杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT及应用
阅读：264发布：2020-05-14
专利汇可以提供杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于分子克隆技术领域，具体涉及杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT及应用。本发明的目的在于获取一种杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT，根据该基因核苷酸序列弥补了盐藻DGAT基因研究的空白，丰富了 植物 界DGAT基因的 生物 信息数据；在于揭示DsDGAT基因编码蛋白的 氨 基酸序列及其特征；在于获取DsDGAT基因核苷酸序列在指示盐藻二酰甘油酰基转移酶活性及富油 水 平方面的应用作用。本发明的基因DsDGAT核苷酸序列丰富了低等藻类植物的DGAT基因信息数据，相关研究人员可根据该信息及已设计的特异性引物对，对其部分(全部)区域进行特异性扩增。，下面是杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT及应用专利的具体信息内容。
1.杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT，其特征在于：所述基因DsDGAT的cDNA全长序列如SEQ ID NO.1所示，由2915个碱基组成。
2.根据权利要求1所述杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT，其特征在于：所述SEQ ID NO.1序列编码区1644bp，SEQ ID NO.1序列5’端非编码区515bp，SEQ ID NO.1序列
3’端非编码区756bp。
3.杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT编码的蛋白质，其特征在于：该基因编码的蛋白质由547个氨基酸残基组成，分子量为62.55kDa，等电点为9.51，整体为亲水蛋白质，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
4.杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的克隆方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
步骤1，调整杜氏盐藻D.m培养基溶液中NaCl的浓度为6g/L，外部光照强度为20000lx，温度为25±5℃，每个光周期光照16小时，静置培养60天，定时镜检，期间每20天补充新鲜D.m培养基溶液至固定体积；
步骤2，杜氏盐藻静置培养60天后，以8000r/min低温离心3min，弃上清，富集杜氏盐藻细胞，液氮速冻后迅速研磨，用Trizol法提取杜氏盐藻细胞总RNA，并对杜氏盐藻细胞总RNA进行如下两方面的操作：一方面对杜氏盐藻总RNA进行转录组测序分析,并将转录组测序分析的数据与七大生物信息数据库进行比对，获得基因注释信息，从中筛选编码产物注释为二酰甘油酰基转移酶的序列片段，去重复后获得DsDGAT的部分序列片段如SEQ ID NO.3所示，由423个碱基组成；另一方面先反转录杜氏盐藻总RNA为cDNA，再以cDNA为模板，根据SEQ ID NO.3的序列信息设计上下游引物对DsDGAT的核心片段进行第一轮PCR扩增；
步骤3，对第一轮PCR扩增产物进行测序：使用质量分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测第一轮PCR扩增产物，回收含有目的片段的琼脂糖凝胶，进行测序，并将测序数据与SEQ ID NO.3比对，删除片段大小不一致及核苷酸比对率低于90％的阴性结果，保留核苷酸比对率高于90％的阳性结果，阳性测序结果如SEQ ID NO.4所示；
步骤4，以第一轮PCR扩增产物为模板，依据基因DsDGAT核心片段的阳性测序结果SEQ ID NO.4，设计引物，通过RACE法对基因DsDGAT的5’和3’端进行第二轮扩增，得到第二轮扩增产物；
步骤5，对步骤4中的第二轮扩增产物，用RACE法进行第三轮扩增，最终获得基因DsDGAT的5’和3’端核苷酸序列信息，第三轮扩增的5’RACE阳性测序结果如SEQ ID NO.5所示，由
1348个碱基组成；第三轮扩增的3’RACE阳性测序结果如SEQ ID NO.6所示，由1011个碱基组成；
步骤6，将SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID.6所得序列碱基进行拼接，去除引物接头序列后获得杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的cDNA全长，如SEQ ID NO.1所示，其cDNA全长2915bp，分子量918.64KDa，516bp处为启动密码，2157bp处为终止密码。
5.根据权利要求4所述杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的克隆方法，其特征在于：
所述步骤2中第一轮的PCR引物对为DsDGAT-1F/DsDGAT-1R：
SEQ ID.7：DsDGAT-1F：5’-TGTGCTTTGGATGCAGCTTG-3’；
SEQ ID.8：DsDGAT-1R：5’-ACAGATAGTGGTTGCCCAAC-3’；
所述步骤4中第二轮5’-RACE的引物对DsDGAT-5GSP1/UPM，3’-RACE的PCR引物对DsDGAT-3GSP1/UPM分别为：
SEQ ID.9：DsDGAT-5GSP1：5’-CGAGAAACCTTCCTCACCAG-3’；
SEQ ID.10：DsDGAT-3GSP1：5’-AGAGCACATACACAAGCGCC-3’；
所述的UPM由UPM-Long UP和UPM-Short UP组成，具体如下：
SEQ ID.11：UPM-Long UP：
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；
SEQ ID.12：UPM-Short UP:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；
所述步骤5中第三轮5’-RACE的PCR引物对DsDGAT-5GSP2/UPM；3’-RACE的PCR引物对DsDGAT-3GSP2/UPM分别为：
SEQ ID.13：DsDGAT-5GSP2：5’-AGCGCAGCAGTGATGATAGG-3’；
SEQ ID.14：DsDGAT-3GSP2：5’-ACATTGTCTTCTGGCTAACC-3’；
所述的UPM由UPM-Long UP和UPM-Short UP组成，具体如下：
SEQ ID.11：UPM-Long UP：
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；
SEQ ID.12：UPM-Short UP:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’。
6.根据权利要求4所述杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的克隆方法，其特征在于：
所述步骤2中反转录杜氏盐藻总RNA为cDNA的反应体系：1uL总RNA、0.5uL反转录酶、
1uLOligo dT引物、1.5uLdNTPs、2uL含Mg2+的10×PCRbuffer、0.5uLRNase Inhibitor、添加ddH2O至20uL；
