【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、遺伝的な形質転換を通じて、改変されたフィトクロームＡ光レセプターを有する作物植物の成長速度および光応答性を操作する分野に関する。 とりわけ本発明は、経済的に重要な作物植物の環境光に対する応答を調整する分子生物学的戦略によって、植物の構築および光形態形成の改変に関するものである。 これは芝生、特に外見には矮小の、もっと分岐した構造を有する遺伝子組換え芝生に強調をおかれる。 本発明は、日陰回避反応（ｓｈａｄｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の抑制を通じて遺伝子組換え作物植物を開発することにより達成される。 その結果、その遺伝子組換え植物は、健康でしかも強靭であり、病原菌感染に抵抗性を示す。 加えて、遺伝子組換え植物は、その両親の植物よりも、速やかに地面を覆い、往来によるダメージから回復することができる。 これにより、向上した順応可塑性とともに、高い経済価値の植物を提供する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
本発明は、遺伝子組換えノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｓｔｅｕｄ．）に関する。 このノシバは、改変燕麦フィトクロームＡ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏａｔ ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物を用いて形質変換された植物細胞からなる。 当該フィトクロームのセリン−５９８はアラニンに置換されており、光応答性を向上させている。 生起する組換えノシバは、矮小な節間と葉柄、短い葉、暗緑葉色および健康で強靭な外見といった、著しく低下した典型的日陰回避反応を示す。 このことは作物植物の収量と環境適応に大いに影響を与えるものである。
【０００３】
ノシバは、韓国芝生草としても知られ、世界の温帯地域、とくに韓国、日本および中国東部地域を含む極東アジアにおいて最も広範に栽培されている芝生草種の１つである。 その栽培地域は、旱魃耐性および往来によるダメージからの急速な回復能力といった、尋常でない特性のために、近年は、米国および他の諸国でも急速に拡張している。 特に、ノシバは事実上すべての気候でも痩せた土壌ですら充分に成長する。 したがってノシバは、ゴルフコース、運動場、道路の路傍、家庭庭園、河川堤防といった場所において実用目的でも装飾目的でも広く使用されている。 しかしながら、ノシバは、ある固有の欠点を抱えており、その解決が、顧客から強く望まれている。 大方の関心は、改善された病原菌と除草剤に対する耐性ならびに環境変化に対する順応可塑性を含むものである。 加えて、ノシバは、暑い夏季の間、過成長する傾向があり、手間がかかり費用の嵩む頻繁な水遣りと芝刈りを必要とする。 特に重要であることは、過成長の植物は菌類による感染を極めて受けやすいことであり、殺菌剤を含め、大量の化学薬剤を散布して種々の病原菌を抑制する必要があり、結果的には深刻な環境汚染を惹き起こす。 ノシバ栽培におけるこれらの問題を解決する一つの有効な方法は、遺伝子工学的にノシバを処置することあり、これで低下した日陰回避反応を示す。 日陰回避（ｓｈａｄｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ）は、自然界に起こる、光を争う植物の激烈な競争に打ち勝つ適応機構である（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｌａｍ， １９９７）。 植物が暗所または日陰で生育する場合、これは隣接する植物の樹冠（ｃａｎｏｐｙ）下で自然に見られることだが、葉や根の成長を犠牲して、茎または胚軸の伸張が著しく刺激され、ひょろ長いが虚弱の外見になってしまう。 結果的に、そうした植物は病原菌感染および環境ストレスを頗る受けやすく、作物生産性の著しい損失を招く。 遺伝子工学的に日陰回避反応が低下するように作り出されたノシバは、両親植物よりもゆっくり成長するが、丈夫である。 植物学者に得られる技術で、植物の分子生物学的な植物組織培養の充分に確立された技術を用いることにより、関心のある特定の遺伝子を、事実上任意の作物植物に導入して、予測可能な方式で有用な特質を導入するかまたは改善することは、今では可能なことである。
【０００４】
