一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用
专利汇可以提供一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱由8对SSR标记组成。构建方法包括：(1)菌丝培养；(2)基因组DNA的提取；(3)SSR分子标记的检测；(4) 电泳 检测。应用包括：对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇7402菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，利用本发明构建的7402菌种SSR指纹图谱，在收集的40个历年来我国香菇主要栽培品种中具有专一性。，下面是一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于：该指纹图谱由8对SSR标记组成，具体序列如下：
1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；
反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；
76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；
反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；
43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；
反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；
16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；
反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；
19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；
反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；
148-1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；
反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；
002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；
反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；
192-1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；
反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；
所述菌种的带型编号组合为：(0)(2)(2)(1+5)(3+4)(1)(1+2)(1+2+3+5)。
2.一种如权利要求1所述的香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：
(1)将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-4d后收集菌丝；
(2)用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
(3)对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增；
(4)将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。
3.根据权利要求2所述的一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：
(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，轻摇混匀；
(2)12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀10min，
12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，混匀10min，12000rpm、
4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
(5)在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，摇动5min，8000rpm、4℃离心
10min，去上清；
(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次，每次8000rpm，室温离心5min；
(7)加入预冷的95vol％乙醇，上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
(8)加入100μL 1×TE缓冲液，使沉淀溶解；
(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。
4.根据权利要求2所述的一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中的PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH2O 10.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
5.根据权利要求2所述的一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中的加样缓冲液用量为2μL；PCR扩增得到的产物点样量为3μL。
6.根据权利要求2所述的一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中的变性的具体工艺为于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却
3min。
7.根据权利要求2所述的一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为：变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min。
8.根据权利要求2所述的一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中的银染的具体工艺为：电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分后，在银染液中避光银染8min，银染后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数。
9.根据权利要求8所述的一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述银染液的组成为1.5g AgNO3和1500ml H2O；显影液的组成为16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛。
10.一种如权利要求1所述的香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱的应用，其特征在于：应用于鉴定香菇7402菌种相对于其他香菇栽培品种的特异性。
一种香菇7402菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用
技术领域
背景技术
发明内容
本发明对大量的SSR引物进行了筛选，获得了8对多态性高的引物，用这8对引物组合获得的图谱带型，检测目前我国主要栽培的40个香菇品种大多都具有专一性。这8对SSR标记的详细信息如表1。
附图说明
具体实施方式
200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果。
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