所述步骤2中反转录杜氏盐藻总RNA为cDNA的扩增程序:50℃反转录30min，85℃变性
5s；
所述步骤2中第一轮PCR扩增的反应体系：1uL反转录反应产物，2uL含Mg2+的10×PCR buffer，2.5uLdNTPs，DsDGAT-1F和DsDGAT-1R引物各1uL，0.5U Taq酶0.3uL，添加ddH2O至
20uL，在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第一轮PCR扩增；
所述步骤2中第一轮PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min；
所述步骤4中第二轮扩增反应体系：2.5uL第一轮PCR反应产物，2×SeqAmpTM Buffer25uL，DsDGAT-5GSP1或DsDGAT-3GSP1引物1uL，10×UPM 5uL，SeqAmp DNA Polymerase 1uL，添加ddH2O至50uL；在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第二轮扩增；
所述步骤4中第二轮扩增程序：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共25个循环；72℃延伸5min；
所述步骤5中第三轮扩增反应体系：1uL第二轮扩增反应产物，2×SeqAmpTM Buffer25uL，DsDGAT-5GSP2或DsDGAT-3GSP2引物1uL，10×UPM 5uL，SeqAmp DNAPolymerase
1uL，添加ddH2O至50uL；在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第三轮扩增；
所述步骤5中第三轮扩增程序：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共25个循环；72℃延伸5min。
7.杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因的应用，其特征在于：利用杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT相对表达水平指示其催化产物甘油三酯活性及其总脂含量的大小。
8.根据权利要求7所述杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的应用，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤1，取一株杜氏盐藻种，进行扩大培养，然后分别取三份藻液作为样本，三份藻液样本分别接入D.m培养基溶液中培养，其中D.m培养基中NaCl的浓度分别为3g/L，6g/L和20g/L，三份杜氏盐藻样本分别命名为低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS；
步骤2，待低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS分别生长至第30,60和90天时，分别提取其总RNA后,反转录为cDNA；
步骤3，根据SEQ ID NO.1序列信息，设计特异性引物扩增基因DsDGAT的开放性阅读框区ORF，引物信息如下：
特异性引物对：
SEQ ID.15：Ds_F：5’-CAGCCATCGCCCGCACAGCGCA-3’
SEQ ID.16：Ds_R：5’-TCACGAGCTTGAGCCTTTGAG-3’
步骤4，以杜氏盐藻18SrRNA为内参基因，荧光定量PCR法扩增上述三个培养周期的DsDGAT开放性阅读框区ORF，用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，配制qPCR反应体系，即反转录产物2uL，12.5uL 2×qPCR Mix，Ds_F和Ds_R引物各2uL，添加ddH2O至25uL，在Applied Biosystems StepOnePlusTM Real-Time System荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，具体程序是，95℃预变性1min，95℃变性15s，58℃退火32s，收集荧光信号，共40个循环；72℃延伸
20s，72℃延伸5min；溶解曲线分析：58℃-95℃；
步骤5，对杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性进行测定；
步骤6，对杜氏盐藻不同生长时期的总脂含量进行测定。
9.根据权利要求8所述杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的应用，其特征在于：
所述步骤5中对杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性进行测定的具体步骤为：
步骤5.1，取液：在无菌环境下分别提取低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS的藻液5mL；
步骤5.2，上样：对步骤5.1中的三种藻液分别上样，具体为：在酶标板中分别设置空白孔、标准孔和测样孔，标准孔中加标样50uL,测样孔中先加标准样40uL,再加待测藻液10uL，轻轻混匀；
步骤5.3，封膜洗涤：将所有的标准孔和测样孔封膜后37℃温育30min，加入稀释30倍的浓缩洗涤液，洗涤30s后弃液，风干10min；
步骤5.4，显色：风干后每个标准孔和测样孔加入酶标试剂50uL，再分别加入50uL显色剂A,50uL显色剂B,混匀后37℃避光显色10min；
步骤5.4，测定：每个标准孔和测样孔加终止液50uL，用紫外-可见光分光光度计检测
450nm处OD值，重复三次，测定时长不超过15min，根据测定的二酰甘油酰基转移酶OD450值，绘制不同时间节点该酶活性曲线图，即完成对杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性进行测定。
10.根据权利要求8所述杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的应用，其特征在于：所述步骤6中对杜氏盐藻不同生长时期的总脂含量进行测定的具体步骤为：
步骤6.1，分别取低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS的藻液各100mL，8000r/min离心5min后，ddH2O冲洗1次，再离心2min弃上清液；
步骤6.2，每个离心管中都加入体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶液3mL，涡旋震荡2min充分混匀；加ddH2O至ddH2O与氯仿的体积比为1:0.9，混合液10000r/min离心5min，弃上清并收集下层含脂溶液，风干后分别称量每个离心管中的固态总脂重量；
步骤6.3，比较杜氏盐藻不同生长周期的DsDGAT相对表达量，二酰甘油酰基转移酶活大小及总脂含量，从而获得不同盐浓度胁迫下的DsDGAT表达模式及其对二酰甘油酰基转移酶活性及脂类代谢的影响，根据不同样本在不同时期的总脂重量，绘制其总脂含量曲线图，即完成对杜氏盐藻不同生长时期的总脂含量进行测定。
杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT及应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT及应用。
背景技术
