。
[0087] 通用步骤.1H和13C NMR谱在Brucker 500波谱仪上获得，使用TMS或 残余溶剂作为标准。所有柱色谱法使用动态吸附剂230-400目硅胶(SiO2)进 行，使用指示的溶剂体系，除非另有所述。TLC分析使用254nm玻璃支持 的板进行，且使用UV光(254nm)显影，低分辨率质谱和纯度数据使用Agilent Technologies 6130 Quadrupole LC/MS(Santa Clara，CA)获得。分析型HPLC 梯度始于0％甲醇水溶液，且在8分钟后终结于具有0.1％TFA的100％甲醇。 所有最终测试的化合物的纯度确定为>95％(UV，λ＝254nm)。该分辨率质 谱数据在Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS上收集。HPLC纯化在装 配Sunfire Prep C18 OBD柱(30mm*150mm，5μm)的Waters Delta 600 (Waters，Milford，MA)上进行，使用甲醇-水(均含有0.1％TFA)作为流动相。 制备型HPLC梯度始于50％甲醇水溶液，且在40分钟后终结于具有0.1％TFA 的100％甲醇。
[0088] (3-乙炔基苯基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(2)。将化合物1(0.75mL， 7.18mmol)、Fmoc-OSu(2.664g，7.89mmol)在200mL THF中的混合物回流 过夜。该溶液在EtOAc和水之间分配。残余物通过快速硅胶色谱法(Hex/EtOAc ＝8:1)纯化以得到标题化合
1
物，其为白色固体(1.98g，81.4％)。MP:137-138 ℃；H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ7.83(m，2H)，
7.61(m，2H)，7.54(brs， 1H)，7.36(m，3H)，7.28(m，2H)，7.23(m，1H)，7.21(m，1H)，6.66(brs， 1H)，4.57(d，J＝6.6 Hz，2H)，4.30(t，J＝6.6 Hz，1H)，3.08(s，1H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ153.8，144.1，141.2，139.8，129.6，128.1，127.5， 126.2，125.5，122.5，
121.5，120.6，119.3，83.5，80.9，66.1，47.0；HRMS (ESI)：C23H18NO2的计算值(M+H)+:
340.1332，实测值:340.1341；LC-MS(ESI)： 362.0(M+Na)+；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1
物，其为白色固体(1.98g，81.4％)。MP:137-138 ℃；H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ7.83(m，2H)，
7.61(m，2H)，7.54(brs， 1H)，7.36(m，3H)，7.28(m，2H)，7.23(m，1H)，7.21(m，1H)，6.66(brs， 1H)，4.57(d，J＝6.6 Hz，2H)，4.30(t，J＝6.6 Hz，1H)，3.08(s，1H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ153.8，144.1，141.2，139.8，129.6，128.1，127.5， 126.2，125.5，122.5，
121.5，120.6，119.3，83.5，80.9，66.1，47.0；HRMS (ESI)：C23H18NO2的计算值(M+H)+:
340.1332，实测值:340.1341；LC-MS(ESI)： 362.0(M+Na)+；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0089] 5-((3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)苯基)乙炔基)-4-(二甲基氨基)-2- 羟基苯甲酸甲基酯(4)。将4-(二甲基氨基)-2-羟基-5-碘代苯甲酸甲酯3(5.13g， 16mmol)、化合物2(6.5g，19mmol)、Na2CO3(2.03g，19.2mmol)、二(三苯 基膦)氯化钯(II)(0.576g，0.8mmol)和CuI(304mg，1.6mmol)的混合物装载 在烧瓶中，将其脱气且用氮气反填充。添加
15mL DMF。所得混合物在氮气 氛在室温搅拌4小时。反应通过TLC监测以确定完成。该溶液在EtOAc(200 mL)和盐水(200mL)之间分配。有机层用盐水洗涤(3*200mL)，用硫酸钠干 燥且真空浓缩。残余物通过快速硅胶色谱法纯化(Hex/EtOAc＝4:1)以得到标 题化合物，其为粘性油状物(3.74g，44％)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ10.96 (s，1H)，7.97(s，1H)，7.80(m，
2H)，7.64(m，2H)，7.58(brs，1H)，7.45(m， 2H)，7.20-7.31(m，6H)，6.72(brs，1H)，6.33(s，
1H)，4.57(d，J＝6.6 Hz， 2H)，4.30(t，J＝6.6 Hz，1H)，3.93(s，3H)，3.15(s，6H)；13C NMR(125 MHz， CDCl3)：δ169.8，162.6，159.2，153.2，153.2，143.6，141.3，137.8，137.4，
129.0，127.8，127.6，127.1，126.1，124.9，124.7，120.7，120.0，104.1， 103.9，102.8，
92.1，89.0，66.9，51.9，47.1，42.5；HRMS(ESI)：C33H29N2O5的计算值(M+H)+:533.2071，实测值:533.2072；LC-MS(ESI)：533.2(M+H)+， 530.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
15mL DMF。所得混合物在氮气 氛在室温搅拌4小时。反应通过TLC监测以确定完成。该溶液在EtOAc(200 mL)和盐水(200mL)之间分配。有机层用盐水洗涤(3*200mL)，用硫酸钠干 燥且真空浓缩。残余物通过快速硅胶色谱法纯化(Hex/EtOAc＝4:1)以得到标 题化合物，其为粘性油状物(3.74g，44％)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ10.96 (s，1H)，7.97(s，1H)，7.80(m，
2H)，7.64(m，2H)，7.58(brs，1H)，7.45(m， 2H)，7.20-7.31(m，6H)，6.72(brs，1H)，6.33(s，
1H)，4.57(d，J＝6.6 Hz， 2H)，4.30(t，J＝6.6 Hz，1H)，3.93(s，3H)，3.15(s，6H)；13C NMR(125 MHz， CDCl3)：δ169.8，162.6，159.2，153.2，153.2，143.6，141.3，137.8，137.4，
129.0，127.8，127.6，127.1，126.1，124.9，124.7，120.7，120.0，104.1， 103.9，102.8，
92.1，89.0，66.9，51.9，47.1，42.5；HRMS(ESI)：C33H29N2O5的计算值(M+H)+:533.2071，实测值:533.2072；LC-MS(ESI)：533.2(M+H)+， 530.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0090] 2-(3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲 哚-5-甲酸甲酯(5)。向4(1.72g，3.23mmol)、NaHCO3(0.408g，4.85mmol) 在CH2Cl2(500mL)中的溶液中添加碘(1.23g，4.85mmol)。所得混合物在室 温搅拌4小时，然后添加100mL CH2Cl2且用饱和Na2SO3水溶液(2×500mL)、 盐水(500mL)洗涤，用Na2SO4干燥且真空浓缩。残余物通过快速色谱法纯化 (己烷/THF＝1:1)以得到标题化合物，其为无色固体(1.79g，86％)。MP: 131-132℃；1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ10.92(s，1H)，8.03(s，1H)，7.79 (m，2H)，7.65(m，2H)，7.48(m，5H)，7.36(m，2H)，7.18(m，1H)，6.85(s， 1H)，6.80(s，1H)，4.61(m，2H)，
4.30(m，1H)，4.03(s，3H)，3.60(s，3H)； 13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ171.2，158.2，153.4，
143.6，142.5，142.2， 141.3，137.9，131.9，129.2，127.8，127.1，127.0，125.8，124.8，
124.3， 124.1，120.0，107.6，96.2，66.9，60.0，52.3，47.1，32.1；HRMS(ESI)： C32H26IN2O5的计算值(M+H)+:645.0881，实测值:645.0851；LC-MS(ESI)： 667.0(M+Na)+；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
4.30(m，1H)，4.03(s，3H)，3.60(s，3H)； 13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ171.2，158.2，153.4，
143.6，142.5，142.2， 141.3，137.9，131.9，129.2，127.8，127.1，127.0，125.8，124.8，
124.3， 124.1，120.0，107.6，96.2，66.9，60.0，52.3，47.1，32.1；HRMS(ESI)： C32H26IN2O5的计算值(M+H)+:645.0881，实测值:645.0851；LC-MS(ESI)： 667.0(M+Na)+；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0091] 2-(3-氨基苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸甲酯(6)。将化合物5 (1.79g，2.77mmol)溶于10mL CH2Cl2，然后在室温将10mL二乙基胺添加至 该溶液保持3小时。将溶液真空浓缩。残余物分配于CH2Cl2(200mL)和盐水 (200mL)之间。有机层用硫酸钠干燥且真空浓缩。残余物通过快速硅胶色谱 法纯化(CH2Cl2作为洗脱剂)以得到标题化合物，其为白色固体(1g，85.5％)。 MP:83-85℃；1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ10.90(s，1H)，8.02(s，1H)， 7.31(m，1H)，6.84(s，1H)，6.80(m，2H)，6.76(m，1H)，4.03(s，3H)，3.83 (brs，2H)，
3.60(s，3H)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ171.2，158.1，146.4， 143.1，142.4，132.1，129.4，
124.2，124.1，120.8，117.1，115.6，107.4， 96.1，59.4，52.1，32.1；HRMS(ESI)：C17H16IN2O3的计算值(M+H)+:423.0200， 实测值:423.0190；LC-MS(ESI)：423.0(M+H)+，420.8(M-H)-；纯度:>95％ (UV，λ＝254nm)。
3.60(s，3H)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ171.2，158.1，146.4， 143.1，142.4，132.1，129.4，
124.2，124.1，120.8，117.1，115.6，107.4， 96.1，59.4，52.1，32.1；HRMS(ESI)：C17H16IN2O3的计算值(M+H)+:423.0200， 实测值:423.0190；LC-MS(ESI)：423.0(M+H)+，420.8(M-H)-；纯度:>95％ (UV，λ＝254nm)。
[0092] 2-(3-氨基苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(7)。将化合物6(1g， 2.37mmol)溶于8mL THF。然后，添加5％LiOH(4mL)溶液。将混合物加热 至80℃保持2小时，冷却至室温，通过盐水(200mL)稀释，通过2 N HCl酸 化至pH5且用EtOAc(2×200mL)萃取。
合并有机层，用盐水洗涤，用硫酸 钠干燥且真空浓缩以得到标题化合物，其为淡白色固体(940mg，97.2％)。在 148℃分解；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ7.85(s，1H)，7.46(m，1H)，7.11 (m，3H)，7.04(s，1H)，4.11(m，2H)，3.59(s，3H)；13C NMR(125 MHz， DMSO)：δ173.0，158.3，
142.6，142.5，140.9，132.1，130.0，124.5，124.0， 123.8，120.9，119.5，108.1，97.0，60.6，
32.5；HRMS(ESI)：C16H12IN2O3的计算值(M-H)-:406.9898，实测值:406.9894；LC-MS(ESI)：
409.0(M+H)+， 407.0(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
合并有机层，用盐水洗涤，用硫酸 钠干燥且真空浓缩以得到标题化合物，其为淡白色固体(940mg，97.2％)。在 148℃分解；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ7.85(s，1H)，7.46(m，1H)，7.11 (m，3H)，7.04(s，1H)，4.11(m，2H)，3.59(s，3H)；13C NMR(125 MHz， DMSO)：δ173.0，158.3，
142.6，142.5，140.9，132.1，130.0，124.5，124.0， 123.8，120.9，119.5，108.1，97.0，60.6，
32.5；HRMS(ESI)：C16H12IN2O3的计算值(M-H)-:406.9898，实测值:406.9894；LC-MS(ESI)：
409.0(M+H)+， 407.0(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0093] 合成9a-d的通用方法.在0℃将化合物7(30mg，0.074mmol)溶于1mL DMF，然后将1.5当量的相应酰基氯8a-d添加至该溶液过夜。该溶液在EtOAc (200mL)和盐水(200mL)之间分配。有机层用盐水(3×200mL)洗涤，用硫酸 钠干燥且真空浓缩以得到标题化合物，其为淡白色固体，不用纯化就进一步 使用。
[0094] 合成10a-d的通用方法.将化合物9a-d(0.074mmol)溶于2mL THF。然 后，添加5％LiOH(2mL)溶液。该混合物在室温搅拌过夜，通过2 N HCl 酸化至pH5，且用EtOAc(2×200mL)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用 硫酸钠干燥且真空浓缩。该粗产物通过Prep-HPLC纯化以得到标题化合物。
[0095] 2-(3-(羧基甲酰胺基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(10a，核 97)。淡白色固体(26mg，71％，两步)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.38 (brs，1H)，10.95(s，
1H)，7.94(m，2H)，7.86(s，1H)，7.54(m，1H)，7.30 (m，1H)，7.05(s，1H)，3.61(s，3H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ173.0， 162.4，158.3，157.4，142.5，142.4，138.3，131.5，129.4，
127.1，124.0， 123.8，122.6，121.1，108.1，97.0，60.8，32.5；HRMS(ESI)：C18H12IN2O6 的计算值(M-H)-:478.9746，实测值:478.9762；LC-MS(ESI)：481.0(M+H)+， 478.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1H)，7.94(m，2H)，7.86(s，1H)，7.54(m，1H)，7.30 (m，1H)，7.05(s，1H)，3.61(s，3H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ173.0， 162.4，158.3，157.4，142.5，142.4，138.3，131.5，129.4，
