本发明涉及植物细胞、育种材料、植物部分和植物，其中，醛糖 还原酶同源蛋白的表达水平得到提高，因此，表现出对胁迫条件的较 高抗性。提供了植物细胞、育种材料、植物部分和植物本身，并且优 选是转基因的。本发明还涉及核酸，例如，DNA和RNA分子，以及适 用于在细胞中进行醛糖还原酶同源蛋白表达的载体，以及用于制备能 超量表达醛糖还原酶同源蛋白的植物细胞的方法。

本发明特别适用于减轻由有害的生物和非生物胁迫条件在作物 上造成的损害，从而改善作物的收获前景。

在其生命周期中，植物会遇到非生物性(例如，由高光照强度造 成的光抑制，UV-B照射、臭氧、重金属、高温和低温、缺水、水渍和 创伤)和生物性的(例如，病毒、细菌和真菌感染，昆虫活动)胁迫 条件。所述胁迫条件会严重导致植物产量的减少，和经济上的损失。 因此，增强植物对胁迫的抗性并生产具有较高抗胁迫性的植物和育种 材料是植物育种者的主要目标。

醛糖还原酶(EC．1．1．1．21)和醛还原酶(EC．1．1．1．2．)属于醛 -酮还原酶超家族。所述酶是单聚体NADPH-依赖型氧化还原酶，具有 从醛糖到芳香醛的很宽的底物专一性(Bohren K．M．等1989，生物化 学杂志26：9547-9551)。到目前为止，植物醛糖还原酶只能从单子 叶植物中分离。来自大麦的醛糖还原酶同源基因的表达是在胚胎发育 的后期诱导的(Bartels，D．等1991，EMBO杂志10：1037-1043； Roncarati，R．1995植物杂志7(5)：809-822)。用雀麦植物进行的 实验证实了醛糖还原酶同源基因的表达和细胞的低温抗性之间的联 系(Lee，S．P．1993植物生理学杂志142：749-753)。针对醛糖还原 酶在动物细胞中的渗透调节功能进行了一系列研究，因为这些酶能够 催化多原醇反应途径的第一个步骤：即D-葡萄糖还原成山梨醇。众所 周知，细胞内山梨醇含量以及其他渗透剂的调节起着保持渗透压平衡 和细胞容积的作用。Moriyama，T．等1989生物化学杂志264： 16815-16821；Ferraris，J．D．1996，生物化学杂志271：18318- 18321)。不过，有关所述酶的生物学功能有很多尚不清楚，因为醛糖 和醛还原酶与很多醛的高反应性暗示了这些酶在动物细胞中作为解 毒剂的作用的可能性。

所述蛋白的解毒作用的潜在模式可能归纳如下：多种病理学过程 可以产生能导致细胞损伤的有害的自由基。所述自由基的大部分具有 很短的寿命，其毒性作用仅仅集中在其所产生部位周围的小范围内。 不过，所述自由基与膜脂体的反应会导致脂内过氧化物和过氧化氢的 形成，这些物质随后能发生降解作用，产生活性醛类化合物。所述醛 比自由基更稳定，而且，它能够从其形成的部位迁移，将其毒性作用 扩展到整个细胞。最经常形成的并且最有毒性的脂醛是4-羟基壬烯醛 醛(HNE)。由于其活性α-β不饱和双键，HNE可自主性地与细胞蛋白 的-SH基团和赖氨酸或组氨酸残基形成Michael加成物。所述HNE的 醛基团能够与蛋白的α或ε氨基形成Schiff基，因此通过交联，它 可以改变其催化和结构特性。在纳摩尔浓度下HNE能够导致DNA损 伤，而在较高浓度，例如微摩尔浓度下，它具有细胞毒性作用。

由于HNE具有醛基，其解毒作用的一种可能途径是其还原成醇， 通过醛-酮还原酶超家族的成员进行催化。纵观有关文献，可以发现 这种解毒作用与实验结果一致(Van der Jagt，D．L．等1995，生物 化学生物生理学公报1249：117-126；Srivastava，S．等1995，生 物化学生物生理学研究通讯217：741-746；Spycher S．等1996，生 物化学生物生理学研究通讯226：512-516；Spycher S．等1977，FASEB 杂志11：181-187)。

本发明的目的是生产新型的，优选为转基因类型的植物，这种植 物与起始植物(即标准作物或观赏品系)相比，具有对非生物和生物 胁迫条件的改善的抗性，并提供了生产这种植物的方法。

本发明基于以下发现：通过超量产生具有一般解毒和渗透调节作 用的醛糖还原酶同源酶超家族成员，由此所产生的植物细胞和植物能 够同时形成对多种不同来源的胁迫条件的较大程度的抗性。具体地 讲，所述酶的作用与其还原各种底物的醛基的能力相关，例如，4-羟 基壬烯醛(HNE)和DL-甘油醛。

为了实施本发明，业已通过重组基因操作方法分离了编码苜蓿 (Medicago sativa)醛糖还原酶同源酶(MsALRh)的cDNA。通过将 该cDNA连接到一个调节片段(例如，启动子)上确保在植物中进行 异位表达(例如，通过组成型表达)，以功能性关系(例如，框内) 超量产生醛糖还原酶同源酶业已在转基因植物的细胞中实现，因此能 够通过所示醛糖还原酶同源蛋白的解毒和／或渗透调节功能减轻所述 接触不同来源的胁迫条件的植物的损害。

因此，在第一方面，本发明提供了植物、植物细胞、植物部分、 育种材料和植物产品，以上所有均优选为转基因的，其结果是具有较 高含量的醛糖还原酶同源酶，表现出对多种，特别是对各种各样的胁 迫条件的损害作用的抗性。

更具体地讲，本发明涉及能产生一种或几种醛糖还原酶同源超家 族酶的植物细胞，所述酶能够以增强的水平还原醛基，因此，所述植 物细胞具有增强了的对涉及自由基产生的胁迫条件的破坏作用的抗 性和／或对干旱的抗性。特别是提供了对自由基产生的破坏作用的抗 性。

本发明的植物细胞以及植物优选能超量产生含有序列1所示氨基 酸序列的醛糖还原酶同源蛋白，更优选含有序列3所示的苜蓿序列 (MsALRh蛋白)或其功能性变体或衍生物，所述变体与序列1所示醛 糖还原酶同源蛋白序列的同源性优选为至少50％，更优选至少70％， 更优选至少90％，并且更优选与序列3的苜蓿蛋白具有上述同源性。 更优选所述细胞和植物超量产生的所述酶所含有的序列与序列3具有 至少50％的同一性，更优选至少70％的同一性，最优选至少90％的同一 性，最优选这些序列与序列3相同。

本发明的植物细胞优选为转基因的，并且是通过将能够表达醛糖 还原酶同源蛋白的核酸分子整合到其中而转化过的。不过，本发明的 植物细胞、植物部分和植物还可以通过传统的非生物学突变-筛选方 法产生，其中，例如，用一种化合物或紫外线作为诱变剂，并通过诸 如下文所述的方法筛选能超量产生所需活性的醛糖还原酶超家族酶 的植物。可以通过杂交(用Northern或Western印迹技术，参见例2) 或通过检测酶的活性确定醛糖还原酶表达的水平，特别是针对HNE和 ／或DL-甘油醛的活性，例如下文所述。

