【技术领域】
[0001] 本
发明涉及
生物技术的技术领域，特别是一种抗炎活性桑黄多糖SHP及其制备方法的技术领域。【背景技术】
[0002] 桑黄是一种寄生于桑树和杨树等阔叶树上的药食两用
真菌，在传统中医中常被用来
治疗妇科
炎症以及腹泻下痢等肠道
疾病，并且经现代医学研究证明，有显著的抗炎、抗
肿瘤、抗
氧化和调节免疫
力等生理活性。经研究，桑黄
水提物可以显著改善小鼠慢性溃疡性结肠炎，机理显示其通过调控TLR-4/NF-κB通路中IκBα的磷
酸化，阻止NF-κB入核，从而抑制炎症因子IL-1β和TNF-α等的基因转录和蛋白表达来降低炎症。桑黄在传统中医中的服用方式是以水煎服。桑黄多糖是桑黄内
水溶性成分中的重要组成部分，在桑黄的活性发挥中起到重要作用。桑黄多糖在体内外的抗炎活性也被报道。但是，多糖结构复杂，不同的分子量，不同的单糖组成，以及不同的连接方式等因素都可能造成多糖的活性不同。因此，分离纯化制备桑黄中活性多糖并对其结构进行表征，对于桑黄资源的开发利用具有重要意义。【发明内容】
[0003] 本发明的目的就是解决
现有技术中的问题，提出一种抗炎活性桑黄多糖SHP及其制备方法，所制备的桑黄多糖SHP纯度均一，结构明确，体外对细菌脂多糖刺激的巨噬细胞RAW264.7炎症反应有显著抑制作用，体内对小鼠实验性结肠炎有显著的缓解作用，可用于抗炎活性产品开发。
[0004] 为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
[0005] 一种抗炎活性桑黄多糖SHP，所述抗炎活性桑黄多糖SHP为由阿拉伯糖、甘露糖、
葡萄糖和半乳糖以摩尔比为0.050：0.318：1：0.665组成的杂多糖，分子量为46kDa，分子结构如下：
[0006]
[0007] 其中，端基R通过O-6键连接在主链上，端基R包括如下五种：
[0008] β-D-Manp-(1→2,5)-α-L-Araf-(1→；
[0009] β-D-Manp-(1→6)-β-D-Manp-(1→；
[0010] α-D-Galp-(1→4)-α-D-Galp-(1→；
[0011] β-D-Manp-(1→3)-β-D-Manp-(1→；
[0012] →3,5)-α-L-Araf-(1→。
[0013] 一种抗炎活性桑黄多糖SHP的制备方法，包括如下步骤：
[0014] a)原料准备：将野生或者人工栽培的桑黄子实体在收割后切片，自然晒干或在烘箱中烘干，待
粉碎机粉碎后过筛，得到桑黄原料粉；
[0015] b)水提：将步骤a)中的桑黄原料粉加入水中提取，得到水提物；
[0016] c)醇沉：将步骤b)中的水提物用
乙醇进行沉淀，得到桑黄粗多糖；
[0017] d)除蛋白：将步骤c)中的桑黄粗多糖用Sevag法脱除
蛋白质，得到去除蛋白质后的桑黄粗多糖；
[0018] e)脱色：将步骤d)中的去除蛋白质后的桑黄粗多糖用过氧化氢氧化脱色，得到脱色后的桑黄粗多糖；
[0019] f)纯化：将步骤e)中的脱色后的桑黄粗多糖依次通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱、
透析膜除盐和GPC-Autopurify全自动凝胶纯化系统纯化洗脱，得到抗炎活性桑黄多糖SHP成品。
[0020] 作为优选，所述步骤a)中，烘箱
温度为40～60℃，过筛目数为30～50目。
[0021] 作为优选，所述步骤b)中水提具体为，以
质量体积比为1：10～1：40将桑黄原料粉加入水中，在80～100℃下，提取4～6h，待提取完成后过滤去除滤渣并收集滤液，然后将滤渣进行再次提取，再次提取次数至少为一次，合并滤液，得到水提物。
[0022] 作为优选，所述步骤c)中醇沉具体为，将水提物浓缩至干物质含量为10～30g/L，再缓慢添加乙醇至体积分数为40～60％，边加边搅动，在静置12～24h后离心得到沉淀物，接着，将沉淀物进行再次沉淀，再次沉淀次数至少为一次，得到桑黄粗多糖。
[0023] 作为优选，所述步骤d)中除蛋白具体为，以质量体积比为1：5～1：10将桑黄粗多糖加入水中，再以体积比为4：1～6：1将桑黄粗多糖水溶液与Sevage溶液混合，所述Sevage溶液中氯仿与正丁醇的质量比为5：1，在振荡10～20min后静置并离心出上层多糖溶液，接着，将上层多糖溶液进行再次除蛋白直至碘
颜色反应和茚三
