用于在细胞中标记蛋白质或其它生物分子的基于金属螯合的荧光探针
阅读：1029发布：2020-06-02
专利汇可以提供用于在细胞中标记蛋白质或其它生物分子的基于金属螯合的荧光探针专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用于使活细胞中的细胞内 蛋白质 或其它 生物 分子成像 以监控生物事件的基于金属螯合的 荧光 探针。所述探针可以标记带多组 氨 酸标签的蛋白质或生物分子，同时还能够共价结合到标记的蛋白质以进一步分析蛋白质。，下面是用于在细胞中标记蛋白质或其它生物分子的基于金属螯合的荧光探针专利的具体信息内容。
1.用于靶向生物样品中的生物分子的荧光探针，其包含产生荧光信号的荧光团报道部分、螯合用于与编码到靶蛋白质的多组氨酸标签配位的金属离子的金属-螯合部分、连接所述荧光团报道部分和金属-螯合部分的接头，和充当到靶蛋白质上的锚点的光反应性交联剂，其特征在于所述光反应性交联剂为荧光团的共轭体系的一部分。
2.根据权利要求1的荧光探针，其中在吸收光能之后所述报道部分的荧光信号具有
400-800nm的波长。
3.根据权利要求1-2中任一项的荧光探针，其中所述报道部分包含香豆素-衍生物、荧光素-衍生物或若丹明-衍生物。
4.根据权利要求1-2中任一项的荧光探针，其中所述金属-螯合部分包含多齿配体。
5.根据权利要求4的荧光探针，其中所述多齿配体包含次氮基三乙酸(NTA)或亚氨基二乙酸(IDA)。
6.根据权利要求1-2和5中任一项的荧光探针，其中所述金属-螯合部分包含选自镍(II)、钴(II)和铜(II)金属离子的螯合金属离子。
7.根据权利要求1-2和5中任一项的荧光探针，其中所述荧光团报道部分和所述金属-螯合部分之间的接头为烃链或肽序列。
8.根据权利要求1-2和5中任一项的荧光探针，其中所述光反应性交联剂包含芳基叠氮化物、双吖丙啶或二苯甲酮。
9.根据权利要求8的荧光探针，其中在所述荧光探针与生物样品中带多组氨酸标签的蛋白质配位之后，当经受紫外辐射5-15分钟时，所述光反应性交联剂呈现光激活。
10.根据权利要求9的荧光探针，其中所述紫外辐射的范围为340nm-380nm。
11.根据权利要求1-2、5和9-10中任一项的荧光探针，其中选自镍(II)、钴(II)和铜(II)离子的金属离子的螯合产生金属-螯合探针的荧光猝灭。
12.根据权利要求1-2、5和9-10中任一项的荧光探针，其中所述探针以1:1摩尔比与金属离子配位。
13.根据权利要求1-2、5和9-10中任一项的荧光探针，其中标记靶生物分子通过经由所述探针的金属-螯合与编码到所述生物分子的多组氨酸标签配位而实现。
14.根据权利要求13的荧光探针，其中当所述金属-螯合荧光探针在pH 6-8的缓冲液中标记带多组氨酸标签的蛋白质时，所述金属-螯合荧光探针呈现荧光信号的提高并实现所述提高。
15.根据权利要求14的荧光探针，其中当所述金属-螯合荧光探针在4℃-40℃的温度下标记带多组氨酸标签的蛋白质时，所述金属-螯合荧光探针呈现荧光信号的提高。
16.根据权利要求15的荧光探针，其中带多组氨酸标签的蛋白质的标记对过夜孵育稳定。
17.根据权利要求1-2、5、9-10和14-16中任一项的荧光探针，其中带多组氨酸标签的蛋白质的标记在所述蛋白质用90℃-110℃的温度变性之后保持。
18.根据权利要求16的荧光探针，其中带多组氨酸标签的蛋白质的荧光标记能够在非变性或变性凝胶电泳之后在凝胶上显现。
19.标记带多组氨酸标签的蛋白质的方法，其包括：
通过荧光探针的金属螯合将多组氨酸标签编码的蛋白质与靶生物分子配位，所述荧光探针各自包含在吸收光能之后产生荧光信号的荧光团报道部分、螯合用于与编码到靶蛋白质的多组氨酸标签配位的金属离子的金属-螯合部分、连接所述荧光团和金属-螯合部分的接头和充当到靶蛋白质上的锚点的光反应性交联剂，其特征在于所述光反应性交联剂为荧光团的共轭体系的一部分。
20.根据权利要求19的方法，其中在吸收光能之后所述荧光探针产生具有400-800nm的波长的荧光信号。
21.根据权利要求19-20中任一项的方法，其中带多组氨酸标签的蛋白质的标记在包含细菌细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物组织、植物细胞或植物组织的生物样品中实现。
22.根据权利要求21的方法，其中所述标记在4℃-40℃的温度下进行。
23.根据权利要求21的方法，其还包括通过缓冲液进行洗涤。
24.根据权利要求19-20和22-23中任一项的方法，其还包括进行共焦成像。
25.根据权利要求21的方法，其中引入所述荧光探针不损害所述生物样品。
用于在细胞中标记蛋白质或其它生物分子的基于金属螯合的
荧光探针
[0001] 发明背景
[0002] 鉴别和分子水平理解整个生命过程期间的相互作用化学反应在基本生物研究和医药科学中具有很大价值。荧光成像已长期用于这个目的，原因是其允许我们实时且以高空间分辨率探查活细胞和生物体包括人类中的事件。使用小荧光探针的位点特异性化学标记是研究细胞和组织中的生物事件的有力和吸引人的技术，且因此用于探查疾病的机理。具体而言，基于金属螯合的荧光标记具有高选择性、小尺寸和共价标记的优点。
[0003] 在现代生物化学中，将多组氨酸标签基因编码到POI为蛋白质化学中稳健的技术。His标签基本上是指具有寡组氨酸的短肽基序，且六个组氨酸的序列为最常见的His标签。
2+ 2+ 2+
His标签的组氨酸的咪唑环可以与各种过渡金属例如Ni 、Cu 、Zn 等相互作用。因此，通常发现His标签与过渡金属复合物例如Ni2+-次氮基三乙酸(NTA)复合物相互作用，由此有助于使用固定化金属亲和层析法(IMAC)纯化过表达的蛋白质。该相互作用组合亦已广泛应用于位点特异性蛋白质标记，这说明了对所报道的广泛的现有带寡组氨酸-标签的蛋白质库的相容性，且His标签的基因编码是灵活的，其中其可经基因工程改造到用于标记的蛋白质靶标的末端或内部位点(Soh, N. Sensors 8, 1004-1024 (2008)；Kapanidis, A. N., Ebright, Y. W. & Ebright, R. H. J. Am. Chem.Soc. 123, 12123-12125(2001))。
2+ 2+ 2+
His标签的组氨酸的咪唑环可以与各种过渡金属例如Ni 、Cu 、Zn 等相互作用。因此，通常发现His标签与过渡金属复合物例如Ni2+-次氮基三乙酸(NTA)复合物相互作用，由此有助于使用固定化金属亲和层析法(IMAC)纯化过表达的蛋白质。该相互作用组合亦已广泛应用于位点特异性蛋白质标记，这说明了对所报道的广泛的现有带寡组氨酸-标签的蛋白质库的相容性，且His标签的基因编码是灵活的，其中其可经基因工程改造到用于标记的蛋白质靶标的末端或内部位点(Soh, N. Sensors 8, 1004-1024 (2008)；Kapanidis, A. N., Ebright, Y. W. & Ebright, R. H. J. Am. Chem.Soc. 123, 12123-12125(2001))。
[0004] 最成熟和广泛使用的基于金属(或基于类金属)的小分子荧光探针为F1AsH或其类似物，例如ReAsH和SplAsH (Griffin, B. A., Adams, S. R. & Tsien，R. Y. Science 281，269-272 (1998)； Hoffmann，C.等. Nat. Protocols 5，1666-1677 (2010))。Vogel在
2004公开了用于带多组氨酸标签的蛋白质的另外两种典型的小荧光传感物，其具有选择性、快速和可逆的金属螯合NTA探针，而Auer在2008合成了不可逆的金属螯合NTA探针(Guignet，E. G.，Hovius，R.& Vogel，H. Nat. Biotechno1. 22，440-444 (2004)； Hintersteiner，M.等. ChemBioChem 9, 1391-1395 (2008))。大多数其它组氨酸标记探针以相同方式发现，但仅报道标记细胞表面上的蛋白质。业已进行广泛研究，以仅在穿透肽的存在下且历时30分钟以上的孵育时间使用小分子荧光探针使活细胞内的带CysHis6-标签(CH6-标签)的蛋白质成像(Uchinomiya，S.，Nonaka，H.，Wakayama，S.，Ojida，A.& Hamachi，I.Chem.Commun.49，5022-5024 (2013))，遗憾的是，没有这样的探针可以直接进入细胞且标记细胞内蛋白质。
2004公开了用于带多组氨酸标签的蛋白质的另外两种典型的小荧光传感物，其具有选择性、快速和可逆的金属螯合NTA探针，而Auer在2008合成了不可逆的金属螯合NTA探针(Guignet，E. G.，Hovius，R.& Vogel，H. Nat. Biotechno1. 22，440-444 (2004)； Hintersteiner，M.等. ChemBioChem 9, 1391-1395 (2008))。大多数其它组氨酸标记探针以相同方式发现，但仅报道标记细胞表面上的蛋白质。业已进行广泛研究，以仅在穿透肽的存在下且历时30分钟以上的孵育时间使用小分子荧光探针使活细胞内的带CysHis6-标签(CH6-标签)的蛋白质成像(Uchinomiya，S.，Nonaka，H.，Wakayama，S.，Ojida，A.& Hamachi，I.Chem.Commun.49，5022-5024 (2013))，遗憾的是，没有这样的探针可以直接进入细胞且标记细胞内蛋白质。
[0005] 如上所述，用于蛋白质标记的基于小分子的荧光探针已长期用于生物医药和临床科学，然而这些探针的差的膜渗透性阻止其应用。几种特别基于螯合的这样的探针业已上市(例如Invitrogen®的FlAsH、ReAsH和Sp1AsH)。所有这些为双砷荧光探针，其可以跨过细胞膜以遗传标记四半胱氨酸融合的目的蛋白质。然而小的有机化合物，1，2-乙二硫醇(EDT)必须与探针协同使用以提高标记率且降低背景。已知砷对人类有毒，而且还是环境污染物。所述的双砷探针的合成包括大量采用高毒性的汞和砷，导致严重的环境问题。而且，在氧化环境中，特异性标记是困难的，由于还原形式的四半胱氨酸基序可易于转化成氧化形式。相比之下，组氨酸选择大量聚集在特别且重要的蛋白质中，且多组氨酸标签用于蛋白质纯化。
在细胞生物学和生物医药研究中，四半胱氨酸基序并不像多组氨酸标签一样普遍而经基因融合到蛋白质(Rowinska-Zyrek，M.，Witkowska，D.，Potocki，S.，Remelli，M.& Kozlowski，H.New J.Chem.37, 58-70 (2013))。
在细胞生物学和生物医药研究中，四半胱氨酸基序并不像多组氨酸标签一样普遍而经基因融合到蛋白质(Rowinska-Zyrek，M.，Witkowska，D.，Potocki，S.，Remelli，M.& Kozlowski，H.New J.Chem.37, 58-70 (2013))。
[0006] 概述
[0007] 当前，不存在金属可调节探针，其对于标记蛋白质的显现和后续鉴别实现高通量。文中所述为基于金属螯合的荧光探针，其用于使活细胞和组织中的细胞内蛋白质或其它生物分子成像由此监控其生物事件并研究疾病机理。通过缀合各种荧光团到金属-螯合剂和光反应性交联剂提供具有蓝光、红光和绿光的至少三种不同发射的一系列探针。通过与不同金属离子配位，金属-螯合探针充当潜在的探针以标记带多组氨酸标签的蛋白质/生物分子。而且，探针还能够共价结合到标记的蛋白质，使得能够进一步鉴别蛋白质。
[0008] 与使用有毒砷且需要引入四半胱氨酸的最广泛使用的当前的探针(F1AsH)相比，我们的探针使用通过含氮配体螯合的无毒金属例如镍(Il)以使带多组氨酸-标签的蛋白质成像，其更快速跨过细胞膜且毒性较小。更重要地，考虑到多组氨酸标签在生物化学和生物医药研究中的广泛用途，鉴于大的现有带多组氨酸标签的蛋白质库，可更方便地使用所述探针。本发明涉及检测和显现细胞中的生物分子。其适用于容易且快速追踪或追随生物化学事件，包括细胞中的蛋白质。该制备是简单的且因此低成本，且该探针可以避免使用砷和四半胱氨酸(其可以影响细胞中的氧化还原环境)。取而代之地，其它无毒金属离子例如镍(Il)掺入到当前的探针中，所述探针靶向经基因编码到蛋白质或其它生物分子的多组氨酸标签。这种探针因此具有替换或至少补充当前使用最多的种类的探针例如F1AsH (ReAsH)的潜在性。
[0010] 在一方面，提供了用于靶向生物样品特别是活的样品中的生物分子的荧光探针。所述荧光探针包含产生荧光信号的荧光团报道部分、螯合用于与编码到靶蛋白质的多组氨酸标签配位的金属离子的金属-螯合部分、连接所述荧光团报道部分和金属-螯合部分的接头和充当到靶蛋白质上的锚点以激增标记亲和力和稳定性的光反应性交联剂。
[0012] 在一些实施方案中，所述金属-螯合部分包含多齿配体。所述多齿配体包含次氮基三乙酸(NTA)和亚氨基二乙酸(IDA)。所述金属-螯合部分还包含含有镍(II)、钴(II)和铜(II)金属离子的螯合金属离子。
[0013] 在一些实施方案中，所述荧光团和所述金属-螯合部分之间的接头设计为烃链或肽序列。
[0014] 在一些实施方案中，所述光反应性交联剂包含芳基叠氮化物、双吖丙啶或二苯甲酮。所述光反应性交联剂包含或者不包含作为荧光团的共轭体系的一部分。所述光反应性交联剂可以呈现光激活，所述光激活通过在荧光探针与生物样品中的带多组氨酸标签的蛋白质配位之后紫外辐射约5-约15分钟实现。通常所述紫外辐射的范围为约340nm-约380nm。
[0015] 在一些实施方案中，包括镍(II)、钴(II)和铜(II)离子的金属离子的螯合产生金属-螯合探针的荧光猝灭。
[0016] 在一些实施方案中，所述探针以1:1摩尔比与金属离子配位。
[0017] 在一些实施方案中，标记靶生物分子通过经由探针的金属-螯合与编码到生物分子的多组氨酸标签配位实现。当所述金属-螯合荧光探针在pH 6-8的缓冲液(可以在约4℃-约40℃的温度下)中标记带多组氨酸标签的蛋白质时，所述金属-螯合荧光探针呈现荧光信号的提高(“接通”响应)并实现所述提高。在一个实施方案中，所述标记过程花费约5-30分钟。在另一个实施方案中，所述标记对于过夜孵育稳定。
[0018] 在一个实施方案中，带多组氨酸标签的蛋白质的标记在所述蛋白质用约90℃-约110℃的温度变性之后保持。
[0019] 在其它实施方案中，带多组氨酸标签的蛋白质的荧光标记能够在非变性或变性凝胶电泳之后在凝胶上显现。
[0020] 在另一方面，提供了标记带多组氨酸标签的蛋白质的方法。所述方法包括：通过荧光探针的金属-螯合将多组氨酸标签编码的蛋白质与靶生物分子配位，所述荧光探针包含在吸收光能之后产生荧光信号的荧光团报道部分、螯合用于与编码到所述靶蛋白质的多组氨酸标签配位的金属离子的金属-螯合部分、连接所述荧光团和金属-螯合部分的接头和充当到靶蛋白质上的锚点以激增标记亲和力和稳定性的光反应性交联剂。
