技术领域
[0001] 本
发明属于
种子繁殖技术领域，具体涉及一种蒜头果的快速繁殖方法。
背景技术
[0002] 蒜头果(Malania oleifercl Chun et S.K.Lee)，又名山桐果、
马兰后、猴子果，常绿乔木，属
铁青树科，蒜头果属，为国家二级保护珍稀
植物，是我国特有的单种属植物。蒜头果分布极其狭窄，仅自然分布于
云南东南部和广西西部的狭窄区域。蒜头果固有的
生物学特性不利于其种群的发展，动物对蒜头果果实的取食和危害使得本来就有限的种子数量大为减少，人类活动的破坏不仅直接减少了蒜头果资源，也破坏了蒜头果的适生环境，从而不利于蒜头果的生长和天然更新，致使其处于濒危境地。
[0003] 蒜头果种仁胚乳富含油脂,其中15-二十四
碳烯酸被称为神经酸(nervonic acid)，神经酸是大脑发育、维持的必需营养物,对提高脑神经的活跃、防止脑神经衰弱有很重要的作用。神经酸已引起国内外专家的广泛关注,成为目前开发的热
门产品。同时，蒜头果是优良石山绿化树种。随着近几年来国家对西部大开发和生态环境建设的重视，对兼具经济和生态效益的蒜头果进行组织培养研究，可通过快速繁殖获得大量基因型一致的优良苗木，满足人工栽培的需求，丰富石山地区造林树种，对广大石山区群众脱贫致富和生态环境保护有着重要意义。
[0004] 关于蒜头果的繁殖技术，目前主要采用种子直播技术，其操作简单，但是只部分解决了蒜头果种子发芽的问题。或通过隔离、防治
真菌侵入危害蒜头果种子，防止种子霉变腐烂，提高种子发芽率的效果。
[0005] 蒜头果种子容易霉变腐烂，天然维持蒜头果种群困难，要发展人工栽培泽需要大量优质的种苗。因此，如何有效地构建优良单株蒜头果的繁育技术已经成为目前亟需解决的难题。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种蒜头果的快速繁殖方法。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：一种蒜头果的快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0008] (1)外植体采集；将带有蒜头果果实的枝条剪取，洗净，备用；
[0009] (2)外植体消毒和
腋芽诱导；将消毒好的外植体接种到诱导分化培养基进行培育，得到腋芽；所述的诱导分化培养基为：MD培养基+0.2～2.0mg/L6-BA++0.2～2.0mg/L KT+0.02～0.2mg/L NAA+25～40g/L
蔗糖+6g/L琼脂粉，pH为5.4-5.6；
[0010] (3)增殖培养；将所述腋芽切下并转接到增殖培养基上进行培养，得到增殖苗；所述的增殖培养基为：MD培养基+0.5～1.5mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L KT+0.05～0.15mg/L NAA+25～40g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH为5.4～5.6；
[0011] (4)生根培养；将所述增殖苗中切取芽转接至生根培养基上进行培养，得到组培生根苗；所述的生根培养基为：MD培养基+0.1～0.5mg/LNAA+0.1～0.5mg/LIBA+15～25g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0；
[0012] (5)炼苗与移栽。
[0013] 作为优选，所述步骤(1)中外植体采集是选取干型通直圆满、生长速度快、无病虫害的优良单株为母本，树龄15年以上，于10月份晴天的上午，剪取带果实枝条，带回后用纯净
水清洗干净，备用。
[0014] 作为优选，所述步骤(2)中消毒是将种子取出，削去外种皮，用无菌水清洗，再依次用酒精、升汞溶液浸泡消毒，再用无菌水冲洗，备用。
[0015] 作为优选，所述步骤(2)中消毒后的外植体是鲜接种到MD培养基，新芽萌发后再切下所述新芽接入到所述诱导分化培养基中培养。
[0016] 作为优选，所述步骤(2)中所述的诱导分化培养基为：MD培养基+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L KT+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.4-5.6；所述诱导分化培养的培-2 -1
养条件为：
温度24±2℃、光照60μmol·m .s 培养，光照12h/d；所述诱导分化培养的时间为：30天。
[0017] 作为优选，所述步骤(3)中的增殖培养基为：MD培养基+6-BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.4～5.6；所述增殖培养的条件为：温度25±2-2 -1℃、光照60μmol·m .s 培养，光照12h/d。