植物の生育と発達は、成長ホルモンといった発達上の固有合図と様々な環境要因との間の整合的相互作用により調節されている。 光は、植物の生涯全体を通じてその成長と発達の過程における多くの局面に影響を与える最も重要な環境要因の一つであり、それは種子発芽、葉と茎の成長、光周期性（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｓｍ）、日陰回避から開花までカバーし、光形態形成（ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）と総称される。 自然界において植物の生き残りと繁殖に重要であり、際立った光形態形成反応は、日陰の回避である。 それはよく知られた植物による植物性機能の展開活動であり、自然界に起こる、植物の激烈な光を争う競争に絶対に打ち勝つことが求められる過程である。 それは特に森林に自然に発生し、密集栽培部分において往々に遭遇されるように、植物が極めて近接して成長している場合に起こる。 日陰回避反応は、光合成に必要とされる充分な量の光を獲得するために、茎と胚軸の異常に速い伸長成長ならびに抑制された葉と値の成長および抑制された貯蔵器官製造により象徴され、ひょろ長いが虚弱な外見になってしまう。 それは植物の生き残りに必須の機構であるが、作物栽培においてはある問題を孕み得るものである。 作物植物は、やせて虚弱になり病原菌感染や、雨、風といった環境変化を受けやすくなるためである。 作物栽培においてこの問題を解決するために様々な努力がなされてきたが、最近、日陰回避反応を操作することが問題解決の有望な方法であることが見出されている。
【０００５】
植物において日陰回避反応を誘導する接近シグナルとは、隣接する植物から反射される輻射線である。 光合成色素は可視光線波長（４００〜７００ｎｍ）のほとんどを吸収するが、遠赤色光領域にあるより長波長（７００〜８００ｎｍ）の光は、反射されるか伝達される。 その結果、樹冠の下では、遠赤色光（ＦＲ）の波長が潤沢となる。 ＦＲ光はフィトクロームの光レセプターにより認識される。 フィトクロームの生理機能は、ある特異な光化学的活動により主に駆動されるもので、２つの異なるスペクトル形、すなわち赤色（Ｒ）光を吸収するＰｒ形とＦＲ光を吸収するＰｆｒ形との間の可逆的な光変換である。 Ｐｆｒ形が、ほとんどの光形態形成過程における生理機能に関与する。 したがってフィトクローム作用は、光環境においてＲ：ＦＲ比によって決定されていることは明らかである。 シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）では、少なくとも５種の異なるフィトクローム（ｐｈｙＡ〜ｐｈｙＥ）があることが知られている。 それらは異なる機能のみならず、ともに重複する機能をも作用させている。 光が当たらない植物では、ｐｈｙＡが高水準に蓄積され、光に反応して茎が成長することを抑制する。 そのλｍａｘは７１０〜７２０ｎｍあたりにある。 しかし、光で成長した植物では、ｐｈｙＡは急速に分解され、ｐｈｙＢがＲ：ＦＲ比の関数として茎生育の調節に主たる役割を担っている。 ＦＲ含量が高いと、樹冠の下で起こるように、ｐｈｙＢは日陰回避反応を調整する。 その結果、光が当たらない植物では主としてｐｈｙＡの活動を通じてＦＲ光は茎生育を阻害し、光に当たって成長した植物では主にｐｈｙＢ作用を介して茎成長が刺激される。
【０００６】
ｐｈｙＡを過剰発現している遺伝子組換え植物では、ｐｈｙＡレベルは光により誘導される分解を相殺するのに充分なあるレベルに維持されており、比較的高いＦＲ波長の含量を有する光環境で成長した場合、著しい矮小性を示すことが明確に確立されている。 外部からＰＨＹＡ遺伝子を導入することによって日陰回避を操作する技術は、双子葉植物では成功しているが（Ｂｏｙｌａｎ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ， １９８９）、ＰＨＹＡ遺伝子を過剰発現している遺伝子組換えイネ植物はそうした矮小性の外形を呈しなかった。 遺伝子組換えイネ植物において、矮小外形が存在しないことを説明するのに２つの可能性が示唆されている。 一つは、単子葉植物または双子葉植物のフィトクロームは、異なる機能を有しているかも知れず、各フィトクロームはそれぞれの植物において特異的に機能しているというものである。 あるいは、ｐｈｙＡの発現レベルが、光誘導による固有ｐｈｙＡの分解を相殺するほどに充分でなかった。 おそらくそれは用いたプロモーターの不充分な作用によるものである。 単子葉植物および双子葉植物のいずれからも単離された、すべてのｐｈｙＡは、高い配列相同性を示し、同一の光化学的活性を示しているため、我々は、後者が外来ｐｈｙＡを発現する遺伝子組換えイネ植物において、何らかの表現形質の変更が存在しないための理由であるかもしれないと推測した。
【０００７】
我々は最近燕麦ｐｈｙＡ変異体を得たが、そのセリン−５９８はアラニンに置換されており、過敏な光応答性を示した。 改変されたｐｈｙＡを発現する遺伝子組換えモデル植物は、光の中で成育させると野生型ｐｈｙＡを発現する植物よりも一層顕著に矮小であった。 この観察に基づいて、改変ｐｈｙＡを持つ遺伝子組換えの芝生またはイネは、隣に植物があろうとなかろうと、野生型ｐｈｙＡを有する芝生またはイネよりもさらに目立って低下した日陰回避反応を惹き起こすことが予測された。
【０００８】
本明細書において使用される用語「遺伝的な形質転換」とは、予測できる方式で、関心対象の作物植物に遺伝子または遺伝的物質を導入するための操作を言及するものである。 その遺伝子または遺伝的物質は安定的に植物ゲノム中に組み込まれ、植物ゲノムの一部として幾世代にも通じて伝達される。
【０００９】
【発明の概要】
