【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は有用な二次代謝産物を含有する植物から、植物組織培養法を用いて、二次代謝産物の生産能力が高い苗条を取得する方法に関する。

【０００２】

【従来技術】植物を培養あるいは栽培することによって各種医薬、色素、甘味剤などが生産されている。 かかる場合、生産性を向上するためには、植物が必要とする栄養源や温度、光などの環境因子を制御する技術が重要なことは言うまでもないが、さらに生産性の高い株を取得する技術も重要である。 植物培養細胞の場合は、カルスを幾つかの小集塊に分けてそれぞれの生産能を比較して、それらの中から高生産株を選抜する方法が広く用いられている。 しかし、植物の生産する二次代謝産物は、
葉や根、花などの分化した器官では生産されるが、カルスのような未分化細胞では生産されないことが多い。 かかる場合、カルスから優良株を選抜する際に用いられる小集塊選抜法は適用できない。

【０００３】一方近年、遺伝子操作技術を利用して、高生産株の取得が試みられているが、そのような生産に関わる遺伝子を取得して、植物細胞内に導入するに至るには、熟練した技術及び多くの労力が必要である。

【０００４】また伝統的な圃場栽培による交配によって、生産性の高い品種をつくることも行われているが、
この方法は長い年月を要する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、植物組織培養法を用いて、二次代謝産物の生産能力の高い苗条を取得するための簡便な方法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究の結果、組織培養で得た苗条に複数の腋芽が形成する条件で培養した後、ここで得た腋芽の二次代謝産物の含量を調べることにより、これの生産能力の高い苗条が取得し得ること、及びこの腋芽を用いて上記方法を繰り返すことにより、二次代謝産物の生産能力が飛躍的に向上した苗条を取得できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００７】従って、この発明は、組織培養法で得た苗条に形成した複数の腋芽の中から二次代謝産物の生産能力の高い腋芽を選抜することにより、二次代謝産物高生産苗条を取得する方法を提供するものである。 本発明で対象となる二次代謝産物としては、インドールアルカロイドが挙げられ、例えばアジマリシン、カサランチン、
タベルソニン、ビンドリン、ビンブラスチン、ビンクリスチンがこれに該当する。

【０００８】本発明の方法において組織培養に用いられる二次代謝産物を生産する植物としては、例えばニチニチソウ属植物のリトル・ブライト・アイ品種(Catharant
husroseus var. Little Bright Eye)、ジー・ドン品種
(C.roseus G. Don)、リトル・デリカタ品種(C.roseus c
v. Little Delicata)等を挙げることができる。

【０００９】苗条に複数の腋芽を形成させるには、植物ホルモンであるサイトカイニン好ましくはベンジルアデニンを培地における濃度が、0.01〜5ppm好ましくは0.05
〜1.5ppmになる量で使用する。

【００１０】本発明で使用される培地は、通常用いられる培地と同様の成分を含有する。 このような成分として一般に無機成分及び炭素源が用いられ、これに前記植物ホルモン、ビタミン類を添加し、さらに必要に応じてアミノ酸類を添加することができる。 炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラクトースなどの二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類、
グリセロールなどの糖アルコール、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。

【００１１】無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルトなどの化合物として添加できる。

【００１２】ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ1 ）、ピリドキシン（ビタミンＢ
6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸などが用いられる。

【００１３】アミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニン、グルタミン、システインなどを添加できる。 一般に前記の各成分は、無機成分が約0.1μM ないし100m
M、炭素源が約１〜約30g／l、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約0.1〜約10g／lの濃度で用いられる。

【００１４】本発明の組織培養に用いられる培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962年)〔Murashige
& Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965年)
〔Linsmaier Skoog〕の培地、ホワイト(1954年)〔Whit
e〕の培地、ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培地等に前記の植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記した炭素源、ビタミン類、アミノ酸等を添加して調整される培地を例示できるが、この中でも特にムラシゲ・スクーグの培地を用いて調整される培地が好ましい。

【００１５】本発明には、ゲランガムや寒天等を0.1〜
１％含有する固形培地の使用が好ましい。

【００１６】本発明の組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。 先ずニチニチソウ属に属する植物の種子を殺菌処理後、滅菌水を添加した脱脂綿上に無菌的に置床し、暗黒下にて10〜35℃で５〜10日程経過させて幼苗を誘導する。 このようにして得られた幼苗を、複数の腋芽を有する苗条が形成するのに適したゲランガムで固めた固体培地、例えばベンジルアデニンを添加したムラシゲ・スクーグの固体培地に移植し、光照射下にて10〜35℃で３〜６週間静置培養する。 この培養で複数の腋芽を有する丈高３〜５cmの苗条が得られる。 次にこの苗条から全ての腋芽を採取し、更にこれらを個別に上記培地に移植後、上記培養条件下で培養する。 この培養で、腋芽由来で、且つ上記苗条と同様な形態を有する複数の苗条が得られる。 このようにして得られた腋芽由来の苗条から、それぞれ一部を切り取り、高速液体クロマトグラフィーにて二次代謝産物の含量を定量する。
ここで最も二次代謝産物の含量の高い苗条１株のみにつき腋芽を全て採取し、これらを個別に移植後、上記培養条件下で培養する。 そしてこの培養により得られた苗条の二次代謝産物の含量を定量後、最も二次代謝産物含量の高い苗条を選抜し、以降同様の操作を繰り返す。

