技术领域
[0001] 本
发明属于
生物工程技术领域，具体涉及一种刺激隐核虫表面蛋白C1多克隆抗体的制备方法。
背景技术
[0002] 刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是一种寄生于
海水鱼类的纤毛虫，引起
海水养殖鱼类严重致死性
疾病——白点病。近年来，由于我国
海水养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，刺激隐核虫病已经成为大范围、经常性爆发的烈性传染病，给海水渔业造成了非常严重的危害。由于海水养殖的开放性特征，很难杜绝刺激隐核虫对鱼体的感染，加之尚无有效的
治疗药物和处理方法，使得该病的防治异常困难。
[0003] 目前生产上主要采用药物防治和物理防治(Colorni and Burgess，1997；蔡泽平等，2001； Noritaka et al.，2001；Noritaka et al.，2003；黄玮等，2004)，然而这些方法由于存诸多
缺陷，如效果不稳定、破坏养殖环境、危害
食品安全、实施不便等，很难达到理想的效果。大量的研究证实，海水鱼类对刺激隐核虫感染会产生获得性免疫保护，
疫苗接种可能成为防治刺激隐核虫病的有效方法(Yoshinaga et al，1997；Yambot et al，2006；Luo et al，2007；Hatanaka and Hirazawa，2008)。对刺激隐核虫致病机制，以及宿主抗虫免疫机制的研究，有利于高效疫苗的开发。然而，目前尚缺乏刺激隐核虫的标记抗体，限制了虫体与宿主相互作用的研究。
[0004] 本研究从刺激隐核虫转录组
数据库中筛选出一种表面蛋白-表面蛋白C1基因，在四膜虫上表达出其重组蛋白，并制备了抗重组蛋白的多克隆抗体，该抗体可对刺激隐核虫进行标记。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种刺激隐核虫表面蛋白C1多克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：
[0006] 1、刺激隐核虫传代：
[0007] 采用的刺激隐核虫分离于广东省惠州市大亚湾某卵形鲳鲹养殖网箱，对体表及鳃出现明显症状的卵形鲳鲹进行镜检，确认体表及鳃上的滋养体形态与刺激隐核虫报道一致。将10尾感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹置于500L海水中暂养，2天后的晚上转到特制的收虫器，次日早晨收集从鱼体脱落的包囊。包囊于灭菌海水中充气培养60小时左右可孵化出大量幼虫，将孵化2小时内的幼虫以20000/尾再次感染卵形鲳鲹，以此建立稳定的刺激隐核虫传代系统。
[0008] 2、斜带石斑鱼的暂养：
[0009] 所用斜带石斑鱼均购自广东省大亚湾水产试验中心，整个养殖过程中无刺激隐核虫感染记录。实验鱼暂养2周，水温为25度，每天换水量为50％，感染前每天投喂体重4％的养殖
饲料。试验前，随机
抽取10尾鱼进行镜检和阻动试验以确认实验鱼无刺激隐核虫及其他体表寄生虫感染。
[0010] 3、刺激隐核虫总RNA的提取：
[0011] 提取刺激隐核虫的总RNA，具体操作步骤如下：
[0012] 1)从-80℃
冰箱中取出样品，置于冰上，每个样品不超过30mg，快速加入1ml MagZol Reagent，用组织匀浆机快速匀浆。
[0013] 2)室温放置5min让组织充分裂解。
[0014] 3)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。
[0015] 4)4℃，12,000×g离心15min。
[0016] 5)小心转移上清液至新的离心管中，加入1.5倍体积无水
乙醇后混匀。
[0017] 6)把HiPure RNA Mini Column装在2ml收集管中，转移
混合液至柱子中，8,000×g离心 30s。
[0018] 7)倒弃滤液把柱子装回收集管中，加入用乙醇稀释的650μl Buffer RW2至柱子中，8,000 ×g离心30s。
[0019] 8)重复上步骤一次。
[0020] 9)倒弃滤液把柱子装回收集管中10,000×g离心空柱2min甩干柱子的基质。
[0021] 10)将柱子转移至1.5ml离心管中，加入45μl RNase Free Water至柱子的膜中央，室温静置2 min，10,000×g离心1min。
[0022] 11)丢弃RNA柱子，
电泳检测RNA的完整性，OD A260/280测定RNA浓度。剩余样品保存 -80℃。
[0023] 4、一链cDNA的合成：
[0024] 1)按以下体系添加
试剂：Total RNA，1μg；DNase I buffer，1μl；DNase I，1μl；最后加RNase free water至10μl，混匀，短暂离心，37℃恒温孵育30min，以去除基因组DNA污染；