酮反应均检测不到蛋白质，再在40～60℃下减压浓缩去除氯仿和正丁醇。
[0024] 作为优选，所述步骤e)中脱色具体为，在去除蛋白质后的桑黄粗多糖中添加过氧化氢至体积分数为15～25％，在50～65℃下水浴2.5～3.5h，再缓慢加入乙醇至体积分数为40～60％，在静置12～24h后离心得到脱色后的桑黄粗多糖。
[0025] 作为优选，所述步骤f)中DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱具体为，将脱色后的桑黄粗多糖加水调配成10～20mg/ml的溶液，在离心提取上清液并过滤后，以2～4mL/min流速上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，接着，将纯水以2～4mL/min流速洗脱DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，洗脱体积为2～4倍柱床体积，同时用
苯酚-
硫酸法检测洗脱液，直至无颜色反应，随后，将0.1M的NaCl溶液以2～4mL/min流速洗脱DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，收集有显色反应的洗脱液，再减压浓缩。
[0026] 作为优选，所述步骤f)中透析膜除盐具体为，将经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱的洗脱液装入透析袋内后，再在流水中冲洗12～24h，直至滴加
硝酸银后无白色沉淀产生。
[0027] 作为优选，所述步骤f)中GPC-Autopurify全自动凝胶纯化系统纯化洗脱具体为，将经透析膜除盐后的桑黄多糖浓缩液上博睿糖BRTM预装柱，分离范围1.0K～100k Da，利用博睿糖GPC-Autopurify全自动凝胶纯化系统，以水溶液为流动相，流速为1～2ml/min，每管收集10ml，结合在线检测器在线检测和收集，收集第1个对称峰，再在55～75℃下减压浓缩，
真空冷冻干燥，得到抗炎活性桑黄多糖SHP成品。
[0028] 本发明的有益效果：本发明通过水提和醇沉从桑黄子实体中获得桑黄粗多糖，再通过Sevag法和过氧化氢氧化法脱去桑黄粗多糖中的蛋白质和颜色，随后分别利用DEAE琼脂糖凝胶离子交换层析分离出酸性多糖组分，透析膜除盐以及GPC-Autopurify全自动凝胶纯化系统纯化洗脱收集第一个洗脱峰，最终制备出一种由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖以摩尔比为0.050：0.318：1：0.665组成的多糖，分子量约为46kDa，纯度均一，结构明确，体外对细菌脂多糖刺激的巨噬细胞RAW264.7炎症反应有显著抑制作用，体内对小鼠实验性结肠炎有显著的缓解作用，可用于抗炎活性产品开发，对于桑黄资源的利用和挖掘，具有积极的社会效益和经济效益。
[0029] 本发明的特征及优点将通过
实施例结合
附图进行详细说明。【附图说明】
[0030] 图1是抗炎活性桑黄多糖SHP纯度检测的凝胶色谱图；
[0031] 图2是抗炎活性桑黄多糖SHP单糖组成检测的气相色谱图；
[0032] 图3是抗炎活性桑黄多糖SHP对LPS刺激的巨噬细胞炎症反应的抑制作用图；
[0033] 图4是抗炎活性桑黄多糖SHP对聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎的缓解作用图。
[0034] 图3中：a是SHP对体外培养的巨噬细胞RAW264.7培养液上清中致炎因子一氧化氮含量的抑制作用图；b是SHP对巨噬细胞RAW264.7中的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)基因表达的抑制作用图；c是SHP对巨噬细胞RAW264.7中的致炎因子肿瘤
坏死因子α(TNF-α)基因表达的抑制作用图。
[0035] 图4中：a是SHP对聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型小鼠体重下降的缓解作用图，b是SHP对结肠炎小鼠疾病活动指数(DAI)的缓解作用图，c和d是SHP对结肠炎小鼠结肠缩短症状的缓解作用图，e和f分别是SHP缓解结肠炎小鼠结肠组织损伤的