127.1，124.0， 123.8，122.6，121.1，108.1，97.0，60.8，32.5；HRMS(ESI)：C18H12IN2O6 的计算值(M-H)-:478.9746，实测值:478.9762；LC-MS(ESI)：481.0(M+H)+， 478.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0096] 2-(3-(2-羧基乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(10b，核 98)。淡白色固体(30mg，82％，两步)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ10.37 (s，1H)，7.86(s，1H)，
7.74(m，2H)，7.50(m，1H)，7.21(m，1H)，7.04(s， 1H)，3.61(s，3H)，3.40(s，2H)；HRMS(ESI)：
C19H14IN2O6的计算值(M-H)-: 492.9902，实测值:492.9933；LC-MS(ESI)：495.0(M+H)+，-
492.8(M-H) ；纯 度:>95％(UV，λ＝254nm)。
7.74(m，2H)，7.50(m，1H)，7.21(m，1H)，7.04(s， 1H)，3.61(s，3H)，3.40(s，2H)；HRMS(ESI)：
C19H14IN2O6的计算值(M-H)-: 492.9902，实测值:492.9933；LC-MS(ESI)：495.0(M+H)+，-
492.8(M-H) ；纯 度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0097] 2-(3-(3-羧基丙酰胺基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(10c，核 88)。淡白色固体(31mg，82％，两步)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ12.16 (brs，1H)，11.36(brs，1H)，10.19(s，1H)，7.84(s，1H)，7.42(m，2H)，7.47 (s，1H)，7.16(m，1H)，7.04(s，1H)，
3.58(s，3H)，2.60(m，4H)；13C NMR (125 MHz，DMSO)：δ174.2，173.0，170.8，158.3，142.8，
142.5，139.9， 131.5，129.4，125.4，123.9，123.8，121.2，119.7，108.0，97.1，60.6，32.5，
31.5，29.1；HRMS(ESI)：C20H16IN2O6的计算值(M-H)-:507.0059，实测值: 507.0080；LC-MS(ESI)：509.0(M+H)+，507.0(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝ 254nm)。
3.58(s，3H)，2.60(m，4H)；13C NMR (125 MHz，DMSO)：δ174.2，173.0，170.8，158.3，142.8，
142.5，139.9， 131.5，129.4，125.4，123.9，123.8，121.2，119.7，108.0，97.1，60.6，32.5，
31.5，29.1；HRMS(ESI)：C20H16IN2O6的计算值(M-H)-:507.0059，实测值: 507.0080；LC-MS(ESI)：509.0(M+H)+，507.0(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝ 254nm)。
[0098] 2-(3-(4-羧基丁酰胺基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(10d，核 96)。淡白色固体(21mg，54％，两步)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.38 (brs，1H)，10.12(s，
1H)，7.85(s，1H)，7.74(m，2H)，7.48(m，1H)，7.17 (m，1H)，7.04(s，1H)，3.59(s，3H)，2.40(m，2H)，2.29(m，2H)，1.83(m， 2H)；HRMS(ESI)：C21H18IN2O6的计算值(M-H)-:521.0215，实测值: 520.9139；LC-MS(ESI)：523.0(M+H)+，520.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝ 254nm)。
1H)，7.85(s，1H)，7.74(m，2H)，7.48(m，1H)，7.17 (m，1H)，7.04(s，1H)，3.59(s，3H)，2.40(m，2H)，2.29(m，2H)，1.83(m， 2H)；HRMS(ESI)：C21H18IN2O6的计算值(M-H)-:521.0215，实测值: 520.9139；LC-MS(ESI)：523.0(M+H)+，520.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝ 254nm)。
[0099] 组装库11a-d的步骤.将DMF中的化合物10a-d(65mM，3μL)与DMF 中的192种胺(200mM，3μL)分别在羟基苯并三唑(HOBt)(14mM)、O-苯并 三唑-N,N,N',N'-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸盐(HBTU)(17mM)和N,N-二异丙基乙 基胺(DIPEA)(28mM)的存在下在14μL二甲基甲酰胺(DMF)中反应过夜以将 组合的酰胺库11a-d在96孔板中组装。随机选取所述反应中的10个且通过 LC-MS监测，其显示平均70％产率的所需产物。
[0100] 合成(11a-1至11a-26和11c-1至11c-11)的通用方法.将溶于0.5mL DMF 的化合物11a或11c(0.02mmol)添加至相应胺(0.04mmol)、HOBt(3.06mg， 0.02mmol)、HBTU(7.58mg，
0.02mmol)和DIPEA(5.16μL，0.04mmol)在1mL DMF中的溶液中。将混合物在室温搅拌4小时。
该粗产物通过Prep-HPLC 进行KJMM纯化以得到标题化合物。
0.02mmol)和DIPEA(5.16μL，0.04mmol)在1mL DMF中的溶液中。将混合物在室温搅拌4小时。
该粗产物通过Prep-HPLC 进行KJMM纯化以得到标题化合物。
[0101] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(2-氧代-2-((4-(噻吩-3-基)苯基)氨基)乙酰氨基) 苯基)-1H-吲哚-5-甲酸(11a-1，L97M74)。淡白色固体(3.8mg，29％)；在185 ℃分解；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.08(s，1H)，10.95(s，1H)，8.06 (s，1H)，8.01(m，1H)，7.92(m，2H)，7.85(m，2H)，7.75(m，2H)，7.63(m， 1H)，7.57(m，2H)，7.33(m，1H)，7.06(s，1H)，3.63(s，
3H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ173.0，159.2，158.8，158.3，142.6，142.5，141.4，138.3，
137.1，132.0，131.5，129.5，127.5，127.2，126.8，126.5，124.1，123.9， 122.8，121.3，
120.9，108.1，97.1，60.9，32.6；HRMS(ESI)：C28H19IN3O5S 的计算值(M-H)-:636.0096，实+ -
测值:636.0098；LC-MS(ESI)：659.8(M+Na) ， 635.8(M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
3H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ173.0，159.2，158.8，158.3，142.6，142.5，141.4，138.3，
137.1，132.0，131.5，129.5，127.5，127.2，126.8，126.5，124.1，123.9， 122.8，121.3，
120.9，108.1，97.1，60.9，32.6；HRMS(ESI)：C28H19IN3O5S 的计算值(M-H)-:636.0096，实+ -
测值:636.0098；LC-MS(ESI)：659.8(M+Na) ， 635.8(M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0102] 2-(3-(2-([1,1'-联苯]-4-基氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基 -1H-吲哚-5-甲酸(11a-2，L97N08)。淡白色固体(3.5mg，27％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.11(s，1H)，11.02(s，1H)，8.08(s，1H)，8.03(m，1H)， 7.99(m，2H)，7.87(s，1H)，7.70(m，
4H)，7.59(m，1H)，7.37(m，2H)， 7.33(m，2H)，7.06(s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：
C30H21IN3O5的 计算值(M-H)-:630.0531，实测值:630.0546；LC-MS(ESI)：653.8(M+Na)+，
629.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
4H)，7.59(m，1H)，7.37(m，2H)， 7.33(m，2H)，7.06(s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：
C30H21IN3O5的 计算值(M-H)-:630.0531，实测值:630.0546；LC-MS(ESI)：653.8(M+Na)+，
629.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0103] 2-(3-(2-((4-(苄基氧基)-3-氯苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3- 碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-3，L97M50)。淡白色固体(4.2mg，30％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.37(s，1H)，11.07(s，1H)，10.97(s，1H)，8.04(m，2H)，7.93(m，1H)，7.86(s，1H)，7.80(m，1H)，7.59-7.27(m，8H)， 7.07(s，1H)，6.82(m，1H)，5.21(s，2H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)： C31H22ClIN3O6的计算值(M-H)-:694.0247，实测值:694.0233；LC-MS(ESI)： 718.0(M+Na)+，693.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0104] 2-(3-(2-((6-溴苯并[d]噻唑-2-基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘 -1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-4，L97M61)。淡白色固体(3.4mg，24％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ13.16(s，1H)，11.37(s，1H)，11.27(s，1H)，8.37(s， 1H)，8.02(m，2H)，7.87(s，1H)，7.78(m，1H)，7.63(m，2H)，7.34(m， 1H)，7.07(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：
C25H15BrIN4O5S的计算值 (M-H)-:688.8997，实测值:688.9008；LC-MS(ESI)：690.6(M-H)-；
纯度:>95％ (UV，λ＝254nm)。
C25H15BrIN4O5S的计算值 (M-H)-:688.8997，实测值:688.9008；LC-MS(ESI)：690.6(M-H)-；
纯度:>95％ (UV，λ＝254nm)。
[0105] 2-(3-(2-([1,1'-联苯]-3-基氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基 -1H-吲哚-5-甲酸(11a-5，L97M48)。淡白色固体(4.5mg，35％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.37(s，1H)，11.12(s，1H)，10.99(s，1H)，8.23(s，1H)， 8.05(m，2H)，7.90(m，1H)，7.87(s，1H)，7.80(m，1H)，7.65(m，3H)， 7.52(m，6H)，7.08(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：
C30H21IN3O5的 计算值(M-H)-:630.0531，实测值:630.0533；LC-MS(ESI)：629.8(M-H)-；纯 度:>95％(UV，λ＝254nm)。
C30H21IN3O5的 计算值(M-H)-:630.0531，实测值:630.0533；LC-MS(ESI)：629.8(M-H)-；纯 度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0106] 2-(3-(2-((3-(苄基氧基)苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1- 甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-6，L97M52)。淡白色固体(3.6mg，27％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ11.38(s，1H)，11.09(s，1H)，10.86(s，1H)，8.06(s， 1H)，8.00(m，1H)，7.86(s，1H)，7.64(s，1H)，7.58-7.27(m，9H)，7.07(s， 1H)，6.82(m，1H)，5.10(s，2H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：C31H23IN3O6 的计算值(M-H)-:660.0637，实测值:660.0627；LC-MS(ESI)：684.0(M+Na)+， 659.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0107] 2-(3-(2-(5-溴二氢吲哚-1-基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基 -1H-吲哚-5-甲酸(11a-7，L97M93)。淡白色固体(4.6mg，34％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ
11.36(s，1H)，11.09(s，1H)，8.06(m，1H)，7.92(m，1H)， 7.89(s，1H)，7.86(s，1H)，7.57(m，
2H)，7.46(m，1H)，7.31(m，1H)，7.07 (s，1H)，4.39(m，2H)，3.64(s，3H)，3.18(m，2H)；HRMS-
(ESI)：C26H18BrIN3O5 的计算值(M-H) :657.9480，实测值:657.9501；LC-MS(ESI)：661.8(M+H)+，659.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
11.36(s，1H)，11.09(s，1H)，8.06(m，1H)，7.92(m，1H)， 7.89(s，1H)，7.86(s，1H)，7.57(m，
2H)，7.46(m，1H)，7.31(m，1H)，7.07 (s，1H)，4.39(m，2H)，3.64(s，3H)，3.18(m，2H)；HRMS-
(ESI)：C26H18BrIN3O5 的计算值(M-H) :657.9480，实测值:657.9501；LC-MS(ESI)：661.8(M+H)+，659.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0108] 6-羟基-3-碘-2-(3-(2-((4-碘苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-1-甲基-1H- 吲哚-5-甲酸(11a-8，L97M24)。淡白色固体(3.5mg，25％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ11.36(s，1H)，11.08(s，1H)，11.01(s，1H)，8.05(s，1H)，8.01 (m，1H)，7.86(s，1H)，8.01(m，1H)，7.73(m，4H)，7.58(m，1H)，7.33(m， 1H)，7.07(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：