[0025] 2)反应结束后向上述体系中加入1μl EDTA(25mM)，振荡混匀后，65℃恒温孵育10min，以灭活DNase I；
[0026] 3)将反应产物迅速转移至冰上冷却；
[0027] 4)cDNA合成：反应试剂配制体系如下：第一步变性的RNA溶液，11μl；Oligo(dT)20(10 pmol/μl)，1μl；5×RT Buffer，4μl；dNTP Mixture(各10mM)，2μl；RNase Inhibitor(10U/μl)， 1μl；ReverTra Ace，1μl；Total Volume 20μl。反应程序：42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min。反应产物转到-20℃保存备用。
[0028] 5、表面蛋白C1基因开放阅读框(ORF)的克隆：
[0029] 结合刺激隐核虫转录组数据的全长序列，分别设计了用于扩增刺激隐核虫表面蛋白C1 基因ORF的引物(5’到3’)：C1 F，ATGTAAAAGATTTTAGCTATTTTATT；C1 R， TCATTTGAATAAAAGAGCAAAG。
[0030] 模板使用刺激隐核虫一链cDNA，引物使用C1F/R，PCR反应体系如下：一链cDNA，2μl； C1F(10μM)，2μl；C1R(10μM)，2μl；PrimeSTAR MAX mix，25μl；加H2O至50μl。PCR 反应程序为：98℃，10s；58℃，15s；72℃，2min，35个循环，最后72℃延伸10min。用 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
[0031] 目的条带使用上述回收
试剂盒回收，产物与克隆载体pEASY-Blunt Cloning Vector进行连接，连接反应体系如下：PCR回收产物，4μl；pEASY-Blunt Cloning Vector，1μl。
[0032] 混匀后，于25℃连接30min后转化感受态细胞。从-80℃取出Trans1-T1感受态细胞50μl 置于冰上，待感受态细胞刚化开时加入上述所有连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入1mL LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h，取100μl 菌液涂布于含有X-gal、IPTG和卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
[0033] 次日挑取白色单菌落于10μl无菌水中，漩涡混匀。取1μl混合液为模板，进行阳性克隆鉴定。反应体系如下：菌液，1μl；Primer M13F(10μM)，1μl；Primer M13R(10μM)，1μl；Premix Taq，25μl；加H2O至50μl。PCR反应条件为：95℃预变性10min，(94℃，30s；55℃，30s；
72℃，3min)×35个循环，最后72℃延伸10min。电泳鉴定阳性克隆，随机挑取3个阳性克隆保种并送到公司测序。
[0034] 6、四膜虫rDNA表达载体的构建：
[0035] 1)候选基因的结构特征分析
[0036] 利用
软件对表面蛋白C1基因进行以下分析：预测蛋白序列、限制性酶切位点分析、与四膜虫密码子使用偏好性差异分析、
信号肽序列分析和GPI锚
定位点分析。
[0037] 2)表面蛋白C1基因的改造
[0038] 以目的基因cDNA为模板通过PCR对候选基因进行如下改造：在两端设计特异性酶切位点(BamH和XhoI)、去除GPI-Anchor结构、增加标签、设计TEV位点等。
[0039] 3)候选基因与穿梭载体的连接
[0040] 把改造后的候选基因和分泌型穿梭载体(pTIEV4)进行双酶切(酶切位点为BamH和 XhoI)，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定。
[0041] 4)表达载体的构建
[0042] 把上述穿梭载体和pD5H8载体进行单酶切(酶切位点为NotI)，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定，成功构建四膜虫rDNA表达载体。
[0043] 7、四膜虫rDNA表达载体的转化和阳性虫株筛选：
[0044] 1)四膜虫的准备
[0045] 用NEFF培养基分别培养两种交配型的四膜虫(II型和VII型)，当细胞浓度达到105个/ml 以上时转入饥饿液中震荡培养7-14小时，然后静置培养9.5hr，如果镜检发现细胞
配对比率达到80％以上，且在
荧光显微镜下观察发现新的大核原基已经形成，就可以进行转化；