【００１７】本発明の組織培養における培養温度としては、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が生育速度が早く好適である。

【００１８】本発明の組織培養における光照射量としては、通常は約1000〜約3000lux、特に約1500〜2000luxが好適である。

【００１９】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。 （実施例１）以下、図１を用いて操作内容を説明する。

【００２０】滅菌水を適量添加した脱脂綿(0.75ml／c
m ³ )に、前もって２％アンチホルミン液または70％エタノール溶液等で滅菌処理したニチニチソウ（Catharanth
us roseus var. Little Bright, マダカスガル原産）の種子ａを無菌的に置床し、暗黒下にて25℃で７日間静置してニチニチソウの幼苗ｂを誘導した。 次いでこの幼苗ｂの根部を破線の示す箇所で切断し、切断後の幼苗ｃをベンジルアデニンが0.1ppmの濃度になるように添加したムラシゲ・スクーグ培地の寒天培地（ゲランガム0.2重量％）に移植後、約1500luxの光照射下で25℃にて３週間静置培養した。 そして複数の腋芽が形成し、且つ基部からの丈高が３〜５cmの苗条ｄを得た。

【００２１】このようにして得られた苗条ｄを破線の示す箇所で切断し、苗条ｄから腋芽を全て採取した。 採取した腋芽ｅをそれぞれを個別に上記培地に移植し、次いで上記培養条件下で３週間培養した。 この結果、上記の腋芽由来で、且つ上記苗条と同様な形態を有する数〜十数株の苗条ｆを得た。

【００２２】培養終了後、各苗条ｆの破線枠部分を切り取り、これらを40℃で１夜風乾した。 得られた乾燥試料は重量測定後、メタノール等によりアルカロイド特にビンドリンを抽出し、次いで高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品ビンドリンと比較定量する事でビンドリン含量を測定した。 ここで測定した苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表１に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】（実施例２）実施例１でビンドリン含量を測定した苗条の内、最もビンドリン含量の高かった苗条１株を選抜し、これの腋芽を全て採取した。 そしてこれら腋芽を該実施例に示した培地と同様の培地に個別に移植し、更には同様の培養条件下で培養することで、該実施例と同様な形態を有する数〜十数株の苗条を得た。

【００２５】培養終了後、該実施例と同様な操作方法で乾燥及び抽出を行いビンドリン含量を測定した。 ここで測定した苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表２に示す。

【００２６】

【表２】

【００２７】（実施例３、４）実施例２と同様の操作を繰り返し２回行った。 そしてその結果得た苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表３、
表４にそれぞれ示す。

【００２８】

【表３】

【００２９】

【表４】

【００３０】（比較例１）以下、図２を用いて操作内容を説明する。 実施例１と同様の操作により幼苗ｂを誘導した後、この幼苗ｂの根部を破線の示す箇所で切断し、
切断後の幼苗ｃをインドール酢酸が0.1ppmの濃度になるように添加したムラシゲ・スクーグの寒天培地に移植し、該実施例と同様の培養条件下で３週間培養した。 そして腋芽を有さず、且つ丈高が10〜15cmの苗条ｄを得た。

【００３１】このようにして得られた苗条ｄの茎部を、
破線が示すように最低２枚の葉を含むよう１〜1.5cm間隔で切り分け、数〜十数株の苗条切断片ｅを作成した後、それぞれを個別に上記培地に移植した。 そして該実施例と同様の培養条件下で３週間培養し、苗条の切断片由来で、且つ上記苗条と同様な形態を有する複数の苗条を得た。

【００３２】培養終了後、該実施例と同様な操作方法で乾燥及び抽出を行いビンドリン含量を測定した。 ここで測定した苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表５に示す。

【００３３】

【表５】

【００３４】（比較例２）比較例１でビンドリン含量を測定した苗条の内、最もビンドリン含量の高かった苗条１株を選抜し、該比較例と同様の操作方法での苗条切断片を作成した。 そしてこれら切断片を該比較例に示した培地と同様の培地に個別に移植し、更には同様の培養条件下で３週間培養した。 そして該比較例と同様な形態を有する複数の苗条を得た。

【００３５】培養終了後、該実施例と同様な操作方法で乾燥及び抽出を行いビンドリン含量を測定した。 ここで測定した苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表６に示す。

【００３６】

【表６】

【００３７】（比較例３、４）比較例２と同様の操作を繰り返し２回行った。 そしてその結果得た苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表７、
表８にそれぞれ示す。

【００３８】

【表７】

【００３９】

【表８】

【００４０】以上に示した実施例及び比較例の結果を比較すると、実施例では、選抜回数を重ねるごとに平均ビンドリン含量が増加するのに対し、比較例では選抜回数を重ねても平均ビンドリン含量のはっきりとした増加はみられない。

【００４１】

【発明の効果】本発明の方法により植物組織培養法を用いて二次代謝産物の生産能力が高い苗条を簡便に取得することが可能となる。 植物の二次代謝産物の中には各種医薬、色素、甘味剤等有用な物質が多いのでこの発明によりこれらの原料を容易にかつ大量に提供できるようになる。

【図面の簡単な説明】

【図 1】 本願発明の概要を示す図である。

【図２】 従来技術の概要を示す図である。