[0002] 杜氏盐藻(Dunaliella salina)简称盐藻，是一种生活在极端环境下的真核单细胞噬盐微藻，属绿藻门、绿藻纲、团藻目、盐藻科、杜氏藻属，多分布于海水及高盐度的盐湖，具有强大的渗透平衡能力。杜氏盐藻富含油脂、β-胡萝卜素、多糖等生物活性物质，以特色杜氏藻株作为生物反应器，对其生物活性物质进行规模化生产，具有重要的商业与工业应用前景。此外，我国目前正面临着土地盐渍化的危机，这严重影响了农业生产及生态绿化，利用分子改良后的耐盐植物对盐碱地进行生物修复是解决上述危机的一个重要手段。作为耐盐性最高的真核微藻，杜氏盐藻将是工业生产盐藻活性物质，挖掘关键耐盐基因，进而深入研究植物耐盐机理的理想物种，对该特色藻类植物进行分子及代谢水平的相关研究很有必要。
[0003] 二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol cyltransferase,DGAT)对油脂合成代谢起到正调控作用，被证实是催化三酰甘油生物合成的最后一步关键限速酶，在生物界中广泛存在。DGAT基因已在多种植物中成功克隆，然而截止目前，藻类植物中仅见于微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti)、团藻(Volvox carterif.nagariensis)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)及小球藻(Chlorella variabilis)。研究显示，当杜氏盐藻从低盐环境转到高盐环境时，其光合作用反而增强，CO2同化作用也增强，加速了甘油三脂的大量生成，通过甘油三脂的渗透调节及其它机制的协同作用，使其最终能够耐受高盐胁迫。二酰甘油酰基转移酶基因的表达直接影响到该限速酶的活性，而该酶催化活性的高低一定程度上将影响到盐藻甘油三酯乃至整个油脂的代谢水平。然而截止目前，作为典型的耐盐模式藻株，国内外仍未有公开或发表过杜氏盐藻DGAT基因核苷酸序列及其应用。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于获取一种杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT，根据该基因核苷酸序列弥补了盐藻DGAT基因研究的空白，丰富了植物界DGAT基因的生物信息数据；在于揭示DsDGAT基因编码蛋白的氨基酸序列及其特征；在于获取DsDGAT基因核苷酸序列在指示盐藻二酰甘油酰基转移酶活性及富油水平方面的应用作用。提供杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT及应用，为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0005] 本发明杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT，所述基因DsDGAT的cDNA全长序列如SEQ ID NO.1所示，由2915个碱基组成。
[0006] 本发明所述SEQ ID NO.1序列编码区1644bp，SEQ ID NO.1序列5’端非编码区515bp，SEQ ID NO.1序列3’端非编码区756bp。
[0007] 本发明杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT编码的蛋白质，该基因编码的蛋白质由547个氨基酸残基组成，分子量为62.55kDa，等电点为9.51，整体为亲水蛋白质，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 本发明杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的克隆方法，所述方法包括以下步骤：
[0009] 步骤1，调整杜氏盐藻D.m培养基溶液中NaCl的浓度为6g/L，外部光照强度为20000lx，温度为25±5℃，每个光周期光照16小时，静置培养60天，定时镜检，期间每20天补充新鲜D.m培养基溶液至固定体积；
[0010] 步骤2，杜氏盐藻静置培养60天后，以8000r/min低温离心3min，弃上清，富集杜氏盐藻细胞，液氮速冻后迅速研磨，用Trizol法提取杜氏盐藻细胞总RNA，并对杜氏盐藻细胞总RNA进行如下两方面的操作：一方面对杜氏盐藻总RNA进行转录组测序分析,并将转录组测序分析的数据与七大生物信息数据库进行比对，获得基因注释信息，从中筛选编码产物注释为二酰甘油酰基转移酶的序列片段，去重复后获得DsDGAT的部分序列片段如SEQ ID NO.3所示，由423个碱基组成；另一方面先反转录杜氏盐藻总RNA为cDNA，再以cDNA为模板，根据SEQ ID NO.3的序列信息设计上下游引物对DsDGAT的核心片段进行第一轮PCR扩增；
[0011] 步骤3，对第一轮PCR扩增产物进行测序：使用质量分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测第一轮PCR扩增产物，回收含有目的片段的琼脂糖凝胶，进行测序，并将测序数据与SEQ ID NO.3比对，删除片段大小不一致及核苷酸比对率低于90％的阴性结果，保留核苷酸比对率高于90％的阳性结果，阳性测序结果如SEQ ID NO.4所示；
[0012] 步骤4，以第一轮PCR扩增产物为模板，依据基因DsDGAT核心片段的阳性测序结果SEQ ID NO.4，设计引物，通过RACE法对基因DsDGAT的5’和3’端进行第二轮扩增，得到第二轮扩增产物；
[0013] 步骤5，对步骤4中的第二轮扩增产物，用RACE法进行第三轮扩增，最终获得基因DsDGAT的5’和3’端核苷酸序列信息，第三轮扩增的5’RACE阳性测序结果如SEQ ID NO.5所示，由1348个碱基组成；第三轮扩增的3’RACE阳性测序结果如SEQ ID NO.6所示，由1011个碱基组成；
[0014] 步骤6，将SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID.6所得序列碱基进行拼接，去除引物接头序列后获得杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的cDNA全长，如SEQ ID NO.1所示，其cDNA全长2915bp，分子量918.64KDa，516bp处为启动密码，2157bp处为终止密码。
[0015] 进一步地，本发明所述步骤2中第一轮的PCR引物对为DsDGAT-1F/DsDGAT-1R：
[0016] SEQ ID.7：DsDGAT-1F：5’-TGTGCTTTGGATGCAGCTTG-3’；
[0017] SEQ ID.8：DsDGAT-1R：5’-ACAGATAGTGGTTGCCCAAC-3’；
[0018] 所述步骤4中第二轮5’-RACE的引物对DsDGAT-5GSP1/UPM，3’-RACE的PCR引物对DsDGAT-3GSP1/UPM分别为：
[0019] SEQ ID.9：DsDGAT-5GSP1：5’-CGAGAAACCTTCCTCACCAG-3’；
[0020] SEQ ID.10：DsDGAT-3GSP1：5’-AGAGCACATACACAAGCGCC-3’；
[0021] 所述的UPM由UPM-Long UP和UPM-Short UP组成，具体如下：
[0022] SEQ ID.11：UPM-Long UP：
[0023] 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；
[0024] SEQ ID.12：UPM-Short UP:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；