「低下した日陰回避性を有する遺伝子組換えノシバ」の発明の名称を有する本発明は、光形態形成の成長および発達の様々な局面において光応答性を操作するために改変燕麦フィトクロームＡ遺伝子（配列番号ＮＯ：１）を用いるノシバの遺伝的な形質転換に関する。 その光応答性のなかでも低下した日陰回避性反応、たとえば矮小の外見と増加した分岐が最も顕著である。 同様の遺伝子アプローチが、芝生草の近縁種または、イネといった他の単子葉植物の遺伝的な形質転換にも適用できる。
【００１０】
本発明において使用された燕麦フィトクロームＡ遺伝子（ＰＨＹＡ）は、そのセリン−５９８が、アラニンに置換されている野生型遺伝子の修飾型（Ｓ５９８Ａ）である。 セリンのコドン、ＡＧＴが部位特異的インビトロ突然変異により、ＧＣＴ、アラニンのコドンに変えられていた。 フィトクローム分子は、全体として２個の主要な構造ドメインからなり、システイン−３２１残基において共有結合で結合した発色団、フィトクロモビリン（ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｏｂｉｌｉｎ）を有するＮ−末端光センサー・ドメイン（Ｂｈｏｏら，１９９９）と、フィトクローム二量体化とプロテインキナーゼに必要ないくつかの構造モチーフを有するＣ−末端調節ドメイン（Ｙｅｈ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ， １９９８）である。 またフィトクロームは、ＰＩＦ３（Ｎｉら， １９９８）、ＰＫＳ１（Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒ ら，１９９９）、ＮＤＰＫ２（Ｃｈｏｉ ら，１９９９）といった様々なフィトクローム相互作用因子と直接相互作用する構造エレメントも含んでいる。 セリン−５９８は、上記２つの構造ドメイン間の小さいヒンジ領域に位置している。 特にＰｆｒ型においてインビボで選択的に自己リン酸化されるのは、そのセリン残基のみである。 それゆえ、セリン−５９８は、フィトクローム分子内においてドメイン間シグナリングを調整することによりフィトクローム機能を媒介していると示唆されてきた（Ｌａｐｋｏら， １９９７）。 最近、我々は改変されたＰＨＹＡ遺伝子（Ｓ５９８Ａ）で形質転換されたシロイヌナズナ植物が、過敏な光応答、日陰回避反応の著しい低下を示していることを観察したが、これはフィトクローム機能におけるセリン−５９８の役割を支持している。
【００１１】
本発明は、構成的ユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ−Ｐ）の制御の下にＳ５９８Ａ遺伝子を過剰発現している遺伝子組換えノシバを提供する。 遺伝子組換え細胞系は、除草剤耐性で分離された。
遺伝子組換えノシバのカルスは、ブダペスト条約の下、２００２年５月１０日に国際寄託機関、すなわち韓国基準菌株収集体（大韓民国、３０５−３３３、Ｔａｅｊｏｎ Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ， Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ， ＃５２韓国バイオサイエンス・バイオテクノロジー研究所）に受託番号Ｎｏ． ＫＣＴＣ１０２４２ＢＰとして国際寄託された。
【００１２】
産生された遺伝子組換えノシバは、典型的な日陰回避反応の強力な抑制を示す。 観察された表現型の変化は、矮小化された節間および胚軸、短い葉、より分岐し、暗緑色の葉色を含んでいたが、これらは作物植物にとり作物学的に有用な特質である。 その遺伝子組換えノシバは、矮小であるが健康であることから（暗緑で頑丈である）、往来によるダメージから改善された修復能力や病原菌に対する抵抗性を示すであろう。 加えて頻繁な芝刈りや水遣りも必要でなくなるであろう。
【００１３】
Ｓ５９８Ａ遺伝子を発現している遺伝子組換えノシバについてのこれらの結果は、低下した日陰回避反応を有する遺伝子組換え作物植物が同様の分子アプローチにより産生できることを示している。 それらの植物は、より丈夫に、しかし高度に密植して生育させることができ、それはイネや他の単子葉植物において有用な作物学的特質である。 さらに遺伝子組換え植物は、成長と病原菌のコントロールのためにそれぞれより少ない栄養物および水、薬剤しか必要としない。
【００１４】
したがって、本発明は、１． 改変燕麦フィトクロームＡ遺伝子、Ｓ５９８Ａ（配列番号 ＮＯ：１）を有する遺伝子組換えノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｓｔｅｕｄ．）または近縁の芝生種の産生方法、２． Ｓ５９８Ａ遺伝子を含有し、矮小化された節間および胚軸、短い葉、より分岐し、暗緑の葉色を示す遺伝子組換えノシバ（ＫＣＴＣ１０２４２ＢＰとして寄託）を提供する。
【００１５】
【発明の具体的な説明】
