技术领域
[0001] 本
发明属于食用菌栽培技术领域，涉及菌种栽培，具体涉及一种朱红硫磺菌菌株培育方法以及人工培育方法。
背景技术
[0002] 朱红硫磺菌(Laetiporus sulphureus)隶属担子菌
门 (Basidiomycota)，伞菌亚纲(Agaricomycetes)，多孔菌目 (Polyporales)、拟层孔菌科(Fomitopsidaceae)、硫磺菌属 (Laetiporus)，是一种食药兼用的大型
真菌，具有很高的营养价值和药用价值。朱红硫磺菌主要分布于我国河北、西藏、新疆、陕西、四川、福建等地区，属于中、低温型菌类，生于落叶松等针叶树干和栎树等阔叶树干的基部。朱红硫磺菌子实体幼嫩至成熟时可食用，似鲑鱼，
味道鲜美，营养丰富，含有多种人体必需的
氨基酸和药用成分，老后呈干酪状，不宜食用，但可入药。朱红硫磺菌药用，性温、味甘，具有降血脂、抗
肿瘤、延缓衰老、提高人体免疫
力等功效；此外，其子实体含齿孔酸，可合成甾体药物肾上腺皮质
激素，也是
预防和
治疗多种
疾病的重要药物。因此，朱红硫磺菌人工栽培具有广阔的应用发展前景。
[0003] 目前，国内对朱红硫磺菌的人工栽培已经出现了最新的袋栽方式，但是经试验后发现该技术目前还存在产量不高、以及朱红硫磺菌的生长栽培
质量不稳定的现象。目前，普遍分析原因有两个，一是朱红硫磺菌菌株本身质量不过关，例如活性不高可能导致的产量低的问题，另一个原因是朱红硫磺菌的人工栽培技术还有待改进。
发明内容
[0004] 针对目前朱红硫磺菌袋栽技术存在的
缺陷，本发明的目的首先是获取一种活性高，有利于朱红硫磺菌产量以及质量的菌株，在此
基础上，本发明的另一个目的是基于获取的菌株，提供一套先进的朱红硫磺菌人工栽培技术，彻底从两个根源上解决目前朱红硫磺菌袋栽技术存在的问题，以期为朱红硫磺菌进一步开发利用提供理论参考依据。
[0005] 为此，本发明采取的技术手段如下：
[0006] 首先，本发明提供一种朱红硫磺菌菌株的培育方法，具体包括如下步骤：
[0007] 步骤1，将朱红硫磺菌原种接种于人工栽培培养基中进行发菌；发菌条件包括：
温度为15-18℃，空气
相对湿度为55％-65％，二
氧化
碳浓度为0.8％-1.0％，黑暗培养直至料袋中长满菌丝；所述人工栽培培养基的制备包括：将人工栽培培养基置于聚乙烯料袋中灭菌备用，按质量百分比，人工栽培培养基的配方包括：栎树木屑48％，杜仲枝 32％，麸皮15％，
蔗糖2％，
石膏1％，腐殖土1％，碳酸
钙1％；
[0008] 步骤2，对长满菌丝的料袋进行低温诱导生成原基；
[0009] 步骤3，原基在温度为14-18℃、空气相对湿度为80％-90％，二氧化碳浓度为1.5％-2.0％、光照强度为200-500lx的条件下分化形成朱红硫磺菌子实体，直至朱红硫磺菌子实体停止生长后进行采收；
[0010] 步骤4，从采收的朱红硫磺菌子实体上分离、斜面保藏得到朱红硫磺菌菌株。
[0011] 进一步，上述低温诱导生成原基的条件，尤其包括：空气相对湿度为75％-85％，二氧化碳浓度为1.5％-2.0％，光照强度为100-200lx，白天温度为18-20℃，夜间温度为8-12℃，培养时间为12-18d。
[0012] 更进一步，朱红硫磺菌原种的制备方法，尤其包括：
[0013] 步骤1，将活化的野生朱红硫磺菌菌种接种于朱红硫磺菌液体培养基上进行培养得到朱红硫磺菌液体菌种；液体培养基配方包括：
葡萄糖15g，蔗糖15g，蛋白胨5.0g，
酵母膏2g，
磷酸二氢
钾0.5g，
硫酸镁1.0g，维生素B4 2mg，
水1000mL；
[0014] 步骤2，将液体菌种接种到原种培养基上进行黑暗培养后进行 200-300lx散射光处理得到朱红硫磺菌原种；按质量百分比，原种培养基配方包括：栎树木屑50％，杜仲枝30％，小麦5％，麸皮10％，蔗糖2％，磷酸二氢钾0.8％，
硫酸镁0.6％，石膏1％，磷酸钙
0.6％。
[0015] 最后，优选的，斜面保藏的保藏培养基配方包括：小麦25g，麸皮20g，