本发明还涉及含有本发明植物细胞的植物和植物部分。本发明的 植物和植物部分优选具有针对涉及自由基产生的胁迫条件的增强了 的抗性水平，更具体地讲，例如针对用除草剂和／或重金属和／或产生 过氧化氢和／或用氯化钠处理的抗性；和／或由病毒和／或细菌和／或真 菌导致的感染和／或干旱。

在本发明的第二方面，提供了编码用于本发明的醛糖还原酶同源 蛋白的核酸序列，以及含有所述序列的重组核酸分子。具体地讲，所 述核酸是重组的、分离的、富集的和／或无细胞的，并且编码具有上 述与序列1或3的同源性的上述蛋白。所提供的核酸序列编码的醛糖 还原酶同源蛋白特别适用于本发明，和本发明的植物细胞，适用于生 产本发明的植物和植物部分。

通过使用诱变技术，例如SDM，可将本发明的核酸设计成编码本 发明还原酶蛋白的功能性变体。还可将寡核苷酸和多核苷酸用作探针 和引物，用诸如Southern或Northern印迹的方法鉴定其他天然存在 的或合成的还原酶蛋白。

所述核酸优选为DNA或RNA，特别是cDNA或cRNA，更优选其特 征是当它是一种DNA时，其多核苷酸含有的核苷酸序列与本文序列表 中的序列2至少具有80％的同一性，或者在所述序列上具有密码子核 苷酸的简并取代的序列，而当它是RNA时，它具有一种互补序列，其 中，T用U取代。所述同一性优选为90％或更高，更优选为95％或更高， 最优选100％。所述序列的不相同的部分优选包括简并取代。

最优选的DNA或RNA是能够与序列2的核酸的一条或两条链杂交 的，以及具有15或更多个连续的碱基，优选30或更多个，更优选100 或更多个连续碱基的多核苷酸和寡核苷酸片段，所述碱基选自所述序 列的相应于其他超家族酶的编码核酸的特定片段，所述杂交是在高严 格条件下进行的，更优选能够与所述多核苷酸或寡核苷酸的两种或两 种以上杂交。进行所述杂交的序列的最合适的选择选自序列2的编码 区，编码相对该超家族的其他成员来说是非保守性的部分。

参见下面的图1可以发现，在所述超家族内，41-49号氨基酸以 及250-256号氨基酸倾向于保守，因此所述序列不适用于筛选杂交序 列，这些杂交序列用于筛选优选的苜蓿类型的同系物，而不是筛选一 般的超家族成员。

在本发明的第三方面，提供了编码醛糖还原酶同源蛋白超家族成 员的核酸，为载体或构建体形式，在框内与启动子、激活或其他能够 在植物中促进其异位表达的序列结合，所述表达是组成型的或局部 的，例如，在营养组织或根组织中。通常该表达是非时序的，即与 Rocarati等启动子不同，因此所述植物组织一直免于自由基的破坏作 用，例如产生HNE。

本领域技术人员可以理解，当特定的组织需要对抗胁迫相关毒素 的保护和／或渗透调节时，可以使用组织特异性调控区，如组织特异 性启动子。所述组织特异性启动子的例子为本领域技术人员所熟知， 但可以用WO97／20057中的启动子作为范例(被收作本文参考文献)， 该文献披露了根特异性启动子，而Rocarati等的启动子是胚胎和种 子特异性的。为了保护营养组织，可以使用组织特异性启动子，但也 可以使用CaMv35S和苜蓿(MsH3g1)的组成型启动子(参见被收作本 文参考文献的WO97／20058)。

在本发明的第四方面，提供了用于能超量产生醛糖还原酶同源蛋 白的植物细胞的方法，该方法包括用本发明的核酸分子转化植物细 胞。

在本发明的第五方面，提供了含有上述重组核酸、载体或构建体 的转基因植物或其部分。第五方面的优选植物可以在一种构建体中含 有本发明的核酸，它与启动子、激活或其他调控序列呈功能性结合。 优选的启动子可以是组织特异性的，以便所产生的蛋白表达及其作用 被局限在需要的组织。具有一定程度的组织特异性的启动子对于植物 分子生物学领域的技术人员来说是公知的。

可用于产生本发明的载体和构建体的方法可以是本领域技术人 员所知的常规分子生物学技术。可以用植物细胞转化领域所公知的方 法将含有或编码所述蛋白的DNA、RNA和载体导入靶细胞。特别优选 用诸如电穿孔或基因枪技术将所述DNA或RNA导入细胞的方法，更优 选导入花粉细胞。

优选在整个植株中表达所述DNA或RNA，但在需要利用组织特异 性效果的情况下，本领域技术人员可以理解的是，应当将组织特异性 启动子、增强子或其他激活物整合到转基因细胞中，以与所述DNA的 可操作的关系使用。

本领域的技术人员了解通过插入与合适的调控序列结合的cDNA 生产转基因植物和植物细胞的方法的多种具体例子。植物转化载体由 Denecke等(1992)EMBO杂志11，2345-2355披露，在美国专利申请 流水号08／290301中进一步披露了将其用于生产能产生海藻糖转基因 植物的用途。EP0339009B1和US5250515披露了将异源基因插入植物 中的方法(参见US5250515的第8-26栏)。在US56529183，US7530485 和US7350356中披露了对花粉进行电穿孔，并产生转基因单子叶植物 和双子叶植物。进一步的细节可以阅读参考书，如重组基因表达方法 (1997)Rocky S．Tuan．著，Humana出版社，ISBAO-89603-333-3N； 0-89603-480-1(所有文献均被收作本文参考文献)。可以理解的是， 对打算提供的转基因植物细胞或植物的类型没有特别的限制；所有类 型的植物、单子叶或双子叶植物都可以结合了本发明的核酸的转基因 形式产生，以便组成性地或异位地改变醛，特别是HNE在植物中的还 原活性。

本发明的另一方面提供了苜蓿同源蛋白及其抗体。

下面所定义的术语所给的定义将使用在整个说明书和权利要求 书中，即使所下的定义与所述术语在本领域中通常所使用的意义有所 差别。

“醛糖还原酶同源蛋白”在本说明书中被定义为是醛-酮还原酶 超家族的成员的酶，并类似于该家族的其他成员，所述酶在有NADPH 辅助因子的条件下能够还原多种底物中的醛基。本文所用的术语“醛 糖还原酶同源蛋白”还包括所述蛋白的功能性变体和衍生物。

一种蛋白的“功能性变体”或“功能性衍生物”是这样一种蛋白， 其氨基酸序列可能是通过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和／或 添加而从原始蛋白衍生的氨基酸序列，尽管其氨基酸序列发生了改 变，所述功能性变体保留了所述原始蛋白的至少一种生物学活性的至 少一部分，该活性是本领域技术人员可以检测到的。一种功能性变体 与产生这种变体的蛋白通常具有至少50％的同源性(其氨基酸序列优 选至少50％相同)，优选至少70％的同源性，更优选至少90％的同源性。 功能性变体还可以是一种蛋白的任何功能性部分；本发明中的功能具 体为醛还原作用，但不排除其他作用。