[0025] 所述步骤5中第三轮5’-RACE的PCR引物对DsDGAT-5GSP2/UPM；3’-RACE的PCR引物对DsDGAT-3GSP2/UPM分别为：
[0026] SEQ ID.13：DsDGAT-5GSP2：5’-AGCGCAGCAGTGATGATAGG-3’；
[0027] SEQ ID.14：DsDGAT-3GSP2：5’-ACATTGTCTTCTGGCTAACC-3’；
[0028] 所述的UPM由UPM-Long UP和UPM-Short UP组成，具体如下：
[0029] SEQ ID.11：UPM-Long UP：
[0030] 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；
[0031] SEQ ID.12：UPM-Short UP:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’。
[0032] 进一步地，本发明所述步骤2中反转录杜氏盐藻总RNA为cDNA的反应体系：1uL总RNA、0.5uL反转录酶、1uLOligo dT引物、1.5uLdNTPs、2uL含Mg2+的10×PCR buffer、0.5uLRNase Inhibitor、添加ddH2O至20uL；
[0033] 所述步骤2中反转录杜氏盐藻总RNA为cDNA的扩增程序:50℃反转录30min，85℃变性5s；
[0034] 所述步骤2中第一轮PCR扩增的反应体系：1uL反转录反应产物，2uL含Mg2+的10×PCR buffer，2.5uLdNTPs，DsDGAT-1F和DsDGAT-1R引物各1uL，0.5U Taq酶0.3uL，添加ddH2O至20uL，在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第一轮PCR扩增；
[0036] 所述步骤4中第二轮扩增反应体系：2.5uL第一轮PCR反应产物，2×SeqAmpTMBuffer25uL，DsDGAT-5GSP1或DsDGAT-3GSP1引物1uL，10×UPM 5uL，SeqAmp DNAPolymerase 1uL，添加ddH2O至50uL；在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第二轮扩增；
[0037] 所述步骤4中第二轮扩增程序：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共25个循环；72℃延伸5min；
[0038] 所述步骤5中第三轮扩增反应体系：1uL第二轮扩增反应产物，2×SeqAmpTMBuffer25uL，DsDGAT-5GSP2或DsDGAT-3GSP2引物1uL，10×UPM 5uL，SeqAmp DNAPolymerase 1uL，添加ddH2O至50uL；在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第三轮扩增；
[0039] 所述步骤5中第三轮扩增程序：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共25个循环；72℃延伸5min。
[0040] 本发明杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因的应用，利用杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT相对表达水平指示其催化产物甘油三酯活性及其总脂含量的大小。
[0041] 本发明杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的应用，包括以下步骤：
[0042] 步骤1，取一株杜氏盐藻种，进行扩大培养，然后分别取三份藻液作为样本，三份藻液样本分别接入D.m培养基溶液中培养，其中D.m培养基中NaCl的浓度分别为3g/L，6g/L和20g/L，三份杜氏盐藻样本分别命名为低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS；
[0043] 步骤2，待低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS分别生长至第30,60和90天时，分别提取其总RNA后,反转录为cDNA；
[0044] 步骤3，根据SEQ ID NO.1序列信息，设计特异性引物扩增基因DsDGAT的开放性阅读框区ORF，引物信息如下：
[0045] 特异性引物对：
[0046] SEQ ID.15：Ds_F：5’-CAGCCATCGCCCGCACAGCGCA-3’
[0047] SEQ ID.16：Ds_R：5’-TCACGAGCTTGAGCCTTTGAG-3’
[0048] 步骤4，以杜氏盐藻18SrRNA为内参基因，荧光定量PCR法扩增上述三个培养周期的DsDGAT开放性阅读框区ORF，用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，配制qPCR反应体系，即反转录产物2uL，12.5uL 2×qPCR Mix，Ds_F和Ds_R引物各2uL，添加ddH2O至25uL，在AppliedBiosystems StepOnePlusTMReal-Time System荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，具体程序是，95℃预变性1min，95℃变性15s，58℃退火32s，收集荧光信号，共40个循环；72℃延伸20s，72℃延伸5min；溶解曲线分析：58℃-95℃；
[0049] 步骤5，对杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性进行测定；
[0050] 步骤6，对杜氏盐藻不同生长时期的总脂含量进行测定。
[0051] 进一步地，本发明步骤5中对杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性进行测定的具体步骤为：
[0052] 步骤5.1，取液：在无菌环境下分别提取低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS的藻液5mL；
[0053] 步骤5.2，上样：对步骤5.1中的三种藻液分别上样，具体为：在酶标板中分别设置空白孔、标准孔和测样孔，标准孔中加标样50uL,测样孔中先加标准样40uL,再加待测藻液10uL，轻轻混匀；
[0056] 步骤5.4，测定：每个标准孔和测样孔加终止液50uL，用紫外-可见光分光光度计检测450nm处OD值，重复三次，测定时长不超过15min，根据测定的二酰甘油酰基转移酶OD450值，绘制不同时间节点该酶活性曲线图，即完成对杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性进行测定。
[0057] 进一步地，本发明所述步骤6中对杜氏盐藻不同生长时期的总脂含量进行测定的具体步骤为：
[0058] 步骤6.1，分别取低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS的藻液各100mL，8000r/min离心5min后，ddH2O冲洗1次，再离心2min弃上清液；
[0059] 步骤6.2，每个离心管中都加入体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶液3mL，涡旋震荡2min充分混匀；加ddH2O至ddH2O与氯仿的体积比为1:0.9，混合液10000r/min离心5min，弃上清并收集下层含脂溶液，风干后分别称量每个离心管中的固态总脂重量；
