中间锦鸡儿CiCPK32基因在调控植物抗逆性的应用
阅读：129发布：2020-05-16
专利汇可以提供中间锦鸡儿CiCPK32基因在调控植物抗逆性的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 基因工程领域，具体而言，涉及中间锦鸡儿CiCPK32基因，同时涉及该基因的功能研究和在调控 植物 抗逆性的应用。本发明利用中间锦鸡儿的转录组 数据库 ，从中间锦鸡儿中克隆得到与 非生物胁迫 相关的CiCPK32基因，在拟南芥中过表达后，进行干旱、高盐和ABA等胁迫处理，并揭示其功能，为其今后应用于改善农林草植物耐受逆境能 力 提供理论依据和支持。，下面是中间锦鸡儿CiCPK32基因在调控植物抗逆性的应用专利的具体信息内容。
1.一种中间锦鸡儿CiCPK32基因，其特征在于，所述CiCPK32基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.插入有CiCPK32基因的重组表达载体，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
3.插入有CiCPK32基因的瞬时和稳定表达载体，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
4.插入有CiCPK32基因的超表达和干扰表达载体，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
5.权利要求1中所述CiCPK32基因、权利要求2-4任一所述CiCPK32基因的表达载体在调控植物中对抗逆性中的应用。
6.一种提高植物的抗逆性的生物制剂，其特征是，其活性成分来源于CiCPK32的重组表达载体或超表达和干扰表达载体，或其活性成分含有调控CiCPK32基因表达的生物制品，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
7.一种调控植物抗逆性的方法，其特征是，该方法包括调控CiCPK32基因表达，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
8.权利要求1所述的CiCPK32基因，或权利要求2所述重组表达载体，或权利要求3所述的瞬时和稳定表达载体，或权利要求4所述的超表达和干扰表达载体在改良植物抗逆性的遗传育种中的应用，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
中间锦鸡儿CiCPK32基因在调控植物抗逆性的应用
技术领域
背景技术
[0002] 低温、干旱、土地盐碱化等环境条件是影响植物生长发育的主要逆境胁迫因子，植物在逆境胁迫下的生理生化变化以及对逆境适应能力的研究是近年来的研究热点。探索如何提高植物的抗逆性已经成为急需解决的关键问题。植物为了适应逆境环境，会在分子、细胞、器官、生理生化等水平上做出及时调节。随着生物的进化，植物体内产生了复杂的信号传递系统，从而提高了植物的抗逆能力。钙离子是胞内的第二信使，是植物体内一种重要的信号转导因子，参与植物生长发育、免疫防御和激素调节，并且对光和各种胁迫信号均有响应。目前，在植物中有钙调素、钙依赖蛋白激酶(CDPK)和钙调磷酸酶B类蛋白这三种钙受体蛋白，其中钙依赖蛋白激酶是目前研究的热点。钙依赖蛋白激酶是主要的初级钙离子感受2+
器之一，同时也是Ca 响应蛋白，植物中分布广泛，在植物钙信号转导过程中具有重要作用，同时在植物应答逆境信号传递过程中起重要作用。
器之一，同时也是Ca 响应蛋白，植物中分布广泛，在植物钙信号转导过程中具有重要作用，同时在植物应答逆境信号传递过程中起重要作用。
[0003] CDPK是植物和原生生物所特有的、在动物体内尚未发现的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，它的全称为：钙依赖和钙调素不依赖的蛋白激酶(Calcium-dependent and calmodulin-independent protein kinase)或类钙调素结构域的蛋白激酶(Calmodulin-like protein kinase)，是一种特殊的钙离子结合蛋白。该蛋白首次在豌豆(Pisum sativum)中报道，并在大豆(Glycine max)中首次得到纯化和鉴定。