首页 / 专利库 / 葡萄栽培 / 葡萄栽培 / 一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法

一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法

阅读:10发布:2020-05-08

专利汇可以提供一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种从箭麻内生 真菌 中分离蜜环菌的方法,针对现有分离蜜环菌方法存在分离材料受限、易染杂菌、菌株易退化等问题,而创新研究的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,包括箭麻预处理、组织分离、组织培养、内生真菌分离、纯化与保藏,经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前,需要与天麻进行栽培试验,栽培试验包括白麻+蜜环菌的无性栽培、天麻 种子 +萌发菌+蜜环菌的有性栽培。本发明实用性强,操作方便,应用这种方法能达到分离污染率低、分离出的蜜环菌菌株在天麻栽培中侵染性强且不易退化的效果。,下面是一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法专利的具体信息内容。

1.一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,包括(1)箭麻预处理、(2)组织分离、(3)组织培养、(4)内生真菌分离、(5)纯化与保藏;
所述步骤(1)箭麻预处理:选取当年采集的进入停长期的商品天麻,用自来冲洗
30min,洗净泥沙,避免损伤天麻,再用无菌水将材料冲洗1~2次;
所述步骤(2)组织分离:用无菌解剖刀将箭麻切成1cm~2cm长的小段,用刀轻轻刮去表面,用无菌水反复冲洗2~3次,再以75%的酒精冲洗30s,取出后再用无菌水反复冲洗3~4次,在无菌滤纸上吸去表面水分,再置于0.1%升汞溶液浸泡消毒1min,再用无菌水清洗3~
4次,用无菌吸水纸吸去表面水分,置于垫有无菌滤纸的表面皿上;
所述步骤(3)组织培养:用无菌解剖刀和镊子将天麻横切成0.5cm×0.5cm的方形小,接种于含有抗生素的改良PDA培养基的培养皿上,培养皿用报纸包好,16℃下暗培养3d,能够有效的减少霉菌的污染,再转移至24℃的培养箱中培养15d;
所述步骤(4)内生真菌分离:培养期间蒂除有颜色的杂菌,蜜环菌基内菌丝为白色网状分支,观察培养基内部是否有根状菌索伸出,若没有进行二次分离;待透明状或白色菌丝长出,且培养基内部是否有根状菌索伸出后,挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中,置于24℃培养15d;
所述步骤(5)纯化与保藏:所得菌株均采用改良PDA培养基纯化,无菌条件下,挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中,置于24℃培养15d,直至纯培养,每株菌备份5份,4℃保藏。
2.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:所述改良PDA培养基:铃薯(去皮)200.0g,玉米粉30.0g,葡萄糖20.0g,琼脂12.0g,KH2PO45.0g,MgSO43.0g,蛋白胨5.0g,VB110.0mg,pH自然,加水定容至1000mL;分装至试管中,装液量为试管的2/3,高压灭菌后直立放置,待用。
3.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:所述含有抗生素的改良PDA培养基:在所述改良PDA培养基中添加氯霉素25μg/mL和链霉素10μg/mL,培养基经高温高压灭菌后,冷却至40℃~50℃左右添加氯霉素和链霉素,其中氯霉素的贮存液浓度为34mg/mL,链霉素的贮存液浓度为10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前,需要与天麻进行栽培试验,所述栽培试验包括白麻+蜜环菌的无性栽培、天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培。