関心のある遺伝子または遺伝子セグメントを用いる作物植物の遺伝的な形質転換は、新規なもしくは増強された有用特性を有する、植物種の新しい変種を効率よく開発する方法であり、最近になって確立されたものである。 作物植物の遺伝子操作に好適と目される標的特性として、改変された成長速度、順応可塑性、生物的もしくは非生物的ストレスに対する増強された耐性および向上された収量が挙げられる。 植物の分子生物学および組織培養における最近の進歩した技術と知識でもって、関心のある遺伝子は、いずれも任意の特定植物種に定石通り導入することができる。 遺伝的な形質転換と組織培養のための効率的なシステムが、ノシバについても開発されてきており、遺伝子組換えノシバに導入された遺伝子が高水準に発現することが確認されてきた（Ｂａｅら、２００１）。
【００１６】
本発明の詳細な記載が、本発明を実施する場合の当業者を支援するために開示される。 しかしながら、本発明の修飾および変更は、本発明の方向および範囲から逸れることがなければ、通常の当業者にとり可能であろう。
本発明は、矮小化された茎（胚軸）および葉柄、短い葉、より分岐すること、暗緑色といった低下した日陰回避反応を示す遺伝子組換えの単子葉または双子葉植物を提供する。 とりわけ本発明は、改変燕麦フィトクロームＡをコードする遺伝子配列（配列番号、ＮＯ：２）を含有する組換えＤＮＡ構築物を用いて形質転換された植物細胞からなる、遺伝子組換えのノシバおよび近縁芝生とイネ植物を提供する。 前記遺伝子は、植物内でその適切な発現に際し必要とされる発現調節配列エレメントの少なくとも１つと機能的に結びついており、これによりその遺伝子発現は高水準に維持され、日陰回避反応を抑制する能力を植物に付与する。
定義「発現の維持」とは、次のいずれかを意味する；
（１）本来在るフィトクロームＡは、光に不安定であり、光照射により急速に分解されるが、付加されるフィトクロームＡは、調整により光に刺激された分解による損失を相殺するかまたはそれを上回るほど充分な水準にその導入遺伝子から絶えず供給される。 あるいは（２）フィトクロームＡの本来の生物活性が、野生型フィトクロームＡと比較して生理活性が大いに向上するように改変されている。
【００１７】
上記改変フィトクロームＡは、燕麦フィトクロームＡまたは双子葉植物または単子葉植物からの他のフィトクロームＡにおいて、セリン−５９８または１以上のその機能的等価物をそれぞれ置換することにより産生される。 当該改変フィトクロームＡ（配列番号ＮＯ：２）は、日陰回避反応の抑制に関し野生型フィトクロームＡと比べて、同等またはより強い生理活性を有することができる。
【００１８】
前記の改変フィトクロームＡ遺伝子（Ｓ５９８Ａ）は、従来の遺伝的な形質転換操作によって適用することができ、本発明において示された実施例を用いることにより、また当業者によりよく知られた他の方法により適用することができる。
「低下した日陰回避反応」は、日陰回避反応の抑制、すなわちフィトクロームの光レセプターにより感知された接近信号（Ｒ：ＦＲ比）により調節される、葉と根の成長を犠牲にした茎（胚軸）および葉柄の伸長の刺激を指していることから、茎（または節間）と葉柄は、矮小化し、分岐が増加し、植物細胞における葉緑体の密集化により葉色は暗緑色となる。 植物が隣接植物に極めて接近して成長する場合に日陰回避反応の低下は最も顕著となる。
【００１９】
代謝物質をもっと収穫可能な器官に再配分して作物収量を増強するのに有用である日陰回避反応の低下は、フィトクロームＡ発現の上昇によるか、またはフィトクロームＡ本来の生物活性を変更することのいずれかにより達成でき、その結果、本発明の遺伝子組換え植物において発現される場合、その生物活性は、野生型の植物のそれと比較して、大きく向上している。
【００２０】
たとえば、セリン−５９８は、Ｎ−末端光センサー・ドメインとＣ−末端調節ドメインとの間のヒンジ領域に位置している。 そしてＮ−末端ドメインにおける光知覚から、Ｃ末端ドメインにおけるＰＩＦとのフィトクローム相互作用の調節へのドメイン間シグナリングに役割を担うと示唆されてきた（Ｐａｒｋら、２０００）。 ＦＲ吸収性Ｐｆｒフィトクロームにおいてそのセリンは選択的にリン酸化され、フィトクローム機能に重要である。 セリン−５９８のアラニンへの置換は、モデル植物細胞において発現された際、環境光に対し過敏な光反応を生起することが確認されてきた。 もっとも、それは野生型フィトクロームＡと同一の光化学的活性を示す（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、１９９２）。
【００２１】
「発現調節配列エレメント」は、発現ベクター構築物において遺伝子または遺伝子セグメントに適切に結合されている場合には、問題遺伝子の効率的発現を高水準に誘導するヌクレオチド配列エレメントをいう。 これにはプロモーター、エンハンサー、リプレッサーおよびポリ（Ａ）ターミネーター配列が含まれるが、それだけに限定されない。 ポリ（Ａ）ターミネーター配列は、所望の遺伝子の３'末端に結合し、適切な部位における転写の終了、ならびにｍＲＮＡ安定化および効率的翻訳に必要とされるポリ（Ａ）テイル（ｔａｉｌ）の付加を調節する。
【００２２】
たとえばプロモーター（代わりに「遺伝子プロモーター」とも言及されるかも知れない）は、所望の遺伝子の５'末端に結合されて転写の開始を調節する。 本発明に有用なプロモーターは、以下の性質のうち少なくとも１つ有する。
