一株钙离子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌及其构建
方法与应用
技术领域
[0001] 本
发明属于基因工程及
微生物技术领域，具体涉及一种敲除钙离子通道CchA基因的黑曲霉基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
[0002]
柠檬酸作为全世界需求量最大的
有机酸之一，被广泛用于食品、医药、日化等行业。其中，75％的柠檬酸被用于食品工业，主要用于
食品添加剂中的酸味剂、抗
氧剂、pH调节剂，同时由于柠檬酸具有温和爽快的酸味，普遍用于饮料、糕点、葡萄酒、乳制品等食品的制造。另外有15％是用于化工和纺织业，可以用作缓冲液、络合剂、掩蔽剂、金属
助洗剂、媒染剂等等。还有10％的柠檬酸被用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、
化妆品以及
饲料添加剂等等，被广泛应用于医药工业以及
畜牧业中。近些年来，由于我国粮食价格普遍上涨，随之而来的就是柠檬酸生产原料成本的大幅上涨。因此如何改进柠檬酸
发酵方法并且进一步降低成本就成了我国整个柠檬酸产业最为关心的问题。
[0003] 黑曲霉发酵产柠檬酸是当前工业发酵生产柠檬酸的主要途径之一，通过细胞固定化的方法可以大幅提升黑曲霉的发酵效率。目前，细胞固定化的方法主要有四种：包埋法、交联法、共价结合法以及
吸附法。对于丝状
真菌来说，吸附法操作简单，固定过程不需要化学结构的改变，而且理论上适用于所有丝状真菌，更利于在工业上的推广和应用。吸附法的原理主要是依靠载体表面的基团和细胞表面的相互作用
力，进而促使细胞吸附在载体表面进行生长。并且当细胞衰亡之后会从载体上脱落，同时有活性的细胞再吸附上去，形成一个动态平衡，使整个微环境形成一个高效的转化系统，整体发酵效率与游离发酵相比有明显的提升。在人们对固定化发酵机理的研究过程中发现，微生物普遍会在载体上形成
生物膜，并且所形成的生物膜不同会导致固定化发酵的性能发生很大的差异。因此，我们需要对生物膜形成机制进一步的了解，才能真正解决固定化工业应用难的问题。
发明内容
[0004] 为解决现有工业上黑曲霉发酵生产柠檬酸时产量低，发酵周期长的问题，本发明要解决的技术问题是，提供一株钙离子通道CchA基因
缺陷型的黑曲霉基因工程菌。
[0005] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述产柠檬酸黑曲霉基因工程菌的构建方法。
[0006] 本发明最后要解决的技术问题是，提供上述黑曲霉基因工程菌在发酵产柠檬酸中的应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一株钙离子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌，它是通过双交换方法，利用hyg抗性基因替换掉CchA基因部分序列的基因工程菌，钙离子通道CchA基因参与菌丝
主轴极性生长，产孢以及细胞壁的完整性。细胞壁完整性能够影响生物膜的生成，因此，钙离子通道CchA基因能够调控生物膜的生成，从而影响柠檬酸的产量。
[0009] 其中，所述黑曲霉为Aspergillus Niger 831(A.niger 831)，
[0010] 所述钙离子通道CchA基因失活前核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述钙离子通道CchA基因失活后核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 一种钙离子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0012] (1)提取黑曲霉A.niger 831的基因组DNA；
[0013] (2)以步骤(1)得到的基因组为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为引物，扩增出CchA基因的上游同源臂；
[0014] 以步骤(1)得到的基因组为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为引物，扩增出CchA基因的下游同源臂；
[0015] 以质粒pan7-1为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列为引物，扩增出hyg抗性元件；
[0016] 通过overlap PCR，以CchA基因的上游同源臂、CchA基因的下游同源臂、hyg抗性元件为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增得到基因敲除
片段；
[0017] (3)制备黑曲霉原生质体；
[0018] (4)将基因敲除重组片段导入原生质体中进行同源重组，得到钙离子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌。
[0019] 其中，CchA基因的上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，CchA基因的下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，hyg抗性元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