5.根据权利要求4所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:所述白麻+蜜环菌的无性栽培选择室内栽培,栽培用培养箱采用长×宽×高=65cm×40cm×
45cm的PP塑料培养箱,培养箱底部先铺层河沙,厚度5cm,放上栽培菌材,菌材之间间隔为
6cm~8cm,放入培养好的蜜环菌三级种,保证菌材的截面与鳞口必须摆放蜜环菌,紧贴蜜环菌摆放白麻,盖上湿度为60%的河沙与木屑的混合物,厚度以完全覆盖菌材10cm为宜。
6.根据权利要求4所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:所述天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培是在培养箱中铺5cm厚潮湿的河沙,将培养好的萌发菌栽培种撕开,均匀平铺于培养箱中,将天麻蒴果种子均匀的洒上后,拌匀,附上保鲜膜,保鲜膜用牙签均匀扎眼,便于透气,于24℃下培养3d~5d,待树叶表面变白,即可用于栽培种子。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:温度控制在25℃以下,夏季最高不超过30℃,湿度控制在60%,管理期间不需要施肥和松土,秋季湿度控制在50%左右,冬季湿度在30%即可,生长期为8个月,产量统计以白麻重量表示。
8.根据权利要求5所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:所述蜜环菌三级种的制备为选择预先分离筛选的蜜环菌菌种,制备蜜环菌栽培种,栽培种选用
550mL的塑料栽培瓶,栽培配方为枝条80%,豆粉9%,玉米粉10%,蔗糖1%,混匀,加水至瓶口2cm处,采用高压蒸汽灭菌锅,121℃,1.1KPa灭菌2h,冷却至常温后接种,24℃培养50d。
9.根据权利要求6所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:所述萌发菌栽培种的制备为青冈木树叶80%,木屑10%,麸皮10%,加水拌匀,湿度在60%左右,装袋,选用17cm×33cm的聚丙烯菌袋,采用高压蒸汽灭菌锅,121℃,1.1KPa灭菌2h,冷却至常温后接种,24℃培养50d。
10.根据权利要求5或8所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,其特征在于:
所述菌材为长度30cm、直径6cm~8cm,所述菌材使用前砍深度约2cm的鱼鳞口,所述菌材选择青冈木材料。

说明书全文

一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法

技术领域

[0001] 本发明属于蜜环菌分离技术领域,具体而言,涉及一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法。

背景技术

[0002] 蜜环菌属真菌俗名榛蘑、苞谷菌,隶属于真菌界、担子菌亚、伞菌纲、伞菌目、白蘑科。该属真菌在世界约有40种,在中国分布也较为广泛,华中、西南地区和东北地区均有分布。蜜环菌是名贵中药天麻和猪苓重要的共生菌,天麻95%的生长期间均需要蜜环菌以根状菌索的形式提供营养物质。有研究表明用不同来源的蜜环菌菌株伴栽天麻,天麻的产量和质量不同,同时优质的蜜环菌能够有效的提高天麻素含量。因此,选择与天麻亲和性高的蜜环菌菌种栽培天麻是保障天麻生产的关键因素之一。
[0003] 分离纯化蜜环菌菌种,对获取种质资源以及开展育种工作都具有十分重要的意义,当前常用的分离方法中,子实体分离法由于人工栽培蜜环菌子实体较困难,野生材料难于获得;菌索及菌木分离法技术较为复杂,易染杂菌,操作难度大、成功率低;2006年,肖波等在《生物学通报》上发表学术论文“蜜环菌菌种分离新法——天麻组织分离法”,利用蜜环菌菌索侵入白麻皮层组织,蜜环菌菌丝体穿插于白麻皮层及细胞间,所以分离材料采用了种麻的表皮组织,但此法存在分离材料受限(仅白麻皮层)、分离培养易染菌的问题,而且菌株性状不稳定高,往往分离当年的菌株活性表现良好,转接到第二、三代后,容易出现菌株退化现象。

发明内容