C24H16I2N3O5的计算值(M-H)-: 679.9185，实测值:679.9183；LC-MS(ESI)：703.8(M+Na)+，
679.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
C24H16I2N3O5的计算值(M-H)-: 679.9185，实测值:679.9183；LC-MS(ESI)：703.8(M+Na)+，
679.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0109] 2-(3-(2-((2-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟 基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-9，L97M77)。淡白色固体(4.7mg，35％)； 1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.38(s，1H)，11.13(s，1H)，8.81(m，1H)， 8.17(m，1H)，8.12(s，2H)，7.78(s，1H)，7.64(m，4H)，7.39(m，5H)，7.07 (s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：C31H21IN5O5的计算值(M-H)-:670.0593， 实测值:670.0594；LC-MS(ESI)：672.0(M+H)+，669.8(M-H)-；纯度:>95％ (UV，λ＝254nm)。
[0110] 2-(3-(2-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲 基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-10，L97N15)。淡白色固体(3.5mg，28％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ13.02(s，1H)，11.37(s，1H)，11.28(s，1H)，8.12(m，1H)， 8.06(s，2H)，7.85(m，2H)，7.60(m，1H)，7.52(m，1H)，7.38(m，2H)， 7.06(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：C25H16IN4O5S的- + -
计算值(M-H) : 610.9892，实测值:610.9884；LC-MS(ESI)：613.0(M+H) ，610.8(M-H) ；纯 度:>95％(UV，λ＝254nm)。
计算值(M-H) : 610.9892，实测值:610.9884；LC-MS(ESI)：613.0(M+H) ，610.8(M-H) ；纯 度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0111] 2-(3-(2-((3-氯苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H- 吲哚-5-甲酸(11a-11，L97M21)。淡白色固体(4.1mg，34％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ11.36(s，1H)，11.11(s，1H)，11.10(s，1H)，8.03(m，3H)，7.85 (m，2H)，7.57(m，1H)，7.42(m，
1H)，7.34(m，1H)，7.24(m，1H)，7.07(s， 1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：C24H16ClIN3O5的计算值(M-H)-:587.9829， 实测值:587.9831；LC-MS(ESI)：587.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝
254nm)。
1H)，7.34(m，1H)，7.24(m，1H)，7.07(s， 1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：C24H16ClIN3O5的计算值(M-H)-:587.9829， 实测值:587.9831；LC-MS(ESI)：587.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝
254nm)。
[0112] 2-(3-(2-((4-(1H-咪唑-1-基)苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘 -1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-12，L97M63)。淡白色固体(4.8mg，38％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.24(s，1H)，11.15(s，1H)，9.53(s，1H)，8.23 (s，1H)，8.13(m，2H)，8.08(s，1H)，8.01(m，1H)，7.87(s，1H)，7.82(m， 3H)，7.59(m，1H)，7.35(m，1H)，7.08(s，1H)，3.63(s，
3H)；HRMS(ESI)： C27H19IN5O5的计算值(M-H)-:620.0436，实测值:620.0442；LC-MS(ESI)：
622.0(M+H)+，619.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
3H)；HRMS(ESI)： C27H19IN5O5的计算值(M-H)-:620.0436，实测值:620.0442；LC-MS(ESI)：
622.0(M+H)+，619.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0113] 2-(3-(2-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3- 碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-13，L97M30)。淡白色固体(3.6mg，27％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.38(s，2H)，11.14(s，1H)，10.99(s，1H)， 8.52(s，1H)，8.19(m，1H)，8.06(s，1H)，8.01(m，1H)，7.86(s，1H)，7.77 (m，1H)，7.59(m，1H)，7.34(m，1H)，7.07(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS (ESI)：C25H15ClF3IN3O5的计算值(M-H)-:655.9702，实测值:655.9720； LC-MS(ESI)：679.8(M+Na)+，655.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0114] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(2-氧代-2-((5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)乙酰 氨基)苯基)-1H-吲哚-5-甲酸(11a-14，L97M73)。淡白色固体(4.5mg，35％)； 1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ13.61(s，1H)，11.38(s，1H)，11.29(s，1H)， 8.01(m，4H)，7.86(s，1H)，7.58(m，4H)，7.34(m，4H)，7.07(s，1H)，3.62 (s，3H)；HRMS(ESI)：C26H17ClIN5O5S的计算值(M-H)-:638.0001，实测值: 638.0015；LC-MS(ESI)：637.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝
254nm)。
254nm)。
[0115] 2-(3-(2-((4-氟苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H- 吲哚-5-甲酸(11a-15，L97N95)。淡白色固体(4.7mg，41％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ11.39(s，1H)，11.11(s，1H)，11.02(s，1H)，8.06(s，1H)，8.01 (m，1H)，7.92(m，2H)，7.88(s，
1H)，7.58(m，1H)，7.34(m，1H)，7.23(m， 2H)，7.06(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：
C24H16FIN3O5的计算值(M-H)-: 572.0124，实测值:572.0148；LC-MS(ESI)：571.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
1H)，7.58(m，1H)，7.34(m，1H)，7.23(m， 2H)，7.06(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：
C24H16FIN3O5的计算值(M-H)-: 572.0124，实测值:572.0148；LC-MS(ESI)：571.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
[0116] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(2-氧代-2-(噻唑-2-基氨基)乙酰氨基)苯基)-1H- 吲哚-5-甲酸(11a-16，L97N13)。淡白色固体(3.9mg，34％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ12.73(s，1H)，11.36(s，1H)，11.20(s，1H)，8.01(s，1H)，7.99 (s，1H)，7.86(s，1H)，7.60(m，
2H)，7.42(m，1H)，7.32(m，1H)，7.07(s， 1H)，3.62(s，3H)；HRMS(ESI)：C21H14IN4O5S的计算值(M-H)-:560.9735， 实测值:560.9744；LC-MS(ESI)：563.0(M+H)+，560.8(M-H)-；纯度:>
95％ (UV，λ＝254nm)。
2H)，7.42(m，1H)，7.32(m，1H)，7.07(s， 1H)，3.62(s，3H)；HRMS(ESI)：C21H14IN4O5S的计算值(M-H)-:560.9735， 实测值:560.9744；LC-MS(ESI)：563.0(M+H)+，560.8(M-H)-；纯度:>
95％ (UV，λ＝254nm)。
[0117] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(2-氧代-2-((3-(三氟甲氧基)苯基)氨基)乙酰氨基) 苯基)-1H-吲哚-5-甲酸(11a-17，L97M32)。淡白色固体(3.3mg，25％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ11.37(s，1H)，11.21(s，1H)，11.13(s，1H)，8.05(m， 3H)，7.90(m，1H)，7.87(s，1H)，7.76-7.51(m，2H)，7.33(m，1H)，7.17(m， 1H)，7.07(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：
C25H16F3IN3O6的计算值 (M-H)-:638.0041，实测值:638.0039；LC-MS(ESI)：661.8(M+Na)+，-
637.8 (M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
C25H16F3IN3O6的计算值 (M-H)-:638.0041，实测值:638.0039；LC-MS(ESI)：661.8(M+Na)+，-
637.8 (M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0118] 2-(3-(2-((3-溴苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H- 吲哚-5-甲酸(11a-18，L97M18)。淡白色固体(3.8mg，30％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ11.38(s，1H)，11.10(s，1H)，11.08(s，1H)，8.17(s，1H)，8.06 (s，1H)，8.01(m，1H)，7.89(m，
1H)，7.86(s，1H)，7.58(m，1H)，7.36(m， 3H)，7.07(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：
C24H16BrIN3O5的计算值 (M-H)-:631.9323，实测值:631.9326；LC-MS(ESI)：655.8(M+Na)+，
631.8 (M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1H)，7.86(s，1H)，7.58(m，1H)，7.36(m， 3H)，7.07(s，1H)，3.63(s，3H)；HRMS(ESI)：
C24H16BrIN3O5的计算值 (M-H)-:631.9323，实测值:631.9326；LC-MS(ESI)：655.8(M+Na)+，
631.8 (M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0119] 2-(3-(2-((3-氟苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H- 吲哚-5-甲酸(11a-19，L97N07)。淡白色固体(4.7mg，41％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ11.37(s，1H)，11.13(s，2H)，8.08(s，1H)，8.03(m，1H)，7.99 (m，2H)，7.87(s，1H)，7.82(m，
1H)，7.76(m，1H)，7.58(m，1H)，7.43(m， 1H)，7.32(m，1H)，7.06(s，1H)，7.01(m，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)： C24H16FIN3O5的计算值(M-H)-:572.0124，实测值:572.0136；LC-MS(ESI)： 573.8(M+H)+，571.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1H)，7.76(m，1H)，7.58(m，1H)，7.43(m， 1H)，7.32(m，1H)，7.06(s，1H)，7.01(m，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)： C24H16FIN3O5的计算值(M-H)-:572.0124，实测值:572.0136；LC-MS(ESI)： 573.8(M+H)+，571.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0120] 6-羟基-3-碘-2-(3-(2-((3-碘苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-1-甲基-1H- 吲哚-5-甲酸(11a-20，L97M23)。淡白色固体(4.5mg，33％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ11.36(s，1H)，11.08(s，1H)，11.01(s，1H)，8.34(s，1H)，8.05 (s，1H)，8.01(m，1H)，8.01(m，
1H)，7.90(m，1H)，7.87(s，1H)，7.57(m， 2H)，7.33(m，1H)，7.19(m，1H)，7.07(s，1H)，3.63-
(s，3H)；HRMS(ESI)： C24H16I2N3O5的计算值(M-H) :679.9185，实测值:679.9184；LC-MS(ESI)： 679.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1H)，7.90(m，1H)，7.87(s，1H)，7.57(m， 2H)，7.33(m，1H)，7.19(m，1H)，7.07(s，1H)，3.63-