[0060] 步骤6.3，比较杜氏盐藻不同生长周期的DsDGAT相对表达量，二酰甘油酰基转移酶活大小及总脂含量，从而获得不同盐浓度胁迫下的DsDGAT表达模式及其对二酰甘油酰基转移酶活性及脂类代谢的影响，根据不同样本在不同时期的总脂重量，绘制其总脂含量曲线图，即完成对杜氏盐藻不同生长时期的总脂含量进行测定。
[0061] 本发明克隆获得的杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT是调控盐藻甘油三脂代谢通路的重要开关，其核苷酸序列信息的公开及其应用将为丰富低等藻类植物DGAT基因及其编码蛋白信息，分子水平指示不同盐藻品系的产油富油能力，最终为优势特色藻株的工业化生产应用以及遗传定向改良植物耐盐品质提供理论与技术支持。
[0062] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0063] 1.本发明的基因DsDGAT核苷酸序列丰富了低等藻类植物的DGAT基因信息数据，相关研究人员可根据该信息及已设计的特异性引物对，对其部分(全部)区域进行特异性扩增；也可通过本发明预测的该基因编码蛋白氨基酸序列特征、结构及进化地位为低等藻类植物二酰甘油酰基转移酶的功能开发及应用奠定基础。
[0064] 2.本发明的基因DsDGAT独特的表达模式有利于藻类工作者优化控制杜氏盐藻的室内培养条件，缩短了高富油藻株的筛选周期。
[0065] 3.本发明的基因DsDGAT相对表达水平可间接指示杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性的高低，也可间接指示某杜氏属未知品系的脂类代谢水平及产油富油能力，便于高产油工业藻株的精准筛选，在工业、医疗、农业领域具有广泛的应用前景。
[0066] 4.本发明所用的基因克隆方法将转录组测序技术、分子克隆及生物信息技术相结合，在生物数据库中杜氏盐藻DGAT基因空白的情况下，通过转录组测序快速高效地捕获目的基因少量遗传信息，再通过生物信息联合分子克隆技术筛选阳性片段，设计特异性巢氏引物对，运用RACE法获得基因片段，通过生物信息技术拼接获得其全长cDNA序列，克隆方法较传统单一的同源克隆、遗传筛选、电子克隆等技术实验周期短、易操作、效率高，是一种可间接复制的基因克隆技术。
[0067] 5.本发明的公开的基因DsDGATqPCR技术可快速、间接地指示样本的二酰甘油酰基转移酶活性，适用于大量供试样本的初始筛选，较直接的酶活性检测技术实验周期短，阳性筛选率高，在很大程度上提高了工业高产油富油藻株的生产效率。附图说明
[0068] 图1是运城盐湖杜氏藻的显微形态；
[0069] 图2是运城盐湖杜氏藻的室内培养形态；
[0070] 图3是运城盐湖杜氏藻总RNA电泳检测图，M代表DNAmarker；
[0071] 图4是运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因扩增电泳检测图，M代表DNAmarker，其中图4a为第一轮核心片段扩增电泳图(1号泳道为空白对照)，图4b为第二轮5’和3’RACE扩增电泳图(1号泳道为5’RACE，2号泳道为3’RACE)，图4c为第三轮5’和3’RACE扩增电泳图(1号泳道为5’RACE，2号泳道为3’RACE)；
[0072] 图5是运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因编码蛋白亲/疏水性及其三级结构预测图，其中图5a的蛋白亲/疏水性预测图中，横坐标表示不同的氨基酸位点，纵坐标表示Hobob./Kyte&Doolittle评分值,评分值>0表示亲水，<0表示疏水，且分值越高，亲水性越强；图5b是运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因编码蛋白三级结构预测图；
[0073] 图6是运城盐湖杜氏藻DGAT氨基酸同源性及其蛋白保守性分析图；
[0074] 图7是运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因编码蛋白功能预测图；
[0076] 图9是运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因ORF区扩增及其qPCR表达，其中图9a是不同盐度胁迫下运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因ORF区在第60天的PCR扩增图；图9b是不同盐度胁迫下运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因qPCR表达，检测时间节点为培养至第30天，60天和90天；
[0077] 图10是不同盐度胁迫下运城盐湖杜氏藻的二酰甘油酰基转移酶活性，检测周期为0～90天；
[0078] 图11是不同盐度胁迫下运城盐湖杜氏藻的总脂含量，检测周期为0～90天。
具体实施方式
[0079] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0080] 本发明的二酰甘油酰基转移酶英文全称为Diacylgycerol Acyltransferase，简称为DGAT，酶编号为：EC2.3.1.20；杜氏盐藻全称为Dunaliella salina，该藻中的DGAT基因简称为DsDGAT。
[0082] 本发明中的RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
[0083] 本发明中的qPCR是Quantitative Real-time PCR的简称,也叫实时荧光定量PCR。
[0084] 实施例1
[0085] 一种杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT，所述基因DsDGAT的cDNA全长序列如SEQ ID NO.1所示，由2915个碱基组成；该SEQ ID NO.1序列编码区1644bp，SEQ ID NO.1序列5’端非编码区515bp，SEQ ID NO.1序列3’端非编码区756bp。
[0086] 实施例2
[0087] 一种杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT编码的蛋白质，该基因编码的蛋白质由547个氨基酸残基组成，分子量为62.55kDa，等电点为9.51，整体为亲水蛋白质，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
[0088] 实施例3
[0089] 本实施例中的杜氏盐藻采自山西运城盐湖，命名为Dunaliella_YC,镜检表明其符合典型的杜氏盐藻特征，细胞呈绿色或黄绿色，形态为圆形或椭圆形，有2条鞭毛，有一定的耐盐性，含油脂，其显微形态见图1。
[0090] 运城盐湖杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的克隆方法，所述方法包括以下步骤：
[0091] 步骤1，调整运城盐湖杜氏盐藻D.m培养基溶液的NaCl浓度为6g/L，外部光照强度为20000lx，温度为27℃，每个光周期光照16小时，静置培养60天，每10天定期镜检是否染菌，期间每20天补充新鲜培养基溶液至1000mL，其室内培养形态见图2，观察图2中藻液的颜色，藻体的形态，发现藻液均为绿色，未有其他颜色，其藻体形态均为绿色小球状，综合图1的镜检结果，确定其未染菌。
[0092] D.m培养基配方如下所示：
[0093] NaCl 6g，NaNO3 0.42g，NaH2PO4·2H2O 0.0156g，CaCl2·2H2O 0.044g，KCl 0.074g，MgSO4·7H2O 1.23g，NaHCO3 0.84g，FeC6H5O7 0.005g，pH 7.5，VB1 0.5mg，VB12