所述氨基酸序列与序列1或序列3的不同优选主要或仅在于保守 性取代。更优选所述蛋白含有与序列1或序列3具有90％或更高，更 优选95％的序列同一性的氨基酸序列，并最好与所述序列100％相同。

适用于排列序列以便比较并计算序列同源性或同一性的算法和 软件为本领域技术人员所公知。所述工具的突出的例子是Pearson和 Lipman检索基FAST和BLAST程序。上述技术的有关详情可以参见 Altschul等(1990)，分子生物学杂志215：403-10；Lipman D J和 EARSON W R(1985)科学227，1435-41卷。公开的BLAST细节可以 从互联网上查到，网址是 ‘http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／blast-help．html’，所述 同源性和同一性百分比可以用采用了诸如FASTA和BLASTn软件的商 业或公开的软件包确定，或者通过在互联网上提供服务的计算机进 行。前者的一个例子是GCG威斯康星软件包，而Genbank(参见 http：／／www．aabi．nlm．nih．gov／BLAST)和EMBL：(参见 http：／／www．embl-heidelberg．de／Blast2)都提供了互联网服务。

术语同一性是指要在参考序列中检索的氨基酸序列或碱基序列 在相同的相对位置上在对所述序列进行最佳排列时的用数字表示的 百分比，虽然实际情况是所述序列可能在某些位置上具有缺失或添 加，需要引入缺口，以便获得所述氨基酸或碱基的最大百分比的排 列。所述序列优选通过使用10个或更少的缺口排列，即导入两个序 列中的缺口总数加起来为10或更少。缺口的长度不是特别重要，只 要能保留醛还原活性即可，通常不超过10个，优选不超过5个氨基 酸，或者30个碱基，优选不超过15个碱基。

BLAST检索的优选参数是预设值，即，对于EMBL高级Blast2来 说为：Blastp Matrix BLOSUMS，Filter预设值，Echofilter X， Expect10，截断预设，双链，说明50，排列50。对BLASTn也优选预 设值。GCG威斯康星包预设值是Gap Weight12，长度重量4。用于同 源性计算的其他优选方法的FASTDB参数是错配罚分=1．00，缺口罚分 =1．00，缺口大小罚分=0．33，以及连接罚分=30．0。

本领域技术人员可以理解高‘严格条件’的含义，不过，通常如 在US5202257中第9-10栏中所下定义，该专利被收作本文参考文献。

术语‘简并取代’是指能产生编码相同的氨基酸的核苷酸取代； 当表达所述蛋白的细胞或载体是不同于DNA来源生物细胞的类型时， 所述简并取代是有利的，它具有不同于所述cDNA来源细胞的转录／翻 译密码子偏好。因此，所述简并取代是宿主特异性的。

与氨基酸一起使用的术语‘保守取代’是指用具有同一类物理化 学特性的氨基酸取代特定的氨基酸。因此，当序列1或序列3上的氨 基酸具有疏水性特征的基团时，对它的保守取代是由另一个同样具有 疏水性特征基团的另一种氨基酸进行的；其他这种类别是这样的，所 述特征性基团是亲水性的、阳离子型的、阴离子型的或包含硫醇或硫 醚。所述取代对本领域技术人员来说是众所周知的，即参见被收作本 文参考文献的US5380712，只希望所得到的蛋白具有醛还原酶的活 性，特别是对HNE的活性，例如，在有NADPH的条件下具有该活性。

如果一种蛋白在细胞中的浓度至少比在原始细胞中的浓度高20％ 的话，该蛋白或RNA就被认为是“高水平生产的”或“超量生产的”， 所述原始细胞是现在被转化了的原始植物品系的细胞。类似地，如果 一种植物能够承受增强20％的相同有害条件的作用而没有可检测的损 伤，就将该植物、植物组织或植物细胞定义为与原始植物、植物组织 或植物细胞相比具有对有害条件的“增强的抗性水平”。一种分子在 细胞中的超量表达可以通过传统突变和选择技术以及遗传操作方法 实现。

本文所使用的术语“异位表达”是指超量表达的一种特殊体现， 例如，其含义是一种异位表达的蛋白是在植物的一个空间点上产生 的，在这里这种蛋白根本就不能自然表达(或不可检测)，就是说所 述蛋白在所述点上是超量表达的。异位表达的特殊类型包括，例如， 醛-酮还原酶蛋白在植物的营养组织或根中的表达，而在正常情况下 这种蛋白只发现能在胚胎和／或花粉中通过转录物进行瞬时表达(参 见Roncarati等)。

下面将结合以下的非限定性实施例、附图和序列表对本发明进行 示意性说明。落入本发明范围的其他实施例对本领域技术人员来说是 显而易见的。

序列表：

本文所附的序列表的序列如下：

序列1：优选的醛糖还原酶同源酶的氨基酸序列，该序列与本发 明所涉及的酶具有同源性。

序列2：含有编码用于本发明的苜蓿醛糖还原酶同源酶的cDNA 的DNA。

序列3：用于本发明的苜蓿醛糖还原酶同源酶的氨基酸序列。

序列4和5是与例3有关的引物。

附图：

图1：是苜蓿MsALRh蛋白与人、动物和植物醛糖和醛还原酶蛋白 的氨基酸序列比较。

图2表示从苜蓿中分离的基因组DNA的Southern杂交结果。用 在附图中每一个泳道下面所标明的限制性酶消化20微克基因组 DNA。在1％的琼脂糖凝胶上分离所述限制性片段，并吸印到Hybond- N膜上，将P-32标记的MsALRh cDNA的编码片段用作杂交探针。

图3表示用MsALRh cDNA进行的Northern杂交实验结果。从用 150微摩尔ABA(脱落酸)激素(3a)、10％聚乙二醇(PEG4000，3b) 和氯化镉(3c)处理的苜蓿A2细胞悬浮液中分离总RNA，在1％甲醛 琼脂糖凝胶上对20微克总RNA进行电泳，并转移到Hybond-N膜上， 然后用P-32标记的MsALRh cDNA的片段的编码区进行检测。在每一 种情况下的C都是未处理的对照。

图4表示MsALRh基因表达的Western杂交分析。4a表示用较长 (上)和较短表达时间在不同苜蓿组织中蛋白的含量。4b表示在用 10％PEG，25微摩尔氯化镉和1毫摩尔过氧化氢处理期间蛋白含量的变 化。

图5是用于表达编码所述酶的cDNA的pGEX起点(pGEX-5X-3) 的载体的图谱。所述载体在大肠杆菌细胞中以谷胱苷肽-S-转移酶融 合蛋白形式表达所述酶。

图6表示在谷胱苷肽-Sepharose上纯化MsALRh-GST融合蛋白。

图7表示硫酸铵处理对MsALRh-GST重组融合蛋白的活性的影 响。通过测定在340nm波长下NADPH氧化作用的指标，通过分光光度 法测定对10mM DL-甘油醛底物的酶促活性。标准反应混合物含有5 微克酶和0．15mM NADPH。在开始所述活性测定之前，将所述酶与硫 酸铵预培养3分钟。