随着对CDPK的研究的不断深入，人们发现CDPK是一个大的基因家族，目前，在水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杨树(populus trichocarpa)和葡萄(Vitis vinifera)等多种植物中均鉴定出CDPK蛋白，例如，在模式植物拟南芥基因组中已经鉴定出34个CDPK家族成员，分别位于五条染色体上，其中CPK2/17/20/34被证实与花粉管伸长有关；而且在早期研究中表明，矮牵牛的两个基因PiCPK1和PiCPK2也可能参与对花粉管生长的调节，拟南芥CPK28基因被认为是赤霉素(Gibberellic acid，GA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)的调节基因，CPK4和CPK11在乙烯的生物合成中发挥着重要作用，CPK21和CPK23在植物的耐盐和耐旱途径起负调控作用，该基因缺失增强了对相应非生物胁迫的耐受性，而过表达的株系则表现出相反的表型。在水稻中，目前为止已鉴定出31个CDPK家族成员，大豆中发现50个CDPK基因成员，玉米(Zea mays)中克隆得到40个CDPK基因，普通小麦和杨树中分别发现20个CDPK基因，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)基因组中鉴定出25个CDPK基因，谷子(Setaria italica)中发现29个CDPK基因，马铃薯(Solanum tuberosum)中鉴定出21个CDPK基因，此外，在甜瓜(cucumis melo)、苹果(Malus pumila Millapple)、葡萄和花生(Arachis hypogaea)中均鉴定出CDPK基因。随着研究的不断深入，发现CDPK参与花期调节、植物根系发育和激素的合成及信号通路的调节，同时也在调控细胞分化、程序性死亡中发挥重要功能，如StCDPK5转基因马铃薯增强了对晚疫病病原体的抗性。
[0004] 中间锦鸡儿(Caragana inermedia)属于豆科锦鸡儿属多年生灌木。根系较发达，地下根近5米，茎干直立或斜向上，株高1-2米；羽状复叶，小叶12-16片，倒卵形或椭圆形，多有被毛；中间锦鸡儿4月中旬开始生长，花期为5月中旬，花冠蝶形，黄色，果期为6月份，种子为肾形，有淡绿褐色和黄褐色两种颜色。在我国内蒙古、山西、宁夏和陕西等地区分布广泛，具有耐旱、耐高温、耐盐碱和耐寒等特性，是干旱、荒漠地区防风固沙和保持水土的优良植物；另外，中间锦鸡儿还可以作为饲料、燃料、造纸、肥料和板材原料，同时还具有药用价值。干旱、高盐和冷冻等其他的极端环境严重影响着植物的生长发育和农作物的产量。植物不像动物可以灵活主动地去躲避各种逆境胁迫，因此，为了适应各种不良生长环境，植物也逐渐进化形成了一系列复杂的抗逆机制，从而增强了植物自身的抗逆性。CDPKs被认为是胞质钙离子下游多种植物信号转导通路的重要调控因子，可能起到增强植物抗逆性的作用。本发明从中间锦鸡儿中克隆得到一个与抗逆相关的CiCPK32基因，并对其功能进行了初步研究，从分子和生理等各个水平上探究其抗逆机理。
发明内容
[0005] 本发明利用中间锦鸡儿的转录组数据库，从中间锦鸡儿中克隆得到与非生物胁迫相关的CiCPK32基因，在拟南芥中过表达后，进行干旱、高盐和脱落酸(ABA)等胁迫处理，并揭示其功能，为其今后应用于改善农林草植物耐受逆境能力提供理论依据和支持。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一个能增加植物抗逆性的中间锦鸡儿CiCPK32基因及其编码蛋白。
[0008] 本发明的另一目的是提供中间锦鸡儿CiCPK32在提高植物对抗逆性中的应用。特别地，所述抗逆性是指抗渗透胁迫、抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗ABA胁迫。
[0009] 插入有CiCPK32基因的重组表达载体，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1蛋白质的核苷酸序列。
[0010] 插入有CiCPK32基因的瞬时和稳定表达载体，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
[0011] 插入有CiCPK32基因的超表达和干扰表达载体，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
[0012] 本发明的另一目的是提供CiCPK32基因在植物育种中的应用。
[0013] CiCPK32基因，或其重组表达载体，或其瞬时表达和稳定表达载体，或其超表达和干扰表达载体在改良植物对抗逆性的遗传育种中的应用，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