[0046] 2)转化
[0047] 将浓缩的表达载体(浓度＞1ug/ul)包被金颗粒，利用BIO-RAD PDS-1000台式基因枪把表达载体转入四膜虫的大核原基中；
[0048] 3)筛选
[0049] 将转化后的细胞培养在NEFF培养基中，依次加入1000×～100×的巴龙霉素进行梯度筛选，最终获得带有9000-10000个外源基因的工程四膜虫。
[0050] 8、工程四膜虫的诱导表达和重组蛋白的分离纯化：
[0051] 1)当细胞浓度达到105个/ml以上时800×g离心2分钟弃上清，加入1mM CdCl2，诱导四膜虫表达；
[0052] 2)对于分泌型表达的工程四膜虫，诱导3小时后，收集虫液800×g离心2分钟，取上清经
硫酸铵沉淀、
透析和Ni-NTA
树脂纯化后即可得到纯的重组蛋白。
[0053] 重组蛋白大量诱导后，收集上清，重组蛋白经镍柱纯化后，得到较纯的单一目的条带，详见
附图1，其中M泳道表示蛋白Marker，1、2、3泳道分别表示50mM、100mM、250mM咪唑洗脱得到的纯化样品。
[0054] 9、重组蛋白多克隆抗体制备：
[0055] 对新西兰兔进行四次免疫，每次间隔2周，首免疫苗含
抗原蛋白500mg，与弗氏完全佐剂1∶1混匀乳化后进行背部多点注射，加强免疫抗原蛋白量减半，与弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行背部多点注射，最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰雄兔进行颈动脉
采血室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心30min，后小心吸取上层血清，56℃处理30min 以灭活补体，用protein A柱子进行纯化，分装后-20℃保存。首免之前采血作为阴性对照。
[0056] 10、ELISA测定多抗效价：
[0057] 1)用包被液稀释纯化的蛋白抗原至20μg/ml，在96孔酶标板中每孔加入100μl，4℃过夜包被；
[0058] 2)拍干孔中的液体，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
[0059] 3)每孔中加入200μl封闭液，室温封闭1h；
[0060] 4)弃去孔中封闭液，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
[0061] 5)将多克隆抗体与PBS按照1∶10比例进行连续的梯度稀释，每孔中加入100μl，设置3个平行，以PBS作为阴性对照组，37℃孵育2h；
[0062] 6)弃去孔中一抗，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
[0063] 7)每孔加入100μl稀释的二抗，避光，37℃孵育2h；
[0064] 8)弃去孔中二抗，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
[0065] 9)配制新鲜底物液，每孔中加入100μl，避光，37℃孵育20min；
[0066] 10)每孔中加入50μl终止液，用酶标仪检测450nm
波长时各孔的吸光度值，标准为P/N≥2.1 或P≥N+3D。
[0067] 结果表明，多克隆抗体效价为1∶100000，可用于后续研究。
[0068] 11、Western blotting检测多抗的特异性：
[0069] (1)刺激隐核虫总蛋白提取
[0070] 1)在液氮中
研磨刺激隐核虫幼虫，直至成为匀浆状态。
[0071] 2)加入蛋白裂解液，冰浴30-45min。
[0072] 3)用
超声波破碎仪对样品进行超声破碎，15s，间隔15s，重复两次。
[0073] 4)4℃，14000g离心10-20min。取上清，分装后保存于-80℃。
[0074] (2)多抗的特异性检测
[0075] 1)抗原蛋白进行SDS-PAGE电泳，完成后，将凝胶按
照蛋白泳道切成适当大小，置于转膜缓冲液进行浸泡。
[0076] 2)按照蛋白凝胶大小剪裁1张
硝酸纤维素膜(NC膜)以及2张转膜专用
滤纸，置于转膜缓冲液中进行浸泡。
[0077] 3)按照
棉花垫、滤纸、蛋白凝胶、NC膜、滤纸、棉花垫的顺序铺设“三明治”转膜结构，除去气泡。凝胶向着负极，NC膜向着正极，用夹子加紧。
[0078] 4)将夹子放入转印槽中，加入转膜缓冲液，80mA恒流转印1h。
[0079] 5)转印结束后，取出NC膜，放入10％
脱脂奶粉封闭液中，4℃封闭过夜或室温封闭1h。蛋白凝胶
染色。
[0080] 6)封闭结束后，弃去封闭液，用TBST洗涤3次，每次5min。
[0081] 7)加入稀释后的一抗，室温孵育1h。
[0082] 8)弃去一抗稀释液，TBST洗涤3次，每次5min。