组织学评分图和组织学直观图。【具体实施方式】
[0036] 实施例一、制备抗炎活性桑黄多糖SHP：
[0037] a)原料准备：将野生或者人工栽培的桑黄子实体在收割后切片，自然晒干或在烘箱中烘干，待粉碎机粉碎后过筛，得到桑黄原料粉，烘箱温度为50℃，过筛目数为40目；
[0038] b)水提：以质量体积比为1：10～1：40将步骤a)中的桑黄原料粉加入水中，在80～100℃下，提取4～6h，待提取完成后过滤去除滤渣并收集滤液，然后将滤渣进行再次提取，以质量体积比为1：10～1：40将滤渣加入水中，在80～100℃下，提取2～3h，待提取完成后过滤去除滤渣并收集滤液，再次提取次数至少为一次，合并滤液，得到水提物；
[0039] c)醇沉：将步骤b)中的水提物浓缩至干物质含量为10～30g/L，再缓慢添加乙醇至体积分数为50％，边加边搅动，在静置过夜后离心得到沉淀物，接着，将沉淀物进行再次沉淀，以质量体积比为1：5～1：10将沉淀物加入水中，再缓慢添加乙醇至体积分数为40％，边加边搅动，在静置过夜后离心得到沉淀物，再次沉淀次数至少为一次，得到桑黄粗多糖；
[0040] d)除蛋白：以质量体积比为1：5～1：10将步骤c)中的桑黄粗多糖加入水中，再以体积比为5：1将桑黄粗多糖水溶液与Sevage溶液混合，所述Sevage溶液中氯仿与正丁醇的质量比为5：1，在振荡10～20min后静置并离心出上层多糖溶液，接着，将上层多糖溶液进行再次除蛋白直至碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，再在40～60℃下减压浓缩去除氯仿和正丁醇；
[0041] e)脱色：在步骤d)中去除蛋白质后的桑黄粗多糖中添加过氧化氢至体积分数为20％，在50～65℃下水浴3h，再缓慢加入乙醇至体积分数为50％，静置过夜以去除大部分的过氧化氢，再离心得到脱色后的桑黄粗多糖；
[0042] f)纯化：
[0043] Stp1)DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱：将步骤e)中脱色后的桑黄粗多糖加水调配成10～20mg/ml的溶液，在离心提取上清液并用0.22μm滤
膜过滤后，以2～4mL/min流速上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，接着，将纯水以2～4mL/min流速洗脱DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，洗脱体积为3倍柱床体积，同时用苯酚-硫酸法检测洗脱液，直至无颜色反应，随后，将0.1M的NaCl溶液以2～4mL/min流速洗脱DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，收集有显色反应的洗脱液，再减压浓缩，该洗脱液中的多糖为酸性多糖组分；
[0044] Stp2)透析膜除盐：将经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱的洗脱液装入7kDa透析袋内后，再在流水中冲洗12h，直至滴加硝酸银后无白色沉淀产生，确保NaCl去除干净；
[0045] Stp3)GPC-Autopurify全自动凝胶纯化系统纯化洗脱：将经透析膜除盐后的桑黄多糖浓缩液上博睿糖BRTM预装柱，分离范围1.0K～100k Da，利用博睿糖GPC-Autopurify全自动凝胶纯化系统，以水溶液为流动相，流速为1.5ml/min，每管收集10ml，结合在线检测器在线检测和收集，收集第1个对称峰，再在65℃下减压浓缩，真空冷冻干燥，得到抗炎活性桑黄多糖SHP成品。
[0046] 抗炎活性桑黄多糖SHP成品的形状为白色粉末，贮存方法为避光、干燥、常温(25℃以下)保存。
[0047] 实施例二、纯度检测：
[0048] 如图1所示，采用配有BRT104-102
串联凝胶柱(8×300mm)(BoruiSaccharide,Biotech.Co.Ltd.)的高效液相色谱仪(岛津LC-10A)，以示差折光检测器检测实施例一所制备的抗炎活性桑黄多糖SHP的纯度，结果呈现单一对称峰，证明抗炎活性桑黄多糖SHP为均一多糖。
[0049] 实施例三、单糖组成检测：