营养液80-150mL，营养液配方：葡萄糖10g，酵母膏10g，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁1.0g，水1000mL。
[0016] 本发明的另一个目的是直接保护上述朱红硫磺菌菌株培育方法培育出的朱红硫磺菌菌株，为该菌的产业化利用提供便利。具体的，该朱红硫磺菌菌株，命名为朱红硫磺菌(Laetiporus sulphureus) LS-AK405，保藏号为CGMCC No.18155，该菌株已于2019年8月26 日保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
[0017] 基于上述获取的菌株，本发明的第三个目的，是提供一种朱红硫磺菌人工栽培方法，具体包括：
[0018] 步骤1，发菌：将朱红硫磺菌菌株(Laetiporus sulphureus) LS-AK405(CGMCC No.18155)接种于人工栽培培养基中进行发菌；发菌条件包括：温度为15-18℃，空气相对湿度为55％-65％，二氧化碳浓度为0.8％-1.0％，黑暗培养直至料袋中长满菌丝；所述人工栽培培养基的制备包括：将人工栽培培养基置于聚乙烯料袋中灭菌备用，按质量百分比，人工栽培培养基的配方包括：栎树木屑48％，杜仲枝32％，麸皮15％，蔗糖2％，石膏1％，腐殖土1％，碳酸钙1％；
[0019] 步骤2，低温诱导原基形成：对长满菌丝的料袋进行低温诱导生成原基；
[0020] 步骤3，出菇：原基在温度为14-18℃、空气相对湿度为80％-90％，二氧化碳浓度为1.5％-2.0％、光照强度为200-500lx的条件下分化形成朱红硫磺菌子实体；
[0021] 步骤4，采收：直至朱红硫磺菌子实体停止生长，
颜色由浅黄色变成橘黄色时进行采收，得到朱红硫磺菌鲜产品。
[0022] 进一步，低温诱导生成原基的条件，尤其包括：空气相对湿度为 75％-85％，二氧化碳浓度为1.5％-2.0％，光照强度为100-200lx，白天温度为18-20℃，夜间温度为8-12℃，培养时间为12-18d。
[0023] 与
现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0024] 1、本发明朱红硫磺菌菌株的获取，包含三个关键技术点：(1) 发菌技术，创新性的在人工栽培培养基中以栎树木屑和杜仲枝为主要原料，提高了菌丝生长速率；(2)利用低温诱导来刺激原基形成，使原基处在生长优势条件下，为进一步发育大量菌蕾、袋栽产量保证提供基础；(3)原基分化得到子实体，在这一阶段按照本发明公开的出菇条件，可以使原基顺利地过渡到生殖生长，菌蕾的分化期管理非常关键，是获得朱红硫磺菌高产稳产的一个重要时期。
[0025] 2、本发明红硫磺菌菌株的获取，是采用朱红硫磺菌原种进行发菌，采用液体菌种制备原种，大大缩短了培养周期，进一步提高了菌丝活性。
[0026] 3、本发明的朱红硫磺菌人工栽培方法，基于上述获取的朱红硫磺菌菌株进行，主要包括发菌、低温诱导原基形成以及出菇三个关键技术控制点。在人工栽培培养基中以栎树木屑和杜仲枝为主要原料，大大缩短了培养周期，提高了菌丝活性；利用低温诱导来刺激原基形成，成功突破了朱红硫磺菌人工栽培产量低的问题，为朱红硫磺菌的工厂化栽培奠定了基础。
附图说明
[0027] 图1为采用本发明的方法生产的人工栽培朱红硫磺菌。
具体实施方式
[0028] 以下结合具体
实施例和附图对本发明的方案进行进一步说明。
[0029] 需要说明的是，本发明所指的栎树木屑，取自
粉碎后的陈的栎树枝条，要求无杂质，无霉变；本发明所指的杜仲枝为杜仲枝条，要求无霉变；本发明所指的麸皮，取自小麦、稻谷等脱米粒后的壳；本发明所指的腐殖土，指的是由腐烂的
植物物质以及各类有机垃圾组成的一层混合物，或者是森林中
表土层树木的枯枝残叶经过长时期腐烂
发酵后而形成的产物。尤其要说明的是，本发明上述栎树木屑、麸皮以及腐殖土的不同来源不影响本发明的技术再现性，只要是满足上述要求的配方料均可以用到本发明的技术方案中。
