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西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法

阅读：522发布：2020-05-16

专利汇可以提供西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法。本发明根据已有报道的Dicer like 1蛋白序列，同源比对Fon基因组序列，获得西瓜枯萎病菌FonDCL1基因，采用基因同源置换原理，利用Split‑marker策略，用潮霉素B(HPH)基因DNA 片段替换目的基因FonDCL1，通过构建该基因同源重组片段，以野生菌株Fon1遗传转化获得FonDCL1的基因缺失突变体，该FonDCL1突变体具有对西瓜幼苗致病力增强，对莫能霉素钠、羟基脲、荧光增白剂CFW、刚果红CR及双氧水等非生物胁迫因子更加敏感等特性，这为Fon1参与自身生长发育及侵染西瓜过程中产生的小RNA的功能解析提供研究基础。，下面是西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1，其特征在于，包含其上、下游核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1，其特征在于，所述上、下游核苷酸序列的长度均为3Kb。
3.一种西瓜枯萎病菌FonDCL1基因缺失突变体的构建方法，其特征在于，通过以下步骤获得：
1)FonDCL1基因缺失重组DNA片段构建
第一轮PCR扩增：以西瓜枯萎病基因组DNA为模板，引物Fon1DCL1-LBCK/Fon1DCL1-HPH-LB-R扩增FonDCL1基因上游FonDCL1-UP片段，引物Fon1DCL1-HPH-RB-F/Fon1DCL1-RBCK扩增FonDCL1基因下游FonDCL1-DOWN片段；以载体pCT74质粒DNA为模板，引物HYG-F/HYG-R扩增抗性基因HYG片段；
第二轮PCR扩增：以FonDCL1-UP和HYG为模板，引物Fon1DCL1-LB-F/HYG-R1扩增FonDCL1-UP+HY片段，以FonDCL1-DOWN和HYG为模板，引物HYG-F1/Fon1DCL1-RB-R扩增YG+FonDCL1-DOWN片段；
2)将原生质体与FonDCL1-UP+HY片段和YG+FonDCL1-DOWN片段混匀，进行FonDCL1基因缺失遗传转化，获得突变体；
所述引物Fon1DCL1-LBCK、Fon1DCL1-HPH-LB-R、Fon1DCL1-HPH-RB-F、Fon1DCL1-RBCK、HYG-F、HYG-R、Fon1DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1、Fon1DCL1-RB-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:
11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示；
所述西瓜枯萎病基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述的一种西瓜枯萎病菌FonDCL1基因缺失突变体的构建方法，其特征在于，所述FonDCL1基因缺失突变体通过以下方法鉴定：
以转化子的基因组DNA为模板，设计四对引物用于鉴定FonDCL1基因缺失突变体，分别是上游引物Fon1DCL1-LBCK/HPT-LBCK，下游引物Fon1DCL1-RBCK/HPT-RBCK，用于扩增HYG基因的引物HYG-F/HYG-R，FonDCL1基因内部引物Fon1DCL1-2193/Fon1DCL1-3030；
所述引物HPT-LBCK、HPT-RBCK、Fon1DCL1-2193、Fon1DCL1-3030的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示。

说明书全文

西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的西瓜维管束系统病害，病原主要通过根部伤口或根毛顶端细胞间隙侵入，在寄主管壁细胞间和细胞内生长后，进入维管束，分解破坏细胞，使导管内积累果胶类物质，堵塞导管，影响水分运输，进而引起植株萎蔫。

[0003] 西瓜枯萎病自幼苗至成株均可发病，以座瓜期和瓜膨大后期发病最重。幼苗受害，出苗前可造成烂种出土后发病，子叶、真叶呈失水状萎蔫，茎基部变褐收缩呈碎倒状，拔出苗子可见根部黄褐色腐烂。成株期受害，初期病株下部叶片失水萎蔫，茎蔓基部向上褪绿。后期病部呈棕褐色，发软，常纵裂，有胶状红色物质溢出。病株基部潮湿时，布满白色至粉红色霉状病原分生孢子，剖视茎基部至根部，可见维管束变黄褐色。