0.5mg，VH0.1g，H3BO3 286mg，MnCl2·4H2O 181mg，ZnSO4·7H2O 22.2mg，Na2MoO4·2H2O
39mg，CuSO4·5H2O 7.9mg，Co(NO3)2·6H2O 4.9mg，ddH2O补齐至1L。
0.5mg，VH0.1g，H3BO3 286mg，MnCl2·4H2O 181mg，ZnSO4·7H2O 22.2mg，Na2MoO4·2H2O
39mg，CuSO4·5H2O 7.9mg，Co(NO3)2·6H2O 4.9mg，ddH2O补齐至1L。
[0094] 步骤2，运城盐湖杜氏盐藻静置培养60天后，在4℃下，以8000r/min离心3min，弃上清，富集Dunaliella_YC细胞，液氮速冻后迅速研磨，速冻研磨后取1g样本加入1mLTrizol溶液，混匀震荡20s，室温静置15min后加入15uL氯仿再次混匀，室温静置2min后，在4℃下，以12000r/min离心15min，取其上清并加入600uL异丙醇，混匀后20℃沉降1.5h，在4℃下，以
12000r/min离心15min，弃上清后加入1mL75％的冰乙醇清洗沉淀(无水乙醇与水的体积比为3:4)，在4℃下，以6000r/min离心5min，弃上清后迅速风干，最后加入RNase-free Water溶解，质量百分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA，紫外-可见光分光光度计检测总RNA浓度(见图3和表1)，检测合格后-80℃超低温冰箱保存备用，并对Dunaliella_YC总RNA进行如下两方面的操作：一方面对运城盐湖杜氏盐藻总RNA进行转录组测序分析,并将转录组测序分析的数据与七大生物信息数据库(NR、NT、KEGG、GO、SwissProt、Pfam和KOG)进行比对，获得基因注释信息，从中筛选编码产物注释信息为二酰甘油酰基转移酶的序列片段，去重复后获得DsDGAT基因的部分序列片段如SEQ ID NO.3所示，由423个碱基组成；另一方面先反转录运城盐湖杜氏盐藻总RNA为cDNA，再以cDNA为模板，根据SEQ ID NO.3的序列信息设计上下游引物对DsDGAT的核心片段进行第一轮PCR扩增；
12000r/min离心15min，弃上清后加入1mL75％的冰乙醇清洗沉淀(无水乙醇与水的体积比为3:4)，在4℃下，以6000r/min离心5min，弃上清后迅速风干，最后加入RNase-free Water溶解，质量百分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA，紫外-可见光分光光度计检测总RNA浓度(见图3和表1)，检测合格后-80℃超低温冰箱保存备用，并对Dunaliella_YC总RNA进行如下两方面的操作：一方面对运城盐湖杜氏盐藻总RNA进行转录组测序分析,并将转录组测序分析的数据与七大生物信息数据库(NR、NT、KEGG、GO、SwissProt、Pfam和KOG)进行比对，获得基因注释信息，从中筛选编码产物注释信息为二酰甘油酰基转移酶的序列片段，去重复后获得DsDGAT基因的部分序列片段如SEQ ID NO.3所示，由423个碱基组成；另一方面先反转录运城盐湖杜氏盐藻总RNA为cDNA，再以cDNA为模板，根据SEQ ID NO.3的序列信息设计上下游引物对DsDGAT的核心片段进行第一轮PCR扩增；
[0095] 表1运城盐湖杜氏藻总RNA浓度检测
[0096]样品名称 浓度(ng/uL) OD260/OD280 OD260/OD230
Dunaliella_YC 154 1.99 1.95
Dunaliella_YC 154 1.99 1.95
[0097] 从表1可以看出OD260/OD280值介于1.8-2.2,OD260/OD230值接近2.0，同时由图3可以看出28S和18S条带清晰，表明提取的总RNA无蛋白污染，纯度较高，完整性较好。
[0098] 所述步骤2中反转录杜氏盐藻总RNA为cDNA的反应体系：1uL总RNA、0.5uL反转录酶、1uLOligo dT引物、1.5uLdNTPs、2uL含Mg2+的10×PCRbuffer、0.5uLRNase Inhibitor、添加ddH2O至20uL；
[0099] 所述步骤2中反转录杜氏盐藻总RNA为cDNA的扩增程序:50℃反转录30min，85℃变性5s；
[0100] 所述步骤2中第一轮PCR扩增的反应体系：1uL反转录反应产物，2uL含Mg2+的10×PCRbuffer，2.5uLdNTPs，DsDGAT-1F和DsDGAT-1R引物各1uL，0.5U Taq酶0.3uL，添加ddH2OTM至20uL，在Bio-Rad T100 PCR仪上进行第一轮PCR扩增；
[0101] 所述步骤2中第一轮PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min；PCR扩增体系如表2所示：
[0102] 表2运城盐湖杜氏藻基因DsDGAT核心片段第一轮PCR扩增体系
[0103]成分 剂量
2+
10×PCR buffer(含Mg ) 2uL
RT-PCR产物 1uL
DsDGAT-F(10uM) 1uL
DsDGAT-R(10uM) 1uL
dNTPs(200uM) 2.5uL
Taq酶(0.5U) 0.3uL
ddH2O Up to 20uL
2+
10×PCR buffer(含Mg ) 2uL
RT-PCR产物 1uL
DsDGAT-F(10uM) 1uL
DsDGAT-R(10uM) 1uL
dNTPs(200uM) 2.5uL
Taq酶(0.5U) 0.3uL
ddH2O Up to 20uL
[0104] 步骤3，对第一轮PCR扩增产物进行测序：使用质量分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测第一轮PCR扩增产物，其中1号泳道为空白对照，检测到在2号泳道3000bp、1000bp和750bp左右有条带(见图4a)，3000bp处的条带为阴性(其大小与核心片段SEQ ID NO.3不符)，琼脂糖凝胶回收后，进行测序，并将测序数据与SEQ ID NO.3比对，删除片段大小不一致及核苷酸比对率低于90％的阴性结果，保留核苷酸比对率高于90％的阳性结果，1000bp左右处的比对结果>99.9％，证明该处条带的扩增结果为阳性，750bp处为非特异扩增，阳性测序结果如SEQ ID NO.4所示；
[0105] 步骤4，以第一轮PCR扩增产物为模板，依据基因DsDGAT核心片段的阳性测序结果SEQ ID NO.4，设计引物，通过RACE法进行第二轮扩增，对基因DsDGAT的5’和3’端进行扩增，得到第二轮扩增产物；
[0106] 所述步骤4中第二轮5’-RACE的引物对DsDGAT-5GSP1/UPM，3’-RACE的PCR引物对DsDGAT-3GSP1/UPM分别为：
[0107] DsDGAT-5GSP1：5’-CGAGAAACCTTCCTCACCAG-3’；
[0108] DsDGAT-3GSP1：5’-AGAGCACATACACAAGCGCC-3’；
[0109] 所述的UPM由UPM-Long UP和UPM-Short UP组成，具体如下：
[0110] UPM-Long UP：
[0111] 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；
[0112] UPM-Short UP:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；