[0021] 在一些实施方案中，所述荧光探针产生在吸收光能之后具有约400-约800nm的波长的荧光信号。
[0023] 在一些实施方案中，标记方法在约4℃-约40℃的温度下进行。标记可以花费约5-约60分钟。
[0024] 在其它实施方案中，所述方法包括通过缓冲液洗涤和/或进行共焦成像。
[0025] 在一些实施方案中，具有图l中表示的化学结构的荧光剂包含：
[0026] (a) 具有确定的共轭体系作为荧光团的环状部分，且发射范围为400-800nm；
[0027] (b) 包含多齿配体的金属-螯合部分，包括但不限于螯合金属离子的含羧酸配体，例如次氮基三乙酸(NTA)和亚氨基二乙酸(IDA)；
[0028] (c) 金属离子，其与金属-螯合部分部分配位，包括但不限于，镍(II)、钴(II)和铜(II)离子中的一种或多种；
[0029] (d) 所述荧光团和所述金属-螯合部分之间的接头，其可以包括短烃链或短肽序列；和/或
[0030] (e) 光反应性交联剂，包括但不限于，芳基叠氮化物、双吖丙啶和二苯甲酮，其可以是或可以不是荧光团的共轭体系的一部分。
[0031] 本发明提供有效标记细胞内(和细胞外)带多组氨酸标签的蛋白质/生物分子，同时探针还能够共价结合到标记的蛋白质以进一步鉴别蛋白质。在加入生物样品之后，部分-配位的金属离子可以引导荧光剂以标记带多组氨酸标签的蛋白质，而接近地所述光反应性交联剂可以通过340-380nm的UV辐射光激活以产生到靶蛋白质的共价键。
[0032] 在一些实施方案中，本发明的优点包括与常规方法中超过30分钟相比，带多组氨酸标签的蛋白质在10分钟或更少时间(例如9分钟)快速标记。优点还可以包括标记带多组氨酸标签的靶蛋白质会产生“接通”响应，这增强荧光剂的荧光强度超过5倍、超过10倍且甚至高达13倍。还有，在一些实施方案中，所公开的标记方法不损害生物样品或其组分。
[0034] 图1说明荧光剂设计的示意图。
[0035] 图2说明金属-螯合的NTA-AC和NTA-AF的结构。
[0036] 图3A显示展示使用Ni-NTA-AC细胞内标记带His6-标签的蛋白质(顶部)和NTA-AC的合成方案(底部)的示意图。探针快速进入细胞并靶向具有显著荧光“接通”的带His6-标2+
签的蛋白质。图3B显示在加入Ni (作为NiSO4)之后NTA-AC (5μM)的标准化荧光变化。注意到在Ni2+与NTA-AC螯合之后荧光降低约70%。图3C显示在NTA-AC与Ni2+在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)中络合之后荧光变化(λex=342nm，λem=448nm)的Job's图。NTA-AC和Ni2+的总浓度保持恒定(10μM)。在0.5的Ni2+: NTA-AC摩尔比下观察到最大荧光变化，指示Ni-NTA-AC复
2+
合物以1:1的NTA-AC: Ni 比率形成。
签的蛋白质。图3B显示在加入Ni (作为NiSO4)之后NTA-AC (5μM)的标准化荧光变化。注意到在Ni2+与NTA-AC螯合之后荧光降低约70%。图3C显示在NTA-AC与Ni2+在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)中络合之后荧光变化(λex=342nm，λem=448nm)的Job's图。NTA-AC和Ni2+的总浓度保持恒定(10μM)。在0.5的Ni2+: NTA-AC摩尔比下观察到最大荧光变化，指示Ni-NTA-AC复
2+
合物以1:1的NTA-AC: Ni 比率形成。
[0037] 图4A说明NTA-AC的1H (4-A)且图4B说明13C (4-B)NMR光谱。
[0038] 图5说明NTA-AC的ESI-MS光谱。
[0039] 图6说明NTA-AC的激发(实线)和发射(虚线)光谱，且λex=342nm和λem=448nm。
[0040] 图7A显示在加入His-XPA122 (10μM)之后在不同时间间隔下Ni-NTA-AC (1μM)的荧光光谱。插图：在结合到His-XPA122之后Ni-NTA-AC的时间依赖性荧光变化(λem=448nm)。对于Ni-NTA-AC，观察到荧光提高13倍且信号在9分钟达到平稳。图7B显示在各种条件下用His-XPA122孵育的Ni-NTA-AC的标准化荧光。在没有芳基叠氮化物光激活(在黑暗下)的情况下，将过量的EDTA (40倍)加到Ni-NTA-AC和His-XPA122的混合物中导致荧光降低了约
60%(由于来自Ni-NTA-AC的Ni2+被EDTA螯合)，这导致探针从His-XPA122解离。相反，在Ni-NTA-AC结合到His-XPA122之后且在芳基叠氮化物光激活之后，加入过量的EDTA将不干扰探针和蛋白质之间的共价键，且荧光稍微提高(30%)归因于从被Ni猝灭恢复的荧光。图7C显示在不同条件下通过等摩尔量Ni-NTA-AC (或Ni-NTA-C)的蛋白质标记(12μΜ)的SDS-PAGE分析。该探针通过Ni结合蛋白质的His-标签，然而芳基叠氮化物部分在光激活之后经由共价键进一步增强结合，因此标记甚至在变性电泳下保持。第1道：His-XPA122；第2道：在过量EDTA (50μΜ)存在下的His-XPA122；第3道：His-XPA122和Ni-NTA-AC (不具有芳基叠氮化物)；第4道：XPA122 (不具有His-标签)。所有样品在4℃下孵育过夜且在凝胶电泳之前通过UV辐射(λ=365nm )10分钟进行芳基叠氮化物的光激活。
60%(由于来自Ni-NTA-AC的Ni2+被EDTA螯合)，这导致探针从His-XPA122解离。相反，在Ni-NTA-AC结合到His-XPA122之后且在芳基叠氮化物光激活之后，加入过量的EDTA将不干扰探针和蛋白质之间的共价键，且荧光稍微提高(30%)归因于从被Ni猝灭恢复的荧光。图7C显示在不同条件下通过等摩尔量Ni-NTA-AC (或Ni-NTA-C)的蛋白质标记(12μΜ)的SDS-PAGE分析。该探针通过Ni结合蛋白质的His-标签，然而芳基叠氮化物部分在光激活之后经由共价键进一步增强结合，因此标记甚至在变性电泳下保持。第1道：His-XPA122；第2道：在过量EDTA (50μΜ)存在下的His-XPA122；第3道：His-XPA122和Ni-NTA-AC (不具有芳基叠氮化物)；第4道：XPA122 (不具有His-标签)。所有样品在4℃下孵育过夜且在凝胶电泳之前通过UV辐射(λ=365nm )10分钟进行芳基叠氮化物的光激活。
[0041] 图8A显示通过考马斯蓝和荧光染色监控的在用不同量(0-10摩尔当量)的Ni-NTA-AC孵育之后通过SDS-PAGE分析蛋白质标记(10μM)，Ni-NTA-AC到His-XPA122的标记效率。图8B显示通过图8A中的SDS-PAGE测定的Ni-NTA-AC到His-XPA122的标记产率。图8C显示在不存在和存在1和2摩尔当量的Ni-NTA-AC的情况下，His-XPA122 (10μΜ)的MALDI-TOF MS光谱。在14981Da的m/z的峰可指定为完整蛋白质(计算值14979Da)且在15549和16100Da的m/z的峰在用Ni-NTA-AC孵育His-XPA122之后出现，对应于分别结合到1和2个探针的蛋白质。由于蛋白质的尺寸比探针的尺寸大得多，假定Ni-NTA-AC掺入His-XPA122呈现对天然蛋白质His-XPA122的离子化效率的可忽略不计的作用，通过比较完整His-XPA122和探针结合的His-XPA122的峰面积而评估标记效率。使用1和2摩尔当量的标记效率分别计算为38%和
62%。
62%。
[0042] 图9显示原核和真核细胞中的蛋白质的Ni-NTA-AC标记。图9A显示不同时间下的Ni-NTA-AC标记的His-RFP-转染细胞。Ni-NTA-AC快速进入细胞且在2分钟内标记细胞内His-RFP蛋白质。图9B显示相对于孵育时间绘制的相对荧光强度的图表。图9C显示在用Ni-NTA-AC(10μΜ)处理30分钟(n=5)之后具有或不具有His-XPA122过表达的大肠杆菌(E. coli)细胞的图像。只有表达带His-标签的蛋白质的细胞显示蓝色荧光。比例尺：5μm。图9D显示在用Ni-NTA-AC (25μΜ)孵育30分钟之后His-XPA122-转染的HeLa细胞的图像。该信号在核中富集，其中定位XPA蛋白质(Kuraoka I, 等. (1996) Mutat Res 362(1)：87-95)。没有转染的HeLa细胞充当对照，显示在相同处理(n=5)下没有荧光。比例尺：10μΜ。图9E显示用于图9D中的共焦成像的细胞的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。第1道：纯化的His-XPA122和Ni-NTA-AC；第2道：没有His-XPAl22转染的HeLa细胞的细胞裂解物；第3道：His-XPAl22转染的HeLa细胞的核提取物。His-XPA122转染细胞的核提取物的蓝带匹配纯化的His-XPA122的带，确定出现带His-标签的蛋白质被细胞中Ni-NTA-AC标记，但不在未转染的细胞中标记。图9F显示在用Ni-NTA-AC(25μM) (n=5)处理之后His-RFP-His-XPA122-转染HeLa细胞的荧光标记的图像。该蛋白质在所有细胞上表达，与使用Ni-NTA-AC的荧光标记相反。蓝色和红色荧光共定位且在重叠图像中显示为紫色。比例尺：10μM。
[0043] 图10显示与野生型(顶部)叶(n=5)相比，来自表达His-BjCHIl的叶绿体转基因烟草叶(底部)的远轴表面的保卫细胞的共焦成像。幼苗(左)在含Ni-NTA-AC的缓冲液(10μΜ)中孵育过夜。野生型烟草充当负对照。比例尺：10μM。
[0044] 图11显示用于原生质体提取的野生型(WT)和His-BjCHI1-表达的4周龄烟草植物和在用Ni-NTA-AC(10μΜ)孵育30-分钟之后来自WT和His-BjCHI1-表达的4周龄烟草植物(n=5)的原生质体的共焦图像。比例尺：10μM。
[0045] 图12说明NTA-AF的合成。
[0046] 图13说明NTA-AF的荧光光谱，展示在496nm的激发最大值同时在518nm的发射最大值。
[0047] 图14说明与考马斯蓝染色相比，带多组氨酸标签的蛋白质His-XPA122与Ni2+-NTA-AF在SDS-PAGE变性凝胶中的荧光标记。
[0048] 图15显示Ni-NTA-AC (1μΜ)对范围为0-10μΜ的XPA122浓度的荧光响应的图表。在相同条件下加入XPA之后在不存在His6标签的情况下，Ni-NTA-AC不显示明显的荧光响应。
[0049] 图16显示NTA-AC (1μΜ)对范围为0-10μΜ的His-XPA122浓度的荧光响应的图表。在相同条件下加入His-XPA122之后在不存在Ni2+的情况下，NTA-AC不呈现任何荧光响应。
[0050] 图17显示通过等温滴定量热法的(A) Ni-NTA-AC和(B) Ni-NTA-C对His-XPA122 (在20mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.4)的结合亲和力。将Ni-NTA-AC和Ni-NTA-C (各自500μΜ)逐滴注射到包含apo-His-XPA122 (35μΜ)的细胞中，且记录每一次注射的结合热。
[0051] 图18显示NTA-C的合成方案的示意图。
[0052] 图19显示NTA-C的13C NMR (125MHz)光谱。
[0053] 图20显示NTA-C的ESI-MS光谱。在m/z 514.5的离子对应于[M-2H++K+] (计算值514.5)。
[0054] 图21显示通过与其衍生物NTA-C比较，NTA-AC的芳基叠氮化物的作用的图表评估。(A) 在加入Ni2+之后NTA-C (5μΜ)的标准化荧光变化。注意到与Ni2+结合到NTA-AC (70%)相比，Ni2+掺入NTA-C导致荧光在较少程度(50%)上猝灭。(B) 在用His-XPA122孵育之后在λem=448nm下NTA-AC的时间-依赖性荧光变化。尽管Ni-NTA-C结合到His-XPA122，但没有观察到明显的荧光接通响应。
[0055] 图22显示在补充Ni-NTA-AC (25μΜ) 2分钟(n=5)之后具有His-RFP-表达的HeLa细胞的共焦图像。注意到蓝色荧光与来自RFP的红色荧光共定位，确定探针进入细胞且标记带His-标签的蛋白质。比例尺：10μM。
[0056] 图23显示在用NTA-AC (25μΜ)或Ni-NTA-AC (25μΜ)处理30分钟(n=5)之后His-RFP-His-XPA122-转染的HeLa细胞的荧光标记的显微镜图像。在细胞内没有观察到蓝色荧光，由于NTA-AC在不存在Ni2+的情况下无法进入细胞。比例尺：10μM。
[0057] 图24为显示通过显微镜成像测定的用不同浓度的Ni-NTA-AC (0，10，25，50，100μΜ)孵育的His-XPA122-表达的大肠杆菌的存活力的图表(n=5)。甚至当100μΜ的Ni-NTA-AC用细胞孵育时，大肠杆菌的存活力达到99% +/－1%。
[0058] 图25显示HeLa细胞中的Ni-NTA-AC的毒性测定的图表。Ni-NTA-AC (25和50μΜ)用HeLa细胞孵育且细胞毒性通过MTT化验测定(n=5)。该探针呈现对HeLa细胞的细胞存活力的可忽略不计作用。
[0059] 图26显示具有考马斯蓝染色和荧光的SDS-PAGE凝胶。具有(第1道)或不具有(第2道) His-XPA122过表达的大肠杆菌细胞在37℃下用Ni-NTA-AC(10μΜ)孵育30分钟，用HEPES缓冲液洗涤，裂解并进行电泳。注意到只有具有His-XPA122过表达的细胞呈现强烈荧光带(对应于 15kDa的分子量，即His-XPA122)，与不具有过表达的大肠杆菌细胞相反。M：蛋~白标准品(marker)。
[0060] 图27说明Ni-NTA-AF的ESI-MS光谱。
[0061] 图28显示COS-7细胞中蛋白质的Ni-NTA-AF标记的共焦成像。His-FP在COS-7细胞中转染并表达，且样品用Ni-NTA-AC(25μΜ)处理(n=3)。蓝色和红色荧光共定位且在重叠图像中显示为紫色。比例尺：10μM。
[0062] 序列概述
[0063] SEQ ID NO: 1为含有BamHI限制位点的用于质粒构建的引物。
[0064] SEQ ID NO: 2为含有XhoI限制位点的用于质粒构建的引物。
[0065] SEQ ID NO: 3为含有BamHI限制位点的用于质粒构建的引物。
[0066] SEQ ID NO: 4为含有Xhol限制位点的用于质粒构建的引物。