图8表示从转基因烟草植物叶片中分离的细胞提取物中醛糖还原 酶同源蛋白的Western杂交检测。

图9a和9b表示在用20微摩尔百草枯(9a)和250微摩尔氯化 镉(9b)处理期间对照和转基因植物叶片的光诱导荧光测定结果。

图10a、10b、10c和10d表示在对照 条件(10a)，在有15mM 过氧化氢(10b)，150微摩尔氯化镉(10c)和250mM绿化钠(10d) 的条件下对照(SR1)和转基因(TR1／1，1／5，1／9)植物的发芽试验结 果。

图11表示对照(SR1)和转基因(TR1／4，1／7和1／9)植物在缺 水生长期间光诱导荧光测定的结果。

图12a表示经过35天的严重干旱处理之后恢复供水10天之后对 照和转基因植物的照片。12b表示在经过上述干旱抗性试验之后从12a 中所示的对照和转基因植物的叶片中制备的细胞提取物中醛糖还原 酶同源蛋白的检测。

图13表示在UV-B照射之前(第1天)，期间(第2-4天)和之 后(第8和第15天)在烟草叶片中叶绿素荧光的Gentry参数形式的 光合效率测定。实心圆圈表示1／1，1／5，1／8，1／9和1／10植物的平 均数据。空心圆圈表示1／4，1／7植物和对照SR1的数据。

实验

在下面的实验实施例中，本发明人证实了cDNA形式的编码苜蓿 醛糖还原酶同源蛋白的基因的分离。其核苷酸序列和推测的氨基酸序 列证实所分离的cDNA编码一种迄今尚未鉴定过的新型植物醛糖还原 酶同源蛋白。将所分离的醛糖还原酶cDNA克隆到植物表达载体上， 并通过常用的基因导入方法生产转化的烟草植物。除了对所述转基因 烟草植物进行分子生物学鉴定之外，还证实了其对不同胁迫条件的增 强了的抗性。 例1 从一种基因文库中分离苜蓿醛糖还原酶同源cDNA(MsALRh)，并预测 其所编码的氨基酸序列。

为了制备苜蓿cDNA文库并鉴定醛糖还原酶同源cDNA，采用广泛 使用的分子生物学方法，如Sambrook，J．等的方法(Sambrook，J． 等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，N，Y_1989，被收作 本文参考文献)。所述方法的细节可以归纳如下：

按如下方法产生苜蓿cDNA文库。

从体外培养的生长素刺激激活的苜蓿组织中分离总细胞RNA，所 述组织包括去分化愈伤组织和大量的体细胞胚胎。胁迫激活(生长素 刺激)是用2，4-二氯-苯氧乙酸(一种生长素类似物)进行的，采用 本身已知的方法，以提高胁迫诱导mRNA的浓度。mRNA分离方法详细 披露于被收作本文参考文献的Cathala等的文章中(1983 DNA2： 329-335)。

按照被收作本文参考文献的Aviv，H．和Leder，P．的方法(1972 Pro．Natl．Acad．Sci．USA69：1408-1421)，通过寡聚脱氧胸苷纤维素 层析方法从总RNA中分离mRNA分子。

然后用分离的poly-A+(mRNA)组分合成第一条cDNA链，使用寡 聚脱氧胸苷引物并使用AMV逆转录酶。第二条DNA链的合成是用DNA 聚合酶Ⅰ进行的，通过RNaseH处理除去多余的模板mRNA。用末端转 移酶在合成的cDNA的末端合成poly-dC尾，并在PstⅠ消化过的pGEM2 载体(Promega)末端合成poly-pG尾。在退火并用T4DNA连接酶连 接之后，将该构建体转入MC1061大肠杆菌菌株中，并将转化混合物 铺平板到含有100mg／l氨卞青霉素选择LB-平板上。用25微克DNA， 获得了2．5×105原代转化体菌落。证实大约96％的克隆含有可检测大 小的插入片段。cDNA文库的制备方法是遵循本领域普遍使用的方法， 并且特别基于被收作本文参考文献的De Loose等的方法(1988基因 70：13-23)。

测定了该cDNA文库的大约100个独立克隆的核苷酸序列(即从 胁迫诱导的mRNA分离物制备的cDNA克隆)。在测序之前，将插入片 段亚克隆到质粒pUC19上，并且测序反应是在双链DNA上用双脱氧链 终止方法进行的，用α-35-S-dATP标记。为了进行测序反应，按照生 产商推荐的方法使用T7测序试剂盒(Pharmacia)和测序酶2．0试剂 盒(美国生化)。

使用测定的cDNA序列在基因GeneBank和EMBL核苷酸序列数据 库中进行同源性检索。结果表明，源于随后被命名为MsALRh的氨基 酸序列与人、大鼠和植物醛-酮还原酶蛋白都具有同源性。MsALRh cDNA的长度是1231个碱基对，其编码区可能位于34和975号核苷 酸之间(序列2)。该片段编码313个氨基酸的蛋白。苜蓿醛糖还原酶 同源蛋白的氨基酸序列与已知的鉴定最清楚的单子叶大麦醛糖还原 酶同源蛋白具有44．3％的同一性，并且与人醛还原酶和猪醛糖还原酶 分别具有46．2％和46．1％的同一性(图1)。它还表现出与双子叶大豆 NADPH依赖型氧化还原酶具有42％的氨基酸同一性。所观察到的氨基 酸同源水平让我们得出这样的结论，所克隆的苜蓿cDNA编码醛-酮还 原酶超家族的一种新型酶。 例2 苜蓿醛糖还原酶同源基因的分子生物学鉴定

根据本发明进行的苜蓿醛糖还原酶同源基因的彻底的分子生物 学鉴定表明，其行为不同于已知的植物醛糖还原酶同系物，用 Southern杂交分析该基因在苜蓿基因组中的拷贝数；通过Northern 杂交在mRNA水平上并通过Western杂交在蛋白水平上分析该基因的 表达。

从苜蓿细胞中分离基因组DNA，并用限制性内切酶消化纯化的 DNA。将携带完整长度编码序列的MsALRh cDNA片段用作探针，在用 “随机引物”方法进行放射性同位素标记之后进行Southern杂交实 验(Freinberg，A．P．和Vogelstein，B．1983分析生物化学137： 266-267)。杂交是在65℃下在快速杂交缓冲液(Amersham)中进行 的。杂交结果(图2)表明，所述醛糖还原酶同系物基因具有低的拷 贝数，但在放射自显影图上所有的限制消化物都具有微弱的额外的带 有可能表明，在苜蓿基因组中存在其他基因同系物。

用公知方法通过Northern杂交分析所述基因的表达 [Sambrook，J．等，“分子克隆，实验室手册”(第二版，冷泉港 N．Y．1989)，被收作本文参考文献]。详细过程如下：

按照被收作本文参考文献的Maes的方法，(1992核酸研究20： 4374)从苜蓿A2细胞悬浮液中纯化总RNA。在甲醛琼脂糖凝胶上分离 之后，将所述RNA转移到Hybond-N膜上(Amersham)。用“随机引物” 方法对MsALRh基因的完整编码区进行放射性标记(Freinberg，A．P． 和Vogelstein，B．1983分析生物化学137：266-267，被收作本文参 考文献)，并且杂交是在65℃下在快速杂交缓冲液(Amersham)中进 行的。组织特异性实验证实，与大麦醛糖还原酶同系物不同，苜蓿醛 糖还原酶同系物基因是在每一种组织中表达的，而前者只能瞬时表 达，并且只能在胚胎中表达。用不同的激素和胁迫处理处理所述苜蓿 细胞悬浮液，结果表明所研究的基因是均匀诱导的。用植物胁迫激素 脱落酸(ABA)处理在开始处理之后4小时能明显提高RNA含量(图3)。 这一发现的重要性在于激素ABA在若干基因的调控中是一种关键化合 物，它在对诸如干旱和低温的环境胁迫的适应中起着重要作用。