[0020] 上述钙离子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌在制备柠檬酸中的应用在本发明的保护范围之内。
[0021] 作为优选，以钙离子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备柠檬酸。
[0022] 其中，所述固定化发酵是以多孔
纤维材料作为固定化介质，发酵制备柠檬酸，所述多孔纤维材料为
活性炭纤维。
[0023] 其中，所述固定化发酵的发酵培养基的配置方法如下：
[0024] 分别取200g/L～300g/L木薯粉、200g/L-300g/L的玉米粉，在60℃～70℃下，1L发酵液加入1～2mL的
液化酶，酶解35min～45min，再将木薯粉液和玉米粉液分别加热至达85℃，每1L发酵液要加入1～2mL的液化酶，酶解35min～45min，直至碘液不变蓝，过滤木薯粉液，得木薯粉液上清，向木薯粉液上清中加入并加入体积分数为2-10％的未过滤的玉米粉液，混匀得到固定化发酵培养基，所述液化酶中含有α-
淀粉酶，所述α-淀粉酶的酶活为60000～70000U/mL。
[0025] 其中，所述固定化发酵的培养条件如下：培养
温度为30℃～37℃，培养时间为72～120h，转速为180～330rpm。
[0026] 其中，所述的多孔纤维材料先用以下方法进行预处理：
[0027] 将多孔纤维材料用1M的氢氧化钠浸泡1～1.5h，再用
水冲洗至pH为中性，在1M
盐酸中浸泡1～1.5h，再用水冲洗至pH为中性，烘干至恒重，得到改性多孔纤维材料。
[0028] 利用上述钙离子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌固定化发酵生产柠檬酸的方法，具体包括如下步骤：
[0029] (1)载体的制备：将多孔纤维材料用1M的氢氧化钠浸泡1h，用纯水洗净后，在1M盐酸中浸泡1h，之后用纯水冲洗至pH为中性，再放入65℃烘箱中烘干至恒重。剪成大小相同的载体。
[0030] (2)发酵：将活化的黑曲霉基因工程菌平板用刮孢液将其刮下，制成孢子液。以0.2％(体积分数)的接种量接种到已经灭过菌且含有0.1g/100mL多孔纤维材料的发酵培养基中，发酵，得柠檬酸。
[0031] 所述发酵培养基，包括如下组分：200-250g/L玉米粉，200-250g/L木薯粉。
[0032] 发酵条件如下：培养温度为35℃，培养时间为72-96h，转速为200～250rpm。
[0033] 有益效果：
[0034] 本发明通过基因敲除手段构建了一株钙离子通道CchA基因缺失的黑曲霉基因工程菌。该基因工程菌使黑曲霉在固定化发酵产柠檬酸过程中生物膜量减少，抱团现象减轻，提高了柠檬酸的产量和糖转化率，缩短了发酵周期。
附图说明
[0035] 图1为黑曲霉Aspergillus Niger 831基因组的
电泳图；
[0036] 图2为PAN7-1质粒图谱；
[0037] 图3为CchA基因上游同源臂、下游同源臂的PCR电泳图，其中，M为DL5000的DNA Marker，泳道1为CchA的上同源臂，泳道3为CchA的下同源臂，泳道5为hyg抗性表达元件；
[0038] 图4为基因敲除片段的电泳图，其中M为marker泳道1为基因敲除片段；
[0040] 图6为结晶紫染色OD值差异图；
[0041] 图7为原始黑曲霉和黑曲霉基因工程菌的发酵结果。
[0042] 图8为出发菌黑曲霉菌株的生物膜电镜图；
[0043] 图9为黑曲霉基因工程菌的生物膜电镜图；
具体实施方式
[0044]
实施例1：黑曲霉钙离子通道cchA基因敲除菌的构建。
[0045] (一)提取原始黑曲霉基因组
[0046] 使用takara公司提取
植物基因组的
试剂盒(takara minibest plant genomic DNA extraction kit)，具体防范如下：
[0047] 1.将刮取的黑曲霉孢子液取1mL接种于50mLDP培养基中，于35℃，250r/min培养15h；
[0048] 2.于5000r/min离心5min收集菌丝球，用生理盐水洗涤两次后，将收集的菌丝球用液氮
研磨3次，称取100mg研磨好的粉末加入到事先加入500uL的Buffer HS II的tube管中混匀，然后加入10uL的RNase A,充分震荡混匀，于56℃水浴10分钟。
[0049] 3.向步骤2中加入62.5uL Buffer KAC，充分混匀。
冰上放置5min，12000rpm离心5min。取上清600uL，加入600uL的Buffer GB，充分混匀。
[0050] 4.将Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。
[0051] 5.将500uL的Buffer WA加入到Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。
[0052] 6.将700uL的Buffer WB加入到Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。
[0053] 7.重复步骤6一次。