[0030] 同时，本发明在制备朱红硫磺菌菌株时，发菌用到了原种，该原种指的是将朱红硫磺菌母种扩大到培养料上的菌种。原种的制备首先要有活化的野生朱红硫磺菌菌种，该部分为常规操作，之后，利用活化的野生朱红硫磺菌菌种制备朱红硫磺菌液体菌种，最后得到原种，可以参考如下方法：
[0031] 步骤1.采集野生朱红硫磺菌子实体：2013年9月在安康市镇坪县采集野生朱红硫磺菌，采用组织分离法进行组织分离，并在复合P DA培养基上进行纯化培养，菌株编号朱红硫磺菌LS-AK405，菌种由安康市农业科学研究院食用菌研究所保藏。
[0032] 步骤2.朱红硫磺菌菌种活化：利用基础培养基配方制备固体培养基，将保藏的朱红硫磺菌菌种接种到固体培养基上进行活化培养。基础培养基配方如下：基础培养基制备：
马铃薯200g，葡萄糖10g，蔗糖10.0g，蛋白胨2.0g，酵母膏5g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁
0.5g，维生素B4 6mg，琼脂12g，水1000mL。
[0033] 步骤3.朱红硫磺菌液体菌种制备：将活化的朱红硫磺菌菌种接种于液体培养基上，置于温度18-20℃，空气相对湿度55％-65％，摇床转速150r/min的恒温振荡
培养箱中培养7d，制备液体菌种。液体培养基配方如下：葡萄糖15g，蔗糖15g，蛋白胨5.0g，酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1.0g，维生素B4 2mg，水1000mL。
[0034] 步骤4.朱红硫磺菌原种制备：采用规格为110mm×60mm的圆口玻璃瓶制备原种。将制备的液体菌种接种到原种培养基上，置于温度 16-19℃，空气相对湿度55％-65％，黑暗培养，待菌丝长满玻璃瓶。当菌丝长满后，给予200-300lx散射光处理15d，当菌袋中菌丝颜色全部变成橙红色，冷藏备用。按质量百分比，原种培养基配方：栎树木屑50％，杜仲枝30％，小麦5％，麸皮10％，蔗糖2％，磷酸二氢钾0.8％，硫酸镁0.6％，石膏1％，磷酸钙
0.6％，。
[0035] 上述野生朱红硫磺菌的采集地的选取，本发明仅以当地举例，采集地的不同不影响本发明的技术再现性，其他地方采集的野生朱红硫磺菌均可以用到本发明的技术方案中。
[0036] 同时，本发明所述的原基，指的是朱红硫磺菌子实体的原始体或者说胚胎期，一般呈颗粒状或针头状，其进一步发育就成为菌蕾或幼菇。原基的形成，标志着菌丝体已由营养生长阶段，进入生殖生长阶段。当大量繁殖的营养菌丝遇到适宜的光线、温度、湿度等物理条件和机械刺激，以及培养基的生化变化等诱导时，就形成了原基，只有那些处于生长优势条件下的原基，才能发育成成熟的子实体。
[0037] 综上，本
发明人工栽培朱红硫磺菌采用的方法详细如下：
[0038] 1.采集野生朱红硫磺菌子实体
[0039] 2013年9月在安康市镇坪县采集野生朱红硫磺菌，采用组织分离法进行组织分离，并在复合PDA培养基上进行纯化培养，菌株编号朱红硫磺菌LS-AK405，菌种由安康市农业科学研究院食用菌研究所保藏。
[0040] 2.朱红硫磺菌菌种活化
[0041] 利用基础培养基配方制备固体培养基，将保藏的朱红硫磺菌菌种接种到固体培养基上进行活化培养。基础培养基配方如下：基础培养基制备：马铃薯200g，葡萄糖10g，蔗糖10.0g，蛋白胨2.0g，酵母膏5g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，维生素B4 6mg，琼脂12g，水
1000mL。
[0042] 3.朱红硫磺菌液体菌种制备
[0043] 将活化的朱红硫磺菌菌种接种于液体培养基上，置于温度 18-20℃，空气相对湿度55％-65％，摇床转速150r/min的恒温振荡培养箱中培养7d，制备液体菌种。液体培养基配方如下：葡萄糖15g，蔗糖15g，蛋白胨5.0g，酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁 1.0g，维生素B4 2mg，水1000mL。