[0014] 本发明的另一目的是一种将上述中间锦鸡儿CiCPK32基因应用于植物基因工程中，得到CiCPK32的超表达和干扰的转基因植株，用于改变植物的抗逆性，特别地，所述抗逆性是指抗渗透胁迫、抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗ABA胁迫。
[0015] 本发明的另一目的是提供一种提高植物的抗逆性的生物制剂，特别地，所述抗逆性是指抗渗透胁迫、抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗ABA胁迫，优选为指抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗ABA胁迫。
[0016] 一种提高植物的抗逆性的生物制剂，其活性成分来源于CiCPK32的重组表达载体或超表达和干扰表达载体，或其活性成分含有调控CiCPK32基因表达的生物制品，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
[0017] 本发明的另一目的是提供一种调控植物的抗逆性的方法，特别地，所述抗逆性是指抗渗透胁迫、抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗ABA胁迫。
[0018] 一种调控植物的抗逆性的方法，该方法包括调控CiCPK32基因表达，所述CiCPK32基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
[0019] 本发明构建CiCPK32的超表达和干扰表达载体，并通过农杆菌介导法的遗传转化方法，将超表达和干扰表达载体转化至正常植物品种，最后获得CiCPK32的超表达和干扰表达的转基因植物。
[0020] 特别地，所述植物优选为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。在一个具体实施方案中，植物优选为豆科锦鸡儿植物，所述豆科锦鸡儿植物可为中间锦鸡儿。
[0021] 在本发明中，我们获得的一个中间锦鸡儿CiCPK32并进行应用性探索，阐述了该基因以下应用方式：
[0022] (1)应用RACE技术克隆得到中间锦鸡儿CiCPK32基因。
[0023] (2)CiCPK32基因受干旱、NaCl、ABA的胁迫诱导。
[0024] (3)在100mM NaCl、400mM甘露醇或0.4μΜABA处理下，CiCPK32过表达株系种子萌发率高于对照。
[0026] (5)ABA处理下，过表达CiCPK32基因株系中胁迫相关基因的表达量均明显高于野生型。
[0028] 图1：本发明的技术路线图。
[0029] 图2：CiCPK32基因全长cDNA克隆电泳图(A:CiCPK32 3’RACE B:CiCPK32 5’RACE C:CiCPK32ORF)。
[0030] 图3：CiCPK32与其他物种的CDPK的进化关系(括号内为氨基酸登录号；分支上的数字表示Bootstrap验证中基于1000次重复该节点的可信度的百分比；标尺代表演化距离)。
[0031] 图4：CiCPK32与拟南芥CDPKs的系统进化分析(不同颜色的分支代表不同亚家族的成员，蓝色：Ⅰ亚家族；紫色：Ⅱ亚家族；绿色：Ⅲ亚家族；红色：Ⅳ亚家族)。
[0032] 图5：CiCPK32在不同处理下的表达模式分析。
[0033] 图6：CiCPK32转基因纯合体幼苗的筛选。
[0034] 图7：CiCPK32转基因株系表达水平鉴定。
[0035] 图8：甘露醇处理下对照和CiCPK32过表达株系萌发率检测；A：正常1/2MS培养基上各株系的萌发率的统计；B：含有400mM Mannitol的1/2MS培养基上各株系的萌发率的统计。
[0036] 图9：NaCl处理下对照和CiCPK32过表达株系萌发率检测；A和C：正常1/2MS培养基上各株系的萌发情况和萌发率的统计(生长2d的照片)；B和D：含有100mM NaCl的1/2MS培养基上各株系的萌发情况和萌发率的统计(生长2d的照片)。
[0037] 图10：对照和CiCPK32过表达株系抗旱性和失水率分析；A:干旱胁迫处理前2周大的幼苗(上图)、干旱处理10天的幼苗(中图)和复水3天后的幼苗(下图)；B:各株系的存活率统计；C:各株系地上部分失水率统计；**表示P<0.01。
[0038] 图11：ABA处理下野生型和CiCPK32过表达株系萌发率检测；A和C：正常1/2MS培养基上各株系的萌发情况和萌发率的统计(生长7d的照片)；B和D：含有0.4μM ABA的1/2MS培养基上各株系的萌发情况和萌发率的统计(生长7d的照片)。