[0004] 为了解决上述技术问题,本发明公开了一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,本发明通过箭麻预处理、组织分离、组织培养、内生真菌分离、纯化与保藏,以此达到蜜环菌分离、不易染菌、保持种性稳定的目的。
[0005] 为了实现所述发明目的,本发明采用如下技术方案:
[0006] 一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法,包括(1)箭麻预处理、(2)组织分离、(3)组织培养、(4)内生真菌分离、(5)纯化与保藏;
[0007] 所述步骤(1)箭麻预处理:选取当年采集的进入停长期的商品天麻,用自来冲洗30min,洗净泥沙,避免损伤天麻,再用无菌水将材料冲洗1~2次;
[0008] 所述步骤(2)组织分离:用无菌解剖刀将箭麻切成1cm~2cm长的小段,用刀轻轻刮去表面,用无菌水反复冲洗2~3次,再以75%的酒精冲洗30s,取出后再用无菌水反复冲洗3~4次,在无菌滤纸上吸去表面水分,再置于0.1%升汞溶液浸泡消毒1min,再用无菌水清洗3~4次,用无菌吸水纸吸去表面水分,置于垫有无菌滤纸的表面皿上;
[0009] 所述步骤(3)组织培养:用无菌解剖刀和镊子将天麻横切成0.5cm×0.5cm 的方形小,接种于含有抗生素的改良PDA培养基的培养皿上,培养皿用报纸包好,16℃下暗培养3d,能够有效的减少霉菌的污染,再转移至24℃的培养箱中培养15d;
[0010] 所述步骤(4)内生真菌分离:培养期间蒂除有颜色的杂菌,蜜环菌基内菌丝为白色网状分支,观察培养基内部是否有根状菌索伸出,若没有进行二次分离;待透明状或白色菌丝长出,且培养基内部是否有根状菌索伸出后,挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中,置于24℃培养15d;
[0011] 所述步骤(5)纯化与保藏:所得菌株均采用改良PDA培养基纯化,无菌条件下,挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中,置于24℃培养15d,直至纯培养,每株菌备份5份,4℃保藏。
[0012] 优选的,所述改良PDA培养基:铃薯(去皮)200.0g,玉米粉30.0g,葡萄糖20.0g,琼脂12.0g,KH2PO45.0g,MgSO43.0g,蛋白胨5.0g,VB110.0 mg,pH自然,加水定容至1000mL;分装至试管中,装液量为试管的2/3,高压灭菌后直立放置,待用。
[0013] 优选的,所述含有抗生素的改良PDA培养基:在所述改良PDA培养基中添加氯霉素25μg/mL和链霉素10μg/mL,培养基经高温高压灭菌后,冷却至 40℃~50℃左右添加氯霉素和链霉素,其中氯霉素的贮存液浓度为34mg/mL,链霉素的贮存液浓度为10mg/mL。
[0014] 优选的,经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前,需要与天麻进行栽培试验,所述栽培试验包括白麻+蜜环菌的无性栽培、天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培。
[0015] 优选的,所述白麻+蜜环菌的无性栽培选择室内栽培,栽培用培养箱采用长×宽×高=65cm×40cm×45cm的PP塑料培养箱,培养箱底部先铺层河沙,厚度5 cm,放上栽培菌材,菌材之间间隔为6cm~8cm,放入培养好的蜜环菌三级种,保证菌材的截面与鳞口必须摆放蜜环菌,紧贴蜜环菌摆放白麻,盖上湿度为60%的河沙与木屑的混合物,厚度以完全覆盖菌材10cm为宜。
[0016] 优选的,所述天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培是在培养箱中铺5cm厚潮湿的河沙,将培养好的萌发菌栽培种撕开,均匀平铺于培养箱中,将天麻蒴果种子均匀的洒上后,拌匀,附上保鲜膜,保鲜膜用牙签均匀扎眼,便于透气,于24℃下培养3d~5d,待树叶表面变白,即可用于栽培种子。
[0017] 优选的,温度控制在25℃以下,夏季最高不超过30℃,湿度控制在60%,管理期间不需要施肥和松土,秋季湿度控制在50%左右,冬季湿度在30%即可,生长期为8个月,产量统计以白麻重量表示。