[0044] 4.朱红硫磺菌原种制备
[0045] 采用规格为110mm×60mm的圆口玻璃瓶制备原种。将制备的液体菌种接种到原种培养基上，置于温度16-19℃，空气相对湿度 55％-65％，黑暗培养，待菌丝长满玻璃瓶。当菌丝长满后，给予 200-300lx散射光处理15d，当菌袋中菌丝颜色全部变成橙红色，冷藏备用。原种培养基配方：栎树木屑50％，杜仲枝30％，小麦5％，麸皮10％，蔗糖2％，磷酸二氢钾0.8％，硫酸镁0.6％，石膏1％，磷酸钙 0.6％。
[0046] 5.栽培培养基制备
[0047] 采用规格为14cm×28cm×0.006cm的聚乙烯折
角塑料袋，每袋装料0.4kg左右。其配方如下：栎树木屑48％，杜仲枝32％，麸皮15％，蔗糖2％，石膏1％，腐殖土1％，碳酸钙1％。装袋后采用高压灭菌，冷却后接种。
[0048] 6.接种
[0049] 无菌环境下，打开无
棉盖进行一头接种，每袋接种量为20g左右。
[0050] 7.发菌
[0051] 将接种后的菌袋移入发菌室，发菌阶段温度应保持15-18℃、空气相对湿度55％～65％，二氧化碳浓度保持在0.8％—1.0％，黑暗培养。发菌前5d不要搬动菌袋，待菌丝吃料
2cm左右后，翻堆检查菌种萌发及污染情况。正常情况下培养25-30d，菌丝即长满料袋。
[0052] 8.低温诱导原基形成
[0053] 将长满菌丝的菌袋转移到出菇房，去掉菌袋上端的无棉盖和套环。利用低温刺激来促进原基形成，低温诱导阶段白天
温度控制在 18-20℃，晚上温度控制在8-12℃，空气相对湿度75％～85％，二氧化碳浓度保持在1.5％—2.0％，光照强度100-200lx，培养15d左右，菌袋周围及出现原基。
[0054] 9.出菇管理
[0055] 待袋口出现菌蕾后，即进入出菇阶段，出菇期间温度应保持 14-18℃、空气相对湿度80％～90％，二氧化碳浓度保持在1.5％—2.0％，光照强度200-500lx，直至子实体形成。
[0056] 10.采收
[0057] 当子实体基本停止生长，颜色由浅黄色变成橘黄色时，为采收最佳时期。
[0058] 11.菌种保藏
[0059] 优良菌株是人工栽培的关键因素。目前常用的斜面保藏法，具有保藏时间短、易退化等缺点。利用该发明采用的培养基可长时间保留菌株的优良遗传性能。保藏培养基配方：小麦25g，麸皮20g，葡萄糖10g，酵母膏10g，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁1.0g，水1000mL。
[0060] 实施例1：
[0061] 本实施例提供一种朱红硫磺菌菌株(菌株编号为CGMCC No.18155，该菌株已于2019年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的培育方法，包括如下步骤：
[0062] 步骤1，将朱红硫磺菌原种接种于人工栽培培养基中进行发菌；发菌条件包括：温度为15-18℃，空气相对湿度为55％-65％，二氧化碳浓度为0.8％-1.0％，黑暗培养直至料袋中长满菌丝；所述人工栽培培养基的制备包括：将人工栽培培养基置于聚乙烯料袋中灭菌备用，按质量百分比，人工栽培培养基的配方包括：栎树木屑48％，杜仲枝 32％，麸皮15％，蔗糖2％，石膏1％，腐殖土1％，碳酸钙1％；
[0063] 步骤2，对长满菌丝的料袋进行低温诱导生成原基；
[0064] 步骤3，原基在温度为14-18℃、空气相对湿度为80％-90％，二氧化碳浓度为1.5％-2.0％、光照强度为200-500lx的条件下分化形成朱红硫磺菌子实体，直至朱红硫磺菌子实体停止生长后进行采收；
[0065] 步骤4，从采收的朱红硫磺菌子实体上分离、斜面保藏得到朱红硫磺菌菌株。
[0066] 其中，低温诱导生成原基的条件包括：空气相对湿度为75％-85％，二氧化碳浓度为1.5％-2.0％，光照强度为100-200lx，白天温度为 18-20℃，夜间温度为8-12℃，培养时间为12-18d。