（１） 植物の一生を通じ、すべての植物器官において所望の遺伝子または遺伝子セグメントの構成的発現；または（２） 特定の環境シグナルまたは発達上のシグナルがそのプロモーター活性を誘導する場合に限って、所望の遺伝子または遺伝子セグメントの条件的発現；または（３） 特定の植物器官、たとえば花、葉または茎における所望の遺伝子または遺伝子セグメントの器官特異的な発現；または（４） 特定の発達上の段階、たとえば無性の、または繁殖の成長段階の間における所望の遺伝子または遺伝子セグメントの発達段階に特異的な発現。
【００２３】
植物細胞における遺伝子発現に使用される２つの代表的なプロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）プロモーターおよびトウモロコシのポリユビキチン（Ｕｂｉ−Ｐ）プロモーターである。 後者は、単子葉植物で所望の遺伝子または遺伝子セグメントを発現させる場合に、少なくとも１０倍、前者よりも強力であるために特に有用である。
【００２４】
「植物発現ベクター」は、プロモーターおよびポリ（Ａ）シグナル配列といった上記発現調節配列エレメントに適切に結合された所望の遺伝子を少なくとも１つ含む組換えＤＮＡ構築物として定義され、当該遺伝子の産物を高水準に発現することとなる。
本発明の植物発現ベクター構築物（ｐＣＵＭＢ−ｐｈｙＡ）は、以下の特徴を有している。
（１） 所望の遺伝子の効率的発現のための、ユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ−Ｐ）およびＮＯＳターミネーター；
（２） 高等植物細胞における選択のために除草剤耐性遺伝子（ＢＡＲ）およびヒグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｇｒ ^Ｒ ）；
（３） Ｅ． ｃｏｌｉおよびにＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおける細菌選択のためにカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ ^Ｒ ）；および（４） セリン−５９８がアラニンに置換された改変燕麦フィトクロームＡ遺伝子（Ｓ５９８Ａ）、これはＵｂｉ−Ｐプロモーターの制御のもとに、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ認識部位を用いてＧＵＳコード配列領域を置換することによりｐＣＵＭＢベクター中に挿入した。
【００２５】
所望の遺伝子は、合成するか、自然界から単離するかいずれかにより調製することができる。 あるいは、その遺伝子は、合成のＤＮＡ成分と自然界から単離されたＤＮＡ成分の混合物からなることもでき、タン白質、酵素、キャリヤー、ポンプまたは植物ホルモンをコードする。 一般に合成ＤＮＡ配列は、適当なコドン類を用いて製造され、植物細胞における遺伝子発現に好ましく使用される。
【００２６】
「植物の形質転換」とは、関心のある遺伝子またはｃＤＮＡを、適切に結合された発現調節配列エレメントとともに、任意の高等植物、好ましくは作物植物中に、当業者に周知の方法を使用して導入する操作をいう。 そうした植物は、遺伝子またはｃＤＮＡを機能的に作動し得る態様で導入されれば、低下した日陰回避反応を示すように遺伝子工学的に操作され得て、日陰回避反応が低下するのに有効なレベルで発現し、これにより植物の構造および成長速度が改変される。
【００２７】
本発明において、ノシバが、上記改変燕麦フィトクロームＡ遺伝子（Ｓ５９８Ａ）の発現のためのホスト植物として使用された。 そのような遺伝子組換えノシバは、矮小化された節間および胚軸、短い葉、増加した分岐を示す。 さらに環境変化に順応する可塑性への増強された能力ならびに病原菌感染に対する向上した抵抗性を発揮するであろう。 さらにまたそのような組換えノシバの栽培においては、芝刈りと水遣りに必要な通常の維持経費は大幅に軽減されるであろう。
【００２８】
【実施例】
植物発現ベクター構築
燕麦フィトクロームＡ３遺伝子をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ １６１１０）は、特定のＰＣＲプライマー、および３'から５'方向へのプルーフリーディング活性を有するＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いる逆トランスクリプターゼ−仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）実施により単離した。 ５'および３'ＰＣＲプライマーは、ＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ認識配列をそれぞれ有しており、後続のＤＮＡ操作を促進する。 該遺伝子を含むＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてダブル消化し、そのＰＣＲ産物と同様の方法でＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩでダブル消化したｐＧＥＭ３Ｚ（＋）クローニングベクターに連結した。 