[0083] 9)加入稀释后的二抗，室温孵育1h。
[0084] 10)弃去二抗稀释液，洗涤3次，每次5min。
[0085] 11)加入
化学发光显色试剂盒A液和B液各1mL，室温2min，使用化学发光仪进行曝光及拍照。
[0086] 检测结果如图2所示，其中泳道M表示Marker，泳道1为刺激隐核虫全蛋白。由此可知，该多克隆抗体可识别刺激隐核虫天然蛋白(约为32kDa)。
[0087] 12、刺激隐核虫免疫荧光：
[0088] 使用1％甲
醛灭活刺激隐核虫幼虫，800g离心2min收集虫体，加入免疫荧光固定液在室温下固定15min，使用PBS洗3次，加入一抗(即制备的表面蛋白C1多克隆抗体)4℃过夜，使用PBS洗3次，加入二抗室温2h，使用PBS洗3次，观察。图3所示为多抗识别的刺激隐核虫。
附图说明
[0089] 图1为表面蛋白C1重组蛋白纯化结果。
[0090] 图2为抗表面蛋白C1多克隆抗体的特异性检测结果。
[0091] 图3为表面蛋白C1多克隆抗体的细胞免疫荧
光标记结果。
具体实施方式
[0092] 下面结合具体
实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行
修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0093] 一种刺激隐核虫表面蛋白C1多克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：
[0094] 1、刺激隐核虫传代：
[0095] 采用的刺激隐核虫分离于广东省惠州市大亚湾某卵形鲳鲹养殖网箱，对体表及鳃出现明显症状的卵形鲳鲹进行镜检，确认体表及鳃上的滋养体形态与刺激隐核虫报道一致。将10尾感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹置于500L海水中暂养，2天后的晚上转到特制的收虫器，次日早晨收集从鱼体脱落的包囊。包囊于灭菌海水中充气培养60小时左右可孵化出大量幼虫，将孵化2小时内的幼虫以20000/尾再次感染卵形鲳鲹，以此建立稳定的刺激隐核虫传代系统。
[0096] 2、斜带石斑鱼的暂养：
[0097] 所用斜带石斑鱼均购自广东省大亚湾水产试验中心，整个养殖过程中无刺激隐核虫感染记录。实验鱼暂养2周，水温为25度，每天换水量为50％，感染前每天投喂体重4％的养殖饲料。试验前，随机抽取10尾鱼进行镜检和阻动试验以确认实验鱼无刺激隐核虫及其他体表寄生虫感染。
[0098] 3、刺激隐核虫总RNA的提取：
[0099] 提取刺激隐核虫的总RNA，具体操作步骤如下：
[0100] 1)从-80℃冰箱中取出样品，置于冰上，每个样品不超过30mg，快速加入1ml MagZol Reagent，用组织匀浆机快速匀浆。
[0101] 2)室温放置5min让组织充分裂解。
[0102] 3)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。
[0103] 4)4℃，12,000×g离心15min。
[0104] 5)小心转移上清液至新的离心管中，加入1.5倍体积无水乙醇后混匀。
[0105] 6)把HiPure RNA Mini Column装在2ml收集管中，转移混合液至柱子中，8,000×g离心 30s。
[0106] 7)倒弃滤液把柱子装回收集管中，加入用乙醇稀释的650μl Buffer RW2至柱子中，8,000 ×g离心30s。
[0107] 8)重复上步骤一次。
[0108] 9)倒弃滤液把柱子装回收集管中10,000×g离心空柱2min甩干柱子的基质。
[0109] 10)将柱子转移至1.5ml离心管中，加入45μl RNase Free Water至柱子的膜中央，室温静置2 min，10,000×g离心1min。
[0110] 11)丢弃RNA柱子，电泳检测RNA的完整性，OD A260/280测定RNA浓度。剩余样品保存-80℃。
[0111] 4、一链cDNA的合成：
[0112] 1)按以下体系添加试剂：Total RNA，1μg；DNase I buffer，1μl；DNase I，1μl；最后加RNase free water至10μl，混匀，短暂离心，37℃恒温孵育30min，以去除基因组DNA污染；
[0113] 2)反应结束后向上述体系中加入1μl EDTA(25mM)，振荡混匀后，65℃恒温孵育10min，以灭活DNase I；
[0114] 3)将反应产物迅速转移至冰上冷却；
[0115] 4)cDNA合成：反应试剂配制体系如下：第一步变性的RNA溶液，11μl；Oligo(dT）20(10 pmol/μl)，1μl；5×RT Buffer，4μl；dNTP Mixture(各10mM)，2μl；RNase Inhibitor(10U/μl)， 1μl；ReverTra Ace，1μl；Total Volume 20μl。反应程序：42℃，30min；99℃，5min；4℃， 5min。反应产物转到-20℃保存备用。