[0054] 8.将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm，离心2min。
[0055] 9.将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入40uL的65℃灭菌水，室温静置1min。12000rpm离心2min，洗脱DNA。通过琼脂糖凝胶电泳测定黑曲霉基因组浓度如图1所示。
[0056] 图1显示，M为DL15000的DNA marker，1号为提取的黑曲霉基因组。
[0057] (二)运用PCR技术扩增CchA基因上下同源臂。
[0058] 表1 PCR反应体系
[0059]
[0060] 以原始黑曲霉基因组为模板，以CchA-up-F为上引物，以CchA-up-R为下引物(如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)扩增上同源臂；以CchA-down-F为上引物，以CchA-down-R为下引物(如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)扩增下同源臂。反应体系见表1，反应条件：98℃变性10s，55～65℃
退火30s，68℃延伸2min，上述步骤重复30次。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图3。
[0061] (三)扩增hyg抗性表达元件
[0062] 以PAN7-1质粒(PAN7-1质粒图谱见图2，核苷酸序列见SEQ ID NO.17)为模板，以CchA-hyg-F为上引物，以CchA-hyg-R为下引物(如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)扩增hyg抗性表达元件。反应体系见表1，反应条件：98℃变性10s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，上述步骤重复30次。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图3。其中hyg抗性表达元件的核苷酸序列见SEQ ID NO：13。
[0063] 图3表示，M为DL5000的DNA Marker，1号为CchA的上同源臂，3号为CchA的下同源臂，5号为hyg抗性表达元件。
[0064] (四)扩增基因敲除片段
[0065] 以CchA上下游同源臂及hyg抗性表达元件为模板，以CchA-F为上引物，以CchA-R为下引物(如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示)，利用Overlap PCR技术扩增CchA基因敲除片段。反应体系见表1，反应条件：98℃变性10s，55-65℃退火30s，68℃延伸7min，上述步骤重复30次。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图4。其中敲除片段的核苷酸序列见SEQ ID NO：14。
[0066] 图4表示，M为DL10000的DNA Marker，1号为基因敲除片段。
[0067] (五)黑曲霉原生质体的制备及转化
[0068] 1.将黑曲霉接种到PDA平板，待长满孢子，加3mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，转移至灭菌的5mL离心管中。
[0069] 2.接种0.5mL孢子液到50mL YPD培养基，35℃,250rpm培养9-13h。
[0070] 3.孢子萌发完毕后，用Miracloth过滤，留下菌丝。配制酶解液(Lysing enzyme，崩溃酶，蜗
牛酶各0.1g/10mL，
纤维素酶400μL/10mL)，用无菌
注射器过滤除菌。
[0071] 4.取2g菌丝至酶液中，30℃,220rpm酶解30min。将转速降低至150rpm培养4h。
[0072] 5.酶解完成后，用
滤纸过滤，取滤液，4℃,5000rpm离心10min。去上清，加入1mL 1M山梨醇(冰水浴)，用枪吹吸混匀，再加入15mL山梨醇，离心，去上清。然后再重复一次。去掉上清，加入1mL Solution5，用枪吹吸混匀。
[0073] 6.吸100μL的原生质体到1.5mL灭菌离心管中，加入10μL步骤(四)中构建的基因敲除片段与之混匀。再加入50μL的Solution 4，混匀，置于冰上并计时15-30min。
[0074] 7.20min后，加入900uLSolution4，上下颠倒几次，放置在室温并计时15-30min。15-30min后，6000rpm离心5min，弃900uL上清液，剩余菌体涂布于
蔗糖浓度为1mol/L,潮霉素浓度为75mmol/L的PDA培养基中，正置培养。得到转化子。
[0075] 8.挑取转化子进行菌落PCR验证。其具体方法如下：取适量转化子加入到50uL的菌落PCR缓冲液(100mM/L Tris-Hcl、10mM/L EDTA、1M/L Kcl)中，95℃水浴10min，取0.5uL加入PCR反应体系。PCR引物为hyg-F和hyg-R(如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示)，琼脂糖电泳显示扩增条带，表示转
化成功。
[0076] 实施例2：结晶紫染色实验