部位特異的インビトロ突然変異のためにＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者により供された手順に従って使用した。 燕麦フィトクロームＡ３遺伝子の本来のＡＧＴコドンは、セリン−５９８をアラニンに置換するために、ＧＣＴへ変異させた。 塩基置換は、直接のＤＮＡ配列決定により立証した。 変異したフィトクロームＡ３遺伝子（Ｓ５９８Ａ）は、つぎに、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＣＵＭＢベクターにサブクローンして、ｐＣＵＭＢ−ｐｈｙＡベクターとした。 このｐＣＵＭＢベクターは、Ｅ． ｃｏｌｉおよびＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける細菌選択のためにカナマイシンに対する耐性遺伝子と、植物細胞における選択のためにヒグロマイシンおよび除草剤に対する耐性遺伝子とを含むバイナリーベクターである。 Ｓ５９８Ａ遺伝子の発現は、ユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ−Ｐ）の制御のもとにあった。 すべての中間的および最終のベクター構築物は、制限地図の作成と直接のＤＮＡ配列決定により確認された。
ノシバカルスの調製
ノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｓｔｅｕｄ．）の成熟種子は、２％次亜塩素酸ナトリウム、１ｍｌで１５分間、表面殺菌し、次に無菌の２回蒸留精製水で３回、徹底的に洗浄した。 カルス誘導のために種子は３ＭＭろ紙−載置ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， １９６２）培地ペトリ皿に蒔いた。 その培地は、３％（ｗ／ｖ）スクロース、１００ｍｇ／Ｌ α−ケトグルタル酸、４ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、０．２ｍｇ／Ｌ ＢＡおよび０．２％（ｗ／ｖ）ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）を含有していた。 その培地は、ＨＣｌを使用してｐＨ５．８に調整し、１．２〜１．３ｋｇ／ｃｍ ^２の圧力で、１２１℃、２０分間オートクレーブにかけた。 カルス誘導は、２６．１±１℃に設定され、完全に暗所の培養室で３カ月間、行なった。 その後、蛍光灯管によって与えられ、３０ μｍｏｌ ｍ ^−２ ｓ ^−１の強度を有する、持続的な白色光のもとで、３日間、インキュベートされ、１ ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄおよび０．２ ｍｇ／Ｌ ＢＡを含有する新鮮ＭＳ培地には緑色組織だけを移行させ、さらに成長させるため暗所で培養した。 暗所での５週間の培養後、緑色をした個々の種子由来カルスは、２，４−Ｄおよび ＢＡを含有する３ＭＭろ紙−戴置ＭＳ培地上に移して、暗所でさらに培養した。 観察された４種のカルスの間で（タイプＩ〜ＩＶ）、タイプＩＩＩカルスだけは、４週間インターバルで継代培養後、４ ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄを含有するＭＳ培地上でさらに増殖させ、遺伝的な形質転換のためのホスト植物細胞として使用した。
アグロバクテリウム感染のための最適条件
ｐＣＵＭＢ−ｐｈｙＡを含有するＡ． Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０５をノシバカルスの感染に使用した。 Ａ． Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞は、５０ｍｇ／Ｌ ヒグロマイシンおよび１００ｍｇ／Ｌ カナマイシンを補充したＬＢ培地２０ｍｌを含む１００ｍｌ容エルレンマイヤーフラスコ内で、１６０ｒｐｍで震盪し、２８℃で一晩成長させた。 懸濁培養液１０ｍｌ中の細胞を、２５００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により５０ｍｌ容ポリプロピレンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， ＵＳＡ）に集め、１０ｍｌの液体感染培地（カルシルムフリーのＭＳ塩およびビタミン類、３０ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌ グルコース、１００ｍｇ／Ｌ ベタイン、５０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）、０．０１％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８， ０．０１ｍｇ／Ｌ ＢＡ、２ｇ／Ｌ ｇｅｌｒｉｔｅ， ｐＨ ５．２）に穏やかな撹拌により再懸濁させた。
【００２９】
アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）は、適当量の粉末をジメチルスルホキシドに溶解し、最終濃度１００ｍｇ／ｍｌになるように調製し、滅菌ろ過し使用までは暗中、４℃で保存した。 それが必要な場合には、滅菌培地に適当な最終濃度で直接添加した。 増殖したカルスは、アグロバクター細胞懸濁液中に１分間、浸漬した。 そのカルスは滅菌３ＭＭろ紙上で手短に脱水してから、４ ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄを追加した以外は感染培地と同じ、共培養用培地プレート上で、暗中２６．１±１℃で、１５日間培養した。 共培養後、カルスは界面活性剤（０．０２％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）を添加した滅菌２回蒸留精製水で穏やかに撹拌しながら、洗浄液が透明になるまで完全に洗浄し、最後に１０００ｍｇ／Ｌ ｃａｌｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎおよび０．０２％ 界面活性剤を含有する滅菌２回蒸留精製水で洗浄した。
【００３０】
ノシバカルスの効果的なＡ． Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ感染のための最適条件は、受け入れる細胞としてタイプＩＩＩカルスの使用、９日間の共培養、感染培地から２，４−ＤおよびＣａＣｌ _２の排除および１００ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンの使用であった。
共培養したカルスは、次に３ＭＭろ紙−載置ＭＳＣＧＣＢ培地（ＭＳ塩およびビタミン類、３０ｇ／Ｌスクロース、１ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、０．０１ｍｇ／Ｌ ＢＡ、２ｇ／Ｌ ｇｅｌｒｉｔｅおよび５００ｍｇ／Ｌ ｃａｌｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ， ｐＨ ５．８）に移して暗中で２〜４週間培養した。 そのカルスは、新芽の誘導のために３ＭＭろ紙−載置ＭＳＳＩ培地（ＭＳ塩およびビタミン類、３０ｇ／Ｌマルトース、１ｍｇ／Ｌ ＢＡ、２ｇ／Ｌ ｇｅｌｒｉｔｅおよび２５０ｍｇ／Ｌ ｃａｌｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ， ｐＨ ５．８）へ移した。 誘導された新芽は、その後４週間、根づかせることと選択のためにＭＳＲＳ培地（ＭＳ塩およびビタミン類、３０ｇ／Ｌスクロース、１ｍｇ／Ｌ ＧＡ _３ 、２ｇ／Ｌ ｇｅｌｒｉｔｅ、２５０ｍｇ／Ｌ ｃａｌｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、および ５ｍｇ／Ｌ ｂｉａｌａｐｈｏｓもしくは１０ｍｇ／Ｌヒグロマイシン、ｐＨ ５．８）へ移された。 根付いた植物は、抗生物質およびバイアラフォスを欠くＭＳＰＧ培地（ＭＳ塩およびビタミン類、３０ｇ／Ｌスクロース、８ｇ／Ｌ ａｇａｒ， ｐＨ ５．８）へ移し、さらに成長させた。 充分に成長した植物は、次に土壌を有するポットに移し変えて、３０℃、相対湿度８０％、冷白色蛍光管で与えられる、３０ μｍｏｌ ｍ ^−２ ｓ ^−１照射での１８時間の光期間に設定された環境制御生育室で成長させた。 根が充分に発達した頃にポットを温室へ移した。
組換えノシバの選択
土壌中で組換え植物が落ち着いたのち、その植物に２週間の期間、毎日５ｇ／Ｌ除草剤液（明治製菓、日本）を散布した。 ２週間の除草剤の適用後、組換え植物は、バイアラフォス（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）塗布から生き抜いて成熟した。 しかしながら、対照植物は、成長を停止し、最後は死んだ。
組換えノシバ植物の日陰回避反応の解析
Ｓ５９８ＡフィトクロームＡ遺伝子を持つ組換えノシバ植物は、それが真にＳ５９８Ａ遺伝子を持つように形質転換されたか確認するために分子生物学的に検討し、さらに同一生育条件下で対照植物と並行して土壌中で生育させた。 調べて比較された形態学的および光形態形成上の特徴として、日陰回避反応に関係したものを含み、それには植物体の構築、茎と葉の成長速度、分岐パターンおよび葉の色が挙げられる。
結果セリン−５９８コドン、ＡＧＴが、アラニンコドンＧＣＴに置換され、ユビキチンプロモーターにより推進される改変燕麦フィトクロームＡ遺伝子（Ｓ５９８Ａ）を用いて形質転換されたノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｓｔｅｕｄ．）の同型接合細胞が分離され、植物体の構築、成長速度および形態が調べられた。
【００３１】