[0116] 5、表面蛋白C1基因开放阅读框(ORF)的克隆：
[0117] 结合刺激隐核虫转录组数据的全长序列，分别设计了用于扩增刺激隐核虫表面蛋白C1 基因ORF的引物(5’到3’)：C1 F，ATGTAAAAGATTTTAGCTATTTTATT；C1 R， TCATTTGAATAAAAGAGCAAAG。
[0118] 模板使用刺激隐核虫一链cDNA，引物使用C1 F/R，PCR反应体系如下：一链cDNA，2μl； C1 F(10μM)，2μl；C1R(10μM)，2μl；PrimeSTAR MAX mix，25μl；加H2O至50μl。PCR 反应程序为：98℃，10s；58℃，15s；72℃，2min，35个循环，最后72℃延伸10min。用 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
[0119] 目的条带使用上述回收试剂盒回收，产物与克隆载体pEASY-Blunt Cloning Vector进行连接，连接反应体系如下：PCR回收产物，4μl；pEASY-Blunt Cloning Vector，1μl。
[0120] 混匀后，于25℃连接30min后转化感受态细胞。从-80℃取出Trans1-T1感受态细胞50μl 置于冰上，待感受态细胞刚化开时加入上述所有连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入1mL LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h，取100μl 菌液涂布于含有X-gal、IPTG和卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
[0121] 次日挑取白色单菌落于10μl无菌水中，漩涡混匀。取1μl混合液为模板，进行阳性克隆鉴定。反应体系如下：菌液，1μl；Primer M13F(10μM)，1μl；Primer M13R(10μM)，1μl；Premix Taq，25μl；加H2O至50μl。PCR反应条件为：95℃预变性10min，(94℃，30s：55℃，30s；
72℃，3min)×35个循环，最后72℃延伸10min。电泳鉴定阳性克隆，随机挑取3个阳性克隆保种并送到公司测序。
[0122] 6、四膜虫rDNA表达载体的构建：
[0123] 1)候选基因的结构特征分析
[0124] 利用软件对表面蛋白C1基因进行以下分析：预测蛋白序列、限制性酶切位点分析、与四膜虫密码子使用偏好性差异分析、信号肽序列分析和GPI锚定位点分析。
[0125] 2)表面蛋白C1基因的改造
[0126] 以目的基因cDNA为模板通过PCR对候选基因进行如下改造：在两端设计特异性酶切位点(BamH和XhoI)、去除GPI-Anchor结构、增加标签、设计TEV位点等。
[0127] 3)候选基因与穿梭载体的连接
[0128] 把改造后的候选基因和分泌型穿梭载体(pTIEV4)进行双酶切(酶切位点为BamH和 XhoI)，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定。
[0129] 4)表达载体的构建
[0130] 把上述穿梭载体和pD5H8载体进行单酶切(酶切位点为NotI)，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定，成功构建四膜虫rDNA表达载体。
[0131] 7、四膜虫rDNA表达载体的转化和阳性虫株筛选：
[0132] 1)四膜虫的准备
[0133] 用NEFF培养基分别培养两种交配型的四膜虫(II型和VII型)，当细胞浓度达到105个/ml 以上时转入饥饿液中震荡培养7-14小时，然后静置培养9.5hr，如果镜检发现细胞配对比率达到80％以上，且在荧光显微镜下观察发现新的大核原基已经形成，就可以进行转化；
[0134] 2)转化
[0135] 将浓缩的表达载体(浓度＞1ug/ul)包被金颗粒，利用BIO-RAD PDS-1000台式基因枪把表达载体转入四膜虫的大核原基中；
[0136] 3)筛选
[0137] 将转化后的细胞培养在NEFF培养基中，依次加入1000×～100×的巴龙霉素进行梯度筛选，最终获得带有9000-10000个外源基因的工程四膜虫。
[0138] 8、工程四膜虫的诱导表达和重组蛋白的分离纯化：
[0139] 1)当细胞浓度达到105个/ml以上时800×g离心2分钟弃上清，加入1mM CdCl2，诱导四膜虫表达；