[0067] SEQ ID NO: 5为含有Nhel限制位点的用于质粒构建的引物。
[0068] SEQ ID NO: 6为含有BamHI限制位点的用于质粒构建的引物。
[0069] 发明详述
[0070] 定义
[0071] 术语“生物分子”是指通过活的生物体产生的分子。文中所用的实例包括但不限于多肽、蛋白质、核酸和脂质。如文中所用的术语“靶生物分子”是指一种生物分子，即是: (1) 能够将其所附接的实体(例如荧光部分)主动引导到靶区域，例如细胞；或(2) 优先被靶区域被动吸收或夹带在其内。所述靶生物分子可以为小分子，其旨在包括非肽和肽两者。靶基团还可以为大分子，其包括但不限于糖、凝集素、受体、受体的配体、蛋白质例如BSA、抗体、聚(醚)、树状聚合物、聚(氨基酸)等。
[0072] 术语“光反应性交联剂”是指用于在被紫外光或可见光激活之后以不可逆方式标记蛋白质、核酸和其它生物分子的可光激活的反应基团。光反应性交联剂的实例包括，但不限于，芳基叠氮化物、叠氮基-甲基-香豆素、二苯甲酮、蒽醌、某些重氮基化合物、双吖丙啶和补骨脂素衍生物。在某些实施方案中，所述探针在其骨架中具有芳基叠氮化物作为交联剂。术语“芳基叠氮化物”还称为苯基叠氮化物，是指含有与叠氮基直接连接的芳基的化合物。
[0073] 术语“荧光团”是指吸收特定波长的光且重新发射不同且通常更长波长的光的荧光化合物。大多数荧光团为小分子荧光团，表示具有含有结合芳基的确定的共轭体系或π体系的典型的大环状化合物。典型的小荧光团包括氧杂蒽衍生物、香豆素衍生物、荧光素衍生物和BODIPY衍生物等。该标签-标记对策略当然能够受益于化学荧光团的不同选择，且与荧光蛋白质相比，这些荧光化合物的响应时间相对短和稳定。现在选择香豆素和荧光素用于该目的，但各种荧光团可以容易地从商业上获得或通过简单合成获得以用于未来计划。
[0074] 术语“接头”是指用于不同目的的碳链(C)n，文中的“C”是指碳原子。其可以为烃链以提高试剂的亲油性或为肽序列以提高亲水性。接头的合适长度对该目的是重要的。在一些实施方案中使用的例示性连接基团-(C4H8)-使当渗透细胞膜且接近生物分子靶标时由大环状荧光团和螯合剂引起的干扰最小化。连接基团并不限于烷基。“可裂解接头”为具有一个或多个可以由于反应或条件而断裂的可裂解基团的接头。
[0075] 术语“金属螯合”是指金属-螯合部分以提高的稳定性结合金属离子的方式。在一些实施方案中，金属螯合在金属离子和金属螯合部分之间发生，且在金属离子和带多组氨酸标签的蛋白质之间发生，且具有相对较强的亲和力。
[0076] 术语“金属-螯合部分”是指金属离子附接到的部分，其常常为环状或环结构中的多齿配体，其根据尺寸、电荷、配位几何和路易斯酸特征与金属离子配位。金属-螯合部分的实例包括但不限于，次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)和亚氨基二乙酸(IDA)。它们往往用于结合金属以启动金属与蛋白质配位的可利用性。在一些实施方案中，NTA部分螯合镍(II)离子以形成用于位点特异性标记带his-标签的蛋白质的Ni2+-NTA螯合室(compartment)。在一些实施方案中为了更好结果考虑其它螯合配体。
[0077] 术语“辐射”是指这样的过程，通过所述过程使对象暴露到辐射例如紫外、可见光、微波和红外。术语“紫外辐射”是指在特定波长紫外光下的辐射过程。其在消毒、农业，医学和工业领域中具有不同应用。光反应性交联剂在通过紫外光激活之后以不可逆方式标记蛋白质、核酸和其它生物分子。在一些实施方案中，荧光探针用光能或UV光(一般为200-400nm波长)或通常具有340-380nm的波长的UV光激发。
[0078] 术语“多组氨酸标签”是指氨基酸基序常常在蛋白质的N-或C-末端包含至少六个组氨酸((His)n，n≥6)残基。多组氨酸蛋白质的实例包括但不限于，六组氨酸((His)6)和十组氨酸(His)10，其亦是公知的且广泛用于生物化学。
[0079] 术语“共价”是指当它们共享电子对以形成键时原子之间力的稳定平衡。所采用的交联剂可以通过光激活产生以提供靶标的共价连接。自修饰蛋白质融合标签用于通过生物正交反应产生与相应的配体的不可逆结合，由此提供最小背景的显著特异性且确保在变性条件中进一步分析。在一些实施方案中，与靶蛋白质的金属配位提供探针非共价结合到靶标和光反应性交联剂自组装到相应的蛋白质，且随后共价连接将通过样品的光激活实现以进行进一步分离和蛋白质鉴别过程。这样至蛋白质靶标的共价键合用于鉴别蛋白质，在整个变性分离过程中保留荧光标记并允许切除相应的蛋白质以在全蛋白质组中检测。
[0080] 文中的术语“接通”是指非破坏性和即时检测到的荧光增强。在一些实施方案中，金属-螯合探针的荧光在螯合金属离子例如镍(Il)离子之后猝灭。文中的术语“猝灭”时指荧光快速消失，这还称为荧光断开。然而当Ni2+-螯合探针与Ni2+-螯合的带多组氨酸标签的蛋白质混合时，导致荧光强度显著提高。所记录的荧光提高确保接通体系。
[0081] 文中的术语“生理学条件”是指监控可以在具有合适的缓冲溶液的活生物体中出现的外部或内部环境的实验室条件，例如pH 7.2-7.4，温度20-40℃和大气氧浓度。在文中使用一些常见缓冲体系，包括20mM HEPES (4-(2-羟基乙基)-哌嗪乙磺酸)与100mM氯化钠(pH 7.2)、PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)或20mM Tris-HCl (三(羟基甲基)氨基甲烷，pH 7.2)，其在一些实施方案中应用。
[0082] 术语“生物样品”是指在实验室中作为研究的实验体系使用的生物样本。文中所用的实例包括，但不限于，检测、定位和分析细胞中带his-标签的蛋白质的细菌细胞、植物细胞和组织、哺乳动物细胞系和组织。
[0083] 术语“共焦成像”是指用共焦培养皿进行的荧光成像。例如，可以利用具有Plan-Apochromat 63x 1.40NA油浸目镜的Car1 Zeiss LSM700反向共焦显微镜。
[0084] 术语“SDS-PAGE”是指用变性凝胶电泳的蛋白质分离过程。在一些实施方案中，SDS-PAGE使用15%分离胶进行。荧光凝胶成像可以通过来自GE Healthcare的ImageQuant 350和Typhoon 9410系统捕获。变性凝胶可以通过考马斯蓝(和/或蛋白质印迹)染色进行比较。
[0085] 如文中所用的术语“载体分子”是指共价键合到生物或非生物组分的荧光(fluorogenic)或荧光(fluorescent)化合物。这种组分包括但不限于，氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装体、合成聚合物、聚合微粒、生物细胞、病毒及其组合。
[0086] 如文中所用的术语“可检测的响应”是指通过观察或通过仪器可直接或间接检测的信号的变化或出现。通常，可检测的响应为导致波长分布模式或吸光度或荧光强度改变或光散射、荧光寿命、荧光极化或上述参数的组合改变的光学响应。
[0087] 六组氨酸-Ni-NTA体系业已广泛用于蛋白质纯化且全世界存在大量的带His-标签的蛋白质库。研究用于蛋白质在活细胞中成像的这样一种体系提供用于追踪各种细胞事件的许多机会，且对目的蛋白具有最小空间和功能干扰。然而，先前报道的基于Ni-NTA的探针遭受差的膜渗透性且只限于标记膜蛋白质。本发明提供第一个小荧光探针Ni-NTA-AC，其可以快速跨过细胞膜以在各种类型的活细胞中甚至在植物组织中特异性靶向带His6-标签的蛋白质。所述探针提供用于原位分析各种细胞事件的新机会。
[0088] 在一个实施方案中，荧光探针由报道部分(荧光团)、通过接头连接到荧光团的金属-螯合部分和光反应性交联剂构成(图1)。螯合到荧光探针的金属离子引导试剂以标记带多组氨酸标签的蛋白质，而接近地所述光反应性交联剂通过UV辐射光激活以充当靶蛋白质上的第二锚点且因此给荧光标记提供额外的稳定性。这样的锚接的优点在于结合实际上是共价的，因此激增探针的结合亲和力，且标记可以甚至在靶蛋白质变性(其可以破坏金属-螯合部分到多组氨酸标签的金属-配位)之后保持。
[0089] 在一个实施方案中，所述探针包括蓝色香豆素衍生物(7-氨基-4-
[0090] 甲基香豆素-3-乙酸，AMCA)作为荧光团，这说明了其优异的灵敏度和小尺寸。金属-螯合部分次氮基三乙酸(NTA)用于与金属离子部分配位，允许基于到标签的金属配位追踪带多组氨酸标签的蛋白质，其可以分为通用的金属-螯合试剂，且可能与各种硬金属至边界金属离子(路易斯酸)例如Ni2+、Cu2+和Co2+配位(Haas，K. L. & Franz，K. J. Chem. Rev. 109，4921-4960 (2009))，使其相对适用于追踪结合到过渡金属的带多组氨酸标签的蛋白质。荧光剂还具有光反应性交联剂芳基叠氮化物，以不可逆方式锚接到目的靶标上，前提是交联的引发只需要通过365nm的紫外辐射简单光激活 (Hintersteiner，M.等，ChemBioChem
9，1391-1395 (2008))。这样至蛋白质靶标的共价键合有助于在整个变性蛋白质分离过程(例如凝胶电泳)中保留荧光标记并允许切除相应的蛋白质以在全蛋白质组中检测(图2)。
9，1391-1395 (2008))。这样至蛋白质靶标的共价键合有助于在整个变性蛋白质分离过程(例如凝胶电泳)中保留荧光标记并允许切除相应的蛋白质以在全蛋白质组中检测(图2)。
[0091] 荧光标记的优点在于金属离子通过探针螯合引起荧光猝灭，而带多组氨酸标签的蛋白质的标记增强荧光信号以产生“接通”响应。然而，带多组氨酸-标签的蛋白质的存在引起荧光显著提高，这说明对目的蛋白进行小-分子-荧光标记。在另一个实施方案中，引入带多组氨酸-标签的XPA122蛋白质(His-XPA122)可以引起Ni2+-NTA-AC的荧光增强13倍，而根据时间进程图(图7A)完全标记可以在9分钟内实现。
[0092] 在一些实施方案中，所述探针以共价键标记带多组氨酸-标签的蛋白质，且因此在蛋白质经受变性蛋白质分离过程(例如SDS-PAGE)之后保持染色。在一些实施方案中，荧光剂因此可以应用到活的生物样品以靶向细胞内(和膜结合的)带多组氨酸标签的蛋白质。例如，除了植物细胞和组织之外，生物样品包括但不限于，细菌样品、哺乳动物细胞系和组织。
[0093] 在文中提供具有图1中相同结构设计的另一种探针NTA-AF(图2)，其包含荧光素-衍生的荧光团、连接到荧光团的金属-螯合次氮基三乙酸(NTA)部分接头和芳基叠氮化物光反应性交联剂(图12)。
[0094] 因此，提供以下非限制性实施方案：
[0095] 1. 用于靶向生物样品中的生物分子的荧光探针，其包含产生荧光信号的荧光团报道部分、螯合用于与编码到靶蛋白质的多组氨酸标签配位的金属离子的金属-螯合部分、连接所述荧光团报道部分和金属-螯合部分的接头和充当到靶蛋白质上的锚点以激增标记亲和力和稳定性的光反应性交联剂。
[0096] 2. 根据实施方案1的荧光探针，其中在吸收光能之后所述报道部分的荧光信号具有约400-约800nm的波长。
[0097] 3. 根据实施方案1-2中任一项的荧光探针，其中所述报道部分包含香豆素-衍生物、荧光素-衍生物和若丹明-衍生物。
[0098] 4. 根据实施方案1-3中任一项的荧光探针，其中所述金属螯合部分包含多齿配体。
[0099] 5. 根据实施方案4的荧光探针，其中所述多齿配体包含次氮基三乙酸(NTA)和亚氨基二乙酸(IDA)。
[0100] 6. 根据实施方案1-5中任一项的荧光探针，其中所述金属-螯合部分包含含有镍(II)、钴(II)和铜(II)金属离子中至少一种的螯合金属离子。
[0101] 7. 根据实施方案1-6中任一项的荧光探针，其中所述荧光团和所述金属-螯合部分之间的接头为烃链或肽序列。
[0102] 8. 根据实施方案1-7中任一项的荧光探针，其中所述光反应性交联剂包含芳基叠氮化物、双吖丙啶和二苯甲酮,
[0103] 9. 根据实施方案8的荧光探针，其中所述光反应性交联剂包含或不包含作为荧光团的共轭体系的一部分。
[0104] 10. 根据实施方案8-9中任一项的荧光探针，其中所述光反应性交联剂呈现光激活，其通过在所述荧光探针与生物样品中带多组氨酸标签的蛋白质配位之后紫外辐射约5-约15分钟实现。
[0105] 11. 根据实施方案10的荧光探针，其中所述紫外辐射的范围为约340nm-约380nm。
[0106] 12. 根据实施方案1-11中任一项的荧光探针，其中包括镍(II)、钴(II)和铜(II)离子的金属离子的螯合产生金属-螯合探针的荧光猝灭。
[0107] 13. 根据实施方案1-12中任一项的荧光探针，其中所述探针与金属离子以1: 1摩尔比配位。
[0108] 14. 根据实施方案1-13中任一项的荧光探针，其中标记靶生物分子通过经由所述探针的金属-螯合与编码到所述生物分子的多组氨酸标签配位而实现。
[0109] 15. 根据实施方案14的荧光探针，其中当所述金属-螯合荧光探针在pH 6-8的缓冲液中标记带多组氨酸标签的蛋白质时，所述金属-螯合荧光探针呈现荧光信号的提高(“接通”响应)并实现所述提高。
[0110] 16. 根据实施方案15的荧光探针，其中当所述金属-螯合荧光探针在约4℃-约40℃的温度下标记带多组氨酸标签的蛋白质时，所述金属-螯合荧光探针呈现荧光信号的增强。
[0111] 17. 根据实施方案16的荧光探针，其中带多组氨酸标签的蛋白质的标记对过夜孵育稳定。
[0112] 18. 根据实施方案1-17中任一项的荧光探针，其中带多组氨酸标签的蛋白质的标记在所述蛋白质用约90℃-约110℃的温度变性之后保持。
[0113] 19. 根据实施方案17的荧光探针，其中带多组氨酸标签的蛋白质的荧光标记能够在非变性或变性凝胶电泳之后在凝胶上显现。
[0114] 20. 标记带多组氨酸标签的蛋白质的方法，其包括：
[0115] 通过荧光探针的金属螯合将多组氨酸标签编码的蛋白质与靶生物分子配位，所述荧光探针包含在吸收光能之后产生荧光信号的荧光团报道部分、螯合用于与编码到靶蛋白质的多组氨酸标签配位的金属离子的金属-螯合部分、连接所述荧光团和金属-螯合部分的接头和充当到靶蛋白质上的锚点以激增标记亲和力和稳定性的光反应性交联剂。
[0116] 21. 根据实施方案20的方法，其中所述荧光探针产生在吸收光能之后具有约400-约800nm的波长的荧光信号。
[0117] 22. 根据实施方案20-21中任一项的方法，其中带多组氨酸标签的蛋白质的标记在包含细菌细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物组织、植物细胞或植物组织的生物样品中实现。
[0118] 23. 根据实施方案22的方法，其中所述标记在约4℃-约40℃的温度下进行。
[0119] 24. 根据实施方案22的方法，其还包括通过缓冲液进行洗涤。