用聚乙二醇处理会在植物细胞中产生渗透胁迫。MsALRh基因的表 达可以通过渗透胁迫诱导，也可以通过氯化镉处理诱导(重金属胁 迫；图3)。已知镉离子除了其光合抑制特性之外还能诱导氧化胁迫， 这种情况下，植物细胞中的脂过氧化物含量提高。正如在前言部分所 披露的，脂过氧化物的分解产物是能够在解毒反应用作醛-酮还原酶 底物的脂醛。 例3 苜蓿醛糖还原酶同源蛋白的生化鉴定

为了鉴定所述酶的底物专一性，在原核蛋白表达系统中生产一种 重组蛋白，并进行纯化。

将MsALRh基因的cDNA克隆到pGEX 4T-1原核表达载体 (Pharmacia)上，并在大肠杆菌中生产含有GST(谷胱苷肽-S-转移 酶)的融合蛋白，并进行纯化。用纯化的融合蛋白做抗原，通过常规 技术生产兔多克隆抗体。通过Western杂交用所述抗体分析不同胁迫 处理对MsALRh蛋白产生的影响，并检测在苜蓿植物的不同组织中的 蛋白(图4)。

按照被收作本文参考文献的Mullis和Faloona的方法(1987， 酶学方法155：335)对MsALRh cDNA的编码区(975bp)进行PCR扩 增，使用“引物1”(5’-cgaactcgagatggccacagcaatcaagttt-3’)作 为上游引物并将“引物2”(5’-ccgagctctacttcaccatcccagag-3’) 作为下游引物(在所述引物中的XhoⅠ限制位点下面划线)。用XhoⅠ 限制性内切酶消化所述PCR产物，并将消化的片段克隆到pGEX4T-1 载体(Pharmacia)的XhoⅠ位点上。为了避免PCR产生的错误，确定 克隆产物的核苷酸序列。

为了诱导含有N-末端GST的融合蛋白(MsALRh-GST蛋白，随后) 产生，用0．5mM异丙基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在25℃下处 理转化过的大肠杆菌细胞3小时。按照被收作本文参考文献的Smith 和Johnson(1988基因67：31-40)的方法鉴定能表达所述融合蛋白 的转化体。按照生产商推荐的方法(Pharmacia)在谷胱苷肽- Sepharose 4B柱上纯化MsALRh-GST融合蛋白。

将所产生的并纯化过的MsALRh-GST融合蛋白(100-150微克， 0．5毫升)与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma)充分混合，并用该乳液 对兔子进行免疫。分别在3周和6周之后用所述抗原和不完全弗氏佐 剂的乳液进行再进行两次免疫。在Western分析中检测其血清。在竞 争实验中测定所述血清对MsALRh蛋白的专一性。

为了进行Western印迹分析，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分 离苜蓿细胞悬浮液提取物。在分离之后，将所述蛋白转移到硝酸纤维 素膜上。将所制备的抗所述融合蛋白的血清用作第一抗体(以1∶2000 的比例稀释)；将与过氧化物酶缀合的抗-兔-IgG抗体用作该实验的第 二抗体。用Super SignalRTM CL-HRP底物系统(Pierce)检测抗原抗 体复合体，这是一种高灵敏度的化学发光检测方法。

检测MsALRh蛋白在苜蓿植物的不同类型组织中的存在。结果清 楚地表明(图4a)，所述蛋白存在于检测过的每一种植物器官中。这 一结果与由Bartels，D．等所披露的结果完全相反(1991 EMBO杂志 10：1037-1043)，因为在营养组织中不存在可检测量的大麦醛糖还原 酶同源蛋白。我们的结果证实了苜蓿醛糖还原酶同源蛋白与以前分离 的植物醛糖还原酶的差别，并有可能表明其具有不同的生理学作用。

还通过Western杂交技术检测在由PEG处理诱导的渗透胁迫期间 或者在由氯化镉处理诱导的重金属胁迫期间所导致的MsALRh蛋白量 的增加以及由于过氧化氢处理所导致的有毒的自由基产生。所述结果 表明在渗透和重金属胁迫期间MsALRh蛋白含量的增加与观察到的该 基因的mRNA含量增加相关联，并表明氧化胁迫诱导过氧化氢处理也 能增加苜蓿细胞中MsALRh蛋白的含量。以上结果有力地支持了 MsALRh蛋白在植物针对活性自由基的毒性作用的防御反应中起作 用。

MsALRh酶的底物专一性试验-除了氨基酸同源性之外-证实了 MsALRh基因编码一种属于醛酮还原酶超家族的酶，与此同时，它还具 有若干不同于迄今所鉴定的植物醛糖还原酶同系物的特征。通过光学 方法测定MsALRh-GST融合蛋白对不同底物的酶促活性：在340nm波 长下，在25℃下，在5分钟反应时间内测定NADPH辅因子浓度的降低。 1毫升的反应混合物含有50mM磷酸钠缓冲液(pH=7．0)，0．1mM NADPH 辅因子和不同浓度的底物。一个酶单位被表示为在有所述底物的条件 下在1分钟内氧化1微摩尔NADPH所必需的酶的量(以毫克计)。在 所述专一性测定中将醛糖DL-甘油醛和4-羟基壬烯醛(ICN生物化 学)用作底物，其结果(为Km动力学常数)在下面的表1-3中表示。 根据我们的结果，纯化的酶能够在有NADPH辅因子的条件下还原醛底 物。只能在DL-甘油醛(已知为植物醛糖还原酶同系物的最佳底物) 和4-羟基-壬烯醛上检测到最高的酶促活性。MsALRh酶能够以较低的 活性还原D-木糖，而对其他醛糖底物(如D-葡萄糖，D-半乳糖，D- 甘露糖，或D-核糖)无活性，即使在很高的(400mM)底物浓度下也 没有活性。根据以上结果(参见下面的表1)，苜蓿酶表现出与动物醛 还原酶极为相似的对甘油醛底物的活性。同时，它在有4-羟基-壬烯 醛的条件下具有较低的活性(表2)。

表1

植物醛糖还原酶同系物和哺乳动物醛还原酶在DL-甘油醛底物上 的Km动力学参数比较 酶 Km／mM 1．MsALR 3，18 2．大麦ALR 56，0 3．人醛还原酶 1，6 4．大鼠醛还原酶 8，35