[0077] 将原始黑曲霉(Aspergillus Niger 831)和基因工程菌分别接种到PDA平板，待长满孢子，加3mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，转移至灭菌的5mL离心管中，用刮孢缓冲液定容到2mL，得到孢子液。用血球计数板定量并稀释至106个/mL，随后继续稀释至105，104。
[0078] 在24孔板中预先加入1ml的合成培养基，然后将不同浓度的孢子液取2uL接种到培养基中。35℃下静置培养36h，使黑曲霉在孔板底部成膜。之后倒掉培养基，用PBS冲洗2遍后，加入0.1％的结晶紫染色15min。之后倒掉结晶紫，用PBS冲洗2遍后，加入冰
醋酸在震荡仪中放置30min，使结晶紫脱色。然后进行观察以及酶标仪检测OD570。结晶紫染色图和OD值差异图见图5和图6。
[0079] 表2生物膜结晶紫染色实验在不同孢子浓度下的OD值
[0080]
[0081] 图5和图6结果显示，ΔCchA菌株在脱色后，紫色
颜色明显比原始菌淡，在105浓度下ΔCchA菌株的颜色已经被脱除干净，用酶标仪检测的OD值，数据结果与颜色相符。表明钙离子通道CchA基因失活后，生物膜是减少的。
[0082] 实施例3：基因工程菌固定化发酵实验。
[0083] 1.多孔纤维材料固定化介质的制备
[0084] 将多孔纤维材料(活性炭纤维)用1M的氢氧化钠浸泡1h，用纯水洗净后，在1M盐酸中浸泡1h，之后用纯水冲洗至pH为中性，再放入65℃烘箱中烘干至恒重。剪成大小相同的载体。
[0085] 2.发酵培养基的制备
[0086] 分别称取200/L-300g/L的木薯粉和200g/L-300g/L的玉米粉在75℃水浴锅中进行糊化，待木薯粉液和玉米粉液达到65℃，加1-2mL的液化酶，液化40min,之后水浴锅加热到95℃，待木薯粉液和玉米粉液达到85℃，加1-2mL的液化酶，液化40min,直至碘液不变蓝，过滤木薯粉液得上清，并加入2-10％的未过滤的玉米粉液做回料，混匀，每100mL分装到含有适量载体的500mL锥形瓶中。灭菌，冷却待用。
[0087] 3.发酵方法步骤如下
[0088] (1)将冻存的黑曲霉基因工程菌和原始黑曲霉孢子接种到PDA平板上，恒温
培养箱35℃培养4～5天，待其上满孢子。
[0089] (2)用刮孢子缓冲液将孢子刮下得到孢子悬浮液，取适量转接到装有100mL固定化培养基的500mL锥形瓶中，于30-35℃，250rpm摇床中培养72-96h，发酵过程中每12h取样，12000rpm离心5min，将上清液与沉淀分离，测定上清中的残糖浓度和柠檬酸产量。当残糖浓度低于5g/L时，发酵结束。其中利用NaOH滴定法测柠檬酸，用DNS法测定总糖。
[0090] 其中NaOH滴定法为：取样品1mL(稀释一定浓度)加入250mL锥形瓶中，同时加入50mL纯水，用0.1429M的NaOH滴定，所消耗NaOH的量就是柠檬酸的产量。
[0091] DNS法为：
[0092] DNS的配制：称取3,5-二硝基水杨酸10g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中磁力搅拌溶解，再依次加入
酒石酸甲钠200g、
[0093]
苯酚2g和无水亚
硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用纯水定容[0094] 至1000mL。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
[0095] 标曲的制作方法：配制一系列浓度为0.0-1.0g/L的糖标准溶液，各浓度分别取0.5mL加入15mL离心管中，然后在每个离心管中加入0.5mL DNS溶液，
[0096] 将离心管置于沸水浴中反应5min后，置于冰水中冷却，之后每个离心管中加入8mL纯水，混匀后测定
波长540nm下的吸光值OD540，以0.0g/L为对照。标准溶液的浓度为纵坐标，吸光值OD540为横坐标绘制标准曲线。
[0097] 样品测量方法：样品适当稀释之后，取1mL浓硫酸加入10mL样品中于沸水浴反应15min后，置于冰水中冷却，调PH至中性，并定容到100mL，之后在稀释至适当浓度，测量方法同上。不同的糖对应不同的标曲。
[0098] 图7表示ΔCchA菌株和原始菌株在发酵条件下的差异，结果显示发酵96h后，ΔCchA菌株发酵产柠檬酸的产量平均为162.8g/L，原始菌发酵产柠檬酸的产量平均为153.2g/L,ΔCchA菌株柠檬酸产量与原始菌相比提高6.27％。黑曲霉(Aspergillus Niger831)是一株高产柠檬酸菌株，在此
基础上产量能有所提高，可以说是在黑曲霉固定化发酵成产柠檬酸的基础上取得了很大的进步，适宜于工业生产。
[0099] 实施例4：SEM观察生物膜
[0100] 将固定化发酵72h后的载体取出，用PBS冲洗3遍洗掉吸附的菌丝。在-80℃
冰箱放置过夜后置于冻干机中冻干。再将载体通过导电胶粘在点镜台上，20mA 30s进行喷金。然后拿到TM3000中进行观察。生物膜电镜图见图8和图9。图8表示黑曲霉原始菌株的固定化情况，图9表示ΔCch菌株的固定化情况。可以发现，黑曲霉原始菌在载体上形成了多个球状物，这些球状物连结成膜，同时将载体的孔径堵住，影响了内部菌体的传氧传质。而ΔCchA菌株，在载体的拐
角处和表面形成了少量的生物膜，没有影响内部菌体的传氧传质，有利于固定化发酵产柠檬酸。