[0004] 迄今，己发现西瓜枯萎病有个生理小种，即生理小种0、1、2和3，中国以生理小种1占优势。在农业生产中，枯萎病型尖孢镰刀菌除危害西瓜外，寄主范围广泛，可引起100多种植物维管束萎蔫病害，如川红花、甘蔗、芝麻、粉蕉、凤梨以及瓜类和豆类等多种植物，尤其对葫芦科植物、香蕉、番茄和棉花等高经济价值作物有严重危害作用。

[0005] 西瓜枯萎病在我国各地西瓜栽培区均有发生，该病害可造成西瓜产量下降，甚至绝收。近年来西瓜栽培尤其是保护地面积迅速扩大，重茬连作面积增大，保护地高温高湿造成西瓜枯萎病越来越普遍，越来越严重，给西瓜产业造成巨大经济损失。

[0006] miRNA(microRNA)是一类长约22nt，具有调控功能的内源性非编码小RNA。miRNA参与机体中许多重要的生理及病理过程，如机体的生长发育、肿瘤的发生和免疫反应等，这使得其成为了生物学研究的焦点。Dicer蛋白是RNaseⅢ家族中重要的一员，对miRNA或siRNA的产生起着至关重要的作用。Dicer蛋白通常由1个DEXH盒子或H盒子、1个DUF283结构域、1个PAZ结构域、2个RNaseⅢ结构域(RNaseⅢa和RNaseⅢb)和1个dsRNA结合结构域组成。Dicer蛋白的分子结构决定了其在miRNAs合成中发挥着重要作用。

[0007] Dicer可以将pre-miRNA降解成特定长度，通常为21-25nt的短dsRNA片段。Dicer首先将pre-miRNA的3’端二核苷酸与其自身的PAZ结构域结合，然后利用“分子标尺”的结构在2+
pre-miRNA固定位置进行切割，形成miRNA的5’端，Dicer对pre-miRNA的作用过程需要Mg ，但又不结合Mg2+，其催化活性对离子强度敏感表明静电底物-酶相互作用对Dicer的功能是非常重要的。

[0008] 在拟南芥中，在受到病毒侵染时，DCL4是拟南芥中Dicer抵抗病毒的第一道防线，DCL4可以产生小RNA抵御病毒。在DCL4不能发挥抵御活性时，DCL2就可以成为Dicer抵抗病毒的第二道防线。在水稻的Osdcl1的缺失突变体中，miRNA的数量会大量的减少，会最终影响水稻的发育，表明OsDcr1与水稻miRNA的加工过程有关，通过miRNA来调控水稻的生长发育。在果蝇中DCL1与miRNA的切割和miRISC复合物的产生有关。

[0009] 在正常的果蝇中生殖干细胞和成熟干细胞均能正常产生，而在果蝇Dcr1突变体的卵巢干细胞在发育的早期就已经死亡，这也就表明了Dcr1产生的miRNA能够调控果蝇的生命活动。然而作为哺乳动物典型代表的老鼠，Dicer基因的缺失使其在胚胎阶段都不能存活。

[0010] 在粗糙脉孢菌中，DCL-1和DCL-2的双突变体不能把dsRNA加工成25nt的siRNA，但是每个单突变体与原始菌株都可以把dsRNA加工成siRNA，这就证明了两个Dicer间的功能的互补与交叉。粗糙脉孢菌中的Dicer蛋白sms-3参与脉孢菌的有性生殖过程。sms-3突变体的子囊壳能够成熟同时也可以产生大量成熟的子囊孢子，但是与原始菌株的子囊壳相比发白。在白色念珠菌中CaAgo1和CaDcr1是RNAi引发的基因沉默过程中必须的元件，同时CaDCR1能够严重影响自身的生长。

[0011] 目前，人们采用了种种措施加强对西瓜枯萎病的防治，如嫁接育苗、抗病育种、化学防治等，但其效果都具有一定的局限性，还造成一定的负面作用，嫁接育苗对西瓜成熟期、品质有着重要的影响，抗病育种长周期性及其抗原的缺乏，化学防治大量使用农药带来环境污染、生态破坏和病害抗药性等负面影响。Dicer like作为RNAi通路中的主要组份，在miRNA的生成调控过程中起着重要作用。明确它们和生长及致病的关系，将有助于我们从另一角度阐明西瓜枯萎病菌的致病机理。