表2

醛糖还原酶在4-羟基-壬烯醛底物上的Km动力学参数 酶 Km／μM 1．MsALR ～700 2．人醛煻还原酶 22 3．小牛醛糖还原酶 8，8

表3

用0．3M硫酸铵处理对醛糖和醛还原酶活性的改变 酶 相对活性(％) 1．MsALR 192，8 2．人醛糖还原酶 277，0 3．大鼠醛还原酶 97，0

我们检查了MsALRh酶是否能还原4-羟基-壬烯醛(HNE)的醛基， 这种化合物在前面提到过是脂过氧化物的降解产物之一，因此消除了 其前面披露的毒性作用。我们的结果表明，HNE是MsALRh的底物，它 比DL-甘油醛更好，后者以前被认为是植物醛糖还原酶的最佳底物。 HNE的Km动力学常数值大约为700微摩尔，这一数字是在甘油醛上测 得的数字的大约1／3。所述测定最初是用ALRh-GST融合蛋白进行的， 不过在随后的实验中用去掉了GST-尾的蛋白重复了测定，所述尾是通 过凝血酶裂解位于MsALRh和GST部分之间的凝血酶识别位点而去掉 的。DL-甘油醛和4-羟基-壬烯醛的Km值在两种情况下都相同，因此 我们可以得出结论，GST融合配偶体不能改变MsALRh酶的底物专一 性。

已知SO4 2-能以不同方式改变大鼠醛糖和醛还原酶酶促活性。在我 们的实验中，在存在0．3M硫酸铵的条件下所述酶促活性增强2倍， 是所述醛糖还原酶的一个特征(图7)。MsALRh酶的一个重要特征是 即使在存在低浓度(45mM)硫酸铵的条件下其活性也能增加100％。这 一结果可能表明，通过硫酸铵处理可以增强所述酶在转基因植物中的 有利作用。根据以上结果我们可以得出这样的结论，MsALRh酶以及大 麦醛糖还原酶同源酶也具有类似于动物醛糖和醛还原酶的特征，但它 也具有特殊的不同特征。 例4 将苜蓿醛糖还原酶同源(MsALRh)cDNA插入烟草植物，在转基因植物 的营养器官中产生醛糖还原酶蛋白

可以用基于农杆菌属的转化系统将外源基因导入植物基因组(详 情参见：Hiche，E．等“植物细胞和组织培养”1994，231-270页， Vasil，I．K．和Thorpe，T．A．著，Kluwer学术出版社出版，被收作本 文参考文献)。将研究的cDNA融合到由Benfey等1989 EMBO杂志8： 2195-2202披露的病毒CaMV35S启动子上，该文献被收作本文参考文 献。

将所产生的二元载体构建体转移到农杆菌菌株中，通过摩擦感染 烟草叶片，按照被收作本文参考文献的Claes等披露的方法(1991 植物杂志1：15-26)进行共培养并再生卡那霉素抗性植物。将转化植 物和通过自交获得的种子用于发芽实验。

通过免疫学方法证实苜蓿醛糖还原酶基因在转基因烟草植物中 的功能。

用抗MsALRh-GST融合蛋白的多克隆抗体通过Western印迹分析 证实所述醛糖还原酶基因在转基因烟草植物中的表达。分析所述烟草 品系(图8)。按照以前详细披露的Western杂交方法检测从所述品系 的叶片中获得的蛋白提取物，所不同的是蛋白样品是在10％SDS-聚丙 烯酰胺变性凝胶上分离的，并将碱性磷酸酶缀合的抗-IgG抗体用作第 二抗体。通过BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)和NBT(2，2’-二对 硝基苯-3，3’-[3，3’-二甲氧-4，4’联苯]-双四唑-氯)底物检测所述 抗体蛋白复合物。在10个检查过的转基因品系中有5个可以检测到 大量MsALRh蛋白的合成，其他转基因品系未表现出MsALRh基因的表 达，并且在对照野生型(SR1)植物中也没有检测到信号。 例5 能表达苜蓿醛糖还原酶同源蛋白的转化烟草植物表现出对诸如除草 剂、重金属、过氧化氢和氯化钠的不同胁迫处理的较高水平的抗性

为了证实本发明的理论，在有除草剂百草枯(PQ)和镉(Cd)的 条件下检验了所述转化体的表现。从对照SR1和转化植物的叶片上切 除叶片，并在培养皿中用百草枯(20微摩尔)和氯化镉(250微摩尔) 溶液处理，用Vass．I．等的方法(生物化学1996，35：8964-8973) 用PAM荧光计通过光诱导的荧光测定监测对光合器官的功能性损伤。 对于对照SR1植物来说在处理之后24小时荧光强度的减弱相当明 显，并且在48小时之后这一作用更加明显。相反，对于所述转基因 品系来说，荧光强度的减弱较少，因此表现出光合功能损失的明显的 减弱(图9)。

另外，用发芽实验检查所述转化体对胁迫的抗性。在自交之后， 将来自转化体的种子放在分别含有15mM过氧化氢、150微摩尔氯化镉 和250mM氯化钠的培养基上生长，在光照下，在受控制的条件下让所 述种子发芽。如图10所示，每一个转化品系都比对照SR1烟草植物 具有对所施加的胁迫处理更高的抗性。表达的MsALRh蛋白的保护作 用清楚地表现出取决于浓度，因为发现转基因品系1／5对所述处理的 抗性最高，而该品系能以最高的水平表达所述转基因。 例6 产生苜蓿醛糖还原酶同源蛋白的转基因烟草品系表现出对缺水的抗 性

让转化的烟草植物在受控制的温室条件下在土壤中生长5周，并 在实验开始时测定土壤的含水量。在实验期间通过上述实施例中详细 披露的光诱导荧光测定监测对光合系统的损伤。在开始该实验之前， 我们从转基因烟草品系和SR1对照植物中选择具有类似的发育阶段的 植物，并选择每一个植株上的具有相同日龄的叶片进行荧光测定，这 些测定是在实验期间的特定时间点上进行的。

在开始该实验之后，我们停止了对实验植物浇水。在缺水生长的 第32天到35天，Fv／Fm荧光值显示SR1植物和品系1／4和1／7(图 11)植物生活力的明显下降，而品系1／1，1／5和1／9的植物生活力 减弱不明显。在该实验的第45天检测的植物如图12所示。在干旱期 之后，测定土壤的湿度。此时恢复给植物浇水10天，并再次测定预 先确定的叶片的光诱导荧光值。在品系1／1，1／5和1／9上，所述值 与45天时的值大致相同或略好一些，不过在SR1对照和非表达的1／4 和1／7品系上，Fv／Fm值继续下降。在恢复浇水之后，从叶片中分离 蛋白提取物，并测定MsALRh蛋白含量(图13)。结果表明，在SR1， 1／4和1／7植物中，所述蛋白是检测不到的，而在1／1，1／5和1／9 品系中，存在MsALRh蛋白。因此，我们的结论是只有能耐干旱的植 物才表达所述MsALRh蛋白。

为了证实所述增强的抗旱能力不是由于叶片的储水能力不同所 致，用单一叶片重复所述缺水实验。结果表明，在MsALRh蛋白生产 植物和对照植物上失水的速度大致相同。 例7 UV-B照射保护