(s，3H)；HRMS(ESI)： C24H16I2N3O5的计算值(M-H) :679.9185，实测值:679.9184；LC-MS(ESI)： 679.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0121] 2-(3-(2-((4'-氰基-[1,1'-联苯]-4-基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3- 碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-21，L97L08)。淡白色固体(2.3mg，17％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.37(s，1H)，11.12(s，1H)，11.10(s，1H)，8.14-8.04(m，4H)，7.93(m，4H)，
7.87-7.81(m，3H)，7.59(m，1H)，7.35(m， 1H)，7.07(s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：
C31H20IN4O5的计算值(M-H)-: 655.0484，实测值:655.0509；LC-MS(ESI)：654.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
7.87-7.81(m，3H)，7.59(m，1H)，7.35(m， 1H)，7.07(s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：
C31H20IN4O5的计算值(M-H)-: 655.0484，实测值:655.0509；LC-MS(ESI)：654.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
[0122] 2-(3-(2-((3'-氰基-[1,1'-联苯]-4-基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3- 碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-22，L97L07)。淡白色固体(2.9mg，21％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.37(s，1H)，11.11(s，1H)，11.07(s，1H)， 8.18(s，1H)，8.03(m，5H)，7.87(s，
1H)，7.82(m，3H)，7.67(m，1H)，7.59 (m，1H)，7.34(m，1H)，7.08(s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：C31H20IN4O5 的计算值(M-H)-:655.0484，实测值:655.0499；LC-MS(ESI)：654.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1H)，7.82(m，3H)，7.67(m，1H)，7.59 (m，1H)，7.34(m，1H)，7.08(s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：C31H20IN4O5 的计算值(M-H)-:655.0484，实测值:655.0499；LC-MS(ESI)：654.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0123] 6-羟基-2-(3-(2-((2-(5-(羟基甲基)呋喃-2-基)苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基) 苯基)-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-23，L97L03)。淡白色固体(2.4mg， 18％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.15(s，1H)，10.76(s，1H)，8.05(m， 3H)，7.87(s，1H)，7.82(s，1H)，7.76(m，1H)，7.58(m，2H)，7.41(m，3H)， 7.08(s，1H)，4.51(s，2H)，3.65(s，1H)，3.64(s，-
3H)；HRMS(ESI)：C29H21IN3O7 的计算值(M-H):650.0430，实测值:650.0422；LC-MS(ESI)：
649.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
3H)；HRMS(ESI)：C29H21IN3O7 的计算值(M-H):650.0430，实测值:650.0422；LC-MS(ESI)：
649.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0124] 2-(3-(2-((3-(呋喃-2-基)苯基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3-碘-1- 甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-24，L97L05)。淡白色固体(4.6mg，37％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ11.36(s，1H)，11.10(s，1H)，10.98(s，1H)，8.29(s， 1H)，8.07(s，1H)，8.03(m，1H)，7.94(m，1H)，7.87(s，1H)，7.77(m，2H)， 7.50(m，4H)，7.34(m，1H)，7.07(s，1H)，6.90(m，
1H)，3.64(s，3H)； HRMS(ESI)：C28H19IN3O6的计算值(M-H)-:620.0324，实测值:620.0327； LC-MS(ESI)：619.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1H)，3.64(s，3H)； HRMS(ESI)：C28H19IN3O6的计算值(M-H)-:620.0324，实测值:620.0327； LC-MS(ESI)：619.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0125] 2-(3-(2-((4'-氰基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)-2-氧代乙酰氨基)苯基)-6-羟基-3- 碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11a-25，L97L06)。淡白色固体(3.4mg，26％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.12(s，1H)，11.05(s，1H)，8.29(s，1H)，8.08 (s，1H)，8.03(m，4H)，7.87(s，
1H)，7.86(s，1H)，7.56(m，3H)，7.33(m， 1H)，7.09(s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：
C31H20IN4O5的计算值(M-H)-: 655.0484，实测值:655.0485；LC-MS(ESI)：654.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
1H)，7.86(s，1H)，7.56(m，3H)，7.33(m， 1H)，7.09(s，1H)，3.64(s，3H)；HRMS(ESI)：
C31H20IN4O5的计算值(M-H)-: 655.0484，实测值:655.0485；LC-MS(ESI)：654.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
[0126] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(2-氧代-2-((3-(噻吩-3-基)苯基)氨基)乙酰氨基) 苯基)-1H-吲哚-5-甲酸(11a-26，L97L02)。淡白色固体(3.1mg，24％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ11.12(s，1H)，10.92(s，1H)，8.22(s，1H)，8.08(s， 1H)，8.02(m，4H)，7.87(s，1H)，7.84(m，2H)，7.68(m，1H)，7.59(m， 1H)，7.52(m，2H)，7.43(m，1H)，7.34(m，1H)，7.08(s，
1H)，3.64(s，3H)； HRMS(ESI)：C28H19IN3O5S的计算值(M-H)-:636.0096，实测值:
636.0102； LC-MS(ESI)：635.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1H)，3.64(s，3H)； HRMS(ESI)：C28H19IN3O5S的计算值(M-H)-:636.0096，实测值:
636.0102； LC-MS(ESI)：635.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0127] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(4-氧代-4-((4-(噻吩-3-基)苯基)氨基)丁酰胺基) 苯基)-1H-吲哚-5-甲酸(11c-1，L88M74)。淡白色固体(3.8mg，28％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ11.35(brs，1H)，10.24(s，1H)，10.08(s，1H)，7.86(s， 1H)，7.73(m，4H)，7.62(m，4H)，7.52(m，3H)，7.17(m，1H)，7.04(s， 1H)，3.56(s，3H)，2.69(m，4H)；HRMS(ESI)：
C30H23IN3O5S的计算值(M-H)-: 664.0409，实测值:664.0414；LC-MS(ESI)：663.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
C30H23IN3O5S的计算值(M-H)-: 664.0409，实测值:664.0414；LC-MS(ESI)：663.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
[0128] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(4-氧代-4-((4-苯氧基苯基)氨基)丁酰胺基)苯 基)-1H-吲哚-5-甲酸(11c-2，L88M49)。淡白色固体(1.6mg，11％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ10.22(s，1H)，10.04(s，1H)，7.83(s，1H)，7.76(m，2H)， 7.60(m，2H)，7.47(m，1H)，7.35(m，
2H)，7.09(m，3H)，6.96(m，4H)， 3.58(s，3H)，2.67(m，4H)；HRMS(ESI)：C32H25IN3O6的计算值(M-H)-: 674.0794，实测值:664.0796；LC-MS(ESI)：673.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝
254nm)。
2H)，7.09(m，3H)，6.96(m，4H)， 3.58(s，3H)，2.67(m，4H)；HRMS(ESI)：C32H25IN3O6的计算值(M-H)-: 674.0794，实测值:664.0796；LC-MS(ESI)：673.8(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝
254nm)。
[0129] 2-(3-(4-((4-(苄基氧基)-3-氯苯基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)苯基)-6-羟基-3- 碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11c-3，L88M50)。淡白色固体(5.7mg，39％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ10.23(s，1H)，10.03(s，1H)，7.84(s，1H)，7.80 (m，2H)，7.49-7.33(m，8H)，7.17(m，2H)，7.03(s，1H)，5.15(s，2H)，3.58 (s，3H)，2.67(m，4H)；HRMS(ESI)：C33H26ClIN3O6的计算值(M-H)-: 722.0560，实测值:722.0563；LC-MS(ESI)：746.0(M+Na)+，721.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0130] 2-(3-(4-((3-(苄基氧基)苯基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)苯基)-6-羟基-3-碘-1- 甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11c-4，L88M52)。淡白色固体(2.2mg，15％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ11.35(brs，1H)，10.22(s，1H)，9.99(s，1H)，7.84(s， 1H)，7.73(m，2H)，7.50-7.32(m，7H)，7.15(m，3H)，7.04(s，1H)，6.68(m， 1H)，5.05(s，2H)，3.58(s，3H)，2.67(m，4H)；HRMS(ESI)：C33H27IN3O6 的计算值(M-H)-:688.0950，实测值:688.0950；LC-MS(ESI)：
-
687.8(M-H) ； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
-
687.8(M-H) ； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0131] 2-(3-(4-([1,1'-联苯]-3-基氨基)-4-氧代丁酰胺基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基 -1H-吲哚-5-甲酸(11c-5，L88M48)。淡白色固体(4.8mg，36％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.35(brs，1H)，10.24(s，1H)，10.12(s，1H)，7.93(m， 2H)，7.84(s，1H)，7.76(m，2H)，
7.60-7.40(m，8H)，7.16(m，1H)，7.03(s， 1H)，3.58(s，3H)，2.64(m，4H)；HRMS(ESI)：
C32H25IN3O5的计算值(M-H)-: 658.0844，实测值:658.0861；LC-MS(ESI)：683.4(M+H)+，
657.8(M-H)-；纯 度:>95％(UV，λ＝254nm)。
7.60-7.40(m，8H)，7.16(m，1H)，7.03(s， 1H)，3.58(s，3H)，2.64(m，4H)；HRMS(ESI)：
C32H25IN3O5的计算值(M-H)-: 658.0844，实测值:658.0861；LC-MS(ESI)：683.4(M+H)+，
657.8(M-H)-；纯 度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0132] 2-(3-(4-(5-溴二氢吲哚-1-基)-4-氧代丁酰胺基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基 -1H-吲哚-5-甲酸(11c-6，L88M93)。淡白色固体(3.2mg，23％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ
11.35(brs，1H)，10.25(s，1H)，7.97(m，1H)，7.84(s， 1H)，7.76(m，2H)，7.47(m，1H)，7.42(s，1H)，7.29(m，1H)，7.17(m， 1H)，7.04(s，1H)，4.16(m，2H)，3.56(s，3H)，3.17(m，2H)，
2.77(m，2H)， 2.71(m，2H)；HRMS(ESI)：C28H22BrIN3O5的计算值(M-H)-:685.9793，实 测值:685.9798；LC-MS(ESI)：687.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
11.35(brs，1H)，10.25(s，1H)，7.97(m，1H)，7.84(s， 1H)，7.76(m，2H)，7.47(m，1H)，7.42(s，1H)，7.29(m，1H)，7.17(m， 1H)，7.04(s，1H)，4.16(m，2H)，3.56(s，3H)，3.17(m，2H)，
2.77(m，2H)， 2.71(m，2H)；HRMS(ESI)：C28H22BrIN3O5的计算值(M-H)-:685.9793，实 测值:685.9798；LC-MS(ESI)：687.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0133] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(4-氧代-4-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)丁酰胺基) 苯基)-1H-吲哚-5-甲酸(11c-7，L88M33)。淡白色固体(6.1mg，45％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ11.35(brs，1H)，10.23(s，1H)，10.22(s，1H)，7.84(s， 1H)，7.71(m，5H)，7.48(m，1H)，7.30(m，2H)，7.16(m，1H)，7.03(s， 1H)，3.58(s，3H)，2.70(m，4H)；HRMS(ESI)：