[0050] 如图2所示，将实施例一所制备的抗炎活性桑黄多糖SHP进行气相色谱检测，可知抗炎活性桑黄多糖SHP为由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖以摩尔比为0.050：0.318：1：0.665组成的杂多糖。
[0051] 实施例四、体外抗炎试验：
[0052] 将实施例一所制备的抗炎活性桑黄多糖SHP进行体外抗炎试验。
[0053] 将单核巨噬细胞株RAW264.7细胞以1×105个/ml的
密度接种于12孔板中，每孔500μl，培养过夜。培养液为含有10％胎
牛血清的DMEM培养基。培养板中加入SHP使其在培养液中的终浓度为250ug/ml，孵育4h，然后加入终浓度为1ug/L的LPS刺激细胞，模型组仅加入LPS孵育4h，对照组加入等体积的
溶剂，每组设4复孔。培养结束，用
试剂盒测定培养液上清中的一氧化氮(NO)浓度，以GAPDH基因为内参，用RT-PCR方法测定细胞中导型一氧化氮合酶(iNOS)及肿瘤坏死因子(TNF-α)基因的相对表达量。
[0054] 数据分析：
[0055] 用SPSS12
软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差 表示，应用t检验评价试验结果。
[0056] NO是巨噬细胞被激活所释放的
信号分子，NO含量升高表明巨噬细胞促炎活性增强。从图3可以看出，本发明制备的桑黄多糖SHP显著抑制了LPS刺激巨噬细胞所产生的NO含量。基因表达检测显示，SHP从转录水平降低了催化NO合成的酶iNOS的表达，并抑制了致炎因子TNF-α的表达。这些结果表明，SHP能够在体外直接降低巨噬细胞的炎症反应。
[0057] 实施例五、体内抗炎试验：
[0058] 将实施例一所制备的抗炎活性桑黄多糖SHP进行体内抗炎试验。
[0059] 实验动物及饲养条件：30只体重18～20g的SPF级雌性C57/B6小鼠(中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司[生产
许可证：SCXK(沪)2016-0001])。屏障系统实验饲养室，温度：22±1℃，湿度：50-70％，光照：150-200Lx，12小时明暗交替，噪音<50dB。饮水：
自来水。
饲料：全价营养颗粒饲料。饲养方式：自由饮食，小鼠饲养笼中给予充足的饲料和水，每笼饲养10只小鼠。
[0060] 试验设计及测定指标：小鼠随机分为3组，每组10只，Control组饮用自来水；DSS组饮用含2％葡聚糖硫酸钠(DSS)的自来水，DSS+SHP组饮用含2％DSS及1g/L SHP的自来水。给予DSS水前的14天，DSS+SHP组饮用1g/L SHP自来水，其余2组饮用自来水。DSS连续饮用14天。每天测量体重，每两天观察腹泻及便血情况，计算疾病活动指数(DAI)。第15天，处死小鼠，测量结肠长度，并取结肠一段用于HE
染色，观察肠道损伤情况，并进行组织形态学评分。
[0061] 数据分析：
[0062] 用SPSS12软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差 表示，应用t检验评价试验结果。
[0063] 从图4可以看出，本工艺制备的桑黄多糖SHP显著改善了结肠炎引起的小鼠体重下降、结肠变短，降低了小鼠的疾病活动指数及结肠黏膜损伤情况，表明SHP对小鼠结肠炎有显著的治疗效果。
[0064] 本发明通过水提和醇沉从桑黄子实体中获得桑黄粗多糖，再通过Sevag法和过氧化氢氧化法脱去桑黄粗多糖中的蛋白质和颜色，随后分别利用DEAE琼脂糖凝胶离子交换层析分离出酸性多糖组分，透析膜除盐以及GPC-Autopurify全自动凝胶纯化系统纯化洗脱收集第一个洗脱峰，最终制备出一种由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖以摩尔比为0.050：0.318：1：0.665组成的多糖，分子量约为46kDa，纯度均一，结构明确，体外对细菌脂多糖刺激的巨噬细胞RAW264.7炎症反应有显著抑制作用，体内对小鼠实验性结肠炎有显著的缓解作用，可用于抗炎活性产品开发，对于桑黄资源的利用和挖掘，具有积极的社会效益和经济效益。
[0065] 上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