[0039] 图12：ABA处理下过表达CiCPK32拟南芥幼苗和对照幼苗主根长度比较；A和C：正常1/2MS培养基上各株系的根长情况和统计(生长10d的照片)；B和D：含有12μM ABA的1/2MS培养基上各株系的根长情况和统计(生长10d的照片)；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
[0040] 图13：拟南芥不同株系ABA信号途径基因和胁迫响应基因表达量检测。
具体实施方式
[0041] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体的技术路线图如图1所示。
[0042] 实施例1.中间锦鸡儿CiCPK32编码基因的克隆
[0043] 1.1 RACE法扩増CiCPK32基因3’端序列
[0044] 从中间锦鸡儿干旱转录组数据库中筛选获得一条与拟南芥CPK32同源的CiCPK32基因的EST序列，片段长度为566bp，在NCBI经过序列比对发现该基因序列3’端与5’端均不完整。根据3’RACE试剂盒要求设计Outer和Inner引物：CiCDPK32-3’-out和CiCDPK32-3’-in，具体引物序列如下：
[0045]
[0046] 1.2 RACE法扩増CiCPK32基因5’端序列
[0047] 根据Smarter RACE cDNA Amplicaion Kit试剂盒的要求，设计5’RACE引物，引物序列如下：
[0048]
[0050] 1.3 CiCPK32基因编码区的克隆
[0051] 将1.1和1.2的RACE扩增结果经上海生工生物公司测序后用Vector NTI10软件进行拼接，获得CiCPK32基因cDNA全长序列，分析得到完整的开放阅读编码框(ORF)序列。根据ORF序列，设计引物：HA-CiCPK32-sense和HA-CiCPK32-anti：
[0052]
[0053] 以中间锦鸡儿的cDNA为模板，利用高保真酶PrimeSTARHSDNA Polymerase对目的基因的ORF进行扩增。其中退火温度设为63℃，延伸时间设为1.5min，反应循环数为30。
[0054] 可见，通过5’RACE扩增得到1196bp的5’端序列，3’RACE扩增得到854bp的3’端序列(图2)。测序后，将RACE技术扩增得到的序列通过Vector NTI10与筛选到的EST序列拼接，获得cDNA全长序列。以中间锦鸡儿cDNA为模板，设计特异性引物，克隆该基因的ORF，测序验证表明拼接正确。
[0055] 1.4 CiCPK32基因的序列分析
[0056] 应用软件对1.3中扩增得到cDNA进行分析发现，扩增得到的CiCPK32基因的cDNA全长为2074bp(SEQ ID NO.2)，由开放阅读框(ORF)1566bp(SEQ ID NO.3)、3'端非编码区和5'端非编码区组成。该基因共编码522个氨基酸(SEQ ID NO.1)，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。通过观察发现在CiCPK32第二位具有Gly(G)残基，可能是豆蔻酰化的位点，并且第四和第五位置被Cys(C)残基占据，可能是棕榈酰化的位点，已知蛋白质豆蔻酰化促进蛋白质与膜或蛋白质与蛋白质相互作用，这一结构对在CiCPK32膜定位过程中起着重要的作用。
[0057] 1.5基因生物信息学分析
[0058] 为了进一步了解CiCPK32与其他物种的CDPK的进化关系，将CiCDPK32基因编码的氨基酸序列在NCBI进行BLAST序列比对，经比对选取大豆、鹰嘴豆、蒺藜苜蓿，梅花(Prunus mume)、苹果、葡萄、棉花、可可树(Theobroma cacao)、拟南芥、甜橙(Citrus sinensisL.Osb.)、烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯中的CDPK蛋白，与CiCPK32蛋白序列通过MAGE7.0一同构建进化树(图3)，我们发现其与拟南芥AtCPK32(AT3G57530)一致性达到77％。经过序列分析，中间锦鸡儿CiCPK32与鹰嘴豆、蒺藜苜蓿、大豆的亲缘关系较近，聚在一个大的分支上，可信度达到99％。
[0059] 为了进一步了解CiCPK32基因的功能，将该基因和拟南芥中已经发现的34个CPK基因编码的蛋白序列进行了系统进化分析，并且应用MAGE 7.0构建了系统发育树(图4)，发现CiCPK32与拟南芥第Ⅲ亚族的基因亲缘关系较近，聚类在一起，说明该基因属于拟南芥的第Ⅲ亚家族。而据研究报道，拟南芥第Ⅲ亚族的AtCDPK8和AtCDPK10可以增强植物对干旱胁迫的抗性，而AtCPK32控制花粉管的极性生长，为对目的基因的后续研究提供了方向。
