【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ゾイシア属の組織を培養して苗条原基様体を経由して苗を得ることによりゾイシア属を簡単に且つ大量に増殖させるゾイシア属の増殖方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ノシバ、コウライシバ、コウシュンシバ等の栄養繁殖型や洋芝等の種子繁殖型は、栄養繁殖や種子繁殖により増殖させている。 その栄養繁殖型の増殖方法は、整地した広い面積の土地である植床に、マット状の芝を細長く切り取って、線状に植え込むか、撒芝を行っている。 このような線状に植え込んだり、撒芝により、種芝の植付けを行い、さらに施肥や刈り込みや転圧並びに薬剤撒布等をした後に、目土を撒布することにより芝を成育させていた。 そして、出荷時には、ある程度の根茎が残るように、厚さ１〜２ｃｍ、平面視で３
０〜４０ｃｍ角に表層部を剥ぎ取ったマット状のソッドマットを作成していた。 そして根茎が残ることから、１
年後には、再び芝マットを作る程度に繁殖をさせて、これを再びソッドマットを作るという方式を複数回繰り返す増殖方法である。

【０００３】また後者の種子繁殖型の増殖方法は、主として洋芝について行われており、整地された植床に洋芝の種子を砂と混合して播種し、これを転圧して放置することにより、発芽及び発根させて苗を得て、これをそのまま成長させて使用したり、他のところに転植させている方法である。

【０００４】また、このような従来の増殖方法に加えて、本発明者等は、更に天候などに左右されずにカルスを誘導して増殖させる方法を、特開平５−３１６８９３
号公報に、その一例として提案している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そのために、様々な問題があった。 従来の芝の増殖方法、殊に栄養繁殖型に於いては、病原菌や雑草、異種芝の混入や害虫の食害は完全に防止することができず、収穫も年一回前後に限られている。 そして、その年１回の収穫期には、大量の作業員が必要で、しかも集中的に作業させねばならない条件下で多雨に見舞われれば出荷できない状況が発生する等、その生産における効率及び供給の安定性に問題があり、芝の品質が自然条件に左右されるのみならず、収穫した前記芝を輸送途上や在庫中に品質を低下させるという問題点もある。

【０００６】また、種子繁殖型では、植床に種子をまかねばならず、その後の成長過程では、施肥や農薬散布の必要性がある等の問題があり、さらに広い面積の土地が必要があるうえに、天候条件の影響を受けるという問題もある。

【０００７】また、本発明者らの方法による技術でゾイシア属を増殖させると、天候には左右されずに増殖させることは可能だが、手間やコストがかかる割りには、カルスから芝への再生率が０．００１％〜０．００２％しか得られず、時には全く芝へ再生しないときも見受けられ、工業的に増殖させることはできなかった。

【０００８】

【課題を解決する為の手段】本発明は、このような広大な面積の圃場や人手が係らず、また、手間も係らずにコスト的にも安価で大量増殖が可能なゾイシア属の増殖方法を提供せんとするものである。

【０００９】本発明に用いられるゾイシア属としては、
ノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｍａｃｒｏｓｔａｃｈｙａ）、コウシュンシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ）、コウライシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）等が挙げられる。

【００１０】このようなゾイシア属の組織から苗条原基様体を経由させて苗を得ることにより本発明の課題は解決される。 さらに、ゾイシア属の組織から苗条原基様体を経由して、この苗条原基様体を繰り返して分割増殖させて苗を得ること、即ち、苗条原基様体を分割させて採取させて、培養もしくは増殖させることでも苗条原基様体に成長させることができる。