セリン−５９８残基は、フィトクローム分子の２つの機能的ドメイン間のヒンジ領域に位置しており、Ｐｆｒフィトクロームにおいてそのセリンはインビボで選択的にリン酸化される。 該セリンは、Ｎ−末端光センサー・ドメインにより知覚された光シグナルをＣ−末端調節ドメインへ伝達することによるドメイン間シグナリングに役割を担うと示唆されてきた。 改変フィトクロームＡ遺伝子を担う組換えシロイヌナズナ植物は環境光に対して過敏な光反応を示し、フィトクローム機能におけるセリン−５９８残基の重要性が確認された。 セリン−５９８およびそのアラニンによる置換を含有する燕麦フィトクロームＡの配列領域が図１に表されている。
【００３２】
Ｓ５９８Ａ遺伝子は、植物発現ベクター、ｐＣＵＭＢにサブクローンされ、生起した組換えベクター構築物（図２）は、最近確立されたアグロバクテリウム仲介方法を用いて、ノシバに形質転換された。
Ｓ５９８Ａ遺伝子を用いて形質転換された組換えノシバは、全体として矮小の外見を呈した。 さらに具体的には、節間および葉柄が野生型植物のものと比較すると著しく短小となり、分岐もまた少なくとも２倍に増加していた。 加えてその葉は暗緑色であった。 これらの表現形質変化は、日陰回避反応の劇的な低下の結果として、フィトクロームＡの増強された発現を有する組換えモデル植物の典型である。 組換えノシバ植物の成長は大きく抑制されたけれども、旺盛かつ丈夫であり、旱魃、往来によるダメージおよび病原菌感染を含む、生物的および無生物的ストレスに対しさらに耐性があることが期待される。 さらに芝刈りと水遣りの必要がより少なくて済むために通常の維持経費は大幅に節減できる。 特に重要であるのは、改善された病原菌感染、とりわけ暑い夏季には優勢となる菌類感染に対する抵抗性である。 結果的に、化学薬剤の散布の必要は少なくなる。
【００３３】
したがって、本明細書の本発明において用いられたノシバの場合のように、改変フィトクロームＡ遺伝子を有する組換え作物植物は、低下した日陰回避反応を示し、その反応は何世代にもわたり子孫に安定的にしかも再現可能に伝えられていくであろうことは充分に期待される。
記載された本発明は、明らかに多くの態様に変更され得る。 しかしながら、そのような変更態様は、本発明の範囲内からはずれたものとして見なされるべきでなく、当業者にとり明らかであるようなそうした変更態様は、すべて本発明に掲げられた請求の範囲内に包含されるべきものとして意図されている。
【００３４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、燕麦フィトクロームＡ遺伝子のヌクレオチド配列部分を示し（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号１６１１０）、およびセリン−５９８を含む対応アミノ酸配列を示す。 ＰｈｙＡは、２個の機能ドメインからなる。 それらはＮ−末端光センサー・ドメインとＣ−末端調節ドメインであり、これらは一つのヒンジ領域により結び付けられている。 セリン−５９８（Ｓ）は、そのヒンジ領域に位置し、部位特異的インビトロ突然変異により、アラニン（Ａ）で置換されている。

【図２】図２は、改変フィトクロームＡ遺伝子（Ｓ５９８Ａ）を持つ、組換え植物発現ベクター構築物を示す。 Ｓ５９８Ａ遺伝子の転写は、構成的なユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ−Ｐ）によって推進される。 植物発現ベクターは、Ｅ． ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける細菌選択のためにカナマイシン（Ｋａｎ

^Ｒ ）に対する耐性遺伝子と、植物細胞における選択のために除草剤に対する耐性遺伝子（Ｂａｒ）およびヒグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｇｒ

^Ｒ ）とを含む。 ＢａｒおよびＨｇｒ

^Ｒの発現は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）により推進される。 Ｓ５９８Ａ遺伝子は、特異なＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を用いて連結された。 もともとＵｂｉ−Ｐプロモーター内にあったＥｃｏＲＩ部位は、修飾された結果、あとで行なわれるサブクローニングが容易なものとなる。 ＲＢとＬＢ：右と左の境界をそれぞれ示す。 Ｎｏｓ−Ｔおよび３５Ｓ−Ｔ：それぞれＮＯＳと３５Ｓターミネーター配列を表す。

【図３】５ｍｇ／Ｌのバイアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）を含有するＭＳ培地で成長する組換えノシバの発芽を示す。 （Ａ）遺伝子組換え（Ｓ５９８Ａ）およびコントロール（ＷＴ）の発芽は同一実験条件下で生育させた。 植物は、土壌に移し変えてさらに成長させた（Ｂ）。 短い葉（上図）および分岐の増加（下図）といった表現形質変化はさらに明白であることに注意。

【図４】図４は、土壌で生育させた成熟組換えノシバを示す。 改変フィトクロームＡ遺伝子（Ｓ５９８Ａ）を有する組換えノシバ植物（Ｓ５９８Ａ）は、対照植物と比較して、矮小化された節間および胚軸、短い葉、増加した分岐を示す。 組換えノシバ植物は、おそらく植物細胞における葉緑体の密集化により葉色は暗緑色となることに注目すべきだ。