[0060] 实施例2、中间锦鸡儿CiCPK32基因的表达特性分析
[0061] 为了进一步确定CiCDPK32基因是否受非生物胁迫的诱导，将中间锦鸡儿分别在脱水、盐、ABA条件下处理后，应用qRT-PCR技术检测在不同胁迫处理下目的基因表达量的变化情况。
[0062] 在中间锦鸡儿种子中挑选籽粒饱、无虫蛀的种子，将其播种于放有混合土(营养土:蛭石＝1:3)的植物培养钵，培养条件为：22℃、16h光照/8h黑暗、光照强度7000-8000lux。选取生长状态一致并发育良好的中间锦鸡儿幼苗进行脱落酸(ABA)、盐和脱水胁迫处理，将其作为研究目的基因对不同胁迫响应情况的原材料。
[0063] 检测结果显示，脱水处理后CiCPK32的表达被迅速诱导，3h时目的基因的表达量达到最高，是未处理时的2.2倍，6h时表达量基本保持不变，之后略有下降趋势，但依然高于未处理时的表达量；盐处理后，目的基因的表达量明显降低，处理3h表达量迅速降低到未处理时的一半，处理6h时达到最低，12h时依然明显低于未处理时的表达量；ABA处理后，6h时目的基因的表达量升高到未处理时的4倍。以上检测结果说明CiCPK32基因可能参与脱水、盐和ABA胁迫的响应(图5)。
[0064] 实施例3、转CiCPK32基因拟南芥植株的获得和抗逆性鉴定
[0065] 3.1中间锦鸡儿CiCPK32基因表达载体的构建并转化拟南芥
[0066] (1)克隆CiCPK32基因的ORF时引物中包含的酶切位点为Sal I和Sac I，应用以上两种限制性内切酶将目的基因片段从pEASY-Blunt Simple重组载体上切下，经验证正确，与双酶切后的线性表达载体pCanG-HA连接，用于过表达株系的构建。
[0067] (2)将(1)中的连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有20mg·mL-1卡那霉素的LB培养基上筛选阳性克隆菌，进行质粒提取，使用Sal I和Sac I进行双酶切验证。
[0068] (3)制备农杆菌GV3101感受态细胞，并将(2)中验证正确的质粒通过电转化法转化农杆菌GV3101。用浸花法将构建好的过表达载体pCanG-CiCPK32转化野生型拟南芥(Col-0)，收取成熟的T1代的种子，待种子晾干后，将T1代种子播种1/2MS培养基上(含有25mg·L-
1Kan)进行转基因苗的筛选。将培养基中的绿色幼苗(图6A)移到装有混合土(蛭石:营养土＝3:1)的培养钵中进行培养，种子成熟后单株收取，获得的转基因T2代种子。继续将T2代种子播种在1/2MS培养基上(含有25mg·L-1Kan)进行筛选，将培养基上符合孟德尔分离定律的的绿色幼苗移苗到装有混合土的培养钵中进行培养(图6B)。植物成熟后，单株收取T3代种子，将收取的T3代种子播种在1/2MS培养基上(含有25mg·L-1Kan)，7天左右观察平板上幼苗的生长状况，全绿苗的即为纯合体株系(图6C)。
1Kan)进行转基因苗的筛选。将培养基中的绿色幼苗(图6A)移到装有混合土(蛭石:营养土＝3:1)的培养钵中进行培养，种子成熟后单株收取，获得的转基因T2代种子。继续将T2代种子播种在1/2MS培养基上(含有25mg·L-1Kan)进行筛选，将培养基上符合孟德尔分离定律的的绿色幼苗移苗到装有混合土的培养钵中进行培养(图6B)。植物成熟后，单株收取T3代种子，将收取的T3代种子播种在1/2MS培养基上(含有25mg·L-1Kan)，7天左右观察平板上幼苗的生长状况，全绿苗的即为纯合体株系(图6C)。
[0069] 经过筛选鉴定，共获得12个CiCPK32转基因拟南芥纯合体株系。将筛选得到的T3代纯合体株系通过qRT-PCR检测CiCPK32的表达水平(图7)。后续实验中，选取OE-2，OE-6和OE-12纯合体株系做表型检测。
[0070] 3.2不同处理下种子萌发率的检测
[0071] 为了检测CiCPK32在种子萌发阶段对渗透胁迫的耐受性，将转化pCanG-HA空载体的纯合株系(作为对照)和3个过表达纯合体株系OE-2、OE-6、OE-12种子点播在含有0mM和400mM甘露醇的1/2MS培养基上，每个株系55粒种子。在含有0mM甘露醇的培养基中，对照和CiCPK32过表达拟南芥种子的萌发率没有明显区别(图8A)。而在含有400mM甘露醇的培养基中，CiCPK32过表达株系的萌发率均明显高于野生型拟南芥，例如，在萌发第5天时，过表达株系的萌发率均高于92.1％，而野生型拟南芥萌发率仅为74.5％(图8B)，表明过表达CiCPK32增强了拟南芥对渗透胁迫的耐受能力。