【００１１】即ち、ここで苗条原基様体を得るために用いられる培地としては、ムラシゲ・スクーグ培地、リンスマイヤー・スクーグ培地、Ｎ６培地、ガンボルグらの培地、ヘラーの培地、ＡＡ培地などの液体培地、固体培地であり、このような培地に植物成長調節物質としては２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、インドール−３−酢酸、１−ナフタレン酢酸、ゼアチン、６−ベンジルアデニン、カイネチン、ジベレリン、アブシジン酸から選んだ１種または２種以上のものを組合わせたものを前記培地に添加して、ゾイシア属の組織を培養しても良い。 好ましくは、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を前記培地１０００ｍｌに対して３．５ｍｇ〜６ｍｇを添加するのが良く、３．５ｍｇ未満であるとカルスが誘導されて苗条原基様体の誘導ができず、また、６ｍｇより多く添加しても苗条原基様体が誘導されずカルスが誘導されるのみなので、前記範囲の添加量にするのが良い。

【００１２】加えて、培地を静置あるいは振動を与えて無菌状態で培養して、苗条原基様体を得られるものである。 さらに、明条件下や暗条件下で培養させることも可能であり、１５℃〜４０℃の温度条件下で培養することも提案される。 このようにして得られた苗条原基様体は、表層構造を形成したドームを有して茎頂と葉の基となる葉原基との器官分化が認められないもので、表層構造を形成していないカルスとは本質的に異なるものである。 また、この苗条原基様体は、苗条原基様体を得た条件で培養を続けることによって、この苗条原基様体に発生するドームが増加して集塊を形成し、一部は葉原基へと変化して、さらに、これを植物生長調節物質を含まない前記固体培地に植床して培養をつづけることにより、
不定根を誘導させて苗となり、芝へと再生もしくは成長していくものである。

【００１３】前記苗条原基様体に対して、紫外線照射処理、Ｘ線照射処理、γ線照射処理、突然変異物質による浸漬処理から選んだ１種または２種以上の処理を組合わせて処理することによっても前記課題は解決される。 そして、ここで用いられる各処理においては、紫外線照射処理にあっては、２００ｎｍ〜４００ｎｍの波長のものを、Ｘ線照射処理では１ｐｍ〜１０ｎｍのものを、γ線照射処理では０．１オングストローム以上のものを、夫々照射することを意味する。 また、突然変異物質による浸漬処理とは、液体培地や緩衝液等に突然変異物質を添加溶解して、前記苗条原基様体を浸漬させて突然変異を誘発するものである。 その変異を誘発する突然変異物質には、５−ブロモ−２'−デオキシウリジン、エチルメタンサルホネート（ＥＭＳ）、エチレンイミン（Ｅ
Ｉ）、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＭＮＧ）、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル−ウレア（ＭＮＨ）、ジエチル硫酸、１，２−エポキシブタン、
２，３−エポキシプロピオニックアルデヒド、８−アザグアニン、５−ブロモウラシル、アクリジンオレンジ、
ＩＣＲ−１０、アクリフラビン等が用いられる。 このような処理によって耐病性、冬枯れ耐性、耐塩性のある苗条原基様体が得られ、前記課題を解決することもできる。 耐病性に関する病気としては、ラージパッチ（葉腐病）、ピシウム性春はげ症、葉枯病、さび病、しずみ症、ダラースポット、フェアリーリング、黒色小粒菌核病、褐色小粒菌核病、大粒菌核病、紅色雪腐病、褐色雪腐病、萎黄病、黄化症、ほこりかび病などがある。

【００１４】

【作用】ゾイシア属の完熟種子の胚組織、未熟種子の胚組織、頂芽の成長点、腋芽の成長点、茎頂組織をアルコールや塩素系の殺菌剤により殺菌した後に、細胞組織を採取し、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸やインドール酢酸などの植物成長調節物質を添加したムラシゲ・スクーグ培地、リンスマイヤー・スクーグ培地、Ｎ６培地、
ガンボルグらの培地、ヘラーの培地、ＡＡ培地などに植床し、無菌状態で暗条件もしくは明条件により、前記培地を静置あるいは振動を与えて培養することで苗条原基様体が得られ、さらに、これを前記ムラシゲ・スクーグ培地、リンスマイヤー・スクーグ培地、Ｎ６培地などに植床して、培養を継続すると発根、発芽を促して苗を得る。 この苗を圃場に移して培養するとゾイシア属の芝が得られる。