- -
C27H20F3IN3O6的计算值 (M-H) :666.0354，实测值:666.0329；LC-MS(ESI)：665.8(M-H) ；
纯度:>95％ (UV，λ＝254nm)。
- -
C27H20F3IN3O6的计算值 (M-H) :666.0354，实测值:666.0329；LC-MS(ESI)：665.8(M-H) ；
纯度:>95％ (UV，λ＝254nm)。
[0134] 6-羟基-3-碘-2-(3-(4-((4-异丙基苯基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)苯基)-1-甲基 -1H-吲哚-5-甲酸(11c-8，L88N25)。淡白色固体(2.1mg，16％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ9.91(s，1H)，7.70(s，1H)，7.50-7.45(m，5H)，7.15(m， 5H)，6.66(s，1H)，3.58(s，3H)，2.82(m，1H)，2.64(m，4H)，1.17(d，J＝ 6.9 Hz，1H)；HRMS(ESI)：C29H27IN3O5的计算值(M-H)-:
624.1001，实测 值:624.1037；LC-MS(ESI)：648.0(M+Na)+，624.0(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
624.1001，实测 值:624.1037；LC-MS(ESI)：648.0(M+Na)+，624.0(M-H)-；纯度:>95％(UV， λ＝254nm)。
[0135] 2-(3-(4-((苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)苯 基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11c-9，L88N79)。淡白色固体(8.1mg， 63％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ11.35(brs，1H)，10.19(s，1H)，8.37 (m，1H)，7.85(s，1H)，7.61(s，1H)，7.72(m，1H)，7.47(m，1H)，7.16(m， 1H)，7.03(s，1H)，6.80(m，2H)，6.70(m，1H)，
5.93(s，2H)，4.17(m，2H)， 3.58(s，3H)，2.64(m，4H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ172.8，
171.8， 171.3，158.2，147.6，146.3，142.9，142.5，139.8，133.9，131.5，129.4， 125.5，
123.9，123.8，121.2，120.7，119.8，108.3，108.2，108.0，101.1， 97.0，60.5，42.2，32.5，
32.0，30.6；HRMS(ESI)：C28H23IN3O7的计算值 (M-H)-:640.0586，实测值:640.0569；LC-MS(ESI)：642.0(M+H)+，639.6 (M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
5.93(s，2H)，4.17(m，2H)， 3.58(s，3H)，2.64(m，4H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ172.8，
171.8， 171.3，158.2，147.6，146.3，142.9，142.5，139.8，133.9，131.5，129.4， 125.5，
123.9，123.8，121.2，120.7，119.8，108.3，108.2，108.0，101.1， 97.0，60.5，42.2，32.5，
32.0，30.6；HRMS(ESI)：C28H23IN3O7的计算值 (M-H)-:640.0586，实测值:640.0569；LC-MS(ESI)：642.0(M+H)+，639.6 (M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0136] 2-(3-(4-((环丙基甲基)(丙基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)苯基)-6-羟基-3-碘-1- 甲基-1H-吲哚-5-甲酸(11c-10，L88N40)。淡白色固体(10.6mg，87％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ11.35(brs，1H)，10.16(s，1H)，7.85(s，1H)，7.73(m， 2H)，7.48(m，1H)，7.16(m，1H)，7.04(s，1H)，3.58(s，3H)，3.33-3.14(m， 4H)，2.64(m，2H)，1.59-1.46(m，2H)，0.88(m，
4H)，0.50-0.10(m，4H)； HRMS(ESI)：C27H29IN3O5的计算值(M-H)-:602.1157，实测值:
+ -
602.1171； LC-MS(ESI)：604.0(M+H) ，602.0(M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
4H)，0.50-0.10(m，4H)； HRMS(ESI)：C27H29IN3O5的计算值(M-H)-:602.1157，实测值:
+ -
602.1171； LC-MS(ESI)：604.0(M+H) ，602.0(M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0137] 6-羟基-3-碘-1-甲基-2-(3-(4-氧代-4-(噻唑-2-基氨基)丁酰胺基)苯基)-1H- 吲哚-5-甲酸(11c-11，L88N13)。淡白色固体(0.9mg，7％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ12.15(s，1H)，10.25(s，1H)，7.84(s，1H)，7.74(m，2H)，7.46 (m，3H)，7.17(m，3H)，6.88(s，1H)，3.58(s，3H)，2.64(m，4H)；HRMS (ESI)：C23H18IN4O5S的计算值(M-H)-:589.0048，实测值:
589.0056；LC-MS (ESI)：591.0(M+H)+；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
589.0056；LC-MS (ESI)：591.0(M+H)+；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0138] 实施例1
[0139] 在该实施例中，分析SHP2催化结构域与IIB08的共晶结构。
[0140] SHP2结晶和X-射线数据收集。重组SHP2的表达和纯化之前描述于 Zhang等人，2010，Salicylic acid-based small molecule inhibitor for the oncogenic Src homology-2domain containing protein tyrosine phosphatase-2(SHP2)，J.Med. Chem.53，pp.2482-2493。结晶实验在室温使用坐滴蒸气扩散法进行。
[0141] 在结晶结构中，羟基吲哚羧酸核结合至SHP2的活性位点，且联苯部分 中的远端苯基环夹在β5-β6环(残基362-365)中的R362和K364的侧链之间， 其在PTP中是高度发散的，且末端联苯基和残基R362和K364之间的相互 作用很可能有助于IIB08观察到的功效和选择性；然而，该2-苯基几乎与酶 不具有相互作用，其主要是由于Click反应形成的三唑烷连接基的刚性。在 三唑烷连接基和SHP2之间没有观察到显著接触。基于该信息，将多种可商 购的胺通过适当连接基添加至羟基吲哚羧酸的2位以增加羟基吲哚羧酸的功 效和特异性(图1)。具体地，选择192种可商购的胺(图3A和3B)，它们的电 荷、极性、疏水性、溶解性和类药性不同，因此提供了结构多样性以增加SHP2 和抑制剂之间非共价相互作用的数量和强度。
而且，为保证库的组分可最佳 地桥接活性位点腔室和SHP2中相邻的外周位点，将0至3个亚甲基单元的 间隔基引入氨基-氧代酰胺基苯基连接基中的两个羰基之间(图1)。
而且，为保证库的组分可最佳 地桥接活性位点腔室和SHP2中相邻的外周位点，将0至3个亚甲基单元的 间隔基引入氨基-氧代酰胺基苯基连接基中的两个羰基之间(图1)。
[0142] 为构建该二齿库11a-d(图2)，将胺1用FmocOSu保护以制备炔烃2。炔 烃2通过Sonogashira反应与碘化物3偶联以得到化合物4，44％产率。通过 I2亲电环化4得到化合物5，86％产率。在50％二乙基胺的DCM溶液中脱保 护5得到胺6。通过在5％LiOH中在80℃将6水解2小时得到化合物7。 化合物7用乙酰氯8a-d处理后，得到化合物9a-d，它们在5％LiOH中在室 温水解2小时得到化合物10a-d。为了组合库11a-d，以相等量将192种结构 不同的胺(图3A和3B)引入两个96-孔板的单独的孔，在羟基苯并三唑(HOBt)、 O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙基胺 (DIPEA)的存在下在二甲基甲酰胺(DMF)中，以与化合物10a-d中的羧酸缩合 过夜。孔中反应的质量随机通过LC-MS监测，指示60-80％的化合物10a-d 转化为所需产物(化合物11a-d)。
[0143] 库11a-d以～5μM筛选SHP2抑制剂，不用进一步纯化。库组分抑制SHP2- 催化水解对硝基苯基磷酸酯(pNPP)的能力在pH7.0和25℃评估。更具体地， SHP2的磷酸酶活性使用对硝基苯基磷酸酯(pNPP)作为底物在25℃在50mM 3,3-二甲基戊二酸盐缓冲液(pH7.0)中测试，该缓冲液包含1mM EDTA且通 过NaCl调节离子强度为0.15μM。在96-孔板中在5μM化合物浓度筛选该 库。该反应通过添加5μl酶至包含5μM库化合物和2.9mM(Km值)pNPP的195μl反应混合物而引发，且5分钟后通过添加50μl5 N NaOH淬灭。pNPP 的非酶水解通过测量不添加酶的对照校正。产物对硝基酚的量根据405nm的 吸光度确定，其通过Spectra MAX340微板分光光度计(Molecular Devices， Sunnyvale，CA)检测，使用的摩尔消光系数为18,-1 -1000 M cm 。用于IC50测量 的抑制剂浓度涵盖IC50值的0.2至5X的范围。选择的再合成和纯化的活性分 子(hit)的IC50值通过将405nm的吸光度对抑制剂浓度拟合为以下方程而计 算:
[0144] AI/A0＝IC50/(IC50+[I])
[0145] 其中AI为在抑制剂存在下样品在405nm的吸光度；A0为不存在抑制剂 时405nm的吸光度；且[I]为抑制剂浓度。
[0146] 根据初始筛选结果立即显而易见的是，连接基长度是非常重要的。事实 上，所有最高活性分子源自库11a，其具有最短的草酸连接基。
[0147] 再合成了库11a的最高22个活性分子，通过高效液相色谱法(HPLC)纯 化，且测定它们的IC50值。如表2可见，该IC50值与在～5μM化合物浓度测 量的百分比抑制数据匹配良好。筛选鉴定的最佳活性分子化合物11a-1也显 示对SHP2具有最低的IC50值：0.20±0.02μM。类似于11a-1，其它携带联 芳基取代基的化合物(例如，11a-2和11a-5)也强烈抑制SHP2。有趣的是，具 有苄基氧基苯基氨基骨架的化合物(例如，11a-3和11a-6)也在亚微摩尔浓度 抑制SHP2。
[0148] 为进一步建立作为SHP2结合的特有结构的联芳基取代基，合成了11a-1 的6种另外的联芳基取代的衍生物(表3)。化合物11a-21至11a-26的IC50值 与11a-1相当。为证实草酸连接基的有效性，再合成和表征了库11c(具有琥 珀酸连接基)的11个最高活性分子。与筛选的结果一致，相比其库11a对应 物，选自库11c的活性分子不太有效(表2和表4)。例如，11c-1，库11c的最 高活性分子，具有的IC50为2.3μM，该值比11a-1(IC50＝0.20μM)高超过10 倍。
[0149] 总之，该结构和活性数据指示，为了增强对SHP2的抑制剂结合，芳族 草酸连接基和联芳基取代基是优选的。
[0150] 选择性概况揭示了相比20种哺乳动物的PTP组，11a-1对SHP2具有超 过5倍的选择性，所述哺乳动物的PTP组包括受体样PTPs，PTPμ，PTPε， PTPα，PTPσ和PTPγ，细胞溶质PTPs，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，淋 巴蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)，SHP1，蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)，造血酪 氨酸磷酸酶(HePTP)，富含纹状体的蛋白酪氨酸磷酸酶(STEP)，和蛋白酪氨酸 磷酸酶PEZ，双特异性磷酸酶，牛痘H1-相关的磷酸酶(VHR)，VH1-样磷酸 酶Z(VHZ)，MAP激酶磷酸酶5(MKP5)，蛋白磷酸酶CDC14A，包含泛素 样结构域的CTD磷酸酶1(UBLCP1)和痫蛋白，低分子量PTP(LMWPTP)和 蛋白磷酸酶SSu72(表5)。所述PTP从大肠杆菌表达和纯化。这些PTP的IC50测定在与SHP2的相同条件进行，不同的是使用的pNPP浓度对应于研究的 PTP的Km值。
[0151] 特别注意的是，相比其最相关的相关物SHP1和PTP1B，化合物11a-1 显示对SHP2具有7倍和11倍的偏好。
[0152] 实施例2
[0153] 在该实施例中，分析了化合物11a-1和11c-9抑制SHP2的结构基础。
[0154] 具体地，为阐明11a-1或11c-9抑制SHP2的结构基础，确定了与11a-1 或11c-9复合的SHP2 PTP结构域(残基240-528)的晶体结构。
[0155] 对于共结晶，将100μl SHP2储液(7.0mg/ml)在20mM MES(pH6.0)、 50mM NaCl、0.1mM EDTA和4mM DTT中与1μl化合物11a-1或11c-9储 液(50mM在DMSO中)混合。然而，对于SHP2·11a-1复合物没有获得衍射 晶体。
[0156] SHP2·11c-9复合物的晶体在室温通过坐滴蒸气扩散得到。蛋白质液滴相 对包含20％w/v聚乙二醇3350、200mM乙酸镁四水合物和100mM HEPES 缓冲液(pH7.7)的储备溶液进行平衡，且使之浸透30分钟。然后将晶体通过 液氮快速冷却。X-射线数据以19 BM光束线在APS(Argonne，IL)收集。使 用程序HKL3000(Minor等人，2006，HKL-3000:the integration of data reduction and structure solution–from diffraction images to an initial model in minutes.Acta.Crystallogr.Sect.D.62,pp.859-866)处理数据。空间群P1中结 晶的空间群在不对称单元中具有一个分子。
[0157] SHP2·11c-9复合物的晶体衍射至 分辨率，且结构使用程序MolRep (Vagin&Teplyakov，1997，MOLREP:an automated program for molecular replacement，J.Appl.Cryst.30，pp.1022-1025)通过分子替代解析。SHP2催 化结构域的载脂形式(apo-form)(PDB登记3B7O)(Barr等人,2009, Large-scale structural analysis of the classical human protein tyrosine phosphatome,Cell 136,pp.352-363)用作研究模型。所得不同的傅里叶图表明 前16个N-末端残基具有不同的构象。该图还揭示SHP2的活性位点中化合 物11c-9的密度。N-末端肽246-261首先根据Fo-Fc密度图重建。通过程序 CNS1.1(Brunger等人，1998,Crystallography&NMR system:a new software suite for macro-molecular structure determination,Acta Crystallogr.Sect.D.54, pp.905-921)将SHP2·11c-9的三维结构精修至20.3％的晶体学R-因子(R自由＝ 26.4％)(2.4分辨率)，其使用在2,500 K模拟的退火，然后是交替的定位和单 独的温度因子精修循环。数据收集和精修的统计示于表6。原子模型包括 SHP2残基246-314和323-526，和化合物11c-9的所有原子(图4A&4B)。
[0158] 表6.数据收集和精修统计
[0159]
[0160]
[0161] aR合并＝∑h∑i|I(h)i-|/∑h∑iI(h)i.