在26℃下将烟草植物保持在通风的生长箱中进行5天实验。在每 天的上午8点和下午6点之间由荧光灯管(40W钨灯)以60-80μmol m-2s-2的强度从上面和侧面提供光合激活照射。在每天的上午9点到下 午3点由UV-B313灯管(Q-panel，美国)以7．5μmol m-2s-2总的UV-B 光强从上面进行UV-B(280-320nm)照射，从开始实验的第2天起共 照射4天。为了排除可能的UV-C(λ＜280nm)照射的作用，将一层 乙酸纤维素滤膜(Courtauld Chemicals UK)放置在植物和UV-B源 间。在恢复期间，将植物于正常生长条件下保持在温室中。

为了进行叶绿素荧光测定，将植物转移到实验室中。在黑暗中进 行测定，在大约45分钟内结束，包括最初的15分钟暗适应时间。在 此之后，将植物转移回到生长箱或(在恢复期内)回到温室中。所有 的叶绿素荧光测定都是在下午3点到5点进行的。

在实验第1天的下午测定未处理的植物，并在实验的第2天之后 开始UV-B照射。在实验的第2-第5天和终止照射后30分钟测定UV-B 照射的植物。

用一台PAM叶绿素荧光计(WALZ公司，德国)用弱的(＜1μmol m-2s-2)调节红色光线测定叶绿素荧光。分别在用0．5秒的饱和白色光 线脉冲(2500μmol m-2s-2)照射之前和照射时在11．5μmol m-2s-2 光化红色光线中测定稳态(Fs)和最大(Fm’)荧光产量。用Gentry- 参数衡量光合电子转移效率，表示为(Fm’-Fs)／Fm’。对每一个植物 的两个叶片进行检测，并且在每一个叶片的近轴侧在中脉的两侧对称 地进行两次叶绿素荧光测定。

结果：从实验的第3天开始，在UV-B照射2天之后，植物叶片 表现出可见的UV-B损伤症状，即具有损伤色素沉积的斑点。在进一 步的照射之后上述斑点变得更明显，并且即使在恢复期也依然存在于 叶片上。叶绿素荧光表明从UV-B照射第1天起光合效率降低(Gentry- 参数)。对于植物1／1，1／5，1／8，1／9和1／10来说，在温室中经过1 周的恢复之后，其光合效率恢复到原始效率的大约90％。而在对照 SR1，1／4和1／7植物中没有明显的恢复。

在UV-B照射之前(第1天)、期间(第2-4天)、和之后(第8 天和第15天)，以烟草叶片中叶绿素荧光的Gentry-参数形式测定光 合效率。在图13中，实心圆表示用植物1／1，1／5，1／8，1／9和1／10 获得的平均数据。空心圆表示在植物1／4，1／7和SR1上测定的平均 数据。

综合上文详细说明的实验的结果并考虑所述酶的生物化学特 征，我们可以得出如下结论：

(1)分离的苜蓿醛糖还原酶同源基因编码一种具有新型特征的 酶，它能与有毒的脂醛4-羟基-壬烯醛起反应。

(2)生产能表达所述苜蓿醛糖还原酶同源基因的转基因植物， 以便利用所述酶的上述特征及其他特征，并且所生产的植物被证实能 抗多种有害的胁迫处理。

(3)上述实施例证实了本发明构思的实用性，这一构思还得到 了理论方面的支持，即能超量产生苜蓿醛糖还原酶同源酶的植物具有 对不同来源的多种胁迫条件的较强的抗性。

由于本发明基本上新型的方法不包括任何种专一性必要特征，技 术人员可以合理地推断，能超量表达任何来源醛糖还原酶同源蛋白的 任何种的植物细胞都具有对多种不同胁迫条件的增强的抗性。根据上 文证实的结果，考虑到醛糖还原酶同源蛋白的一般保护作用极有可能 是基于所披露的基本细胞生物学过程，人们还可以合理地推断，本发 明的方法还可用于产生对其他胁迫条件的抗性，例如对高温或低温， UV-B照射，和植物病原体活动的抗性。