【００１５】さらに、紫外線照射処理、Ｘ線照射処理、
γ線照射処理、突然変異物質による浸漬処理から選んだ１種または２種以上の処理を組合わせて施すことにより、ゾイシア属の持つ遺伝情報を変化させて突然変異を誘発できるので、前記培地に移しても苗が得られ、それを圃場に移しても従来のものとは形質の異なる芝となる。

【００１６】

【実施例】

（実験）コウシュンシバの茎頂組織が含まれるほふく茎を採取し、７０％（Ｖ／Ｖ）のエチルアルコール水溶液並びに１％（Ｖ／Ｖ）次亜塩素酸ソーダ水溶液により殺菌し、無菌水で水洗した後、無菌室で無菌操作により、
この茎頂組織を無菌状態の容器中の固体培地に植えつけた。 その固体培地としては、ムラシゲ・スクーグ培地１
０００ｍｌにショ糖３０ｇと寒天７ｇとを加えた基本培地に、表１に示すような２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を表１に示す１．０ｍｇ〜１０．５ｍｇの添加量で、
ｐＨを５．８に調整したムラシゲ・スクーグ固体培地を用いて行った。 そして２５℃の温度条件で、しかも暗条件下の室内で培養した。 培養開始後、約２週間で誘導体としての苗条原基様体及びカルスを得た。 さらに芝へと成長させるために、苗条原基様体は、同培地で培養を続けて、ドームを葉原基へと変化させて、茎葉の生長とともに不定根を誘導させるために植物成長調節物質を含まないムラシゲ・スクーグ固体培地に植床し、２８℃、３
０００ルクスの明条件下で培養を続け、不定根を誘導し、苗を経由した後に、芝へと成長した。 また、カルスも同様の操作を行い、芝へと成長させた。 その結果を表１に示した。 表１より、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を１．０ｍｇ〜３．０ｍｇの添加量ではカルスが、
３．５ｍｇ〜６．０ｍｇの添加量では苗条原基様体及びカルスが、６．５ｍｇ以上の添加量ではカルスが、夫々誘導された。 また、表１に示すように芝への再生率は、
１．０ｍｇ〜３．０ｍｇでカルスは、０．００１％であり、殆どのものが再生できず、３．５ｍｇ〜６．０ｍｇ
では苗条原基様体のみが芝へと再生し、その再生率は０．２％であった。 さらに、６．５ｍｇ以上の添加量で得られたカルスは、１．０ｍｇ〜３．０ｍｇで得られたカルスとは異なったカルスが得られたが、全てのものは芝にはならなかった。 以上のことにより、芝への再生率は、苗条原基様体を得たものが、カルスを得たものよりも１００倍も高かった。

【００１７】

【表１】

【００１８】（実施例１）前記実験で４ｍｇの２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸を含む固体培地で形成した苗条原基様体に、固体培地に植床した状態で、３分間の紫外線照射（２５４ｎｍ）処理を施し、実施例１としての苗条原基様体を得た。 そして、植物成長調節物質を含まないムラシゲ・スクーグ固体培地に移して植床し、２８
℃、３０００ルクスの明条件下で培養を続け、不定根を誘導させて、苗を経由した後に芝を得た。

【００１９】（実施例２）全線量８ＧｙのＸ線を照射する以外は全く、実施例１と同様の処理行い、実施例２としての苗条原基様体を得た。 そして、その苗条原基様体を実施例１と同様の条件で培養を行い苗を経由した後に芝を得た。