[0067] 其中，朱红硫磺菌原种的制备方法包括：
[0068] 步骤1，将活化的野生朱红硫磺菌菌种接种于朱红硫磺菌液体培养基上进行培养得到朱红硫磺菌液体菌种；液体培养基配方包括：葡萄糖15g，蔗糖15g，蛋白胨5.0g，酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1.0g，维生素B4 2mg，水1000mL；
[0069] 步骤2，将液体菌种接种到原种培养基上进行黑暗培养后进行 200-300lx散射光处理得到朱红硫磺菌原种；按质量百分比，原种培养基配方包括：栎树木屑50％，杜仲枝30％，小麦5％，麸皮10％，蔗糖2％，磷酸二氢钾0.8％，硫酸镁0.6％，石膏1％，磷酸钙
0.6％。
[0070] 其中，斜面保藏的保藏培养基配方包括：小麦25g，麸皮20g，营养液80-150mL，营养液配方：葡萄糖10g，酵母膏10g，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁1.0g，水1000mL。
[0071] 实施例2：
[0072] 本实施例提供一种朱红硫磺菌人工栽培方法，具体包括：
[0073] 步骤1，发菌：将朱红硫磺菌菌株(Laetiporus sulphureus) LS-AK405(CGMCC No.18155)接种于人工栽培培养基中进行发菌；发菌条件包括：温度为15-18℃，空气相对湿度为55％-65％，二氧化碳浓度为0.8％-1.0％，黑暗培养直至料袋中长满菌丝；所述人工栽培培养基的制备包括：将人工栽培培养基置于聚乙烯料袋中灭菌备用，按质量百分比，人工栽培培养基的配方包括：栎树木屑48％，杜仲枝32％，麸皮15％，蔗糖2％，石膏1％，腐殖土1％，碳酸钙1％；
[0074] 步骤2，低温诱导原基形成：对长满菌丝的料袋进行低温诱导生成原基；
[0075] 步骤3，出菇：原基在温度为14-18℃、空气相对湿度为80％-90％，二氧化碳浓度为1.5％-2.0％、光照强度为200-500lx的条件下分化形成朱红硫磺菌子实体；
[0076] 步骤4，采收：直至朱红硫磺菌子实体停止生长，颜色由浅黄色变成橘黄色时进行采收，得到朱红硫磺菌鲜产品。
[0077] 进一步，低温诱导生成原基的条件，尤其包括：空气相对湿度为 75％-85％，二氧化碳浓度为1.5％-2.0％，光照强度为100-200lx，白天温度为18-20℃，夜间温度为8-12℃，培养时间为12-18d。
[0078] 效果证明：
[0079] 为明确栎树木屑、杜仲枝最佳比例，本发明研究了不同基质对朱红硫磺菌菌丝生长及产量的影响，试验设计见表1。
[0080] 表1朱红硫磺菌不同基质配方设计
[0081]
[0082]
[0083] 不同基质配方对朱红硫磺菌菌丝生长的影响结果，见表2。
[0084] 由表2可知，不同基质配方对朱红硫磺菌菌丝生长影响较大。当以配方2为培养基时，朱红硫磺菌菌丝生长速率最快，为1.216cm/d，满袋时间最短，为25d，此时菌丝浓密，长势好，杂菌感染率最低；其次为配方2，菌丝生长速率为1.109cm/d，配方7表现最差。
[0085] 表2.不同基质配方对朱红硫磺菌菌丝生长影响
[0086]
[0087] 备注：+++菌丝长势健壮、浓密，++菌丝长势较浓密，+菌丝长势稀疏；不同大写字母表示1％显著水平，不同小写字母表示5％显著水平；菌袋规格：14cm*28cm*0.006cm。
[0088] 不同基质配方对朱红硫磺菌产量的影响结果，见表3。
[0089] 由表3可知，不同基质配方对朱红硫磺菌原基分化速度及产量影响较大。当以配方3为培养基时(图1)，原基分化速率快，产量最高，为142.15g/袋，与CK相比，产量提高了
33.69g/袋。表明适宜的配方是提高产量的关键因素。
[0090] 表3.不同基质配方对朱红硫磺菌产量及生物学效率的影响
[0091]
[0092] 备注：不同大写字母表示1％显著水平，不同小写字母表示5％显著水平。