[0120] 25. 根据实施方案20-24中任一项的方法，其还包括进行共焦成像。
[0121] 26. 根据实施方案22的方法，其中引入所述荧光探针不损害所述生物样品。
[0122] 材料和方法
[0123] NTA-AC的合成。合成NTA-AC包括三个步骤且整体产率为64% (图3)。分析型薄层层析法(TLC)使用Macherey-Nage1预先包被的0.25mm厚TLC-板(具有荧光指示剂UV254的硅胶60)进行。来自Merck的硅胶60用于快速柱层析法(230-400目ASTM)。用于电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)的HPLC级的水得自Labscan。用于NMR的氘化溶剂购自Cambridge Isotope Laboratories (对于丙酮-d6)和Sigma-Aldrich (对于D2O)。质子和碳磁共振光谱(1H和13C NMR)实验在298 K下在Bruker Avance-300和Avance-500光谱仪上进行。ESI-MS光谱使用Finnigan LCQ光谱仪收集。
[0124] 探针NTA-AC通过图3A中所示的三步合成法合成。所有反应避免曝光进行。
[0125] 在一个实施方案中，NTA-A的荧光光谱在25℃的水中在Hitachi F-7000荧光分光光度计上使用1000W氙灯源测定，且激发和发射狭缝宽度设定在5.0nm，同时光电倍增管电压设定在700V。具有1.5mL样品体积的1cm x 1cm石英比色皿应用于实验。具有5μM溶解在25℃的水中的NTA-AC的样品用近紫外波长激发并在蓝光区域中发射，呈现在λex=342nm的激发最大值和中心在λem=448nm的发射(图6)。
[0126] 在一个实施方案中，NTA-AC与Ni2+离子的结合化学计量通过NTA-AC和Ni2+离子在Tris-HCl缓冲液中的荧光变化的Job's图测定。NTA-AC和Ni2+离子的浓度恒定地保持在总共10μM，且11种溶液具有变化浓度的NTA-AC和Ni2+离子且在检测之前孵育30分钟。Ni2+-NTA-AC络合的化学计量通过监控荧光变化(λex=342nm和λem=448nm)测量且在[Ni2+]/{[Ni2+]+[NTA-AC]相交的点的标绘等于0.5，指示Ni2+-NTA-AC的络合源自1:1的Ni2+:NTA-AC比率(图
3C)。Ni2+离子与NTA-AC配位通过质谱法监控，其在560.0m/z(计算值560.0m/z)呈现峰值，证实Ni2+-NTA-AC以等于1:1的Ni2+:NTA-AC比率形成。
3C)。Ni2+离子与NTA-AC配位通过质谱法监控，其在560.0m/z(计算值560.0m/z)呈现峰值，证实Ni2+-NTA-AC以等于1:1的Ni2+:NTA-AC比率形成。
[0127] 2-(7-叠氮基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酸(1)
[0128]
[0129] (1)根据文献合成。(Thevenin BJ等. (1992) Eur J Biochem 206 (2):471-477)。简而言之，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(0.143g，0.61mmol)与亚硝酸钠(0.045g，
0.65mmol)在含有浓硫酸(1mL)的水(6mL)中在冰浴中混合。随后，将叠氮钠(0.051g，
0.79mmol)加到冰浴中的混合物中，且连续搅拌45分钟，且形成沉淀物。将沉淀物过滤，用冰冷的水洗涤，随后通过冻干干燥并作为浅褐色粉末(0.135g，0.52mmol，85%产率)获得。
0.65mmol)在含有浓硫酸(1mL)的水(6mL)中在冰浴中混合。随后，将叠氮钠(0.051g，
0.79mmol)加到冰浴中的混合物中，且连续搅拌45分钟，且形成沉淀物。将沉淀物过滤，用冰冷的水洗涤，随后通过冻干干燥并作为浅褐色粉末(0.135g，0.52mmol，85%产率)获得。
[0130] 2,5-二氧代吡咯烷-l-基 2-(7-叠氮基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酸酯(2)
[0131]
[0132] (2). 将化合物(1) (0.129g，0.50mmol)溶解在25mL乙腈中并在室温下搅拌。随后将N-羟基琥珀酰亚胺(0.058g，0.51mmol)和N，N'-
[0133] 二环己基碳亚胺(0.105g，0.51mmol)加到反应烧瓶中且反应混合物在室温下搅拌过夜。将溶液过滤，且将滤液旋转蒸发以产生粗制黄色产物，其随后溶解在氯仿中以进行简单的溶剂提取。粗制黄色固体(2)在旋转蒸发之后获得。
[0134] (S)-2,2'-(5-(2-(7-叠氮基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酰氨基)-l-羧基戊基氮烷二基)二乙酸 (NTA-AC)
[0135]
[0136] 将化合物(2)溶解在乙腈(50mL)中并在室温下搅拌。将Nα,Nα-双(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物(0.180g，0.69mmol)溶解在补充三乙胺(0.5mL)的水(10mL)中。随后将该溶液逐滴加到(2)的溶液中,且反应混合物在室温下连续搅拌过夜。在旋转蒸发和冻干之后，粗制产物通过柱层析纯化以得到浅黄色粉末NTA-AC (0.198g，0.39mmol，与第二反应中的反应-1物1相比79%产率) (整体产率为64%)。IR(Nujol, cm )：3413.8 (br), 2725.2 (m),
2119.6 (m), 1645.2 (s), 1461.9 (s), 1307.6 (m), 1159.1 (w), 1097.4 (w),
1035.7 (w), 964.3 (w), 866.0 (w), 721.3 (m)。1H NMR (500MHz, D2O) (图4A)：δ 7.70 (d, J=8.69 Hz, 1H), δ 7.03 (d, J=8.62 Hz, 1H), δ 6.94 (s, 1H), δ 3.80 (br s,
5H), δ 3.63 (s, 2H), δ 3.24 (s, 2H), δ 2.39 (s, 3H), δ 1.98 (s, 2H), δ 1.59 (br s, 4H). 13C NMR (500 MHz, D2O) (图4B)：δ 180.794, δ 172.698, δ 171.057, δ
163.884, δ 152.817, δ 152.765, δ 144.057, δ 127.385, δ 117.926, δ 117.378, δ
116.407, δ 106.835, δ 68.977, δ 55.999, δ 55.696, δ 39.606, δ 34.383, δ
28.616, δ 27.119, δ 24.320, δ 23.042, δ 15.298。ESI-MS (m/z) (图5)：[M+Na]+ 计算值526.1，观测值526.1。Ni-NTA-AC ESI-MS (m/z)：[M-3H]-计算值558.9，观测值558.6。
2119.6 (m), 1645.2 (s), 1461.9 (s), 1307.6 (m), 1159.1 (w), 1097.4 (w),
1035.7 (w), 964.3 (w), 866.0 (w), 721.3 (m)。1H NMR (500MHz, D2O) (图4A)：δ 7.70 (d, J=8.69 Hz, 1H), δ 7.03 (d, J=8.62 Hz, 1H), δ 6.94 (s, 1H), δ 3.80 (br s,
5H), δ 3.63 (s, 2H), δ 3.24 (s, 2H), δ 2.39 (s, 3H), δ 1.98 (s, 2H), δ 1.59 (br s, 4H). 13C NMR (500 MHz, D2O) (图4B)：δ 180.794, δ 172.698, δ 171.057, δ
163.884, δ 152.817, δ 152.765, δ 144.057, δ 127.385, δ 117.926, δ 117.378, δ
116.407, δ 106.835, δ 68.977, δ 55.999, δ 55.696, δ 39.606, δ 34.383, δ
28.616, δ 27.119, δ 24.320, δ 23.042, δ 15.298。ESI-MS (m/z) (图5)：[M+Na]+ 计算值526.1，观测值526.1。Ni-NTA-AC ESI-MS (m/z)：[M-3H]-计算值558.9，观测值558.6。
[0137] NTA-C的合成
[0138] (S)-二甲基-2,2'-((6-氨基-l-甲氧基-l-氧代己-2-基)氮烷二基)二乙酸酯(3)。
[0139] 将(S)-2，2'-((5-氨基-l-羧基戊基)氮烷二基)二乙酸(100mg，0.43mmol)溶解在30mL甲醇中且将该溶液冷却到0℃，随后将SOCl2(623μl，8.58mmol)以逐滴方式加入。混合物在55℃的回流下搅拌48小时，随后将溶剂旋转蒸发以提供无色油状产物。假定保护步骤为100%产率且(3)在不进一步纯化的情况下用于下一个步骤。1H NMR (300MHz, CD3OD)：δ
4.53-4.35 (m, 5H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 6H), 3.08-2.96 (m, 2H), 2.15-2.02 (m, 2H), 1.87-1.73 (m, 2H), 1.72-1.60 (m, 2H). ESI-MS (m/z) (图5)：[M+Na]+ 计算值305.2，观测值305.2。
4.53-4.35 (m, 5H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 6H), 3.08-2.96 (m, 2H), 2.15-2.02 (m, 2H), 1.87-1.73 (m, 2H), 1.72-1.60 (m, 2H). ESI-MS (m/z) (图5)：[M+Na]+ 计算值305.2，观测值305.2。
[0140] (S)-二甲基-2，2'-((6-(2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酰氨基)-1-甲氧基-1-氧代己-2-基)氮烷二基)二乙酸酯(4)
[0141] 将2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酸(30mg，0.13mmol)溶解在1mL DMF中，随后加入HATU(GL Biochem) (98mg，0.26mmol)。在5分钟之后，加入DIEA (90PL，0.516mmol)和(3) (51mg，0.167mmol)的0.5mL DMF和2mL DCM的溶液，且在稀释到
50mL DCM中之前，搅拌反应混合物2小时。有机相用5%乙酸、水和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥。在旋转蒸发之后，残留物通过快速层析纯化以提供(4) (12mg，18%产率)。ESI-MS (m/z)：[M+Na]+ 计算值542.2，观测值542.3。
50mL DCM中之前，搅拌反应混合物2小时。有机相用5%乙酸、水和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥。在旋转蒸发之后，残留物通过快速层析纯化以提供(4) (12mg，18%产率)。ESI-MS (m/z)：[M+Na]+ 计算值542.2，观测值542.3。
[0142] (S)-6-(2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酰氨基)-2-((羧基甲基)(过氧氢基甲基)氨基)己酸 (NTA-C)
[0143] 将LiOH·H2O(8mg，0.19mmol)溶解在4.5mL溶液混合物(H2O:THF:MeOH为1:4:1)中，且随后加入(4) (10mg，0.019mmol)且溶液进一步搅拌48小时。使用树脂(Dowex® 50Wx8氢形式)以通过调节pH到6除去Li+离子，且随后将溶剂旋转蒸发且通过冻干除去水以产生1
NTA-C。(3.5mg，39%产率) H NMR (300 MHz, D2O)：δ 7.49 (d, J=8.3Hz, 1H), 6.76 (d, J=9.3Hz, 1H), 6.64 (s, 1H), 3.78-3.65 (m, 5H), 3.45 (s, 2H), 3.17-3.04 (m,
2H), 2.24 (s, 3H), 1.88-1.63 (m, 2H), 1.53-1.27 (m, 4H)。13C NMR (400Hz, D2O)：ι
172.94, 172.63, 170.36, 164.38, 153.38, 148.02, 126.90, 114.40. 114.36,
113.29, 102.77, 68.23, 55.39, 39.03. 33.90, 28.12, 26.59, 23.63, 14.77。ESI-MS (m/z)：[M-2H+K]-计算值514.5，观测值514.5。
NTA-C。(3.5mg，39%产率) H NMR (300 MHz, D2O)：δ 7.49 (d, J=8.3Hz, 1H), 6.76 (d, J=9.3Hz, 1H), 6.64 (s, 1H), 3.78-3.65 (m, 5H), 3.45 (s, 2H), 3.17-3.04 (m,
2H), 2.24 (s, 3H), 1.88-1.63 (m, 2H), 1.53-1.27 (m, 4H)。13C NMR (400Hz, D2O)：ι
172.94, 172.63, 170.36, 164.38, 153.38, 148.02, 126.90, 114.40. 114.36,
113.29, 102.77, 68.23, 55.39, 39.03. 33.90, 28.12, 26.59, 23.63, 14.77。ESI-MS (m/z)：[M-2H+K]-计算值514.5，观测值514.5。
[0144] NTA-AF的合成