发明内容

[0012] 本发明根据尖孢镰刀菌番茄专化型Fol中的Dicer like 1蛋白序列，比对尖孢镰刀菌西瓜专化型基因组DNA，找到同源序列FonDCL1，通过该基因重组片段的构建及遗传转化获得FonDCL1基因缺失突变体。

[0013] 本发明采取的技术方案如下：

[0014] 一种西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1，包含其上、下游3Kb核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0015] 与潮霉素抗性基因HPH发生替换的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0016] 本发明西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1编码的cDNA，其具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

[0017] 本发明西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1表达的蛋白质，其具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

[0018] 本发明还提供了一种西瓜枯萎病菌FonDCL1基因缺失突变体，该突变体通过以下方法获得：

[0019] 1)FonDCL1基因缺失重组DNA片段构建

[0020] 第一轮PCR扩增：以西瓜枯萎病基因组DNA为模板，引物Fon1DCL1-LBCK/Fon1DCL1-HPH-LB-R扩增FonDCL1基因上游FonDCL1-UP片段，引物Fon1DCL1-HPH-RB-F/Fon1DCL1-RBCK扩增FonDCL1基因下游FonDCL1-DOWN片段；以载体pCT74质粒DNA为模板，引物HYG-F/HYG-R扩增抗性基因HYG片段；

[0021] 第二轮PCR扩增：以FonDCL1-UP和HYG为模板，引物Fon1DCL1-LB-F/HYG-R1扩增FonDCL1-UP+HY片段，以FonDCL1-DOWN和HYG为模板，引物HYG-F1/Fon1DCL1-RB-R扩增YG+FonDCL1-DOWN片段；

[0022] 3)将原生质体与FonDCL1-UP+HY片段和YG+FonDCL1-DOWN片段等比例混匀，进行FonDCL1基因缺失遗传转化，获得突变体；

[0023] 所述引物Fon1DCL1-LBCK、Fon1DCL1-HPH-LB-R、Fon1DCL1-HPH-RB-F、Fon1DCL1-RBCK、HYG-F、HYG-R、Fon1DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1、Fon1DCL1-RB-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。

[0024] 所述FonDCL1基因缺失突变体通过以下方法鉴定：

[0025] 以转化子的基因组DNA为模板，设计四对引物用于鉴定FonDCL1基因缺失突变体，分别是上游引物Fon1DCL1-LBCK/HPT-LBCK，下游引物Fon1DCL1-RBCK/HPT-RBCK，用于扩增HPH基因的引物HYG-F/HYG-R，FonDCL1基因内部引物Fon1DCL1-2193/Fon1DCL1-3030；

[0026] 所述引物HPT-LBCK、HPT-RBCK、Fon1DCL1-2193、Fon1DCL1-3030的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示。

[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0028] 本发明提供了FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法，该FonDCL1突变体具有对西瓜幼苗致病力减弱，对莫能霉素钠、羟基脲、荧光增白剂CFW、刚果红CR及双氧水等非生物胁迫因子更加敏感等特性，这为Fon1参与自身生长发育及侵染西瓜过程中产生的小RNA的功能解析提供研究基础。附图说明

[0029] 图1为FonDCL1基因缺失重组片段的构建示意图及阳性转化子PCR鉴定；其中，图1-A为FonDCL1基因及上下游基片段，抗性标记基因HPH被分割为两部分，分别与FonDCL1基因上下游约2Kb进行融合PCR扩增，箭头为四对PCR鉴定引物；图1-B为四对引物进行PCR扩增后的电泳检测；

[0030] 图2为FonDCL1基因缺失突变体致病力测定；其中，图2-A为西瓜幼苗进行伤根处理后，接种孢子悬液后14d发病结果；图2-B为FonDCL1基因缺失突变体发病的病情指数；

[0031] 图3为FonDCL1基因缺失突变体的生长速度测定；其中，图3-A为PDA平板上培养7d后，FonDCL1基因缺失突变体菌落形态；图3-B为FonDCL1基因缺失突变体的菌落直径测定；