[0162] bR工作＝∑h|F(h)计算-F(h)观察|/∑hF(h)观察，其中F(h)计算和F(h)观察分别为精修的 经计算和观察的结构因子。
[0163] 为随机选择的3.7％的反射计算cR自由，该反射在精修中省略。
[0164] SHP2·11c-9的总体结构类似于用于分子替代的无配体SHP2结构，其中 两者之间所有α-碳位置的均方根偏差(rmsd)为 两种结构的主要差异 为对应于11c-9的SHP2活性位点的电子密度(其通过在2.5σ呈波状的|Fo|-|Fc| 差异图(图4A)证实)和N-末端肽246-261(该N-末端肽246-261根据|Fo|-|Fc| 密度图重建)。11c-9中的羟基吲哚羧酸部分占据SHP2活性位点口袋且与P- 环中的残基(残基458-465)、pTyr识别环(残基277-284)和Q环(残基501-507) 形成广泛的相互作用(图4B)。具体地，羟基吲哚羧酸核中苯酚的氧O1与P- 环中R465的侧链形成两个氢键；羧酸根O2氢键键合至R465的主链酰胺， 且O3形成与A461的主链酰胺的一个H-键和与S460的侧链的极性相互作用。 吲哚环有利地与P-环中S460、A461和R465的侧链以及Q-环中Q506、T507 和Q510的侧链相互作用，且吲哚环3位的碘原子具有与Y279侧链的范德华 力接触。有趣的是，11c-9中的远端苯并二氧杂环戊烯环也参与到与β5-β6环(残 基362-365)中的K364的侧链的极性和非极性相互作用中。最后，琥珀酸连 接基使得与β5-β6环中的R362侧链和WPD环(残基421-431)中的H426侧链 二者的范德华力接触，而连接基中的羰基氧O4形成与R362侧链的极性相互 作用。
[0165] 实施例3
[0166] 在该实施例中，分析了化合物11a-1介导的SHP2抑制的分子基础。
[0167] 通过之前的SHP2·II-B08结构指导(Zhang等人，2010，2010,Salicylic acid-based small molecule inhibitor for the oncogenic Src homology-2domain containing protein tryosine phosphatase-2(SHP2),J.Med.Chem.53,pp. 2482-2493)和目前的SHP2·11c-9结构，化合物11a-1介导的SHP2抑制的分 子基础通过在覆盖围绕SHP2活性位点的II-B08和11c-9二者的区域内进行 对接研究而分析。
[0168] 对接研究.使用Chem3D程序和三种SHP2催化结构域结构，3B7O.pdb (Barr等人，2009，Large-scale structural analysis of the classical human protein tyrosine phosphatome,Cell 136,pp.352-363)(载脂形式SHP2催化结构域)， 3O5X.pdg(Zhang等人，
2010，Salicylic acid-based small molecule inhibitor for the oncogenic Src homology-2domain containing protein tyrosine phosphatase-2 (SHP2),
J.Med.Chem.53,pp.2482-2493)(SHP2·II-B08复合结构)和4 PVG.pdb(SHP2·11c-9复合结构)建立化合物11a-1的3D-结构，且将其能量最 小化，用于在AutoDock4.2.5软件包中的整体对接(Morris等人，2009, AutoDock4and AutoDock Tools4:Automated Docking with Selective Receptor Flexibility,Journal of Computational Chemistry30,pp.2785-
2791)。配体和受体 按照AutoDock Tools.4.6程序(Sanner,1999,Python:A programming language for software integration and development.Journal of Molecular Graphics& Modelling17,pp.57-61)进行预对接处理(例如，合并非极性氢，添加Gasteiger 电荷，对配体设定可旋转的键，和对受体添加溶剂化参数)。
2010，Salicylic acid-based small molecule inhibitor for the oncogenic Src homology-2domain containing protein tyrosine phosphatase-2 (SHP2),
J.Med.Chem.53,pp.2482-2493)(SHP2·II-B08复合结构)和4 PVG.pdb(SHP2·11c-9复合结构)建立化合物11a-1的3D-结构，且将其能量最 小化，用于在AutoDock4.2.5软件包中的整体对接(Morris等人，2009, AutoDock4and AutoDock Tools4:Automated Docking with Selective Receptor Flexibility,Journal of Computational Chemistry30,pp.2785-
2791)。配体和受体 按照AutoDock Tools.4.6程序(Sanner,1999,Python:A programming language for software integration and development.Journal of Molecular Graphics& Modelling17,pp.57-61)进行预对接处理(例如，合并非极性氢，添加Gasteiger 电荷，对配体设定可旋转的键，和对受体添加溶剂化参数)。
[0169] 为确定通常对接区域，将上述两个SHP2复合结构重叠在SHP2的载脂 形式上，矩形对接区域可视化地设置为足够覆盖活性位点周围的II-B08和 11c-9二者，能量网格大小设定为54 X54 X36点，在各轴具有 间隔， 且各原子类型(即，A，C，I，OA，N，SA和HD)的能量网格图以及静电学 和去溶剂化图使用AutoGrid4计算。分子对接使用AutoDock4.2.5进行，最佳 结合构象通过Lamarckian Genetic Algorithm with Local Search(LGALS)测定， 其在每次对接运行中具有以下参数:能量评价为2500000，群体大小为100， 突变率为0.02，交叉率为0.8，Solis和Wets局部搜索迭代(local search iterations) 为300且概率为0.06。
[0170] 对于各SHP2结构，进行200次对接运行且所得结合模式为构象聚集的 和能量排序的。最终结合模式通过目视检查、群体分析和能量比较测定。
[0171] 如图5A所示，11a-1的总体SHP2结合模式类似于II-B08和11c-9。在 所有三种情况下，羟基吲哚羧酸基序穿透进入活性位点，且远端杂环尾部与 β5-β6环中的残基形成的沟相互作用。然而，不像II-B08或11c-9(它们的杂环 尾部通过主要沿着Q-环和WPD-环的柔性连接基延伸至沟)，化合物11a-1将 其尾部沿着pY识别环通过刚性草酸连接基延伸。因此，11a-1中的羟基吲哚 羧酸沿着pY识别裂缝更深入地结合至活性位点，占据大多数活性位点口袋 (图5B)，且相邻的β-苯基环在pY识别环中与Y279形成强π-π堆叠相互作用 (图5C)，其未在SHP2·II-B08和SHP2·11c-9结构中观察到。
[0172] 此外，草酰胺连接基恰当地将苯基噻吩尾部安置以良好地被β5-β6环中 的R362和K364夹住(图5D)。更详细地(图5E)，羟基吲哚羧酸与P-环中的 S460、I463、G464和R465的主链酰胺形成四个H-键，其使得吲哚核固定于 活性位点以与多个P-环残基范德华力接触；1-甲基形成与A461、Y279和I282 的疏水相互作用和与Y279的β-苯基环π-π堆叠；且草酰胺连接基中的羰基 之一与K364侧链形成H-键，因此其使得苯基噻吩尾部取向于β5-β6环中R362 和K364之间。总之，11a-1和SHP2之间增加且更有利的相互作用可能有助 于11a-1对SHP2增强的抑制功效和选择性。为支持对接分析，11a-1对 SHP2/R362A和SHP2/K364S的IC50值为野生型酶的2.2和1.3倍，表明R362 和K364可能参与结合11a-1。
[0173] 实施例4
[0174] 在该实施例中，分析了化合物11a-1抑制SHP-2依赖性信号传导和癌细 胞系增殖的能力。
[0175] 由于化合物11a-1对SHP2的优异功效和选择性，在多种癌细胞系中评 估了其抑制SHP2-依赖性信号传导和增殖的能力。之前已证实SHP2是H1975 生长所需的(Xu等人，2013，Targeting SHP2 for EGFR inhibitor resistant non-small cell lung carcinoma.Biochem.Biophys.Res.Commun.,439,pp. 586-590)，该H1975是在EGF受体中具有次要守门基因突变且显示对EGF 受体抑制剂吉非替尼和埃罗替尼抵抗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者衍生的细 胞系。
[0176] 具体地，人非小细胞肺癌细胞系H1975获自American Tissue Culture Collection且在37℃和5％CO2条件下在补充10％胎牛血清的RPMI-1640 (Corning，Corning，NY)中培养。3X103细胞接种于96-孔板的每孔。用化合 物11a-1处理2天后，细胞用
50μg/ml MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二 苯基四唑鎓溴化物(Sigma，St.Louis，MO)培养3-4小时。然后，去除培养基， 添加DMSO以溶解甲臜晶体。仅包含培养基的孔用于背景校正。以分光光度 计在540nm测量光密度。
50μg/ml MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二 苯基四唑鎓溴化物(Sigma，St.Louis，MO)培养3-4小时。然后，去除培养基， 添加DMSO以溶解甲臜晶体。仅包含培养基的孔用于背景校正。以分光光度 计在540nm测量光密度。
[0177] 对于生物化学研究，将H1975细胞进行血清-饥饿过夜，然后用载体或 化合物11a-1处理3小时，然后不刺激或用5ng/ml EGF(SIGMA，St.Louis， MO)刺激60分钟。然后将裂解产物通过SDS-PAGE解析且蛋白磷酸化水平 通过免疫印迹分析检测。具体地，细胞在加入蛋白酶抑制剂混合物(获自Roche (Basel，Switzerland))的裂解缓冲液(1.0％Nonidet P-
40，50mM Tris-HCl(pH 7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，2mM NaVO3，10mM NaF)中裂解，且 在
10,000rpm在4℃离心5分钟。收集上清液且使用BCA蛋白测试 (ThermoFisher Scientific，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。相等量的蛋白质提 取物与负载凝胶的缓冲液混合且在SDS-PAGE上分离。电泳后，将蛋白质转 移至硝基纤维素膜上，非特异性结合用5％脱脂奶粉在包含0.1％Tween-20的 Tris-缓冲盐水(TBS-T)中阻断。然后将膜在4℃在摇杆上用多种抗体探测过 夜。培养后，膜用TBS-T洗涤且用合适的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二抗 在室温培养1小时。最后，膜上的蛋白质使用SuperSignal West Dura Luminol/Enhancer溶液(ThermoFisher Scientific，Rockford，IL)检测且膜使用 Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System分析。
40，50mM Tris-HCl(pH 7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，2mM NaVO3，10mM NaF)中裂解，且 在
10,000rpm在4℃离心5分钟。收集上清液且使用BCA蛋白测试 (ThermoFisher Scientific，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。相等量的蛋白质提 取物与负载凝胶的缓冲液混合且在SDS-PAGE上分离。电泳后，将蛋白质转 移至硝基纤维素膜上，非特异性结合用5％脱脂奶粉在包含0.1％Tween-20的 Tris-缓冲盐水(TBS-T)中阻断。然后将膜在4℃在摇杆上用多种抗体探测过 夜。培养后，膜用TBS-T洗涤且用合适的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二抗 在室温培养1小时。最后，膜上的蛋白质使用SuperSignal West Dura Luminol/Enhancer溶液(ThermoFisher Scientific，Rockford，IL)检测且膜使用 Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System分析。
[0178] 如图6A所示，用化合物11a-1处理H1975细胞2天后，化合物11a-1 以剂量依赖性方式抑制了H1975细胞增殖(通过MTT测试测量)，其IC50为 0.17±0.02μM。
[0179] 因为SHP2磷酸酶活性是完全活化Ras-Erk1/2途径所需的，进一步评估 了在H1975细胞中化合物11a-1对EGF-诱导的Erk1/2活化的细胞作用。化 合物11a-1以剂量依赖性方式有效减少EGF-诱导的Erk1/2磷酸化(图6B)。为 进一步提供化合物11a-1可在细胞内阻断SHP2的磷酸酶活性的直接证据， 测量了桩蛋白(pY118)的磷酸化水平，桩蛋白为SHP2的生理底物，其通过 SHP2脱磷酸增强EGF-刺激的Erk1/2活化。如图6B所示，用化合物11a-1 处理H1975细胞剂量依赖性地增加了Y118上的桩蛋白磷酸化，其与在化合 物11a-1存在下EGF-诱导的Erk1/2活化减少一致。
[0180] 此外，为确保化合物11a-1的细胞活性通过SHP2抑制体现且不是由于 非特异性作用，还评估了结构相关但显著抑制性较低的化合物10a(对SHP2 的IC50为14.4μM，表2)。在2μM，化合物10a对桩蛋白和Erk1/2磷酸化没 有作用，而在相同浓度，化合物11a-1减少了Erk1/2磷酸化达40％且增加了 桩蛋白磷酸化达30％(图6C)。而且，当SHP2水平被siRNA敲减时，化合物 11a-1降低EGF-介导的Erk1/2活化的能力被减弱(图6E)。
[0181] 为提供进一步证据证明观察到的化合物11a-1的细胞作用是SHP2依赖 性的，评估了化合物11a-1对PMA(佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯)-诱导的 Erk1/2活化的作用，其为SHP2非依赖性的，反之以Ras-非依赖性方式依赖 于蛋白质激酶C和Raf的活化。因此，不会预期SHP2抑制剂影响PMA-诱 导的Erk1/2磷酸化。事实上，化合物11a-1对PMA-诱导的Erk1/2磷酸化没 有作用(图6D)。综上，这些结果指示化合物11a-1特异性抑制SHP2-介导的 细胞信号传导事件。