[0145] 叠氮基荧光素的合成-将荧光素-胺(0.1340g，0.38mmol)溶解在10mL甲醇中，且将0.1506g NaNO2溶解在4mL水中并加到该溶液中，随后加入4mL 5M盐酸。将叠氮钠(0.1827 g)溶解在4mL水中且逐滴加到反应混合物中。在室温下搅拌140分钟且用TLC检查之后，该溶液在真空下浓缩，随后过滤并用冷水洗涤。所有步骤在黑暗或箔包装中进行。产率：92.06%。1H NMR (400 MHz，CO(CD3)2)：δ=7.57 (s，1H，ArH)，7.47 (d，1H，ArH)，7.29 (d，1H，ArH)，6.71-
6.58 (m，6H，ArH)。ESI-MS (m/z)：[M+H]+计算值374.1，观测值374.1。
6.58 (m，6H，ArH)。ESI-MS (m/z)：[M+H]+计算值374.1，观测值374.1。
[0146] NTA-胺的保护-在冰浴中，将NTA-胺(0.1006g，0.38mmol)溶解在30mL甲醇中，且SOCl2 (332μL，4.57mmol)逐滴加到溶液中。使该混合物回流并在油浴中搅拌48小时，且在蒸发之后获得油状产物。1H NMR (400 MHz，MeOD)：δ=4.52-4.38 (m，5H)，3.81 (d，3H+6H)，2.95 (t，2H)，2.10-1.59 (m，6H，2H+2H+2H)。ESI-MS (m/z)：[M+H]+计算值304.2，观测值
305.3。
305.3。
[0147] 探针前体(pro-probe)的合成-在0℃下，将叠氮基荧光素(0.1141 g，0.3mmol)、l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI，0.0544 g，0.35mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT，0.1210 g，0.79mmol)和N-甲基吗啉(NMM，0.15mL，1.2mmol)溶解在无水DMF(5mL)中并在氮气中搅拌1小时。随后，将之前合成的NTA前体(pro-NTA)溶解在2mL无水DMF中且逐滴加入。将该溶液在室温下在氮气下搅拌过夜。在用TLC检查之后，在压力下除去溶剂，将残留物溶解在乙酸乙酯中并用饱和氯化钠洗涤，随后有机相经MgSO4干燥。在除去乙酸乙酯之后，粗制产物通过硅胶柱层析法(溶剂：EA/己烷=2.5：l)纯化，获得干净产物且产率为25.07%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ=7.58 (s，1H，ArH)，7.10 (d，1H，ArH)，7.04 (d，1H，ArH)，6.68-6.42 (m，6H，ArH)，3.66-3.51 (d，6H+3H)，3.46 (m，4H)，3.17 (t，1H)，2.98 (t，2H)，1.98-0.91 (m，6H，2H+2H+2H)。 13C NMR (400MHz，CDC13)：δ 23.341，27.696，
30.000，40.422，51.606，51.932，52.521，64.812，64.983，77.287，98.916，103.289，
110.007，110.115，112.622，113.051，123.951，125.233，129.136，132.738，141.208，
149.376，152.720，152.761，154.138，157.955，158.023，167.526，172.411，173.300. dept NMR：δ 23.263，27.617，29.914，40.349，52.432； 51.527，51.853，64.723，103.201，
103.245，112.543，112.970，123.877，125.177，129.058。ESI-MS (m/z)：[M+Na]+计算值
682.2，观测值682.2。
30.000，40.422，51.606，51.932，52.521，64.812，64.983，77.287，98.916，103.289，
110.007，110.115，112.622，113.051，123.951，125.233，129.136，132.738，141.208，
149.376，152.720，152.761，154.138，157.955，158.023，167.526，172.411，173.300. dept NMR：δ 23.263，27.617，29.914，40.349，52.432； 51.527，51.853，64.723，103.201，
103.245，112.543，112.970，123.877，125.177，129.058。ESI-MS (m/z)：[M+Na]+计算值
682.2，观测值682.2。
[0148] 脱保护-将30.6mg探针前体(0.046mmol)、氢氧化锂(LiOH·H2O，0.0201 g，0.48mmol)在0℃下溶解在6mL 4:1:1的THF:甲醇:水中。在室温下搅拌反应混合物60小时，随后在真空中蒸发。加入5mL甲醇以溶解且蒸发两次以除去溶剂。1H NMR (400 MHz，CD3OD)：
δ=7.55 (s，1H，ArH)，7.24 (d，1H，ArH)，7.06 (d，1H，ArH)，6.64-6.39 (m，6H，ArH)，3.68-
3.58 (m，4H+1H)，3.09 (t，2H)，1.60-0.99 (m，6H，2H+2H+2H)。13C NMR (400MHz，CDC13)：δ
23.387，27.417，28.757，39.504，53.898，65.008，65.442，102.284，109.253，109.326，
112.324，123.721，125.120，128.699，128.777，132.636，141.275，149.645，152.839，
152.925，158.979，167.599，173.924。 dept NMR：δ：23.290，27.328，28.661，39.404，
53.809； 65.346，102.192，112.026，112.236，123.635，125.032，128.611，128.689。ESI-MS (m/z)：[M+H]+计算值618.2，观测值618.5。
δ=7.55 (s，1H，ArH)，7.24 (d，1H，ArH)，7.06 (d，1H，ArH)，6.64-6.39 (m，6H，ArH)，3.68-
3.58 (m，4H+1H)，3.09 (t，2H)，1.60-0.99 (m，6H，2H+2H+2H)。13C NMR (400MHz，CDC13)：δ
23.387，27.417，28.757，39.504，53.898，65.008，65.442，102.284，109.253，109.326，
112.324，123.721，125.120，128.699，128.777，132.636，141.275，149.645，152.839，
152.925，158.979，167.599，173.924。 dept NMR：δ：23.290，27.328，28.661，39.404，
53.809； 65.346，102.192，112.026，112.236，123.635，125.032，128.611，128.689。ESI-MS (m/z)：[M+H]+计算值618.2，观测值618.5。
[0149] 在一些实施方案中，基于荧光素的荧光探针NTA-AF在λem=518nm呈现其绿色荧光，且激发最大值位于λex=496nm(图13)。带多组氨酸标签的蛋白质His-XPA122 (12μΜ)还在4℃下用等摩尔浓度的Ni2+-NTA-AF预先孵育1小时且随后光反应性交联剂芳基叠氮化物在室温下通过365nm的紫外辐射光激活10分钟。SDS-PAGE分析使用15%分离胶进行，且荧光凝胶图像通过来自GE Healthcare的Typhoon 9410系统(λex=488nm，λem=~520nm)捕获且用考马斯蓝染色以进行比较。该探针利于带多组氨酸标签的蛋白质His-XPA122(第1道)在凝胶上的绿色荧光标记，且因此证明其适用性类似于NTA-AC，但以不同的颜色以提供光谱多样性(图14)。
[0150] 哺乳动物表达质粒的构建。包含mrfp基因的pRSETB-mRFP1购自Clontech Laboratories，Inc。在mrfp和xpa122的N-端之前加入连续组氨酸残基。接头(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser)在多组氨酸标签和mrfp或xpa122基因之间插入以增强多组氨酸标签和靶蛋白质之间的柔韧性。
[0151] 全长mrfp基因通过用引物对His-mRFP-For/His-mRFP-Rev (表1)的聚合酶链反应(PCR)扩增。xpa122基因通过用引物对His-XPA122-For/His6-XPA122-Rev (表1)的PCR扩增。限制位点BamHI和XhoI分别在PCR产物的5'-和3'-端引入。PCR产物和载体pcDNA3.1-(+) (Life Technologies Corporation)通过限制性核酸内切酶(New England Biolabs，Inc.)消化。在消化之后，PCR产物通过T4连接酶(Life Technologies Corporation)连接到pcDNA3.1-(+)载体中以获得pcDNA3.1-His-mRFP和pcDNA3.1-His-XPA122。
[0152] 表1. 用于质粒构建的引物
[0153]
[0154] 或者，为了构建pcDNA3.1-His-mRFP-His-XPA122，全长mrfp基因用引物对His-mRFPtag-For/His-mRFPtag-Rev扩增，分别在5'和3'-端引入NheI和BamHI位点。PCR产物和载体pcDNA3.1-His-XPA122通过限制性核酸内切酶(New England Biolabs，Inc.)消化。在消化之后，PCR产物通过T4连接酶(Life Technologies Corporation)连接到载体pcDNA3.1-His-XPA122中以获得pcDNA3.1-His-mRFP-His-XPA122。构建的质粒的序列通过DNA测序确定。
[0155] 哺乳动物细胞培养和瞬时转染。HeLa细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所有关于细胞培养的化学品购自Life Technologies的Gibco®，否则另有说明。HeLa细胞在补充10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(Pen Strep)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中生长，且在37℃的5% CO2培养箱中培养。HeLa细胞用制备的质粒瞬时转染用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行。HeLa细胞在不具有抗生素的10% FBS和DMEM的存在下在6-孔板(用于裂解物收集)或共焦培养皿(用于共焦成像)上接种。当细胞密度达到
90%汇合时，将Lipofectamine和制备的质粒以2PL/Pg的比率补充到细胞样品。在转染24小时之后，培养基用Hank平衡盐溶液(HBSS)替换以进行随后的实验。
90%汇合时，将Lipofectamine和制备的质粒以2PL/Pg的比率补充到细胞样品。在转染24小时之后，培养基用Hank平衡盐溶液(HBSS)替换以进行随后的实验。
[0156] His-XPA122和XPA122的过表达和纯化。将质粒pET-His6-XPA122转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。接种到补充34μg/mL卡那霉素的新鲜Luria-Bertani(LB)肉汤中的过夜培养物在37℃下生长直到600nm(OD600)的光密度为约0.6。蛋白质表达在16℃下用0.2mM异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)过夜诱导。细菌随后通过在4000rpm下在4℃下离心15分钟收获且悬浮在Tris缓冲液A (20mM Tris-HCl，pH 7.6，500mM NaCl和20mM 咪唑)中。
[0157] 细胞在1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)的存在下通过超声裂解。该细胞裂解物在10000g下在4℃下离心30分钟以分离包涵体。上清液通过0.45μm过滤器单元过滤并施加到HisTrap Ni-NTA柱(GE Healthcare)，用相同缓冲液平衡。蛋白质用包含300mM咪唑的Tris缓冲液洗脱。各级分通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。具有His-XPA122的级分通过Amicon Ultra-15离心过滤器单元(Millipore)浓缩。
[0158] 为了获得不具有His-标签的XPA122，将His-XPA122在Tris缓冲液B (20mM Tris-HCl，pH 7.2，130mM NaCl)中通过Amicon Ultra-15离心过滤器单元(Millipore)浓缩。His-标签的除去通过在20℃下在温和振荡下的凝血酶裂解过夜进行，且裂解产物通过HisTrap Ni-ΝΤA柱(GE Healthcare)纯化。
[0159] His-XPA122和XPA122在Tris缓冲液C (20mM Tris-HCl，pH 7.4，300mM NaCl)中通过Superdex 75尺寸排阻柱(GE Healthcare)经受进一步纯化。将峰值级分收集并用Amicon Ultra-15离心过滤器单元(Millipore)浓缩。蛋白质的纯度通过15% SDS-PAGE确定且蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定试剂盒(Novagen)测定。
[0160] 荧光光谱测量。荧光探针在不同条件下结合到蛋白质使用1cm x 1cm石英比色皿(1.5mL样品体积)在具有1000W氙灯的Hitachi F-7000荧光分光光度计上进行。NTA-AC与2+ 2+ 2+
Ni 离子的结合化学计量通过NTA-AC和Ni 离子的荧光变化的Job's图测定。NTA-AC和Ni离子的浓度在总共10μΜ中保持恒定，其具有各种浓度的NTA-AC和Ni2+离子并在每一测量之前孵育30分钟。在加入His-XPA122(10摩尔当量)之后Ni-NTA-AC或Ni-NTA-C (1μM)的荧光变化在25℃下以每分钟间隔测量。