[0032] 图4为FonDCL1基因缺失突变体的产孢量测定；

[0033] 图5为FonDCL1基因缺失突变体的非生物胁迫敏感性测定。

具体实施方式

[0034] 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

[0035] 本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0036] 本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0037] 实施例一：西瓜枯萎病菌FonDCL1基因缺失突变体的获得

[0038] 1、FonDCL1基因缺失重组DNA片段构建

[0039] 西瓜枯萎病菌FonDCL1基因敲除采用同源置换的原理，用抗性基因潮霉素B(HPH)基因DNA片段替换目的基因FonDCL1的DNA片段，FonDCL1以及上下游3kb的序列为SEQ ID NO:1，置换的FonDCL1基因序列为SEQ ID NO:2。

[0040] 1)FonDCL1基因缺失重组DNA片段的引物设计

[0041] 以带有启动子和终止子的1.4Kb的HPH基因为模板，第一轮PCR扩增，设计用于扩增1.4Kb的HYG基因片段的引物HYG-F/HYG-R，用于扩增FonDCL1上游2Kb基因片段的引物Fon1DCL1-LBCK/Fon1DCL1-HPH-LB-R，用于扩增FonDCL1下游2Kb基因片段的引物Fon1DCL1-HPH-RB-F/Fon1DCL1-RBCK；

[0042] 第二轮PCR扩增，设计引物Fon1DCL1-LB-F/HYG-R1，用于扩增上游1.5Kb以及HYG部分序列HY，引物HYG-F1/Fon1DCL1-RB-R，用于扩增HYG部分序列YG以及下游1.5Kb序列；用于阳性转化子的PCR验证，HPT-LBCK/HPT-RBCK，以及FonDCL1基因替换部分的序列引物Fon1DCL1-2193/Fon1DCL1-3030。

[0043] 表1引物序列

[0044]

[0045]

[0046] 2)FonDCL1基因缺失重组DNA片段的PCR扩增

[0047] 第一轮PCR扩增：

[0048] 以Fon1基因组DNA为模板，引物Fon1DCL1-LBCK/Fon1DCL1-HPH-LB-R扩增基因上游FonDCL1-UP片段(1808bp)；引物Fon1DCL1-HPH-RB-F/Fon1DCL1-RBCK扩增基因下游FonDCL1-DOWN片段(1947bp)，以载体pCT74质粒DNA为模板，引物HYG-F/HYG-R扩增1376bp的HYG片段。

[0049] PCR反应程序：95℃，4min，1cycle；94℃，40s，58℃，40s，72℃，1min 30s，32cycles；72℃，10min，1cycle；16℃，hold。

[0050] 第二轮PCR扩增：

[0051] 使用LA Taq进行扩增，将第一轮PCR产物稀释100倍后用作模板，以FonDCL1-UP和HYG为模板，引物Fon1DCL1-LB-F/HYG-R1扩增FonDCL1-UP+HY片段(2570bp)，以FonDCL1-DOWN和HYG为模板，引物HYG-F1/Fon1DCL1-RB-R扩增YG+FonDCL1-DOWN片段(2259bp)。

[0052] PCR反应程序：95℃，4min，1cycle；94℃，40s，58℃，1min20s，72℃，2min 30s，32cycles；72℃,10min，1cycle；16℃，hold。