[0113] 所述步骤4中第二轮扩增反应体系：2.5uL第一轮PCR反应产物，2×SeqAmpTMBuffer25uL，DsDGAT-5GSP1或DsDGAT-3GSP1引物1uL，10×UPM 5uL，SeqAmp DNAPolymerase 1uL，添加ddH2O至50uL；在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第二轮扩增；
[0114] 所述步骤4中第二轮扩增程序：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共25个循环；72℃延伸5min，PCR扩增体系如表3所示：
[0115] 表3运城盐湖杜氏藻基因DsDGAT5’/3’RACE第二轮扩增体系
[0116]成分 剂量
核心片段阳性扩增产物 2.5uL
DsDGAT-5GSP1(10uM)/DsDGAT-3GSP1(10uM) 1uL
10×UPM(含UPM-Long UP/UPM-Short UP) 5uL
2×SeqAmpTMBuffer 25uL
SeqAmp DNA Polymerase 1uL
ddH2O Up to 50uL
核心片段阳性扩增产物 2.5uL
DsDGAT-5GSP1(10uM)/DsDGAT-3GSP1(10uM) 1uL
10×UPM(含UPM-Long UP/UPM-Short UP) 5uL
2×SeqAmpTMBuffer 25uL
SeqAmp DNA Polymerase 1uL
ddH2O Up to 50uL
[0117] 5’和3’RACE第二轮扩增结果检测：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测到1号泳道的5’RACE结果非特异扩增条件较多，2号泳道的3’RACE结果无特异性扩增产物(图4b)。基于此结果，仍需要进行第三轮的5’和3’RACE扩增。
[0118] 步骤5，对步骤4中得到的扩增产物，用RACE法进行第三轮扩增，最终获得基因DsDGAT的5’和3’端核苷酸序列信息，第三轮PCR的5’RACE阳性测序结果如SEQ ID NO.5所示，由1348个碱基组成；第三轮PCR的3’RACE阳性测序结果如SEQ ID NO.6所示，由1011个碱基组成；PCR扩增体系如表4所示：
[0119] 表4运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因5’/3’RACE第三轮扩增体系
[0120]
[0121]
[0122] 5’和3’RACE第三轮扩增结果检测验证：使用质量分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测到1号泳道的5’RACE约1500bp处有清晰的特异性扩增条带，2号泳道的3’RACE约1000bp处有清晰的特异性扩增条带(图4c)，将这两个条带胶回收后，送生工公司测序，将测序数据分别与本发明的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6比对，数据比对结果均>99.8％，证明这两处条带的扩增结果为阳性。
[0123] 所述步骤5中第三轮5’-RACE的PCR引物对DsDGAT-5GSP2/UPM；3’-RACE的PCR引物对DsDGAT-3GSP2/UPM分别为：
[0124] DsDGAT-5GSP2：5’-AGCGCAGCAGTGATGATAGG-3’；
[0125] DsDGAT-3GSP2：5’-ACATTGTCTTCTGGCTAACC-3’；
[0126] 所述的UPM由UPM-Long UP和UPM-Short UP组成，具体如下：
[0127] UPM-Long UP:
[0128] 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；
[0129] UPM-Short UP:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’。
[0130] 所述步骤5中第三轮扩增反应体系：1uL第二轮扩增反应产物，2×TM
SeqAmp Buffer25uL，DsDGAT-5GSP2或DsDGAT-3GSP2引物1uL，10×UPM 5uL，SeqAmp DNA Polymerase 1uL，添加ddH2O至50uL；在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第三轮扩增；
SeqAmp Buffer25uL，DsDGAT-5GSP2或DsDGAT-3GSP2引物1uL，10×UPM 5uL，SeqAmp DNA Polymerase 1uL，添加ddH2O至50uL；在Bio-Rad T100TMPCR仪上进行第三轮扩增；
[0131] 所述步骤5中第三轮扩增程序：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共25个循环；72℃延伸5min。
[0132] 步骤6，将SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID.6所得序列碱基进行拼接，去除引物接头序列后获得杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT的cDNA全长，如SEQ ID NO.1所示，其cDNA全长2915bp，分子量918.64KDa，516bp处为启动密码，2157bp处为终止密码，该实例证明所获得的运城盐湖杜氏藻DsDGAT的真实性。
[0133] 运城盐湖杜氏藻DsDGAT编码蛋白特征分析：
[0134] 将本实施例获得的运城盐湖杜氏藻DsDGAT核苷酸序列在ORFinder上检索，获取可靠的ORF区信息数据，用以下步骤对其编码蛋白特征进行分析：
[0135] 1.用DNAMAN软件将该藻DsDGAT的ORF区碱基转换为对应氨基酸序列，将氨基酸数据导入ExPASy在线分析软件，计算得到该蛋白的基本信息数据(见表5)，将氨基酸数据载入Protscale软件，获得预测蛋白的亲疏水性(图5a)。
[0136] 将运城盐湖杜氏盐藻DsDGAT编码蛋白氨基酸序列载入Swiss-model软件，默认软件各项参数值，在线预测该蛋白的三级结构(图5b)。
[0137] 表5运城盐湖杜氏藻DGAT编码蛋白基本信息
[0138]
[0139] 由图5a和表5可知DGAT蛋白的亲/疏水性评分值>0，表面该预测蛋白整体为亲水性蛋白。从图5b中可以看出DGAT蛋白的三级预测结构包含典型的α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲构件。
[0140] 2.用Clustal X联合BLASTp软件，将运城盐湖杜氏藻DsDGAT编码氨基酸数据载入，默认各项指标参数，运算获得该蛋白的氨基酸同源比对结果，不同植物间高度保守的DGAT蛋白同源比对见图6a，该蛋白的保守区见图6b。其中图6a是15种不同植物物种间DGAT基因编码蛋白氨基酸同源比对图，由比对结果可知，各物种DGAT氨基酸长度不一，上游差异较大，从上到下的比对物种分别为：Dunaliella salina、Chlorella vulgaris、Chromochloriszofingiensis、Chlorella sorokiniana、Auxenochlorella protothecoides、Raphidocelis subcapitata、Abrus precatorius、Lactuca sativa、Citrus clementina、Capsicum chinense、Arachis hypogaea、Prunus persica、Brassica napus、Glycine max、Arabidopsis thaliana；图6b是运城盐湖杜氏藻DsDGAT编码蛋白保守性预测图，285～525bp的区域与ARE1和MBOAT两个已知蛋白高度保守，75～525bp区域预测为潜在的MBOAT蛋白超家族，该家族包括DGAT1、LPLAT、GUP及MBOAT-1四类蛋白；