[0018] 作为优选，所述步骤(4)中的生根培养基为：MD培养基+NAA 0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.8～6.0；所述生根培养的条件为：温度24±2℃、光照60μmol·m-2.s-1培养，光照12h/d。
[0019] 作为优选，所述步骤(5)中的炼苗是将所述组培生根苗移到
温室中适应外界环境10～15天；所述步骤(5)中的移栽是将所述炼苗完成后的容器苗洗净粘在根上的培养基，移栽到混合基质中，所述移栽后的前30天采用盖膜保湿，之后揭膜进行日常管理。
[0020] 作为优选，所述混合基质由
泥炭土和珍珠岩混合而成，所述泥炭土与珍珠岩的
质量比为2～4:1。
[0021] 本发明中的MD培养基若没有特殊
指定，均为：
[0022] MD培养基含有如下成分：700mg/L NH4NO3+350mg/L KNO3+600mg/L Ca(NO3)2·2H2O+170mg/LMgSO4·7H2O+85mg/L KH2PO4+65mg/L KCl+22.3mg/L MnSO4·4H2O+8.6mg/LZnSO4·7H2O+6.2mg/L H3BO3+0.83mg/L KI+0.25mg/LNa2MoO4·2H2O+0.25mg/LCuSO4·5H2O+0.025mg/LCoCl2+27.8mg/LFeSO4·7H2O+37.3mg/LNa2·EDTA·H2O+100mg/L肌醇+2.0mg/L甘
氨酸+1.0mg/L
盐酸硫胺素+0.2mg/L烟酸+0.2mg/L盐酸吡哆醇，pH为5.8。
[0023] 本发明的有益效果在于：
[0024] 针对蒜头果现有育苗技术中存在的组培无菌性建立困难、增殖培养的芽伸长慢、质量差、增殖倍率低，生根率低，技术不稳定等技术问题，根据蒜头果成年大树生理状态、离体培养的营养需求而采用MD基本培养基进行培养。其外植体的腋芽速度快；诱导率高、达100％；增殖系数大、达4.2以上，增殖芽伸长生长快，培养30d芽高达5～6cm；生根率可达
90％，平均根数为3.4根/株；组培生根苗健壮、移栽成活率高。本发明具有不定芽诱导快、增殖倍率高、芽粗壮生长快、生根率高、生根苗根系发达健壮、移栽成活率等特点，可以用于规模化生产培养。
附图说明
[0026] 图2为实施例1的优树无菌材料的发芽诱导结果图；
[0027] 图3为实施例1的诱导腋芽形成的芽丛结果图；
[0028] 图4为实施例1的生根培养基中的生根苗根系结果图；
[0029] 图5为实施例1的移栽苗的生长图；
[0030] 图6为实施例1的定植苗的生长图。
具体实施方式
[0031] 为使本领域技术人员详细了解本发明的生产工艺和技术效果，下面以具体的生产实例来进一步介绍本发明的应用和技术效果。
[0032] 实施例1
[0033] 一种蒜头果的快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0034] (1)外植体采集：选取干型通直圆满、生长速度快、无病虫害的优良单株为母本，优树树龄15年以上，于10月份晴天的上午，剪取带果实枝条，带回后用纯净水清洗干净，低温保湿备用；
[0035] (2)外植体消毒和腋芽诱导：在超净
工作台上，将果实内的种子取出，削去外种皮(图1)，用无菌水清洗一遍，再用浓度75％酒精溶液浸泡时间为45s，倒掉酒精溶液后无菌水冲洗2次，然后加入0.01％1升汞溶液，浸泡10min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后用无菌水冲洗5次，用无菌水冲洗后，无菌
滤纸吸干无菌材料表面水份，将茎段切成2cm带叶腋切并接种到MD培养基，30d以后新芽萌发，切下新芽，接入诱导分化培养基(诱导分化培养基：MD培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.4-5.6(
激素购自Sigma-Aldrich公司)，放到培养室，于24±2℃、60μmol·m-2.s-1培养，光照12h/d；诱导培养30d，将长度大于2cm的新芽切下转接到增殖培养基培养；培养30d，腋芽分化形成新芽丛，将芽高≧3cm幼嫩枝条切割成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基培养；每瓶接种一个外植体,一个月后一个种子能萌出一个芽(图2)，将其继续培养，继而形成芽丛，每丛有芽4～6株，芽苗健壮，翠绿(图3)，诱导率为100％；
[0036] (3)增殖培养：将步骤(2)的诱导出的腋芽截成1.0～2.0㎝的茎段并转接到增殖培养基(MD培养基+6-BA 1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.8～6.0)上进行培养，