[0053] 2、PEG介导的原生质体转化

[0054] 1)原生质体制备

[0055] 取5-10块Fon1菌丝块(培养7-10d，大小5mm)，加入到100ml的PDB中，28℃，150rpm摇培4-5d。3层擦镜纸过滤，收集滤液中的分生孢子。取5-10ml分生孢子液，加入200ml的PDB中，28℃，150rpm摇培12-18h。将培养好的菌液通过4层纱布过滤，适量0.7M NaCl(8.18g NaCl，用H2O定容至200ml)溶液冲洗，收集鲜嫩菌丝，将菌丝转入50ml离心管中。加入8-10ml酶解液(储存液浓度为20mg/ml，工作浓度为10mg/ml，称取崩溃酶后用0.7M NaCl溶解，定容)。涡旋，使菌体散开与酶解液充分接触，30℃，80-100rpm，温浴3-4h。酶解结束后，加入0.7M NaCl到50ml离心管稀释酶解液，颠倒混匀后三层擦镜纸过滤，用适量0.7M NaCl冲洗滤纸；4℃，不超过5000rpm离心15min后收集原生质体。用10-20ml的STC(21.86g山梨醇；
1.0ml的1M Tris-HCl pH 7.5；0.735g CaCl2·2H2O，加H2O定容至100ml)充分溶解沉淀，
4500rpm 15min离心，弃上清。加入大概400μl STC充分溶解沉淀，STC的量根据沉淀的量决定，保证原生质体的浓度能够达到108个/ml，将其置于1.5ml的离心管中。

[0056] 2)原生质体转化

[0057] 将原生质体分装，保证无菌操作。将原生质体(大概200μl)与FonDCL1-UP+HY片段(100μl)和YG+FonDCL1-DOWN片段(100μl)于1.5ml离心管中混匀(轻旋一下)，放于冰上1-2h。冰上进行，将小离心管中的液体转移至尖端离心管中(标有准确刻度50ml的)，逐滴加入
400μl PEG(30g PEG4000，0.5ml的1M Tris-HCl pH 7.5，0.735g CaCl2·2H2O，加H2O定容至
50ml)，盖上盖轻旋一下，冰浴15min。加入800μl PEG(逐滴加入，此步即可不在冰上进行，室温即可)，轻旋一下，混匀，室温置20min后。加入2ml RB。28℃培养箱中培养12h后，在尖端离心管中加入RA培养基(葡萄糖10g；KCl 0.52g；MgSO4·7H2O 0.52g；KH2PO4 0.25g；山梨醇
218.5g(1.2M)；NaNO3 6g；1％的琼脂)，定容至50ml，分转成5个培养皿。28℃培养箱中培养
24h后，在培养基表面覆盖一层PDA(含潮霉素)做为筛选，潮霉素含量至少需要50μg/ml，置于培养箱中培养。

[0058] 3)FonDCL1基因缺失突变体鉴定

[0059] 以转化子的基因组DNA为模板，利用四对引物用于鉴定FonDCL1基因缺失突变体，分别是上游引物组合Fon1DCL1-LBCK/HPT-LBCK，下游引物组合Fon1DCL1-RBCK/HPT-RBCK，引物HYG-F/HYG-R，扩增HPH基因，FonDCL1基因内部引物Fon1DCL1-2193/Fon1DCL1-3030。PCR扩增结果如图1-B所示，FonDCL1基因缺失突变体的上游和下游引物组合扩增出产物说明转化子上、下游序列发生置换，基因内部引物未能扩增出条带说明FonDCL1与HYG发生替换(图1-B)。

[0060] 实施例二：FonDCL1基因缺失突变体功能分析

[0061] 1、FonDCL1缺失突变体致病力测定

[0062] 1)取培养7d的FonDCL1缺失突变体，用5mm打孔器打取菌丝块3块，加入200ml的PDB培养基中，28℃，150rpm摇培3d，3层擦镜纸过滤，收集分生孢子液，5000rpm离心10min，用无菌水调节孢子悬液浓度至2×106个/ml。

[0063] 2)取西瓜种子，用0.1％次氯酸钠于28℃浸泡6-12h，用纱布包裹西瓜种子清洗3-5次，将西瓜种子均匀平铺于湿润的毛巾上，28℃黑暗条件下催芽2d。将催好芽的种子播种于含有椰糠等营养土的营养钵(15×15cm)中，每个营养钵10棵西瓜种子，25℃下，常规管理，7d后，长成两叶一心的西瓜幼苗，备用。

[0064] 3)将两叶一心的西瓜幼苗用解剖刀伤根处理，然后将20ml的孢子悬液从伤根处均匀加入，25℃下，2d后正常水肥管理，接菌后3d、5d、7d及14d，记录发病情况，并计算病情指数。