[0018] 优选的,所述蜜环菌三级种的制备为选择预先分离筛选的蜜环菌菌种,制备蜜环菌栽培种,栽培种选用550mL的塑料栽培瓶,栽培配方为枝条80%,豆粉9%,玉米粉10%,蔗糖1%,混匀,加水至瓶口2cm处,采用高压蒸汽灭菌锅,121℃,1.1KPa灭菌2h,冷却至常温后接种,24℃培养50d。
[0019] 优选的,所述萌发菌栽培种的制备为青冈木树叶80%,木屑10%,麸皮10%,加水拌匀,湿度在60%左右,装袋,选用17cm×33cm的聚丙烯菌袋,采用高压蒸汽灭菌锅,121℃,1.1KPa灭菌2h,冷却至常温后接种,24℃培养50d。
[0020] 优选的,所述菌材为长度30cm、直径6cm~8cm,所述菌材使用前砍深度约2cm的鱼鳞口,所述菌材选择青冈木材料。
[0021] 由于采用了上述技术方案,本发明具有如下有益效果:
[0022] 1、本发明从箭麻组织中分离的内生真菌,进而选育的蜜环菌菌株,与天麻的亲和性高,选择与天麻亲和性高的蜜环菌菌种栽培天麻是保障天麻生产的关键因素之一。相对于传统子实体或孢子分离方法,具有生长速度快,污染率低等优势,分离出的菌株受药物刺激少,与天麻的亲和性好,在天麻栽培中侵染性较强,克服了传统复壮方法难以解决的蜜环菌退化问题。
[0023] 2、本发明采用了一套避免杂菌污染措施。在组织分离时需要精确掌握75%酒精和0.1%升汞的浸泡时间,时间过短,杀菌不彻底,时间过长,菌索失去活。在分离过程中,先在16℃下暗培养3d,能够有效的减少霉菌的污染,在分离培养基中添加2种或两种以上抗生素能够有效避免细菌的污染。菌株形态特征观察中,要经常进行观察记录,若出现菌株污染现象,应及时转接或补充。
[0024] 3、本发明创新了改良PDA培养基,菌丝的浓密度与培养基的营养成分有很大关系,选择合适的培养基,调整好氮比,能够有效的提高菌种的性状。
[0025] 4、本发明提出经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前,需要与天麻进行白麻+蜜环菌的无性栽培试验、天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培试验,进一步对蜜环菌菌株进行复壮,避免出现菌株退化现象。附图说明
[0026] 图1是18株蜜环菌的试管生长情况;
[0027] 图2是18株蜜环菌的菌索生长速度;
[0028] 图3是在米麻-蜜环菌组合下,18株蜜环菌对红杆天麻、乌杆天麻产量的影响;
[0029] 图4是在石斛小菇-蜜环菌-天麻种子组合下,18株蜜环菌对红杆天麻、乌杆天麻产量的影响。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例,对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明。理当明确的是,下述说明仅用于解释说明本发明,而不应理解为对本发明的限制。本发明的方法如无特殊说明,均为本领域常规方法;所用试剂如无特殊说明,均为本领域常用试剂、均可从商业途径获得。
[0031] 实施例一:从箭麻内生真菌中分离蜜环菌试验
[0032] 1材料:
[0033] 箭麻采自秦巴山区天麻主要生长点。
[0034] 改良PDA培养基:马铃薯(去皮)200.0g,玉米粉30.0g,葡萄糖20.0g,琼脂12.0g,KH2PO4 5.0g,MgSO4 3.0g,蛋白胨5.0g,VB1 10.0mg,pH 自然,加水定容至1000mL;分装至试管中,装液量为试管的1/3,高压灭菌后直立放置,待用。
[0035] 抗生素培养基:PDA培养基添加氯霉素(25μg/mL)和链霉素(10μg/mL),培养基经高温高压灭菌后,冷却至40-50℃左右添加氯霉素和链霉素。其中氯霉素的贮存液浓度为34mg/mL,链霉素的贮存液浓度为10mg/mL。
[0036] 2方法
[0037] 2.1箭麻预处理:选取当日采集的进入停长期的商品天麻,用自来水冲洗30min,洗净泥沙,避免损伤天麻,再用无菌水将材料冲洗1~2次。
[0038] 2.2组织分离:用无菌解剖刀将箭麻切成1~2cm长的小段,用刀轻轻刮去表面,用无菌水反复冲洗2~3次,再以75%的酒精冲洗30s,取出后再用无菌水反复冲洗3~4次,在无菌滤纸上吸去表面水分,再置于0.1%升汞溶液浸泡消毒 1min,再用无菌水清洗3~4次,用无菌吸水纸吸去表面水分,置于垫有无菌滤纸的表面皿上。