温度控制在25±2℃，光照(60μmol·m-2.s-1)时间12h/d；4周后，单芽形成芽丛，芽伸长生长快，增殖系数高达4.3(图4)；有效芽(芽高≥2cm)可达3.3个/丛，芽高可达5～6cm。
[0037] (4)生根培养：从步骤(3)得到的增殖苗中切取2.0cm芽转接至生根培养基(MD培养基+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.8～6.0)上进行培养，温度控制在24±2℃，光照(60μmol·m-2.s-1)时间12h/d，15d后，不定根的诱导率为100％，生根苗健壮，高达4～5cm，基部愈伤组织少，平均根数可达3.4条/株。
[0038] (5)炼苗与移栽：将步骤(4)组培生根苗移到温室进行炼苗移栽，得到容器苗。将生根培养30d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境10～15d，然后将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝3：1混合基质上，移栽后前30d采用盖膜保湿，然后揭开
薄膜按常规
幼苗管理，该移栽成活率高于90％；一个月后移栽苗生长良好，新叶嫩绿光亮(图5)，约一年后可以定植(图6)。
[0039] 实施例2
[0040] 一种蒜头果的快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0041] (1)外植体采集：选取干型通直圆满、生长速度快、无病虫害的优良单株为母本，优树树龄15年以上，于10月份晴天的上午，剪取带果实枝条，带回后用纯净水清洗干净，低温保湿备用；
[0042] (2)外植体消毒和腋芽诱导：在超净工作台上，将果实内的种子取出，削去外种皮，用无菌水清洗一遍，再用浓度75％酒精溶液浸泡时间为30s，倒掉酒精溶液后无菌水冲洗1次，然后加入0.05％升汞溶液，浸泡8min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后用无菌水冲洗5次，用无菌水冲洗后，无菌滤纸吸干无菌材料表面水份，将茎段切成2cm带叶腋切并接种到MD培养基，30d以后新芽萌发，切下新芽，接入诱导分化培养基(诱导分化培养基：MD培养基+0.2mg/L6-BA+0.2mg/LKT+0.02mg/LNAA+蔗糖25g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.4-5.6(激素购自Sigma-Aldrich公司)，放到培养室，于24±2℃、60μmol·m-2.s-1培养，光照12h/d；诱导培养
30d，将长度大于2cm的新芽切下转接到增殖培养基培养；培养30d，腋芽分化形成新芽丛，将芽高≧3cm幼嫩枝条切割成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基培养；每瓶接种一个外植体,一个月后一个种子能萌出一个芽，将其继续培养，继而形成芽丛，每丛有芽4～6株，芽苗健壮，翠绿，诱导率为100％；
[0043] (3)增殖培养：将步骤(2)的诱导出的腋芽截成1.0～2.0㎝的茎段并转接到增殖培养基(MD培养基+6-BA 0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA 0.15mg/L+蔗糖25g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.4～5.6)上进行培养，温度控制在25±2℃，光照(60μmol·m-2.s-1)时间12h/d；4周后，单芽形成芽丛，芽伸长生长快，增殖系数高达4.3；有效芽(芽高≥2cm)可达3.3个/丛，芽高可达5～6cm。
[0044] (4)生根培养：从步骤(3)得到的增殖苗中切取2.0cm芽转接至生根培养基(MD培养基+NAA 0.1mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.8～6.0)上进行培养，温度控制在24±2℃，光照(60μmol·m-2.s-1)时间12h/d，15d后，不定根的诱导率为100％，生根苗健壮，高达4～5cm，基部愈伤组织少，平均根数可达3.4条/株。
[0045] (5)炼苗与移栽：将步骤(4)组培生根苗移到温室进行炼苗移栽，得到容器苗。将生根培养30d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境10～15d，然后将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝2：1混合基质上，移栽后前30d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理，该移栽成活率高于90％；一个月后移栽苗生长良好，新叶嫩绿光亮，约一年后可以定植。