[0065] 西瓜幼苗病情调查按照如下病株分级标准：

[0066] 0级：无病症；

[0067] 1级：1片或2片子叶轻微发黄，但生长正常；

[0068] 2级：1-2片子叶黄化或1片子叶出现坏死斑，真叶稍变黄、轻微萎焉；

[0069] 3级：子叶枯死，真叶明显萎焉，植株生长受阻，少矮化；

[0070] 4级：全株严重萎焉，叶片枯黄；

[0071] 5级：整株枯死，甚至倒伏。

[0072] 病情指数计算公式:

[0073] 病情指数＝Σ(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)×100％

[0074] 致病力测定结果如图2-A：阴性对照(水处理)，不接种枯萎病菌的情况下，西瓜幼苗生长健壮，没有枯萎病害发生。阳性对照，接种野生菌株Fon1，西瓜表现出明显的枯萎病症状，接种FonDCL1突变株，西瓜幼苗发病，为害严重，计算出其病情指数为92.3，显著高于野生株Fon1的70.2，表明FonDCL1突变株致病力增强(图2-B)。

[0075] 2、FonDCL1缺失突变体生长速度测定

[0076] 取培养7d的FonDCL1缺失突变体(图3-A)，用5mm打孔器打取菌丝块，接种于PDA平板(Φ＝60mm)中，28℃中倒置培养7d，分别于接种后2d、3d、4d、5d测量菌落直径，测量其生长速度。结果如图3-B所示，接种5d后FonDCL1缺失突变体长满整个平板，菌落直径达到5.1cm，而野生株菌落直径为4.6cm，突变体生长速度与野生菌株Fon1无显著差别。

[0077] 3、FonDCL1缺失突变体产孢量测定

[0078] 取培养7d的FonDCL1缺失突变体，用5mm打孔器打取菌丝块3块，加入200ml的PDB培养基中，28℃，150rpm摇培3d，取1ml孢子悬液用血球计数板计算孢子浓度，并换算成对数值，统计结果显示，FonDCL1缺失突变体在摇培3d后，与野生菌株Fon1都能产生107个/ml的孢子，经方差分析后，FonDCL1缺失突变体产孢量与Fon1无显著差别(图4)，表明FonDCL1的缺失不影响Fon1的孢子产量。

[0079] 4、FonDCL1缺失突变体非生物胁迫敏感性测定

[0080] 将摇培3d的FonDCL1缺失突变体孢子悬液分别用无菌水调节孢子浓度至为2×107、2×106、2×105、2×104个/ml，分装至1.5ml的无菌EP管中，4℃保存备用。

[0081] 配制基本MM培养基，将MM培养基分别加入非生物胁迫因子，调节至浓度为：0.1M MgCl2、0.5M CaCl2、1.0M山梨醇(Sorbitol)、1.0M KCl、1.0M葡萄糖(Glucose)、0.7M NaCl、0.05％(W/V)莫能霉素钠(MMS)、1.0mg/ml羟基脲(Hydroxyurea)、6.0mg/ml组氨酸(Histidine)、400μg/ml荧光增白剂(CFW)、200μg/ml刚果红(CR)、0.01％(W/V)SDS、1.0μM H2O2，做成MM平板(Φ＝15cm)，在MM平板底部均匀划线成1.5×1.5cm小格，备用。

[0082] 将梯度浓度的孢子悬液分别取2.0μl滴加到MM平板的小格中，28℃倒置培养2d，拍照，观察FonDCL1缺失突变体的非生物胁迫敏感性。结果如图5所示，蛋白转运抑制剂莫能霉素钠处理的FonDCL1缺失突变体，其生长受到抑制。另一个羟基脲(hydroxyurea，HU)，羟基脲能抑制核苷酸还原酶，阻止胞苷酸转变为脱氧胞苷酸，从而抑制DNA的合成，它能选择性地作用于S期细胞。经过羟基脲处理后，显著抑制FonDCL1缺失突变体的生长。经过荧光增白剂CFW及刚果红CR等细胞壁完整性相关的胁迫因子处理后，FonDCL1缺失突变体更加敏感。经过双氧水处理后，FonDCL1缺失突变体更加敏感。而其他非生物胁迫因子(金属离子、渗透势、去污剂等)对FonDCL1缺失突变体均无显著影响。

[0083] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

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