序列表 <110>Oberschall，Attila

 Horvath Dr，Gabor

 Deak Dr，Maria

 Torok，Karolyne

 Dudits Dr，Denes

 Feher Dr，Attila

 Sass，Laszlo

 Hideq Dr，Eva

 Vass Dr，Imre

 BTG International Ltd <120>抗胁迫基因 <130>137980／PCT <140> <141> <150>HU P9702118 <151>1997-11-18 <150>HU P9702118 <151>1998-03-09 <150>HU P9702118 <151>1998-04-21 <160>5 <170>PatentIn Ver．2．0 <210>1 <211>306 <212>PRT <213>苜蓿 <400>1 Phe Gln Leu Asn Thr Gly Ala Lys Ile Pro Ser Val Gly Leu Gly Thr  1               5                  10                  15 Trp Gln Ala Glu Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa             20                  25                  30 Xaa Xaa Gly Tyr Arg His Ile Asp Cys Ala Glu Ala Tyr Lys Asn Gln         35                  40                  45 Ser Glu Ile Gly Ser Ala Leu Lys Lys Leu Xaa Glu Asp Gly Val Val     50                  55                  60 Lys Arg Glu Glu Leu Trp Ile Thr Ser Lys Leu Trp Cys Ser Asp His 65                  70                  75                  80 His Pro Glu Asp Val Pro Lys Ala Leu Asp Lys Thr Xaa Xaa Xaa Xaa                 85                  90                  95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His Trp Pro Val Ser Met             100                 105                 110 Lys Arg Gly Thr Gly Glu Phe Met Gly Glu Asn Leu Asp His Ala Asp         115                 120                 125 Ile Pro Ser Thr Trp Lys Ala Leu Gly Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Lys    130                 135                 140 Ala Lys Ala Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Thr Lys Lys Leu Gln Asp 145                 150                 155                 160 Leu Leu Asp Val Ala Arg Val Pro Pro Ala Val Asn Gln Val Glu Leu                 165                 170                 175 His Pro Gly Trp Gln Gln Ala Lys Leu His Ala Phe Cys Glu Ser Lys             180                 185                 190 Gly Ile His Leu Ser Gly Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Pro Gly Val Leu         195                 200                 205 Lys Ser Asp Ile Leu Lys Asn Pro Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Lys     210                 215                 220 Leu Gly Lys Thr Pro Gly Gln Val Ala Leu Arg Trp Gly Leu Gln Ala  225                 230                 235                 240 Gly His Ser Val Leu Pro Lys Ser Thr Asn Glu Ala Arg Ile Lys Lys                 245                 250                 255 Asn Leu Asp Val Tyr Asp Trp Ser Ile Pro Glu Asp Leu Phe Pro Lys             260                 265                 270 Phe Ser Glu Ile Lys Gln Asp Lys Leu Ile Lys Gly Thr Phe Phe Val         275                 280                 285 Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Phe Arg Thr Ile Glu Glu Leu Trp Asp Gly     290                 295                 300 Glu Val 305 <210>2 <211>1231 <212>DNA <213>苜蓿 <220> <221>CDS <222>(34)．．(972) <400>2 attcaataaa aaccacatat tcatggctcc aaa atg gcc aca gca atc aag ttt  54                                      Met Ala Thr Ala Ile Lys Phe                                    1                  5 ttt cag ttg aac act ggt gct aaa atc cct tca gtt ggt tta ggt act  102 Phe Gln Leu Asn Thr Gly Ala Lys Ile Pro Ser Val Gly Leu Gly Thr          10                  15                  20 tgg caa gct gaa cct ggt gtt gtt gcc aaa gct gtc acc act gct gtt   150 Trp Gln Ala Glu Pro Gly Val Val Ala Lys Ala Val Thr Thr Ala Val      25                  30                  35 cag gtt gga tac aga cat att gat tgt gct gaa gct tat aag aat caa   198 Gln Val Gly Tyr Arg His Ile Asp Cys Ala Glu Ala Tyr Lys Asn Gln  40                  45                  50                  55 tca gag att ggt tca gct ctc aaa aag ctt ttt gag gat ggt gtg gtt   246 Ser Glu Ile Gly Ser Ala Leu Lys Lys Leu Phe Glu Asp Gly Val Val                  60                  65                  70 aag cgc gag gag tta tgg atc acc tca aaa cta tgg tgt tca gat cat   294 Lys Arg Glu Glu Leu Trp Ile Thr Ser Lys Leu Trp Cys Ser Asp His              75                  80                  85 cat cca gaa gat gtt cca aaa gca ttg gat aaa act tta aat gat ttg   342 His Pro Glu Asp Val Pro Lys Ala Leu Asp Lys Thr Leu Asn Asp Leu          90                  95                 100 cag ctt gat tac ctt gac ctc tat ctg atc cac tgg cca gtg agc atg   390 Gln Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Val Ser Met     105                 110                 115 aaa agg gga aca ggt gaa ttt atg ggt gaa aat ctt gat cat gcc gac   438 Lys Arg Gly Thr Gly Glu Phe Met Gly Glu Asn Leu Asp His Ala Asp 120                 125                 130                 135 ata cca agc aca tgg aaa gca ttg gga gca cta tat gao tct ggc aag   486 Ile Pro Ser Thr Trp Lys Ala Leu Gly Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Lys                 140                 145                 150 gct aaa gct att gga gtc agc aat ttc tct aca aag aaa ctt caa gac   534 Ala Lys Ala Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Thr Lys Lys Leu Gln Asp             155                 160                 165 cta ttg gac gta gca aga gtg cct cca gct gtt aat cag gtg gaa ttg   582 Leu Leu Asp Val Ala Arg Val Pro Pro Ala Val Asn Gln Val Glu Leu         170                 175                 180 cac cct gga tgg cag cag gca aag ttg cat gca ttt tgt gaa tca aaa   630 His Pro Gly Trp Gln Gln Ala Lys Leu His Ala Phe Cys Glu Ser Lys     185                 190                 195 gga att cat cta tct gga tat tct cct cta ggc tca cca gga gta ctc   678 Gly Ile His Leu Ser Gly Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Pro Gly Val Leu 200                 205                 210                 215 aaa agt gac att ctt aag aat cca gtt gtc aaa gag att gca gag aaa   726 Lys Ser Asp Ile Leu Lys Asn Pro Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Lys                 220                 225                 230 ctt ggg aag aca cca gga caa gtt gcc ctt cga tgg ggt cta caa gca   774 Leu Gly Lys Thr Pro Gly Gln Val Ala Leu Arg Trp Gly Leu Gln Ala             235                 240                 245 gga cac agc gtg ctc cct aag agc acc aat gag gct agg atc aag aaa   822 Gly His Ser Val Leu Pro Lys Ser Thr Asn Glu Ala Arg Ile Lys Lys         250                 255                 260 aat ctt gac gtg tac gat tgg tct att cct gaa gac ttg ttt ccc aag   870 Asn Leu Asp Val Tyr Asp Trp Ser Ile Pro Glu Asp Leu Phe Pro Lys     265                 270                 275 ttt tct gaa att aag cag gat aag cta atc aag ggt acc ttt ttc gtt   918 Phe Ser Glu Ile Lys Gln Asp Lys Leu Ile Lys Gly Thr Phe Phe Val 280                 285                 290                 295 aac gac acc tat ggt gct ttt agg acc att gaa gaa ctc tgg gat ggt   966 Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Phe Arg Thr Ile Glu Glu Leu Trp Asp Gly                 300                 305                 310 gaa gta tgagcaatat gcaacattga gatgacaaat aatacactgt ttccacaata    1022 Glu Val aaaccagata ctgtttccat gataaagatt aaagctagat gctgatatga ttcgtgtaat 1082 tttaggttcc gtgaagtgtt actttctgta taacaactgt aattcagatt aaagacatat 1142 ctgatgtttg acatttattg ttgtcgattc agacaagaca tcattgtacg tggttatatt 1202 taatctctaa tattgtctaa attattacc                                   1231 <210>3 <211>313 <212>PRT <213>苜蓿 <400>3 Met Ala Thr Ala Ile Lys Phe Phe Gln Leu Asn Thr Gly Ala Lys Ile   1               5                  10                  15 Pro Ser Val Gly Leu Gly Thr Trp Gln Ala Glu Pro Gly Val Val Ala              20                  25                  30 Lys Ala Val Thr Thr Ala Val Gln Val Gly Tyr Arg His Ile Asp Cys          35                  40                  45 Ala Glu Ala Tyr Lys Asn Gln Ser Glu Ile Gly Ser Ala Leu Lys Lys      50                  55                  60 Leu Phe Glu Asp Gly Val Val Lys Arg Glu Glu Leu Trp Ile Thr Ser  65                  70                  75                  80 Lys Leu Trp Cys Ser Asp His His Pro Glu Asp Val Pro Lys Ala Leu                  85                  90                  95 Asp Lys Thr Leu Asn Asp Leu Gln Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu             100                 105                 110 Ile His Trp Pro Val Ser Met Lys Arg Gly Thr Gly Glu Phe Met Gly         115                 120                 125 Glu Asn Leu Asp His Ala Asp Ile Pro Ser Thr Trp Lys Ala Leu Gly     130                 135                 140 Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Lys Ala Lys Ala Ile Gly Val Ser Asn Phe 145                 150                 155                 160 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Asp Leu Leu Asp Val Ala Arg Val Pro Pro                 165                 170                 175 Ala Val Asn Gln Val Glu Leu His Pro Gly Trp Gln Gln Ala Lys Leu             180                 185                 190 His Ala Phe Cys Glu Ser Lys Gly Ile His Leu Ser Gly Tyr Ser Pro         195                 200                 205 Leu Gly Ser Pro Gly Val Leu Lys Ser Asp Ile Leu Lys Asn Pro Val     210                 215                 220 Val Lys Glu Ile Ala Glu Lys Leu Gly Lys Thr Pro Gly Gln Val Ala 225                 230                 235                 240 Leu Arg Trp Gly Leu Gln Ala Gly His Ser Val Leu Pro Lys Ser Thr                 245                 250                 255 Asn Glu Ala Arg Ile Lys Lys Asn Leu Asp Val Tyr Asp Trp Ser Ile             260                 265                 270 Pro Glu Asp Leu Phe Pro Lys Phe Ser Glu Ile Lys Gln Asp Lys Leu         275                 280                 285 Ile Lys Gly Thr Phe Phe Val Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Phe Arg Thr     290                 295                 300 Ile Glu Glu Leu Trp Asp Gly Glu Val 305                 310 <210>4 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>4 cgaactcgag atggccacag caatcaagtt t                             31 <210>5 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>5 ccgagctcta cttcaccatc ccagag                                   26