[0039] 2.3组织培养:用无菌解剖刀和镊子将天麻横切成0.5cm×0.5cm的方形小块,接种于含有抗生素的改良PDA培养基的培养皿上,每皿仅接1块,紧贴培养基,培养皿用报纸包好,16℃下暗培养3d,转移至24℃的培养箱中培养15d。
[0040] 2.4内生真菌分离:培养期间蒂除有颜色的杂菌,蜜环菌菌丝为白色网状分支,观察培养基内部是否有根状菌索伸出,若没有进行二次分离;待透明状或白色菌丝长出,且培养基内部是否有根状菌索伸出后,挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中,置于24℃培养15d。
[0041] 2.5纯化与保藏:所得菌株均采用改良PDA培养基纯化,无菌条件下,挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中,置于24℃培养15d,直至纯培养。每株菌备份 5份,4℃保藏。
[0042] 3结果与分析
[0043] 经分离纯化共获得18株蜜环菌,结果如图1。
[0044] 培养3-5d,观察可发现在原接种点处出现白色或透明的菌丝,伴随菌丝生长菌索也随即进行生长。15-20d大部分菌株可长满试管及培养皿。记录菌丝菌索形态特征,菌丝、菌索颜色记录以5d内颜色不变时的颜色为准。
[0045] 无菌操作下分别接种18株蜜环菌至直立试管,24℃培养15d,期间隔天进行观察记录,结果如图2。在相同培养基及培养条件下,18株蜜环菌的生长速度存在明显差异。18株蜜环菌中,ZY-18的菌索生长速度最快,达到1.71cm/d,其次是ZY-2、ZY-8、ZY-10菌索的平均生长速度达到1.5cm/d,长势最慢的为 ZY-11,菌索的平均生长速度只有0.67cm/d,18株蜜环菌的总平均生长速度为 1.133cm/d,ZY-4、ZY-6、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-16、ZY-17的生长速度均低于这个平均值,ZY-18的生长速度比总平均值高0.577cm/d,比ZY-11 的生长速度高1.04cm/d。
[0046] 24℃下,无菌操作下接种18株蜜环菌至培养皿培养3d,5d,7d,9d, 11d和15d分别进行观察记录18株的菌索萌发时间以及测量菌索的生长距离, 18株蜜环菌的菌丝、菌索颜色,浓密度,菌索分支,粗细,色素含量,荧光强度,生长速度等特征差异明显。
[0047] 从培养皿的菌索形态可以分为两大类,ZY-2、ZY-4、ZY-6、ZY-7、ZY-13、 ZY-18此6株菌菌索顶端分叉方式为单轴分支,分支少;菌索颜色均为棕色或红棕色,且培养阶段观察发现其菌丝浓密度稀疏,菌索较细,形状为圆柱状;荧光强度除ZY-7、ZY-18外其余菌株均表现的不强,生长期间色素只有ZY-3、ZY-8、 ZY-15产生较多,其余色素产生很少;生长速度除ZH-7外,均接近总平均生长速度1.133cm/d。
[0048] ZY-1、ZY-3、ZY-5、ZY-8、ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-14、ZY-15、 ZY-16、ZY-17菌索顶端分支方式为叉状分支,分支较多;培养期间,大部分菌株菌丝白而浓密,菌索粗壮且密集,部分交织成网格状,菌索颜色以白色和红棕色为主,菌索形状上ZY-1,ZY-3、ZY-5、ZY-8、ZY-10、ZY-14、ZY-15呈圆柱状,ZY-9、ZY-11、ZY-12、ZY-16、ZY-17呈扁平状;荧光强度上ZY-4、ZY-6、 ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14的荧光强度很弱,ZY-2、ZY-8、ZY-16的荧光强度中等,ZY-1、ZY-3、ZY-5、ZY-7、ZY-9、ZY-10、ZY-15、ZY-17、ZY-18的荧光强度强;产生色素上ZY-
1、ZY-2、ZY-4、ZY-5、ZY-6、ZY-7、ZY-9、ZY-10、 ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-16、ZY-17、ZY-18的色素产生很少,ZY-3、 ZY-8、ZY-15的色素含量比较多;菌索生长方面ZY-11、ZY-14、ZY-16生长速度缓慢,只有0.6-0.8cm/d,其余菌株菌索的生长速度均接近总平均生长速度 