[0072] 3.3过表达CiCPK32基因拟南芥种子萌发对盐胁迫耐受性检测
[0073] 为了检测对照和CiCPK32过表达拟南芥在种子萌发阶段对盐胁迫的耐受性，将3个过表达株系和对照拟南芥种子各55粒点播分别至含有0mM和100mM NaCl的1/2MS培养基上。在不含NaCl的培养基中，对照和CiCPK32过表达株系的萌发率没有区别(图9A和C)；而在含有100mM NaCl的培养基中，3个CiCPK32过表达株系的萌发率明显高于野生型(图9B和D)。例如，当种子萌发第2天时，野生型的萌发率为60.0％，而3个过表达株系的萌发率均高于
87.3％，说明在拟南芥种子萌发阶段CiCPK32超表达可以提高其耐受盐胁迫的能力。
87.3％，说明在拟南芥种子萌发阶段CiCPK32超表达可以提高其耐受盐胁迫的能力。
[0074] 3.4过表达CiCPK32基因拟南芥干旱胁迫表型及失水率检测
[0075] 为了进一步探究CiCPK32基因在干旱胁迫中的功能，对生长3周的对照和CiCPK32过表达拟南芥的地上部分进行了失水率的检测，发现过表达株系的失水率均低于对照(图10C)。对正常生长2周的对照和过表达株系进行干旱处理后发现，停止浇水10d后，野生型叶片失水严重，叶片呈卷曲和萎蔫状态，而转基因株系叶片的萎蔫现象明显较对照轻(图
10A)。对干旱处理的植物复水，3d后统计存活率，对照的存活率为56.3％，而CiCPK32过表达株系OE-2、OE-6和OE-12存活率分别为99.3％、100％和99.6％，均明显高于野生型(图10B)。
综上所述，CiCPK32过表达后提高了拟南芥的抗旱性。
10A)。对干旱处理的植物复水，3d后统计存活率，对照的存活率为56.3％，而CiCPK32过表达株系OE-2、OE-6和OE-12存活率分别为99.3％、100％和99.6％，均明显高于野生型(图10B)。
综上所述，CiCPK32过表达后提高了拟南芥的抗旱性。
[0076] 3.5过表达CiCPK32基因拟南芥种子萌发对ABA的耐受性检测
[0077] 为了检测CiCPK32在种子萌发阶段的调控作用是否与ABA有关，将对照和CiCPK32过表达株系分别点播在含有0和0.4μM ABA的1/2MS培养基上，统计种子的萌发率。在未加ABA的培养基上，对照和过表达的萌发率无明显区别(图11A和C)；而在含有0.4μM ABA的培养基上，CiCPK32过表达株系的萌发率均明显高于对照(图11B和D)，例如，在萌发第7天时，野生型的萌发率为83.0％，过表达株系萌发率的平均值为95.8％，说明过表达CiCPK32提高了拟南芥种子在萌发阶段对ABA耐受性。
[0078] 3.6 ABA对过表达CiCPK32基因拟南芥幼苗根长的影响
[0079] 为了进一步了解CiCPK32基因是否对拟南芥幼苗根系的生长发育产生影响，使用12μMABA对萌发5d的拟南芥幼苗进行处理，观察并记录幼苗根部生长情况。将在1/2MS培养基中生长5d的拟南芥幼苗移到含有0和12μM ABA的1/2MS培养基上，测量并记录根的长度为L1，竖直培养10后测量并记录根长为L2，则根的伸长长度记为L(L＝L1-L2)，结果如图12所示，在1/2MS培养基上生长10d后过表达株系的根长伸长略长于对照(图12A和C)，而在含12μM ABA的培养基上生长10d后过表达株系的根长伸长明显高于对照(图12B和D)，并且过表达株系的叶片的生长状态明显比过表达好，说明该基因在幼苗时期同样可以提高植物根系和地上部分对ABA的耐受性。
[0080] 3.7 ABA信号通路基因和胁迫响应基因表达量检测
[0081] 通过实时荧光定量PCR，检测了正常生长状态下和100μM ABA处理过的对照和CiCPK32转基因水培苗中以下10个基因的表达量。结果显示(图13)，所选的4个ABA信号通路基因中ABF1、ABF2、ABI1、ABI2和5个胁迫响应基因MYC2、MYB2、KIN1、COR15A、RD29A等在正常生长条件，各个株系中没有明显区别，且表达都较低；ABA处理后，被检测基因的表达量都显著提高，说明ABA的处理是有效的；并且各个被检测基因在CiCPK32过表达株系中的表达量均高于野生型。说明CiCPK32在拟南芥中过表达后，在正常生长情况下对这些基因的影响不大；当植物遇到干旱、盐和ABA胁迫时，会诱导这些基因的表达，从而抵御外界不良环境的影响。
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