[0140] 2)对于分泌型表达的工程四膜虫，诱导3小时后，收集虫液800×g离心2分钟，取上清经硫酸铵沉淀、透析和Ni-NTA树脂纯化后即可得到纯的重组蛋白。
[0141] 重组蛋白大量诱导后，收集上清，重组蛋白经镍柱纯化后，得到较纯的单一目的条带，详见附图1，其中M泳道表示蛋白Marker，1、2、3泳道分别表示50mM、100mM、250mM咪唑洗脱得到的纯化样品。
[0142] 9、重组蛋白多克隆抗体制备：
[0143] 对新西兰兔进行四次免疫，每次间隔2周，首免疫苗含抗原蛋白500mg，与弗氏完全佐剂1∶1混匀乳化后进行背部多点注射，加强免疫抗原蛋白量减半，与弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行背部多点注射，最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心30min，后小心吸取上层血清，56℃处理30min 以灭活补体，用protein A柱子进行纯化，分装后-20℃保存。首免之前采血作为阴性对照。
[0144] 10、ELISA测定多抗效价：
[0145] 1)用包被液稀释纯化的蛋白抗原至20μg/ml，在96孔酶标板中每孔加入100μl，4℃过夜包被；
[0146] 2)拍干孔中的液体，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
[0147] 3)每孔中加入200μl封闭液，室温封闭1h；
[0148] 4)弃去孔中封闭液，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
[0149] 5)将多克隆抗体与PBS按照1∶10比例进行连续的梯度稀释，每孔中加入100μl，设置3个平行，以PBS作为阴性对照组，37℃孵育2h；
[0150] 6)弃去孔中一抗，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
[0151] 7)每孔加入100μl稀释的二抗，避光，37℃孵育2h；
[0152] 8)弃去孔中二抗，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
[0153] 9)配制新鲜底物液，每孔中加入100μl，避光，37℃孵育20min；
[0154] 10)每孔中加入50μl终止液，用酶标仪检测450nm波长时各孔的吸光度值，标准为P/N≥2.1 或P≥N+3D。
[0155] 结果表明，多克隆抗体效价为1∶100000，可用于后续研究。
[0156] 11、Western blotting检测多抗的特异性：
[0157] (1)刺激隐核虫总蛋白提取
[0158] 1)在液氮中研磨刺激隐核虫幼虫，直至成为匀浆状态。
[0159] 2)加入蛋白裂解液，冰浴30-45min。
[0160] 3)用
超声波破碎仪对样品进行超声破碎，15s，间隔15s，重复两次。
[0161] 4)4℃，14000g离心10-20min。取上清，分装后保存于-80℃。
[0162] (2)多抗的特异性检测
[0163] 1)抗原蛋白进行SDS-PAGE电泳，完成后，将凝胶按照蛋白泳道切成适当大小，置于转膜缓冲液进行浸泡。
[0164] 2)按照蛋白凝胶大小剪裁1张硝酸
纤维素膜(NC膜)以及2张转膜专用滤纸，置于转膜缓冲液中进行浸泡。
[0165] 3)按照棉花垫、滤纸、蛋白凝胶、NC膜、滤纸、棉花垫的顺序铺设“三明治”转膜结构，除去气泡。凝胶向着负极，NC膜向着正极，用夹子加紧。
[0166] 4)将夹子放入转印槽中，加入转膜缓冲液，80mA恒流转印1h。
[0167] 5)转印结束后，取出NC膜，放入10％脱脂奶粉封闭液中，4℃封闭过夜或室温封闭1h。蛋白凝胶染色。
[0168] 6)封闭结束后，弃去封闭液，用TBST洗涤3次，每次5min。
[0169] 7)加入稀释后的一抗，室温孵育1h。
[0170] 8)弃去一抗稀释液，TBST洗涤3次，每次5min。
[0171] 9)加入稀释后的二抗，室温孵育1h。
[0172] 10)弃去二抗稀释液，洗涤3次，每次5min。
[0173] 11)加入化学发光显色试剂盒A液和B液各1mL，室温2min，使用化学发光仪进行曝光及拍照。
[0174] 检测结果如图2所示，其中泳道M表示Marker，泳道1为刺激隐核虫全蛋白。由此可知，该多克隆抗体可识别刺激隐核虫天然蛋白(约为32kDa)。
[0175] 12、刺激隐核虫免疫荧光：
[0176] 使用1％甲醛灭活刺激隐核虫幼虫，800g离心2min收集虫体，加入免疫荧光固定液在室温下固定15min，使用PBS洗3次，加入一抗(即制备的表面蛋白C1多克隆抗体)4℃过夜，使用PBS洗3次，加入二抗室温2h，使用PBS洗3次，观察。图3所示为多抗识别的刺激隐核虫。