[0182] 实施例5
[0183] 在该实施例中，评估了化合物11a-1阻断乳腺癌细胞生长的能力。
[0184] 11a-1在抑制H1975肺癌细胞增殖中的期待活性启发了人们研究其抑制 ErbB2阳性SKBR3乳腺癌细胞系生长的有效性。这些细胞通过ErbB2上调， 强烈活化Ras，其然后促进Akt信号传导(当生长在塑料上)或Erk1/2信号传 导(当生长在Matrigel中)。由于多个研究显示癌细胞在Matrigel中以团块生长， 其更接近模拟真实人肿瘤的形成和信号传导性质，因此测定了化合物11a-1 在Matrigel中阻断这些细胞生长的有效性。
[0185] 在35mm培养皿将约300,000个SKBR3细胞接种于150μl减少生长因 子的Matrigel(Corning，Corning，NY)中。然后在每个条件下向3个培养皿添 加包含10μl载体(DMSO)或指示浓度的化合物11a-1的2mL培养基。每隔 24小时，将细胞用NIKON SMZ1500立体显微镜成像。源自各图像的各集落 的横截面积使用Adobe Photoshop软件测量。4天后，细胞从Matrigel回收且 在包含蛋白酶抑制剂混合物的PLC缓冲液(Cat.No.P8340；SIGMA-Aldrich， St.Louis，MO)中裂解。裂解产物然后通过SDS-PAGE解析且指示蛋白质的 相对水平通过免疫印迹分析检测。
[0186] 同样，SKBR3细胞在用载体处理的Matrigel中形成肿瘤样生长物，但它 们的生长在24小时内被3μM化合物11a-1有效抑制(图7A)。
[0187] 而且，尽管在4天内对照和化合物11a-1处理的细胞都显示相等水平的 总Erk1/2和Akt，但它们的磷酸化水平一致地通过增加化合物11a-1浓度(从 1μM至10μM)而抑制(图7B)。总之，该数据显示化合物11a-1有效抑制ErbB2 阳性SKBR3细胞系的生长，很可能是通过其阻断SHP2依赖性Erk1/2和Akt 活化的能力。
[0188] 实施例6
[0189] 在该实施例中，分析和比较了在II-B08或化合物11a-1存在下携带致癌 性的KITD814V的32D骨髓细胞的生长。
[0190] 人的KIT受体(KITD814V)中的功能获得性突变与胃肠道间质瘤、全身 性肥大细胞增多症和急性骨髓性白血病相关。之前已显示第一代SHP2抑制 剂II-B08抑制致癌性的KITD814V诱导的配体非依赖性生长(Mali等人， 2012，Role of SHP2 phosphatase in KIT-induced transformation:identification of SHP2 as a druggable target in diseases involving oncogenic KIT,Blood 120,pp. 269-2678)。
[0191] 为进一步确定化合物11a-1的功效，比较了在II-B08和11a-1存在下携 带致癌性的KITD814V的32D骨髓细胞的生长。具体地，将野生型(WT)KIT 和KITD814V插入双顺反子逆转录病毒载体MIEG3，其在内部核糖体进入位 点(IRES)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因上游，如上在Mali等人2012中 所述。用于转导32D骨髓细胞和原代造血干细胞和祖细胞的逆转录病毒上清 液使用用逆转录病毒载体质粒转染的Phoenix亲嗜性包装细胞系通过磷酸钙 转染试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)产生。转染48小时后收集上清液且通 过0.45μm膜过滤。32D骨髓细胞以24小时间隔用2mL高/滴度病毒上清液 在10ng/mL IL-3和8μg/mL聚凝胺存在下感染两次。感染48小时后，将表 达WT KIT或KITD814V受体的32D细胞基于EGFP表达划分为均一种类， 且用于进行所有实验。
[0192] 如图8A所示，在II-B08或化合物11a-1存在下，在测试浓度没有观察 到显著抑制携带WT KIT的细胞的生长。然而，用5μM II-B08处理显示了显 著抑制携带KITD814V的细胞的配体非依赖性生长，但在1μM浓度没有观 察到抑制。而且，用1μM和5μM浓度二者的化合物11a-1处理显示了显著 抑制携带KITD814V的细胞的配体非依赖性生长。
[0193] 为进一步测定II-B08和化合物11a-1对携带致癌性的KITD814V的原代 骨髓细胞的作用，将C57BL/6小鼠的原代低密度骨髓细胞用KITD814V转导 且将挑选的细胞在SHP2抑制剂、II-B08和化合物11a-1存在或不存在下进行 增殖测试。为在骨髓细胞中表达WT KIT和KITD814V受体，低密度骨髓细 胞从WT小鼠收集，且在补充20％FBS、2％青霉素/链霉素和细胞因子(100 ng/mL SCF，100ng/mL TPO，50ng/mL FLT3-L和4ng/mL IL-6)的IMDM中预 刺激48小时，然后在非组织培养板中在纤连蛋白片段(Retronectin)上进行逆 转录病毒感染。在第三天，细胞用2mL如上制备的WT KIT或KITD814V 的高滴度逆转录病毒上清液感染。24小时后进行第二次病毒感染。第二次感 染48小时后，挑选表达EGFP的细胞且用于进行所有实验。
[0194] 类似于32D骨髓细胞，相比于II-B08，携带KITD814V的原代骨髓细胞 在1μM和5μM浓度的化合物11a-1的存在下显示显著的生长降低(图8B)。 这些结果表明相比于II-B08，化合物11a-1在抑制致癌性的KITD814V诱导 的组成性生长方面更有效。
[0195] 为测定化合物11a-1是否也抑制Akt和Erk1/2信号传导的配体非依赖性 活化，使携带WT KIT或KITD814V的32D骨髓细胞饥饿且用化合物11a-1 处理。与上述结果一致，携带野生型KIT的细胞在化合物11a-1存在或不存 在情况下未显示任何Akt或Erk1/2的组成性激活(数据未显示)。同样，SHP2、 Akt和Erk1/2的组成性磷酸化在携带致癌性的KITD814V的细胞中观察到(图 8C，泳道1)。在化合物11a-1存在下出现磷酸化SHP2、Akt和Erk1/2的剂量 依赖性抑制(图8C，泳道2-4)。这些结果表明化合物11a-1抑制Akt和Erk1/2 信号传导的活化，导致携带致癌性的KITD814V的细胞的生长减少。
[0196] 总之，上述结果指示在H1975肺癌细胞、ErbB2阳性SKBR3乳腺癌细 胞、携带致癌性KITD814V的32D骨髓细胞和原代低密度骨髓细胞中，化合 物11a-1在阻断SHP2活性和细胞增殖方面高度有效。
[0197] 上述实施例显示本发明的基于羟基吲哚羧酸的抑制剂显示高度有效的 细胞活性且可在细胞内特异性阻断SHP2依赖性信号传导。因此，这些抑制 剂化合物不仅作为用于开发广泛肿瘤疾病药物的有希望的候选物，而且还可 用作有用工具以研究SHP2在正常生理中的功能和阐明潜在的SHP2-引发转 化事件。对于理解SHP2-介导的致癌性的机理、开发靶向SHP2的抗癌和抗 白血病治疗而言，获得该知识是关键的。
[0198] 以下方法和化合物用于实施例7-8。
[0199] 材料和通用步骤.对硝基苯基磷酸酯(pNPP)购自ThermoFisher Scientific (Rockford，IL)。对于有机合成，试剂按购买时原样使用(Aldrich，Acros，Alfa Aesar，TCI)，除非另有所述。1H和13C NMR谱获自Brucker 500波谱仪， 以TMS或残余溶剂作为标准。所有柱色谱法使用动态吸附剂230-400目硅胶 (SiO2)进行，使用指示的溶剂体系，除非另有所述。TLC分析使用254nm玻 璃支持的板进行，且使用UV光(254nm)显影，低分辨率质谱和纯度数据使 用Agilent Technologies 6130 Quadrupole LC/MS获得。高分辨率质谱数据使用 Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS获得。HPLC纯化通过装配Sunfire Prep C18 OBD柱(30mm*150mm，5μm)的Waters Delta 600进行，使用甲醇- 水(均含有0.1％TFA)作为流动相。所有最终测试的化合物的纯度通过Agilent Technologies 6130 Quadrupole LC/MS(UV，λ＝254nm)确定为>95％。
[0200] 合成4’a-c的通用方法.将4-(二甲基氨基)-2-羟基-5-碘代苯甲酸甲酯2’ (321mg，1mmol)、化合物3’a-c(2mmol)、TEA(228μL，2mmol)、二(三苯 基膦)氯化钯(II)(70.2mg，0.1mmol)和CuI(38mg，0.2mmol)的混合物装入烧 瓶，将其脱气且用氮气填充。添加DMF(5mL)。所得混合物在氮气氛在室温 搅拌4小时。反应通过TLC监测以确定完成。该溶液在EtOAc(40mL)和盐 水(40mL)之间分配。有机层用盐水(3×40mL)洗涤，用硫酸钠干燥，且真空 浓缩。残余物通过快速硅胶色谱法纯化(Hex/EtOAc＝8:1)以得到化合物4’a-c。
[0201] 4-(二甲基氨基)-2-羟基-5-(6-甲氧基-6-氧代己-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯 (4’1
a)。无色油状物(200mg，62％)；H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ10.87(s， 1H)，7.83(s，1H)，6.31(s，1H)，3.91(s，3H)，3.70(s，3H)，3.05(s，6H)， 2.51(m，4H)，1.96(m，2H)；HRMS(ESI)：
C17H20NO5的计算值(M-H)-: 318.1347，实测值:318.1343；LC-MS(ESI)：320.2(M+H)+；纯度:>
95％(UV， λ＝254nm)。
a)。无色油状物(200mg，62％)；H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ10.87(s， 1H)，7.83(s，1H)，6.31(s，1H)，3.91(s，3H)，3.70(s，3H)，3.05(s，6H)， 2.51(m，4H)，1.96(m，2H)；HRMS(ESI)：
C17H20NO5的计算值(M-H)-: 318.1347，实测值:318.1343；LC-MS(ESI)：320.2(M+H)+；纯度:>
95％(UV， λ＝254nm)。
[0202] 4-(二甲基氨基)-2-羟基-5-((3-(甲氧基羰基)苯基)乙炔基)苯甲酸甲酯 (4’b)。白色固体(257mg，73％)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ10.96(s，1H)， 8.17(s，1H)，7.99(m，
2H)，7.67(m，1H)，7.44(m，1H)，6.35(s，1H)，3.96 (s，3H)，3.94(s，3H)，3.17(s，6H)；LC-MS(ESI)：354.0(M+H)+，351.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
2H)，7.67(m，1H)，7.44(m，1H)，6.35(s，1H)，3.96 (s，3H)，3.94(s，3H)，3.17(s，6H)；LC-MS(ESI)：354.0(M+H)+，351.8(M-H)-； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0203] 4-(二甲基氨基)-2-羟基-5-((4-(甲氧基羰基)苯基)乙炔基)苯甲酸甲酯(4’c)。白色固体(265mg，75％)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ10.97(s，1H)， 8.01(d，J＝8.3 Hz，2H)，
7.97(s，1H)，7.54(d，J＝8.3 Hz，2H)，6.33(s， 1H)，3.94(s，3H)，3.93(s，3H)，3.15(s，6H)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)： δ169.7，166.5，162.9，159.2，137.6，130.6，129.5，128.9，
128.6，104.0， 103.5，102.8，92.1，91.9，52.2，51.9，42.6；LC-MS(ESI)：354.0(M+H)+； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
7.97(s，1H)，7.54(d，J＝8.3 Hz，2H)，6.33(s， 1H)，3.94(s，3H)，3.93(s，3H)，3.15(s，6H)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)： δ169.7，166.5，162.9，159.2，137.6，130.6，129.5，128.9，
128.6，104.0， 103.5，102.8，92.1，91.9，52.2，51.9，42.6；LC-MS(ESI)：354.0(M+H)+； 纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0204] 合成5’a-c的通用方法.向4’a-c(1mmol)、NaHCO3(0.084g，1mmol) 在CH2Cl2或CH3CN(100mL)中的溶液中添加碘(0.304g，1.2mmol)。所得混 合物在室温搅拌4小时，然后添加100mL CH2Cl2且用饱和Na2SO3水溶液(2× 100mL)，盐水(100mL)洗涤，用Na2SO4干燥且真空浓缩。残余物通过快速 色谱法纯化(己烷/EtOAc＝4:1)以得到5’a-c。
[0205] 6-羟基-3-碘-2-(4-甲氧基-4-氧代丁基)-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸甲酯 (5’a)。使用CH3CN作为溶剂，白色固体(182mg，42％)；1H NMR(500 MHz， CDCl3)：δ10.84(s，1H)，
7.90(s，1H)，6.79(s，1H)，4.01(s，3H)，3.72(s， 3H)，3.67(s，3H)，2.89(t，J＝7.7 Hz，2H)，
2.46(t，J＝7.1 Hz，2H)，1.96 (m，2H)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ173.5，171.2，157.9，
142.3，141.5， 123.5，123.2，107.0，95.8，59.3，52.1，51.6，32.8，30.8，26.4，24.0；LC-MS (ESI)：431.2(M+H)+；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
7.90(s，1H)，6.79(s，1H)，4.01(s，3H)，3.72(s， 3H)，3.67(s，3H)，2.89(t，J＝7.7 Hz，2H)，
2.46(t，J＝7.1 Hz，2H)，1.96 (m，2H)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ173.5，171.2，157.9，