Ni 离子的结合化学计量通过NTA-AC和Ni 离子的荧光变化的Job's图测定。NTA-AC和Ni离子的浓度在总共10μΜ中保持恒定，其具有各种浓度的NTA-AC和Ni2+离子并在每一测量之前孵育30分钟。在加入His-XPA122(10摩尔当量)之后Ni-NTA-AC或Ni-NTA-C (1μM)的荧光变化在25℃下以每分钟间隔测量。
[0161] 为了证明His6-标签和Ni2+存在对于特异性相互作用的意义，测定在用蛋白质孵育之后Ni-NTA-AC的荧光变化。载脂蛋白XPA122在20mM HEPES、100mM NaCl (pH 7.4)中制备并以1μΜ增量滴定到Ni-NTA-AC (1μΜ)中。还在20mM HEPES、100mM NaCl (pH 7.4)中制备载脂蛋白His-XPA122并以1μΜ增量滴定到NTA-AC (1μΜ)中。
[0162] 等温滴定量热法(ITC)。载脂蛋白(Apo-protein)His-XPA122在20mM HEPES、100mM NaCl(pH 7.4)中新鲜地制备，同时Ni-NTA-AC或Ni-NTA-C在使用之前在相同缓冲液中在4℃下预先孵育过夜。对于探针-蛋白质相互作用，将Ni-NTA-AC或Ni-NTA-C(500μΜ)滴定到His-XPA122 (35μΜ)中。所有ITC实验在25℃下在ITC200等温滴定量热仪(Microcal)上进行。
[0163] 蛋白质在SDS-PAGE上体外成像。包含Ni-NTA-AC的溶液首先用10摩尔当量的乙二胺四乙酸(EDTA)在4℃下孵育过夜以制备NTA-AC溶液。随后，蛋白质(各自12μΜ)用等摩尔浓度的探针或NTA-C在4℃下预先孵育2小时，共价连接随后使用UVP UVGL-25 Mineralight UV灯通过365nm的紫外辐射在室温下光激活10分钟。SDS-PAGE分析使用15%分离胶进行。荧光凝胶图像通过ImageQuant 350 (GE Healthcare) (λex=365nm，λem=460-500nm)捕获。变性凝胶通过考马斯蓝染色，之后用于比较且His-标签存在蛋白质中通过蛋白质印迹证实。
[0164] 在SDS-PAGE和MALDI-MS上通过Ni-NTA-AC的His-XPA122标记产率。His-XPA122蛋白质(各自10μM)用0、0.2、0.5、1、2、5、10摩尔当量的Ni-NTA-AC在4℃下预先孵育过夜。共价连接在室温下在365nm的紫外辐射下经由光激活使用UVP UVGL-25 Mineralight UV灯10分钟实现。SDS-PAGE分析使用15%分离胶进行。荧光凝胶图像通过ImageQuant 50 (GE Healthcare) (λex=365nm，λem=460-500nm)捕获。变性凝胶通过考马斯蓝染色，之后用于比较。标记产率通过在荧光和考马斯蓝染色之后使用Image J定量蛋白质带的面积获得且相对于最大强度标准化。
[0165] His-XPA122蛋白质(各自10μΜ)在20mM HEPES、100mM NaCl(pH 7.4)中用或不用各种比率的Ni-NTA-AC孵育。随后通过Ultraflex II TOF/TOF MALDI-TOF MS(Bruker)分析。标记效率经由图像J使用峰面积评估。
[0166] 大肠杆菌的共焦成像和体内研究。pET-His-XPA122或pET32a (作为对照)转化的BL21(DE3)细胞在包含34μg/mL卡那霉素(对于pET-His-XPA122)或100μg/mL氨苄西林(对于pET32a)的Luria-Bertani (LB)中在37℃下培养过夜，且随后通过1:100稀释继代培养。当OD600达到0.6时，加入异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG) (0.2mM)以诱导蛋白质在16℃下表达过夜。加入Ni-NTA-AC (10μM)且进一步在黑暗中孵育。具有或不具有His-XPA 122过表达的大肠杆菌细胞随后在4℃下用50mM HEPES、100mM NaCl(pH 7.3)洗涤。用HEPES缓冲液将OD600调节到0.3且在成像之前将碘化丙啶(PI) (1μg/mL)加到样品中以检查细胞的存活力。图像在Carl Zeiss LSM700反向共焦显微镜上使用405nm激光(用于激发)和555nm激光(用于激发碘化丙啶(PI))捕获。使用分别用于荧光和相差成像的Plan-Apochromat 63x 1.40NA油浸物镜来显现细胞。细胞存活力通过测量His-XPA122-表达的大肠杆菌中非PI-染色的死细胞的百分比而测定，其在用不同浓度的Ni-NTA-AC (0-100μΜ)孵育之后通过共焦成像(n=5)捕获。
[0167] 转染的HeLa细胞的共焦成像。HeLa细胞在共焦培养皿上瞬时转染之后，细胞用HBSS洗涤一次，且该溶液被预先负载有25μM Ni-NTA-AC的HBSS替换以进一步孵育30分钟。随后弃去缓冲溶液且细胞用HBSS洗涤三次并进行共焦成像。荧光和相差图像在Carl Zeiss LSM700反向共焦显微镜上使用405nm和555激光在Plan-Apochromat 63 x 1.40NA油浸物镜下捕获，同时发射的测量范围(430-500nm)是固定的(对于探针的发射)且为575-700nm(对于mRFP发射)。为了定量通过探针标记细胞内靶标所需要的时间，His-mRFP转染的HeLa细胞用HBSS洗涤一次，经受共焦显微镜且在25μΜ Ni-NTA-AC补充到细胞之后每30秒引发成像。
来自各个转染细胞的探针荧光强度通过Zen软件(Carl Zeiss)定量并绘制。
来自各个转染细胞的探针荧光强度通过Zen软件(Carl Zeiss)定量并绘制。
[0168] 细胞存活力的测量。将HeLa细胞接种到96-孔板(10000个细胞/孔)中并在37℃下以5% CO2用相应的培养基孵育过夜。将培养基替换且细胞用在培养基中的不同浓度(0、25和50μM)的Ni-NTA-AC在37℃下孵育30分钟并避光。随后除去培养基并用新鲜培养基替换，随后加入10μL溴化(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑鎓(MTT，5mg/mL，在无菌PBS中)并进一步孵育4小时。在除去除25μL培养基外的其它所有之后，将50μL DMSO施加以在37℃下孵育10分钟。各个孔的吸光率在λ=540nm下使用微板阅读器(BIO-RAD，iMarkTM)记录，且相对于未处理的细胞的存活力，报道细胞存活力。
[0169] 烟草植物细胞的共焦成像。使用表达带His-标签的芥菜(Brassica juncea)壳多糖酶的叶绿体转基因烟草(Nicotiana tabacum)Xanthi品种His-BjCHIl植物(Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，Taylor PWJ，Chye M-L (2008) J Exp Bot 59(12)：3475-3484)。将烟草种子表面消毒，播种在补充2%蔗糖的Murashige and Skoog (MS)培养基且如先前报道生长(Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，Taylor PWJ，Chye M-L (2008) J Exp Bot 59(12)：3475-3484)。根据先前方案，原生质体从4周龄野生型和His-BjCHIl 烟草植物的叶提取(Papadakis AK，Siminis CI，Roubelakis-Angelakis KA (2001) Plant Physiol
126(l)：434-444)。剥出叶的下表皮并用提取溶液孵育3小时。分离的细胞用Ni-NTA-AC (10μΜ)孵育30分钟且施加到显微镜载片上以成像。对于活的全植物中的应用，将在MS 培养基中生长的七天龄幼苗转移到补充Ni-NTA-AC (10μΜ)的PBS缓冲液 (pH 7.4)以浸没根24小时。随后用PBS缓冲液洗涤幼苗并在成像之前吸干。在具有Spectra Physics MaiTai HP可调节2-光子激光 (λex=780nm和λem=435-470nm，572-674nm)的Carl Zeiss LSM7 10 NLO 反向共焦显微镜上捕获烟草植物图像。原生质体使用40x1.30油浸物镜镜片成像，而叶上的图像使用63x1.40油浸物镜镜片捕获。
126(l)：434-444)。剥出叶的下表皮并用提取溶液孵育3小时。分离的细胞用Ni-NTA-AC (10μΜ)孵育30分钟且施加到显微镜载片上以成像。对于活的全植物中的应用，将在MS 培养基中生长的七天龄幼苗转移到补充Ni-NTA-AC (10μΜ)的PBS缓冲液 (pH 7.4)以浸没根24小时。随后用PBS缓冲液洗涤幼苗并在成像之前吸干。在具有Spectra Physics MaiTai HP可调节2-光子激光 (λex=780nm和λem=435-470nm，572-674nm)的Carl Zeiss LSM7 10 NLO 反向共焦显微镜上捕获烟草植物图像。原生质体使用40x1.30油浸物镜镜片成像，而叶上的图像使用63x1.40油浸物镜镜片捕获。
[0170] 免疫印迹。细胞在超声缓冲液 (50μM HEPES，pH 7.3，100mM NaCl)中通过超声裂解。细胞裂解物通过12% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜(Hybond-P，GE Healthcare)上。该膜在TBST缓冲液(10mM Tris-HCi，pH 7.6，130mM NaCl，0.1% (v/v) Tween-20)中用5% BSA封闭1小时且用Anti-6X His tag®抗体(Abcam)在室温下孵育1小时。随后将膜用辣根过氧化酶-缀合的山羊抗小鼠IgG第二抗体(Abcam)孵育以用LumiGLO®试剂(Cell Signaling Technology)通过化学发光检测。实施例
[0171] 荧光标记的一个优点在于金属离子通过探针螯合引发荧光的猝灭，而带多组氨酸标签的蛋白质的标记增强荧光信号以产生“接通”响应。在加入Ni2+离子之后对NTA-AC的荧光变化的测量(λex=342nm和λem=448nm)通过在25℃下滴定浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15和20μM的Ni2+离子到5μM NTA-AC进行，且在加入Ni2+之后，NTA-AC的荧光强度逐渐降低了72%(图3B)。然而，带多组氨酸标签的蛋白质的存在引发荧光显著提高，这说明了对目的蛋白进行小-分子-荧光标记。在另一个实施方案中,引入带多组氨酸标签的XPA122蛋白质(His-XPAI22)可以引起Ni2+-NTA-AC的荧光增强13倍，而根据时间进程图(图7A)，完全标记可以在9分钟内获得。
[0172] 带多组氨酸标签的蛋白质His-XPAI22和不带组氨酸-标签的XPA122 (12μM)在4℃下用等摩尔浓度的Ni2+-NTA-AC预先孵育1小时，且随后光反应性交联剂在室温下通过365nm的紫外辐射光激活10分钟。SDS-PAGE分析使用15%分离胶进行，且荧光凝胶图像通过来自GE Healthcare的ImageQuant 350捕获(λex=365nm和λem=460-500nm)。变性凝胶通过考马斯蓝染色，之后用于比较，而蛋白质中多组氨酸标签的存在通过蛋白质印迹确保。与除去多组氨酸标签的蛋白质(第4道)相比，只有带多组氨酸标签的蛋白质(第1道)可以被荧光标记，因此证明对多组氨酸标签编码的蛋白质的荧光标记的特异性(图7C)。
[0173] 为了针对活的生物样品试验荧光剂靶向细胞内(和膜结合的)带多组氨酸标签的蛋白质的应用，将镍(II)预先负载的探针Ni2+-NTA-AC (10μM)直接加到大肠杆菌培养物中且在黑暗中在37℃中进一步孵育1小时，且随后在4℃下用20mM Tris-HCl、100mM NaCl(pH 7.2)洗涤。用缓冲液将细胞的密度调节到0.3 (OD600)且在成像之前将碘化丙啶(PI) (1μg/mL)加到样品中以检查细胞的存活力。在共焦成像下，与不具有带多组氨酸标签的蛋白质过表达的pET 32a样品相比，只有过表达带多组氨酸标签的蛋白质His-XPA122的大肠杆菌细胞可以被照亮，且该细胞在整个标记过程保持存活(图9C)。在另一个实验中，表达带多组氨酸标签的芥菜壳多糖酶BjCHIl(称为His-BjCHIl)的叶绿体转基因烟草(Nicotiana tabacum)品种Xanthi植物的原生质体从4周龄野生型和His-BjCHIl烟草植物的叶提取(图
11)，随后分离的原生质体在黑暗中在室温下在共焦成像分析之前用10μΜ Ni2+-NTA-AC处理30分钟。与野生型(WT)样品相比，对于表达His-BjCHIl的细胞，强烈蓝色荧光只在共焦显微镜上获得，同时另外解释以下事实：His-BjCHIl被表达且随后积聚在烟草叶绿体(Guan，Y.，Ramalingam，S.，Nagegowda，D.，Taylor，P. W. J. & Chye，M.-L. J. Exp. Bot. 59，
3475-3484 (2008))，蓝色荧光在烟草原生质体中共定位可以用叶绿素的自动荧光观察，指示出现通过探针荧光标记His-BjCHIl(只在叶绿体中表达)(图11)。在另一个实施方案中，在共焦显微镜下直接研究标记的植物组织，且将7天龄的叶绿体转基因烟草植物幼苗转移到补充10μΜ Ni2+-NTA-AC的PBS缓冲液(pH 7.4)以将根浸没24小时，随后洗涤并在成像之前吸干。叶绿体转基因烟草叶的远轴表面在共焦显微镜下直接分析，且只在His-BjCHIl叶绿体转基因的烟草叶上的保卫细胞的叶绿体上再次观察到蓝色荧光，指示该探针通过根吸收且可以检测到活的植物内的Ni2+-结合的带多组氨酸标签的蛋白质 (图10)。
11)，随后分离的原生质体在黑暗中在室温下在共焦成像分析之前用10μΜ Ni2+-NTA-AC处理30分钟。与野生型(WT)样品相比，对于表达His-BjCHIl的细胞，强烈蓝色荧光只在共焦显微镜上获得，同时另外解释以下事实：His-BjCHIl被表达且随后积聚在烟草叶绿体(Guan，Y.，Ramalingam，S.，Nagegowda，D.，Taylor，P. W. J. & Chye，M.-L. J. Exp. Bot. 59，
3475-3484 (2008))，蓝色荧光在烟草原生质体中共定位可以用叶绿素的自动荧光观察，指示出现通过探针荧光标记His-BjCHIl(只在叶绿体中表达)(图11)。在另一个实施方案中，在共焦显微镜下直接研究标记的植物组织，且将7天龄的叶绿体转基因烟草植物幼苗转移到补充10μΜ Ni2+-NTA-AC的PBS缓冲液(pH 7.4)以将根浸没24小时，随后洗涤并在成像之前吸干。叶绿体转基因烟草叶的远轴表面在共焦显微镜下直接分析，且只在His-BjCHIl叶绿体转基因的烟草叶上的保卫细胞的叶绿体上再次观察到蓝色荧光，指示该探针通过根吸收且可以检测到活的植物内的Ni2+-结合的带多组氨酸标签的蛋白质 (图10)。