1.133cm/d。
[0049] 综合以上特征,ZY-3、ZY-9、ZY-15、ZY-17菌丝洁白浓密,菌索粗壮浓密,分支多,颜色白色或红棕色,荧光强度强,生长速度快,初步推断为18株蜜环菌的优势菌株。
[0050] 4讨论
[0051] 组织分离时需要精确掌握75%酒精和0.1%升汞的浸泡时间,时间过短,杀菌不彻底,时间过长,菌索失去活力。在分离过程中,先在16℃下暗培养3d,能够有效的减少霉菌的污染,在分离培养基中添加2种或两种以上抗生素能够有效避免细菌的污染。
[0052] 菌株形态特征观察中,要经常进行观察记录,若出现菌株污染现象,应及时转接或是补充,在进行统计时保证生长温度,生长时间相同的条件下进行记录。在培养试管种和培养皿菌种时发现,相同时间下,培养皿的生长速度明显快于试管1-3d,并且试管中有蜜环菌的代谢产物存在,而培养皿中未发现其存在,这可能是试管采用的是胶塞子,气含量低,抑制菌索生长,导致生长缓慢,产生代谢产物。
[0053] 菌株在培养皿中进行形态学比较中,受培养条件,菌株优劣的影响,在实际比较中,可能会存在一定的误差,如ZY-5、ZY-14、ZY-18在培养初期,菌索颜色为白色或红棕色,随着生长周期的延长,菌索转变为红棕色或是棕色。ZY-8、 ZY-13在木屑-麸皮培养基中菌丝生长旺盛,浓密,颜色洁白,在进行形态学观察中,为了保持培养条件相同,转接至PDA培养基中,菌丝稀疏、颜色透明, ZY-13培养皿中甚至出现无菌丝直接进入菌索阶段的现象。这极可能是培养条件的改变造成的。从另一方,也说明的一个信息点,菌丝的浓密度与培养基的营养成分有很大关系,选择合适的培养基,调整好碳氮比,能够有效的提高菌种的性状。
[0054] 实施例二天麻与蜜环菌栽培试验
[0055] 1材料
[0056] 供试蜜环菌选择ZY-1至ZY-18共计18株蜜环菌,萌发菌为石斛小菇。试验用天麻蒴果:包括红杆天麻、绿杆天麻2种,均采自秦巴山区天麻自然分布区。栽培菌材:栽培用的菌材选择青冈木材料,大材(长度30cm,直径8cm),小材(长度10cm,直径2cm),段木(长3cm,直径2cm)。大材与小材使用前砍深度约2cm的鱼鳞口。
[0057] 2方法
[0058] 2.1菌种制备:蜜环菌三级种制备:选择预先分离筛选的蜜环菌菌种,制备蜜环菌栽培种,栽培种选用8×17cm的塑料栽培瓶,栽培配方为80%枝条(长3cm,直径2cm),豆粉9%,玉米粉10%,蔗糖1%,混匀,加水至瓶口2cm处。采用高压蒸汽灭菌锅,121℃,1.1KPa灭菌2h,冷却至常温后接种,24℃培养 50d。
[0059] 2.2萌发菌栽培种制备:青冈木树叶80%,木屑10%,麸皮10%,加水拌匀,湿度在60%左右,装袋(选用17×33cm的聚丙烯菌袋),灭菌及培养方法同上。
[0060] 2.3米麻与蜜环菌无性栽培:栽培方式选择为室内栽培,栽培用培养箱(长×宽×高=65×40×45 PP塑料培养箱),培养箱底部先铺层河沙,厚度5cm,放上栽培菌材,菌材之间间隔为6-8cm,放入培养好的蜜环菌三级种,保证菌材的截面与鳞口必须摆放蜜环菌,紧贴蜜环菌摆放白麻,盖上湿度为60%的河沙与木屑的混合物,厚度以完全覆盖菌材10cm为宜。
[0061] 日间管理过程中,温度控制在25℃以下,夏季最高不超过30℃,湿度控制在60%,管理期间不需要施肥和松土,秋季湿度控制在50%左右,冬季湿度在 30%即可。生长期为8个月,产量统计以白麻重量表示。
[0062] 2.4天麻种子与萌发菌、蜜环菌的有性栽培:培养箱中铺5cm厚潮湿的河沙,将培养好的萌发菌栽培种撕开,均匀平铺于培养箱中,将天麻蒴果种子均匀的洒上后,拌匀,附上保鲜膜(保鲜膜用牙签均匀扎眼,便于透气),24℃下培养 5-7d,待树叶表面变白,即可用于栽培种子。蜜环菌栽培过程及后期管理同无性栽培。8个月后统计产量,以白麻重量表示。
[0063] 3结果与分析
[0064] 3.1米麻-蜜环菌产量统计:经过8个月的生长,统计天麻产量,以每箱天麻的总重量来统计结果,如表1、图3。
[0065] 表1米麻-蜜环菌组合下红、乌天麻产量
[0066]
[0067]