142.3，141.5， 123.5，123.2，107.0，95.8，59.3，52.1，51.6，32.8，30.8，26.4，24.0；LC-MS (ESI)：431.2(M+H)+；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0206] 6-羟基-3-碘-2-(4-(甲氧基羰基)苯基)-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸甲酯(5’c)。 使用CH2Cl2作为溶剂，白色固体(388mg，83％)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)： δ10.90(s，1H)，8.18(d，J＝8.3 Hz，2H)，7.98(s，1H)，7.56(d，J＝8.3 Hz， 2H)，6.80(s，1H)，4.01(s，3H)，3.98(s，3H)，3.58(s，3H)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ171.1，166.5，158.4，142.6，141.5，135.5，130.7，130.4， 129.7，124.5，124.1，107.8，96.2，60.6，52.3，52.2，32.3。
[0207] 合成6’a-c的通用方法.将化合物5’a-c(1mmol)溶于4mL THF。然后添 加5％LiOH(4mL)溶液。将混合物加热至80℃保持2小时，冷却至室温， 盐水(100mL)稀释，通过2 N HCl酸化至pH 5且用EtOAc(2 X 100mL)萃取。 合并有机层，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，真空浓缩且通过HPLC纯化以得 到6’a-c。
[0208] 2-(3-羧基丙基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(6’a，核89)。白色固 体(333mg，82％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ13.68(brs，1H)，12.15(brs，1H)，11.26(s，1H)，7.70(s，1H)，6.95(s，1H)，3.71(s，3H)，2.82(t，J＝7.5 Hz，2H)，2.32(t，J＝7.1 Hz，2H)，
1.76(m，2H)；LC-MS(ESI)：404.0(M+H)+， 401.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
1.76(m，2H)；LC-MS(ESI)：404.0(M+H)+， 401.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0209] 2-(3-羧基苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(6’b，核94)。黄色固 体(223mg，51％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ8.08(m，2H)，7.78(s， 1H)，7.71(m，1H)，7.55(m，-1H)，7.05(s，1H)，3.61(s，3H)；LC-MS(ESI)： 435.6(M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0210] 2-(4-羧基苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(6’c，核95)。黄色固 体(288mg，65％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)：δ13.20(brs，1H)，11.40(brs， 1H)，8.10(d，J＝8.3 Hz，2H)，7.87(s，1H)，7.67(d，J＝8.3 Hz，2H)，7.07 (s，1H)，3.61(s，3H)；13C NMR(125 MHz，DMSO)：δ173.0，167.3，158.5， 142.6，141.6，135.4，131.3，131.2，129.8，124.2，123.8，108.6，96.9，61.5， 32.6；LC-MS(ESI)：435.6(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0211] 合成(7’a-1至7’a-3和7’c-1至7’c-3)的通用方法。将溶于0.5mL DMF 中的化合物7’a或7’c(0.02mmol)添加至相应胺(0.04mmol)、HOBT(3.06mg， 0.02mmol)、HBTU(7.58mg，
0.02mmol)和DIPEA(5.16μL，0.04mmol)在1mL DMF中的溶液中。将混合物在室温搅拌4小时。
该粗产物通过Pre-HPLC纯 化以得到7’a-1至7’a-3和7’c-1至7’c-3。
0.02mmol)和DIPEA(5.16μL，0.04mmol)在1mL DMF中的溶液中。将混合物在室温搅拌4小时。
该粗产物通过Pre-HPLC纯 化以得到7’a-1至7’a-3和7’c-1至7’c-3。
[0212] 2-(4-((3-(苄基氧基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚 -5-甲酸(7’a-1，L89M52)。白色固体(5.4mg，46％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)： δ13.68(s，1H)，11.27(s，1H)，9.91(s，1H)，7.70(s，1H)，7.45-7.31(m， 6H)，7.18(m，1H)，7.10(m，1H)，
6.96(s，1H)，6.69(m，1H)，5.05(s，2H)， 3.73(s，3H)，2.85(m，2H)，2.39(m，2H)，1.87(m，+ -
2H)；LC-MS(ESI)： 607.0(M+Na) ，582.8(M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
6.96(s，1H)，6.69(m，1H)，5.05(s，2H)， 3.73(s，3H)，2.85(m，2H)，2.39(m，2H)，1.87(m，+ -
2H)；LC-MS(ESI)： 607.0(M+Na) ，582.8(M-H) ；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0213] 2-(4-((苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)氨基)-4-氧代丁基)-6-羟基-3- 碘-1-甲基-1H-吲哚-5-甲酸(7’a-2，L89N79)。白色固体(5.5mg，51％)；1H NMR (500 MHz，DMSO)：δ13.68(s，1H)，11.26(s，1H)，8.30(s，1H)，7.70(s， 1H)，6.95(s，1H)，6.83(m，2H)，6.72(m，1H)，5.97(m，2H)，4.17(m， 2H)，3.69(s，3H)，2.79(m，2H)，2.23(m，2H)，1.78(m，
2H)；LC-MS(ESI)： 559.0(M+Na)+，534.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
2H)；LC-MS(ESI)： 559.0(M+Na)+，534.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0214] 2-(4-((4-(苄基氧基)-3-氯苯基)氨基)-4-氧代丁基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H- 吲哚-5-甲酸(7’a-3，L89M50)。白色固体(5.8mg，46％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ9.92(s，1H)，7.75(m，1H)，7.69(m，1H)，7.46-7.32(m，7H)， 7.16(m，1H)，6.94(s，1H)，5.15(s，2H)，
3.72(s，3H)，2.85(m，2H)，2.37 (m，2H)，1.87(m，2H)；LC-MS(ESI)：641.0(M+Na)+，616.8(M-H)-；纯度: >95％(UV，λ＝254nm)。
3.72(s，3H)，2.85(m，2H)，2.37 (m，2H)，1.87(m，2H)；LC-MS(ESI)：641.0(M+Na)+，616.8(M-H)-；纯度: >95％(UV，λ＝254nm)。
[0215] 2-(4-((3-(苄基氧基)苯基)氨基甲酰基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H-吲哚 -5-甲酸(7’c-1，L95M52)。白色固体(8.0mg，64％)；1H NMR(500 MHz，DMSO)： δ10.41(s，1H)，
8.10(m，2H)，7.88(s，1H)，7.70(m，2H)，7.61(s，1H)， 7.48-7.26(m，7H)，7.07(s，1H)，6.80(m，1H)，5.12(s，2H)，3.63(s，3H)； LC-MS(ESI)：619.0(M+H)+，616.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
8.10(m，2H)，7.88(s，1H)，7.70(m，2H)，7.61(s，1H)， 7.48-7.26(m，7H)，7.07(s，1H)，6.80(m，1H)，5.12(s，2H)，3.63(s，3H)； LC-MS(ESI)：619.0(M+H)+，616.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0216] 2-(4-((4-(苄基氧基)-3-氯苯基)氨基甲酰基)苯基)-6-羟基-3-碘-1-甲基-1H- 吲哚-5-甲酸(7’c-3，L95M50)。白色固体(9.3mg，71％)；1H NMR(500 MHz， DMSO)：δ10.44(s，1H)，8.10(m，2H)，8.00(s，1H)，7.88(s，1H)，7.69(m， 3H)，7.50-7.26(m，6H)，7.07(s，1H)，5.22(s，2H)，3.63(s，3H)；LC-MS (ESI)：653.0(M+H)+，650.8(M-H)-；纯度:>95％(UV，λ＝254nm)。
[0217] 实施例7
[0218] 在该实施例中，构造库7’a-c的羟基吲哚羧酸且分析其对SHP2的功效和 特异性。
[0219] 如图10所示，为构建酰胺库7’a-c，通过Sonogashira偶联将化合物2’ 4-(二甲基氨基)-2-羟基-5-碘代苯甲酸甲酯与相应的脂族或芳族炔烃3’a-c偶 联以得到化合物4’a-c，80-90％产率。通过I2亲电环化4’a-c得到碘化物5’a-c， 80-90％产率。通过在5％LiOH中在80℃水解酯5’a-c 2小时得到核6’a-c。 在96-孔板中在DMF中将核6’a-c在HOBT、HBTU和DIPEA的存在下分别 与192种酸(图3A和3B)反应过夜以构建组合的酰胺库7’a-c。该反应随机选 择且通过LC-MS监测。将约60-80％核6’a-c转化为靶分子，指示库7’a-c的 质量良好。
[0220] 这三种库进一步在10μM针对SHP2进行筛选。相比脂族连接基库7’a， 芳族连接基库7’b和7’c具有较高的活性分子比率。再合成库7’a和7’c中的 三对具有相同胺骨架的活性分子且通过HPLC纯化。它们的IC50通过在pH7 和25℃抑制SHP2催化水解对硝基苯基磷酸酯(pNPP)而测试(表1)。与筛选结 果一致，7’c中的所有三种活性分子比7’a中的活性分子更有效。例如，化合 物7’c-3(IC50＝1.6μM)的功效为密切相关的化合物7’a-3(IC50>20μM)的12 倍。IC50数据概况和筛选数据都证实芳族连接基优于脂族连接基。
[0221] 实施例8
[0222] 在该实施例中，SHP2(D2C)用于转化至大肠杆菌BL21/DE3且在含50 μg/ml卡那霉素的LB培养基中在37℃生长至OD600为0.4。添加IPTG至终 浓度为20μM后，培养物在20℃孵育且再摇动16小时。通过在4℃在5000 rpm离心分离5分钟收集细胞。将细菌细胞团重悬浮于20mM Tris(pH7.9)， 500mM NaCl，5mM咪唑中，且通过在1,200psi穿过弗氏细胞压碎器两次 裂解细胞。细胞碎片通过在16,000rpm在4℃离心分离30分钟而去除。蛋 白质使用Ni-次氮基三乙酸-琼脂糖(Qiagen)亲和力纯化的标准操作从上清液 纯化。将从Ni-NTA柱洗脱的蛋白质用Amicon Ultra离心滤器设备(Millipore) 浓缩且缓冲液更换为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA和1mM DTT。蛋白质浓度使用Bradford染料结合测试(Bio-Rad)测定，该测试根据制 造商的推荐稀释且使用牛血清白蛋白作为标准。纯化的SHP2(D2C)制备成 30％甘油且在-20℃储存。
[0223] 抑制研究:抑制测试在25℃在50mM3,3-二甲基戊二酸盐缓冲液，pH 7.0中进行，该缓冲液包含1mM EDTA且通过NaCl调节至离子强度为0.15M。 基于水杨酸的库在96-孔板中在10μM化合物浓度筛选。在96-孔板通过添加 50μl酶至150μl反应混合物而引发反应，该反应混合物包含最终Km值的 pNPP和多种浓度抑制剂。10分钟后通过添加50μl5N NaOH淬灭反应，然 后该反应混合物通过Spectra MAX340微板分光光度计(Molecular Devices)在 405nm检测吸光度。通过将405nm的吸光度对抑制剂浓度拟合为以下方程 计算IC50值:
[0224] AI/A0＝IC50/(IC50+[I])
[0225] 其中AI为存在抑制剂时样品405nm的吸光度；A0为不存在抑制剂时 405nm的吸光度；且[I]为抑制剂浓度。
[0226] 抑制剂对SHP2(D2C)的抑制常数(Ki)在pH7.0和25℃测定。抑制模式 和Ki值按以下方式测定。在抑制剂的多种固定浓度，如上所述，在生成对硝 基酚后测量一系列pNPP浓度的初始比率，其范围为表观Km值的0.4至3 倍。使用SIGMAPlot-酶动力学将该数据拟合为合适的方程以得到抑制常数且 评估抑制模式。
[0227] 对于选择性研究，从大肠杆菌表达和纯化所述PTP，包括LYP、mPTPA、 SHP1-D1C、PTP1B、LMPTP、VHR、痫蛋白和PTPα-D1D2。这些PTP的抑 制测试在与SHP2(D2C)相同的条件进行，除了使用与对应于所研究的PTP 的Km不同的pNPP浓度。
[0228] 根据以上内容，可以看出实现了本发明的多种优点，且得到了其他有利 结果。由于可对上述抑制剂进行多种变化而不偏离本发明的范围，预期上述 说明书包含的且示于附图中的所有物质应理解为解释性的而非限制的含义。
[0229] 当介绍本发明或其多种版本、实施方案或方面的元素时，冠词“一个”、 “一种”、“该”和“所述”预期是指存在一个或多个元素。术语“包含”、“包括” 和“具有”意指包含在内的，且是指可存在所列元素之外的其他元素。
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