[0046] 实施例3
[0047] 一种蒜头果的快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0048] (1)外植体采集：选取干型通直圆满、生长速度快、无病虫害的优良单株为母本，优树树龄15年以上，于10月份晴天的上午，剪取带果实枝条，带回后用纯净水清洗干净，低温保湿备用；
[0049] (2)外植体消毒和腋芽诱导：在超净工作台上，将果实内的种子取出，削去外种皮，用无菌水清洗一遍，再用浓度75％酒精溶液浸泡时间为60s，倒掉酒精溶液后无菌水冲洗2次，然后加入1‰升汞溶液，浸泡12min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后用无菌水冲洗6次，用无菌水冲洗后，无菌滤纸吸干无菌材料表面水份，将茎段切成2cm带叶腋切并接种到MD培养基，30d以后新芽萌发，切下新芽，接入诱导分化培养基(诱导分化培养基：MD培养基+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LKT+0.2mg/LNAA+蔗糖40g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.4-5.6(激素购自Sigma-Aldrich公司)，放到培养室，于24±2℃、60μmol·m-2.s-1培养，光照12h/d；诱导培养
30d，将长度大于2cm的新芽切下转接到增殖培养基培养；培养30d，腋芽分化形成新芽丛，将芽高≧3cm幼嫩枝条切割成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基培养；每瓶接种一个外植体,一个月后一个种子能萌出一个芽，将其继续培养，继而形成芽丛，每丛有芽4～6株，芽苗健壮，翠绿，诱导率为100％；
[0050] (3)增殖培养：将步骤(2)的诱导出的腋芽截成1.0～2.0㎝的茎段并转接到增殖培养基(MD培养基+6-BA 1.5mg/L+KT1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.4-2 -1～5.6)上进行培养，温度控制在25±2℃，光照(60μmol·m .s )时间12h/d；4周后，单芽形成芽丛，芽伸长生长快，增殖系数高达4.3；有效芽(芽高≥2cm)可达3.3个/丛，芽高可达5～
6cm。
[0051] (4)生根培养：从步骤(3)得到的增殖苗中切取2.0cm芽转接至生根培养基(MD培养基+NAA0.25mg/L+IBA 0.25mg/L+蔗糖25g/L+琼脂粉6g/L，pH为5.8～6.0)上进行培养，温度控制在24±2℃，光照(60μmol·m-2.s-1)时间12h/d，15d后，不定根的诱导率为100％，生根苗健壮，高达4～5cm，基部愈伤组织少，平均根数可达3.4条/株。
[0052] (5)炼苗与移栽：将步骤(4)组培生根苗移到温室进行炼苗移栽，得到容器苗。将生根培养30d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境15d，然后将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝4：1混合基质上，移栽后前30d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理，该移栽成活率高于90％；一个月后移栽苗生长良好，新叶嫩绿光亮，约一年后可以定植。
[0053] 上述实施例中，MD培养基若没有特殊指定，均为：
[0054] MD培养基含有如下成分：700mg/L NH4NO3+350mg/L KNO3+600mg/L Ca(NO3)2·2H2O+170mg/LMgSO4·7H2O+85mg/L KH2PO4+65mg/L KCl+22.3mg/L MnSO4·4H2O+8.6mg/LZnSO4·7H2O+6.2mg/L H3BO3+0.83mg/L KI+0.25mg/LNa2MoO4·2H2O+0.25mg/LCuSO4·5H2O+0.025mg/LCoCl2+27.8mg/LFeSO4·7H2O+37.3mg/LNa2·EDTA·H2O+100mg/L肌醇+2.0mg/L甘氨酸+1.0mg/L盐酸硫胺素+0.2mg/L烟酸+0.2mg/L盐酸吡哆醇，pH为5.8，121℃灭菌20分钟。
[0055] 利用上述实施例的方法，外植体的新芽萌发速度快；诱导率高、达100％；增殖系数大、达4.3以上，增殖芽伸长生长快，培养30d芽高达5～6cm；生根率90％，平均根数为3.4根/株；组培生根苗健壮、移栽成活率高。
[0056] 最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的
权利要求范围中。