【００２０】（実施例３）実施例１で用いた苗条原基様体を、滅菌した１００ｍｌ容量の遠心管に入れ、突然変異物質として、エチルメタンサルホネート（以下ＥＭＳ
と称す）が０．２５％（Ｗ／Ｖ）含む、ｐＨ７に調整した０．０１Ｍリン酸緩衝液と、５０ｍｌのムラシゲ・スクーグ液体培地を加えて、２５℃で２時間程処理した。
処理終了後、滅菌したパスツールピペットで上澄みを除去した。 さらに、５０ｍｌのムラシゲ・スクーグ液体培地を前記遠心管に添加して、回転数６００ｒｐｍで３分間の遠心処理（商品名：Ｈ−１８ 国産遠心器株式会社製）を３回程行いＥＭＳを除去して、実施例３としての苗条原基様体を得た。 さらに、その苗条原基様体を、実施例１と同様の条件で培養を行い苗を経由した後に芝を得た。

【００２１】そこで、実施例１、２、３の突然変異が誘発しているかどうかを確認するために、夫々の苗条原基様体について、葉の色及び長さ、耐病性、冬枯れ耐性、
耐塩性について調査した。

【００２２】（葉の色及び長さについて）実施例１、
２、３の苗条原基様体を芝に成長させたものが各々１０
株づつを任意に選択して、葉の色及び葉の長さについて一株づつ肉眼で調査した。 長さについては、従来の芝と変わらないもの、短いもの、長いものについて夫々の株数を表２に示した。 また、色についても従来のものと変わらないもの、緑が濃いもの、薄いものについて夫々の株数を表２に示した。 外観上に明らかな差が見られた。

【００２３】

【表２】

【００２４】（冬枯れ耐性について）実施例１、２、３
から苗条原基様体を、苗を経由して、芝に成長させたものを夫々１０株づつ任意に選び、冬枯れ耐性について確認を行った。 そして、冬枯れしない株数を表３に示した。

【００２５】

【表３】

【００２６】（耐塩性）耐塩性については、０．２％
（Ｗ／Ｖ）、０．４％（Ｗ／Ｖ）、０．６％（Ｗ／
Ｖ）、１．０％（Ｗ／Ｖ）、１．５％（Ｗ／Ｖ）、２．
０％（Ｗ／Ｖ）の計６種類の塩分濃度に調整したムラシゲ・スクーグ固体培地に、実施例１、２、３の処理を施した苗条原基様体を夫々１０株づつ培養した後に苗までに成長させ、さらに圃場に移して芝となったものについての株数を表４に示した。

【００２７】

【表４】

【００２８】その結果、表２、表３、表４より、夫々の処理したものから葉の色及び長さ、耐病性、冬枯れ耐性、耐塩性が得られた。

【００２９】

【発明の効果】ゾイシア属の完熟種子の胚組織、未熟種子の胚組織、頂芽の成長点、腋芽の成長点の中から選ばれた少なくとも１種以上のものから苗条原基様体を経由させた後に、苗を得ることで、自然条件の左右を受けずに、ゾイシア属の大量増殖が可能となり、広大な面積を必要とせずに工場での多量生産が可能となることに加えて、農薬も不要となり、従来年１回の生産であったのが、多数回収穫が可能となり、収穫時の人手もいらずに生産ができる。 また、苗条原基様体から芝に再生することにより、従来のカルスからの再生と比較すると、再生率が１００倍〜２００倍も高くなるので、タンク培養が可能となり、工業的に生産ができる。

【００３０】さらに、この前記苗条原基様体に対して、
紫外線照射処理、Ｘ線照射処理、γ線照射処理、突然変異物質により浸漬処理から選んだ１種または２種以上を組合わせて処理しても、前記の方法と同様に大量増殖が可能となり、前記同様にすぐれた効果が得られる。 そして、さらには優良品種に改良することで、葉の色、長さ、耐病性、耐塩性など、種々の優れた性質をもった品種を得ることができる。 以上のように本発明では、、様々な環境に強いゾイシア属が得られるので、芝の生産管理に手間が係らず、コスト面でも従来の方法から比べると遙に安価になる。