[0174] 荧光探针Ni-NTA-AC的设计和合成。利用Ni2+-次氮基三乙酸体系(包括与荧光团缀合的二、三或四-NTA衍生物)的先前许多荧光探针只可以用于标记细胞中的膜蛋白质，由于这些探针遭受差的膜渗透性且几乎不能够进入细胞(Soh N (2008) Sensors 8(2)：1004-1024； Jing C & Cornish VW (2011) Acc Chem Res 44(9)：784-792)。据推理，高度负电荷会抑制这些探针跨过细胞膜，尽管将多-NTA引入到探针可以克服Ni-NTA与His6-标签的弱结合特点。因此，设计一种探针(图3A)，其由单-Ni-ΝTΑ部分、小的膜可渗透的荧光团(香豆素衍生物) (Uttamapinant C，等. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(24)：
10914-10919)和芳基叠氮化物部分组成。Ni-次氮基三乙酸(NTA)将靶向His6-标签以获得目的蛋白的特异性标记，且将芳基叠氮化物基团掺入探针中以在光激活之后在探针及其靶蛋白质之间提供另外的共价键(Melcher K (2004) Curr Protein Pept Sci 5(4)：287-
296)，因此决定Ni-NTA与His6-标签的固有弱结合性质。单-Ni-NTA和荧光团之间的接头设计成允许Ni-NTA的柔韧性以促进有效的蛋白质标记。另外，这样的接头还可以在活细胞标记期间增强Ni-NTA-AC的膜渗透性，其将进一步详细说明(参见下文)。
10914-10919)和芳基叠氮化物部分组成。Ni-次氮基三乙酸(NTA)将靶向His6-标签以获得目的蛋白的特异性标记，且将芳基叠氮化物基团掺入探针中以在光激活之后在探针及其靶蛋白质之间提供另外的共价键(Melcher K (2004) Curr Protein Pept Sci 5(4)：287-
296)，因此决定Ni-NTA与His6-标签的固有弱结合性质。单-Ni-NTA和荧光团之间的接头设计成允许Ni-NTA的柔韧性以促进有效的蛋白质标记。另外，这样的接头还可以在活细胞标记期间增强Ni-NTA-AC的膜渗透性，其将进一步详细说明(参见下文)。
[0175] 基于香豆素的配体NTA-AC通过将次氮基三乙酸部分与香豆素荧光团和芳基叠氮化物缀合经由三步反应首先合成，且总产率为64%(图3A、图4B和5)。该化合物的纯度通过1H NMR和ESI-MS两者确定。该配体呈现在约342nm(ε=11100M-1cm-1)的最大吸收且在448nm (Φ=0.056)发射(图6)。该探针Ni-NTA-AC随后通过随后NTA-AC与Ni2+ (作为NiSO4)在缓冲水溶液中的反应产生。如图3B中所示，在加入等摩尔量的Ni2+到20mM Tris缓冲液(pH 7.2)中的NTA-AC之后，荧光明显猝灭了约70%；与先前报道的NTA-DCF缀合物中所观察到的5%降低形成鲜明对比(Goldsmith CR，Jaworski J，Sheng M，& Lippard SJ (2006) J Am. Chem Soc 128(2)：418-419)，因此Ni-NTA-AC只具有在448nm的非常弱的发射。滴定数据使用Ryan-Weber方程非线性匹配(Bai YC，等. (2008) Anal Chim Acta 616(1)：115-121)，其产生38±13nM的离解常数(Kd)。为了评估结合化学计量，Job's图通过监控在NTA-AC与Ni2+在448nm下络合在342nm下在20mM Tris缓冲液(pH 7.2)中激发之后荧光的变化而构建。在0.5的Ni2+与NTA-AC摩尔比观察到最大荧光变化，指示Ni-NTA-AC络合物以1:1的NTA-AC:Ni2+比率形成(图3C)。这通过观察在来自ESI-MS的558.6的m/z的峰进一步验证，与558.9的计算值(m/z)一致。
[0176] Ni-NTA-AC探针体外标记带His6-标签的蛋白质的评估
[0177] 为了检查Ni-NTA-AC在体外标记带His6-标签的蛋白质中的可行性，DNA修复蛋白(着色性干皮症A组)的功能域(XPA122)用作展示研究。着色性干皮症A组充当XP蛋白的典型形式，其对修复由紫外辐射引起的DNA损害重要；功能域XPA122充当损害的DNA结合位点且因此引起修复(Cleaver JE (2005) Nat Rev Cancer 5(7)：564-573)。具有(作为His-XPA122表示)或不具有(XPA122)基因融合His6-标签到其N端的蛋白质过表达且如先前所述纯化(支持信息) (Kuraoka I，等. (1996) Mutat Res 362(1)：87-95)。Ni-NTA-AC探针与蛋白质的相互作用首先通过荧光光谱研究。用1μΜ Ni-NTA-AC孵育10摩尔当量的His-XPA122导致荧光强度随时间快速提高，在约9分钟达到稳定，在此观察到荧光提高约13倍(图7A)。相反，在相同条件下混合Ni-NTA-AC与XPA122之后没有注意到明显荧光变化(小于50%提高) (图15)。类似地，配体NTA-AC(不具有Ni2+配位) 与His-XPA122在相同条件下预先混合完全不导致荧光增强(图16)。这些组合结果指示Ni-NTA-AC通过Ni2+选择性靶向蛋白质的His6-标签，导致荧光“接通”响应。非特异性结合在所用的条件下可忽略不计。尽管并不完全理解探针对带His6-标签的蛋白质的荧光接通响应的基本机理，但可能是Ni2+-NTA和荧光团之间的弱相互作用导致“夹层状”结构，由于存在如先前报道的柔韧接头(Kamoto Μ，Umezawa N，Kato N，& Higuchi T (2008) Chem Eur J 14(26)：8004-8012)，其使荧光团的荧光猝灭。这种弱相互作用可能在Ni-NTA-AC结合到细胞内带His6-标签的蛋白质之后消失，荧光团与蛋白质靶标的随后的相互作用导致荧光显著提高。
[0178] Ni-NTA-AC对His-XPA122的结合性质还通过等温滴定量热法(ITC)研究，其产生7.1±0.6μΜ的离解常数和1.4±0.1的结合能力(图17A)，与Ni-NTA与组氨酸残基的弱结合性质一致。结合到His6-标签的Ni-NTA-AC的非整数化学计量归因于以下事实：一个His6-标签可能可以结合一个至两个Ni2+离子(Valenti LE，De Pauli CP，& Giacomelli CE (2006) J Inorg Biochem 100(2)：192-200；Knecht S，Rickiin D，Eberle AN，& Ernst B (2009) J Mol Recognit 22(4)：270-279)。该弱结合可能导致探针在活细胞的复杂环境中从标记的蛋白质离解。为了解决这个问题，将芳基叠氮化物掺入探针，以便提供在光激活之后探针及其靶蛋白质之间的另外的结合。随后检查芳基叠氮化物的作用。首先，使1μΜ Ni-NTA-AC和10摩尔当量的His-XPA122的混合物在UV光(365nm)下经受辐射15min以确保芳基叠氮化物光激活。与Ni-NTA-AC的荧光相比，可观察到显著的荧光增强(高于10倍)，由于探针结合到His-XPA122 (图7B)。在将40摩尔当量的乙二胺四乙酸(EDTA)加到混合物以从探针-蛋白质复合物剥离Ni2+之后，所观察到的荧光强度稍微提高(约30%)，而不是降低，归因于被Ni2+猝灭的荧光恢复(图7B)。随后，在黑暗中进行类似的实验以避免芳基叠氮化物光激活，且结果显示荧光显著降低(60%) (图7B)，指示在没有芳基叠氮化物光激活的情况下，从探针-His-XPA122复合物除去Ni2+废除了探针使带His6-标签的蛋白质成像的能力。基于这些数据，我们得出结论，芳基叠氮化物掺入探针可以克服Ni-NTA对组氨酸残基的弱结合性质。
[0179] 用于在光激活之后增强探针和His-标签蛋白质之间的结合的芳基叠氮化物的能力还通过在变性条件下观察探针-蛋白质复合物证明。Ni-NTA-AC标记的His-XPA122通过4W Longwave Compact UV灯(720PW/cm2)用UV光(365nm)辐射10分钟，随后进行SDS-PAGE电泳。在SDS-PAGE凝胶中可观察到对应于His-XPA122的强烈蓝色荧光带，证实甚至在变性条件下探针与His-XPA122的强结合。相反，当Ni-NTA-AC (12μΜ)在存在50μΜ EDTA的情况下与等摩尔量的XPA122或His-XPA122混合时，没有检测到相应的蓝色荧光带，所述EDTA从探针除去Ni2+ (图7C)，与以上观察一致：探针通过Ni2+靶向到XPA122的His6-标签且芳基叠氮化物基团的随后的光激活增强探针和蛋白质之间的结合。
[0180] 为了进一步评估探针的芳基叠氮化物的作用，经由三步反应合成不具有附接的芳基叠氮化物的基于香豆素的配体，即NTA-C，以便比较(图18-20)。对于NTA-C，加入等摩尔量的Ni2+导致约50%荧光降低(图21A)。意料不到地，在与探针类似的条件下用His-XPA122孵育1μΜ Ni-NTA-C导致荧光不提高(图21AB)，尽管Ni-NTA-C仍以如由ITC滴定数据证明的类似于探针Ni-NTA-AC的亲和力结合到His-XPA122 (图17B)。类似地，当Ni-NTA-C (12μΜ)与等摩尔量的His-XPA122混合时，在SDS-PAGE上没有检测到明显的蓝色荧光(图7C)。这些结果证明芳基叠氮化物不仅对增强探针及其靶标之间的结合有利，而且对针对带His6-标签的蛋白质的显著荧光“接通”响应有利。
[0181] 通过监控其对His-XPA122的反应性进一步评估Ni-NTA-AC对带His6-标签的蛋白质的标记效率。His-XPA122 (10μΜ)用不同摩尔当量的Ni-NTA-AC孵育、光激活且进行SDS-PAGE电泳(图8A)。通过将蛋白质带的荧光强度与考马斯染色的荧光强度比较，确定一摩尔当量的Ni-NTA-AC可以标记 50%的His-XPA122 (图8B)。还检查使用MALDI-TOF质谱的标记~功效。孵育等摩尔的Ni-NTA-AC和His-XPA122且随后在进行MALDI-MS之前光激活。在光谱(图8C)中，在m/z 14981和15549观察到两个离子峰，对应于完整蛋白质和与探针结合的蛋白质(计算值14979和15541)。在将2摩尔当量的探针加到蛋白质溶液中之后，在m/z
15549Da的峰强度相对于在m/z 14981的峰强度进一步提高。在m/z 16100的弱峰可指定为与两个探针结合的蛋白质。通过比较峰面积，发现在分别加入1和2摩尔当量的Ni-NTA-AC之后，38%和62%的His-XPA122被标记(图8C)，与从SDS-PAGE测定的结果(图8A-8B)一致。
15549Da的峰强度相对于在m/z 14981的峰强度进一步提高。在m/z 16100的弱峰可指定为与两个探针结合的蛋白质。通过比较峰面积，发现在分别加入1和2摩尔当量的Ni-NTA-AC之后，38%和62%的His-XPA122被标记(图8C)，与从SDS-PAGE测定的结果(图8A-8B)一致。
[0182] Ni-NTA-AC探针膜渗透性和毒性的评估。研究活的哺乳动物细胞中的Ni-NTA-C的细胞渗透性。His6-标签经基因融合到红色荧光蛋白质(RFP) (His-RFP)的N端且在HeLa细胞中瞬时表达该融合蛋白质。在施用Ni-NTA-AC (25μΜ)之后，在共焦显微镜下使用红色荧光作为参考监控对His-RFP转染的细胞的荧光响应。考虑到芳基叠氮化物在通过用于捕获图像的共焦显微镜法利用的405nm激光下可以容易光激活，在所有细胞成像实验中没有使用另外的UV辐射。在不存在Ni-NTA-AC的情况下通过优化细胞的成像参数使细胞自动荧光最小化。如图9A, B和图22中所示，在用Ni-NTA-AC处理之后快速出现蓝色荧光且在2分钟内达到饱和，指示探针可以快速跨过细胞膜且在结合到His-RFP之后呈现接通荧光。相反，在NTA-AC处理(即没有Ni2+配位)之后没有观察到蓝色荧光，指示NTA-AC本身无法进入细胞(图23)。这与我们的探针设计原理一致：电荷可能是决定探针的膜渗透性的重要因素。在不存在Ni2+的情况下，带电荷的亲水NTA部分保持暴露，且因此抑制NTA-AC跨过细胞膜。在Ni2+与NTA部分配位之后，总电荷显著降低，而且，“夹层状”结构可能形成，由于Ni-NTA和荧光团之间的弱相互作用以及柔韧接头(Kamoto M，Umezawa N，Kato N，& Higuchi T (2008) Chem Eur J. 14(26)：8004-8012)，导致Ni-NTA部分被“埋藏”，这使得Ni-NTA-AC跨过疏水细胞膜。
[0183] 还检查细菌和哺乳动物细胞中的探针的毒性。甚至当100μΜ Ni-NTA-AC用细胞孵育时，大肠杆菌的存活力达到约99%+/-1% (图24)。通过MTT测定法研究的HeLa细胞的存活力显示在用25和50μΜ Ni-NTA-AC孵育之后，超过90%细胞是活的，再次证实探针对细胞呈现无毒性(图25)。
[0184] 用于标记大肠杆菌中的带His-标签的蛋白质的Ni-NTA-AC探针的评估。
[0185] 为了检查探针在使活细胞中的带His-标签的蛋白质成像的可行性，研究用于标记大肠杆菌细胞中His-XPA122的Ni-NTA-AC的适用性。探针(10μΜ)在37℃下用过表达His-XPA122的大肠杆菌细胞孵育30分钟，随后在用HEPES缓冲液(pH 7.4)洗涤之后进行共焦成像(n=5)。如图9C中所示，过表达His-XPA122的大肠杆菌细胞用蓝色荧光染色，且随后SDS-PAGE分析细胞裂解物显示只有具有约15kDa分子量的一个蛋白质带呈现蓝色荧光，证实确实His-XPA122为唯一被标记的蛋白质(图26)。相反，不具有His-XPA122表达的细胞没有呈现蓝色荧光，显示探针在标记活细菌细胞中的细胞内带His-标签的蛋白质的可行性。还通过碘化丙啶(PI)染色检查这些细胞的存活力和膜完整性。如图9C中所示，没有细胞被PI染成红色，说明它们为活细胞。
[0186] 使用Ni-NTA-AC探针使活的哺乳动物细胞中带His-标签的蛋白质成像。研究探针标记哺乳动物细胞内的带His-标签的蛋白质的能力。具有或不具有His-XPA122转染的HeLa细胞在37℃下补充25μΜ在HBSS缓冲液中的Ni-NTA-AC历时30分钟，洗涤且进行共焦成像。如图9D中所示，只有在用His-XPA122转染的细胞中观察到主要位于核的强烈蓝色荧光，但在没有转染的那些细胞中没有观察到。为了进一步证实标记蛋白质的特性，具有或不具有His-XPA122转染的细胞用探针(25μΜ)处理且在365nm下辐射10分钟，使得能够光激活芳基叠氮化物，提取并浓缩转染和未转染的HeLa细胞的核，且随后进行荧光成像和蛋白质印迹(图9E)。为了进行比较，还研究用Ni-NTA-AC (5μΜ)标记的纯化的His-XPA122。来自His-XPA122转染的细胞的核的蓝色荧光和蛋白质印迹带与纯化的His-XPA122的那些类似，证实标记蛋白质实际上为在HeLa细胞中表达的His-XPA122。相反，对于未转染的细胞的核，没有观察到相应的带(图9E)。