[0068] 由表1、图3得知,18株蜜环菌分别与红杆天麻和乌杆天麻伴栽的过程中, ZY-17对红杆天麻的产量明显优于其他菌株,为2.931kg/箱,菌株ZY-12的产量最低,为0.318kg/箱。ZY-4、ZY-6、ZY-10、ZY-11、ZY-13、ZY-14的天麻产量在0.4-1.0kg/箱之间,ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-5、ZY-9、ZY-15、ZY-16、ZY-18 的天麻产量在1.0-2.5kg/箱;ZY-17对乌天麻的产量明显优于其他菌株,为1.523 kg/箱,菌株ZY-11产量最低,为0.178kg/箱,ZY-4、ZY-6、ZY-10、ZY-
12、ZY-13、 ZY-14次之,天麻的产量少于0.5kg/箱,其余菌株产量无明显差异,在0.65-
1.5kg/ 箱之间。
[0069] 3.2石斛小菇-蜜环菌-天麻种子产量统计
[0070] 表2石斛小菇-蜜环菌-天麻种子组合下红乌天麻产量
[0071]
[0072] 萌发菌-蜜环菌与天麻种子伴栽产量统计结果如表2、图4所示,在天麻有性繁殖阶段,与红杆天麻种子伴栽的蜜环菌中,产量最高的菌株是ZY-9,米麻总产量为1.277kg/箱,与乌杆天麻种子伴栽的蜜环菌中产量最高的是ZY-17,为 1.004kg/箱,ZY-9、ZY-5次之,为0.893kg/箱、0.776kg/箱;ZY-6、ZY-10、ZY-11、 ZY-12、ZY-13、ZY-14的产量普遍很低,少于
0.103kg/箱;其他菌株的产量在 0.21-0.65kg/箱,产量不高且差异不显著。
[0073] 综上所述,无性繁殖阶段,与红杆天麻伴栽,产量高的菌株有ZY-5、ZY-9、 ZY-17、产量相对较高的有ZY-3、ZY-15、ZY-16、ZY-18;18株蜜环菌与乌杆天麻伴栽过程中,产量高的菌株有ZY-5、ZY-9、ZY-17,产量相对较高的菌株有 ZY-1、ZY-3、ZY-7、ZY-8、ZY-15、ZY-16、ZY-18。
[0074] 有性繁殖阶段,18株蜜环菌与萌发菌及红杆天麻、乌杆天麻种子伴栽试验中,米麻产量最高的3株蜜环菌与无性阶段相同,仍然是ZY-5、ZY-9、ZY-17,其他菌株的产量明显弱于此3株菌。
[0075] 4讨论
[0076] 在18株蜜环菌与天麻伴栽的试验中,无论是无性繁殖阶段,还是有性繁殖阶段,产量高的ZY-5、ZY-9、ZY-17均是高卢蜜环菌族的属种,说明这与蜜环菌自身的特点有关。高卢蜜环菌族的菌株最明显的特点是营寄生性弱,营腐生为主。而其他菌株则表现最明显的特点均是以营寄生为主。蜜环菌的营寄生特点使得它均有很强的致病性和侵蚀力,能够快速进入树木根部,破坏林木根系,在温带,亚热带地区,大面积的林木皆因被感染蜜环菌而造成林木的大面积死亡。弱寄生能力使得在栽培天麻过程中,既能够侵染天麻,与天麻形成寄生关系,同时强的腐生关系能够为天麻提供营养,温和的天麻形成共生关系。其次是高卢蜜环菌族绝大多数成员的菌索分支多,在土壤中能够交织成网状,能够高效的与天麻建立共生关系。
[0077] 在红杆天麻和乌杆天麻的对比中,相同条件相同菌株的情况下,红杆天麻的产量明显高于乌杆天麻,这可能与天麻自身的特点有关。红杆天麻主要分布在海拔800-1500m的山区,包括陕西汉中地区及各县,均是红天麻的主要种植基地,具有适宜的环境,同时在长期的种植过程中,无形的对红天麻进行了认为的筛选,使得红杆天麻能够完全适应这种环境;乌杆天麻主要分布在东北长白山地区以及海拔1500m以上的高山区,秦巴山区从严格意义上来说,乌杆天麻对环境的适应度不如红杆天麻。因此,在栽培试验中,尽管ZY-5、ZY-9、ZY-17 的产量在18株菌中是产量最高的,但从整体上来看,产量明显偏低,间接的说明种植地区及气候的重要性。
[0078] 随着天麻栽培面积的扩大,利用人工杂交授粉技术培养乌红杂交天麻品种,该品种既能够如红杆天麻一样在秦巴地区完全生长,同时能够获得部分乌杆天麻的营养成分。充分解决了乌天麻产量低,栽培困难的难题。工业化生产的白麻、米麻种整齐,无虫害,种子成麻率高,生长能力强,种麻的生产周期最多可虽短10个月,乌红杂交商品麻的生产周期有
36个月可缩短到17个月,并且利用杂交技术栽培分化的白麻和米麻少,形成的箭麻多,栽培的天麻具有产量高,抗逆性强,含水量多,天麻素含量高的特点。
[0079] 本发明未详述部分为现有技术
[0080] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