[0187] 荧光蛋白业已广泛用于研究在基因融合到目的蛋白时在活细胞的生理学情况下蛋白质功能、定位以及其它生物事件(Lam AJ，等. (2012) Nat Meth 9：1005-1012)。然而，由于其大尺寸，使用荧光蛋白可能潜在地干扰目的蛋白的恰当定位或功能，(Giepmans BNG，Adams SR，Ellisman MH，& Tsien RY (2006) Science 312(5771)：217-224)，特别对于相对小的蛋白质。相反，在该问题上，基于小分子的荧光探针可能具有优点。为了证明这一点，将带His6标签的RFP掺入带His6标签的XPA122的N端以产生His6-RFP-His6-XPA122质粒，随后转染到HeLa细胞中以在相同条件下研究蛋白质的细胞定位。观察到蓝色荧光 (由于Ni-NTA-AC标记) 和红色荧光 (由于RFP的表达)两者共定位 (图9F)。有趣的是，荧光信号均匀地分布在整个细胞中，而不是在核中富集(如对于His-XPA122所发现)(图9D)。蛋白质定位的干扰可以归因于与XPA122 (15 kDa)相比相对大尺寸的RFP (27.5kDa) (Shaner NC，Steinbach PA，& Tsien RY (2005) Nat Meth 2(12)：905-909)。相比之下，使用Ni-NTA-AC探针，发现His-XPA122在核中富集，这与先前报道的XPA(一种在核苷酸切除修复过程期间识别DNA损害中涉及的蛋白质)的细胞内定位 (Uchinomiya S，Nonaka H，Wakayama S，Ojida A，& Hamachi I (2013) Chem Commun 49(44)：5022-5024；Kuraoka I，等. (1996) Mutat Res 362(l)：87-95)一致。综合来看，证明新的荧光探针Ni-NTA-AC可以优先应用于追踪活的哺乳动物细胞中的带His-标签的蛋白质且特别是小蛋白质的丰度和定位。
[0188] 用于使植物组织中带His-标签的蛋白质成像的Ni-NTA-AC探针的应用。显示Ni-NTA-AC可以标记其它真核体系中的蛋白质。如先前所述产生表达带His-标签的芥菜(Brassica juncea)壳多糖酶BjCHIl (His-BjCHIl)的叶绿体转基因烟草(Nicotiana tabacum)Xanthi品种(Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，Taylor PWJ，& Chye M-L (2008) J Exp Bot 59(12)：3475-3484)。根据先前程序，原生质体从4周龄野生型和His-BjCHIl叶绿体转基因烟草的叶(图11)提取(Papadakis AK，Siminis CI，& Roubelakis-Angelakis KA (2001) Plant Physiol. 126(l)：434-444)。在用Ni-NTA-AC (10μΜ)孵育原生质体30分钟之后，在叶绿体中检测到蓝色荧光(图11)，其中His-BjCHIl被表达且随后积聚(Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，Taylor PWJ，& Chye M-L (2008) J Exp Bot 59(12)：3475-3484)。在共焦显微镜下只在表达His-BjCHIl的细胞中看到叶绿体的蓝色荧光与红色自动荧光的共定位，而不是在野生型(WT)中，指示叶绿体中的His-BjCHIl被Ni-NTA-AC标记 (图11)。而且，将Ni-NTA-AC (10μΜ)加到PBS缓冲液 (pH 7.4)中以浸渍7天龄叶绿体转基因幼苗的根过夜，在成像之前洗涤并吸干。叶绿体转基因烟草叶的远轴表面经受共焦显微镜法且在表达His-BjCHIl的烟草叶中再次观察到蓝色荧光(图10)，说明探针通过幼苗的根吸收且随后检测到活的叶内的带His-标签的蛋白质。这些结果明确证明探针、Ni-NTA-AC可以容易地延伸以标记各种真核细胞(包括植物组织)的带His-标签的蛋白质。
[0190] 针对任何图或给定特征的数值范围，图或来自一个范围的参数可以与对于相同特征的另一个图或来自对于相同特征的不同范围的参数合并以产生数值范围。
[0191] 除了操作实施例中或另有指定之外，说明书和权利要求书中使用的提及成分的量、反应条件等的所有数字、数值和/或表达应当理解为在所有情况下由术语“约”修饰。
[0192] 讨论
[0193] 蛋白质的化学和生物化学标记充当用于阐明活细胞中的蛋白质功能、定位、动力学以及其它生物事件的有力工具 (Giepmans BNG，Adams SR，Ellisman MH，& Tsien RY (2006) Science 312(5771)：21 7-224；Sletten EM & Bertozzi CR (2009) Angew Chem Int Ed 48(38)：6974-6998；Uttamapinant C，Sanchez MI，Liu DS，Yao JZ，& Ting AY (2013) Nat Protoc 8(8)：1620-1634)。重组蛋白的基于小分子的荧光标记特别有希望成为荧光蛋白(FP)-融合技术的备选(Tsien RY (1998) Ann Rev Biochem 67：509-544；Shaner NC，Steinbach PA，& Tsien RY (2005) Nat Meth 2(12)：905-909)，而不有害地扰乱蛋白质功能。将短肽引入到能够与所设计的合成荧光探针位点特异性结合的目的蛋白是代表性技术，允许分析体内功能蛋白质。最近几十年来，在使用基于小分子的探针来监控细胞事件方面存在巨大进步 (Ueno T & Nagano T (2011 ) Nat Meth 8(8)：642-645； Marks KM & Nolan G (2006) Nat Meth 3(8)：591-596)，特别是，蛋白质的金属螯合标记似乎为有吸引力方法之一，由于其简单和高特异性。在大量的基于小分子的探针中，FlAsH及其衍生物(包括RcAsH和SplAsH)似乎为最成功的基于小分子的含金属探针之一，其往往用于点亮(light-up)与四半胱氨酸基序融合的细胞内蛋白质 (Giepmans BNG，Adams SR，Ellisman MH，& Tsien RY (2006) Science 312(5771)：217-224； Hoffmann C，等. (2010) Nat Protoc 5(10)：1666-1677； Adams SR & Tsien RY (2008) Nat Protoc 3(9)：1 527-1 534)。尽管业已指出该体系具有若干限制，例如需要充分洗涤以降低背景(Stroffekova K，Proenza C，& Beam K (2001 ) Pflugers Archiv 442(6)：859-866)或其不能应用到细胞氧化环境(Soh N (2008) Sensors 8(2)：1004-1024)，但开发基于双砷的荧光探针充当了重要工作，其已鼓舞研究员设计靶向其它标签体系的各种探针。
[0194] 考虑到(组氨酸)6-Ni2+-次氮基三乙酸体系(Ni2+-NTA)在用于基于亲和层析法的蛋白质纯化的分子生物学和生物技术中的广泛实用性，先前亦已广泛利用该体系以经由与荧光团缀合而位点选择性标记大的现有带六组氨酸标签(His-标签)的蛋白质库(Guignet EG，Hovius R，& Vogel H (2004) Nat Biotcchnol 22(4)：440-444； Meredith GD，Wu HY，& Allbritton NL (2004) Bioconjugate Chem 15(5)：969-982； Hauser CT & Tsien RY (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(10)：3693-3697； Hintersteiner M，等. (2008) ChemBioChem 9(9)：1391-1395； Uchinomiya S，Nonaka H，Wakayama S，Ojida A，& Hamachi I (2013 ) Chem Commun. 49(44)：5022-5024)。各种基于NTA的荧光探针经由荧光团与单-NTA缀合合成 (Guignet EG，Hovius R，& Vogel H (2004) Nat Biotechnol 22(4)：440-444； Goldsmith CR，Jaworski J，Sheng M，& Lippard SJ (2006) J Am Chem Soc 128(2 )：418-419)或与二、三和四NTA衍生物缀合合成以模拟FlAsH概念或克服His-标签与Ni2+-NTA的弱结合性质 (Kd=13μΜ) (Soh N (2008) Sensors 8(2)：1004-1024； Jing C & Cornish VW (2011) Acc Chem Res 44(9)：784-792；Uchinomiya S，Ojida A，& Hamachi I (2013) Inorg Chem 53(4)：1816-1823；Lata S，Gavutis M，Tampe R，& Piehler J (2006) J Am. Chem Soc 128(7)：2365-2372；Kapamdis AN，Ebright YW，& Ebright RH (2001) J Am Chem Soc 123(48)：12123-12125)。尽管与单-NTA相比多个螯合剂头-His-标签复合物的稳定性显著提高，这些部分的高度负电荷可防止它们进入细胞。实际上，靶向带His6-标签的蛋白质的目前已报道的所有基于Ni-NTA的荧光探针排他性限制于标记膜蛋白质，由于它们中没有一个可以跨过细胞膜以标记活细胞中的细胞内蛋白质(Hintersteiner M，等. (2008) ChemBioChem 9(9)：1391-1395； Goldsmith CR，Jaworski J，Sheng M，& Lippard SJ (2006) J Am. Chem Soc 128(2)：418-419)。二NTA双溴二胺(dibromobimane)缀合物进入细胞以靶向含多组氨酸的蛋白质的先前主张并不令人信服，因为使用全细胞进行荧光测量，且其结果并没有被体内细胞成像数据证实(Krishnan B，Szymanska A，& Gierasch LM (2007) Chem Biol Drug Des 69(1)：31-40)。因此很大可能是在用探针处理全细胞之后所观察到的荧光将最可能衍生自来自细胞膜的含多组氨酸的蛋白质的结合。
[0195] 最近报道了含有α-氯乙酰胺、靶向Cys-添加的His-标签(Cys-His6-标签)的基于二NTA的荧光探针能够标记活细胞中的细胞内带Cys-His6-标签的蛋白质。(Uchinomiya S, Nonaka H, Wakayama S, Ojida A，& Hamachi I (2013) Chem Commun,49(44): 5022-5024)。然而，二NTA荧光团缀合物本身几乎不能进入细胞，除非该缀合物与货物附接，所述货物由细胞穿透肽和荧光猝灭剂(具有丹磺酰基、四His和八Arg的丹磺酰基附加的二十肽)组成，促使探针进入细胞以标记带Cys-His6-标签的蛋白质而不是带His6-标签的蛋白质。除了该探针相对较大且制备起来复杂得多之外，所述方法排除其在标记许多现有His6-标签库而不重新亚克隆每一个单独基因的应用。而且，对标记相对慢的动力学(在1小时内80%的产率)还防止其用于蛋白质实时成像。因此，高度优选设计小且简单的荧光探针，其具有良好膜渗透性以快速标记任何细胞内蛋白质(只要与His6-标签融合)。
[0196] 本公开提供了新荧光探针Ni-NTA-AC的设计、合成和应用，其呈现优异的膜渗透2+
性，可以快速进入细胞以使细胞内带His6-标签的蛋白质成像(图3A)。该探针通过Ni -NTA特异性靶向带His6-标签的蛋白质，具有约13倍荧光接通响应。将芳基叠氮化物掺入探针，起初目的在于克服Ni2+和组氨酸之间的弱结合性质，然而意料不到地，对于荧光增强其亦是必不可少的。我们的探针可以用于使不同类型的细胞甚至植物组织中的His-标签蛋白质成像。快速显现与His6-标签基因融合的细胞内蛋白质的能力为不同类型的活细胞中的大量现有带His6-标签的蛋白质的空间和功能分析提供巨大潜在性。
性，可以快速进入细胞以使细胞内带His6-标签的蛋白质成像(图3A)。该探针通过Ni -NTA特异性靶向带His6-标签的蛋白质，具有约13倍荧光接通响应。将芳基叠氮化物掺入探针，起初目的在于克服Ni2+和组氨酸之间的弱结合性质，然而意料不到地，对于荧光增强其亦是必不可少的。我们的探针可以用于使不同类型的细胞甚至植物组织中的His-标签蛋白质成像。快速显现与His6-标签基因融合的细胞内蛋白质的能力为不同类型的活细胞中的大量现有带His6-标签的蛋白质的空间和功能分析提供巨大潜在性。
[0197] 结论。(组氨酸)6-Ni2+-次氮基三乙酸体系(Ni-NTA)在蛋白质纯化中的巨大成功引起开发使带His标签的蛋白质成像的基于小Ni-NTA的荧光探针的极大兴趣。考虑到现有带His标签的蛋白质库较大，这种探针提供在生理学有关条件下功能研究各种细胞内蛋白质的广泛实用性和多功能性。本发明公开了第一个小细胞可渗透荧光探针Ni-NTA-AC，其能够快速标记(约2分钟)且观察到许多不同类型的活细胞且甚至植物组织中的细胞内带组氨酸标签的蛋白质，且具有大量潜在应用。该探针对细胞内His-标签蛋白质呈现高特异性和标记效率。而且，该探针由于其小尺寸对活细胞中的蛋白质功能和定位具有较少干扰，且当标记小蛋白质时，其相对于大荧光蛋白具有显著优点。本发明开辟了用于原位分析不同类型的细胞中所有蛋白质的空间分布和功能的高度有教益的方法。
[0200] 应当理解文中所述实施例和实施方案只用于说明的目的，且本领域技术人员将想到鉴于此的各种修改或改变，且包括在本申请的精神和范围内。
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