[0141] 3.将上述氨基酸比对结果载入EMBL-Swissprot数据库，默认各指标参数，预测获得该蛋白的潜在功能(图7)，E-value值越小表示蛋白功能预测可信度越高，由图7可知，DsDGAT基因编码蛋白的E-value值在4.6E-121～8.0E-41，该蛋白的功能预测为二酰甘油酰基转移酶，表明该预测蛋白极可能为该类酶；
[0142] 4.将上述氨基酸比对结果载入MEGA 5.0软件，随机选择包括运城盐湖杜氏藻在内的17个植物物种，默认各指标参数，用NJ算法分析不同植物物种间DGAT的系统进化关系，构建其系统进化树(图8)。图8中各分支上的数字代表支持率，分支长短代表遗传距离远近；图8中17种植物的DGAT可划分为两大簇，第一簇包含运城盐湖杜氏藻在内的7种低等植物，第二簇包括10种高等植物，显示了DGAT的系统进化与其物种进化地位的相似性特征。
[0143] 5.本实施例中运城盐湖杜氏藻DsDGAT编码蛋白的基础数据与本发明已获得杜氏盐藻DsDGAT编码蛋白数据基本一致，预测蛋白整体为亲水性蛋白质，预测获得该蛋白的模拟三级结构图。该蛋白的氨基酸序列保守性不高，上游序列多态性明显，中下游序列保守性较高，少数区域保守性极高。预测获得该蛋白的三个保守区和一个超蛋白家族区，预测该蛋白的功能与二酰甘油酰基转移酶高度一致，低等植物间该蛋白的系统进化距离较近。上述实例特征再次证明了运城盐湖杜氏藻DsDGAT序列的真实性，预测的编码蛋白产物极可能是二酰甘油酰基转移酶。
[0144] 实施例4
[0145] 本实施例为不同盐度胁迫下的运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因表达模式及与二酰甘油酰基转移酶活性及总脂含量的相关性。
[0146] 杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因的应用，利用杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因DsDGAT表达水平指示其催化产物甘油三酯活性及其总脂含量的大小。
[0147] 本实施例杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶基因的应用包括以下步骤：
[0148] 步骤1，取一株运城盐湖杜氏盐藻种，进行扩大培养，然后分别取三份藻液作为样本，三份藻液样本分别接入D.m培养基溶液中培养，其中D.m培养基中NaCl的浓度分别为3g/L，6g/L和20g/L，三份杜氏盐藻样本分别命名为低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS；
[0149] 步骤2，待低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS分别生长至第30,60和90天时，使用Trizol法分别提取低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS样本的总RNA，按照RT-PCR方法将总RNA反转录成cDNA，RT-PCR反应条件为：50℃反转录30min，85℃变性5s，反转录体系如表6所示：
[0150] 表6运城盐湖杜氏藻总RNA反转录体系
[0151]成分 剂量
总RNA 1uL
10×PCR buffer(含Mg2+) 2uL
M-MLV反转录酶(200U) 0.5uL
Oligo dT(100uM) 1uL
dNTPs(200uM) 1.5uL
RNase Inhibitor 0.5uL
RNase-free ddH2O Up to 20uL
总RNA 1uL
10×PCR buffer(含Mg2+) 2uL
M-MLV反转录酶(200U) 0.5uL
Oligo dT(100uM) 1uL
dNTPs(200uM) 1.5uL
RNase Inhibitor 0.5uL
RNase-free ddH2O Up to 20uL
[0152] 步骤3，根据SEQ ID NO.1序列信息，设计特异性引物扩增DsDGAT的开放性阅读框区ORF，引物信息如下：
[0153] 特异性引物对：
[0154] Ds_F：5’-CAGCCATCGCCCGCACAGCGCA-3’
[0155] Ds_R：5’-TCACGAGCTTGAGCCTTTGAG-3’
[0156] 步骤4，以运城盐湖杜氏盐藻18SrRNA为内参基因，荧光定量PCR法(qPCR)扩增上述三个培养周期的DsDGAT开放性阅读框区ORF，如表7，用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，配制qPCR反应体系，即RT-PCR产物2uL，12.5uL 2×qPCR Mix，其中Mix中含PCRbuffer，dNTPs及Taq酶，Ds_F和Ds_R引物各2uL，添加ddH2O至25uL，在Applied Biosystems StepOnePlusTMReal-Time System荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，具体程序是，95℃预变性1min，95℃变性15s，58℃退火32s，收集荧光信号，共40个循环；72℃延伸20s，72℃延伸
5min；溶解曲线分析：58℃-95℃，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带(见图9a)，发现在约1500bp处有清晰的特异性条带，胶回收，送生工公司测序，与SEQ NO.1比对后获得>
99.0％的相似性，验证了扩增结果的准确性。再用2-ΔΔCT法分别检测三个时间节点DsDGAT的相对表达量(见图9b)；
5min；溶解曲线分析：58℃-95℃，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带(见图9a)，发现在约1500bp处有清晰的特异性条带，胶回收，送生工公司测序，与SEQ NO.1比对后获得>
99.0％的相似性，验证了扩增结果的准确性。再用2-ΔΔCT法分别检测三个时间节点DsDGAT的相对表达量(见图9b)；
[0157] 表7运城盐湖杜氏藻DsDGAT qPCR反应体系
[0158]成分 剂量
RT-PCR产物 2uL
2×qPCR Mix 12.5uL
Ds_YC_F(10uM) 2uL
Ds_YC_R(10uM) 2uL
ddH2O Up to 25uL
RT-PCR产物 2uL
2×qPCR Mix 12.5uL
Ds_YC_F(10uM) 2uL
Ds_YC_R(10uM) 2uL
ddH2O Up to 25uL
[0159] 步骤5，对运城盐湖杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性进行测定，具体如下：
[0160] 步骤5.1，取液：在无菌环境下分别提取低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS的藻液5mL；
[0161] 步骤5.2，上样：对步骤5.1中的三种藻液分别上样，具体为：在酶标板中分别设置空白孔、标准孔和测样孔，标准孔中加标样50uL,测样孔中先加标准样40uL,再加待测藻液10uL，轻轻混匀；
[0162] 步骤5.3，封膜洗涤：将所有的标准孔和测样孔封膜后37℃温育30min，加入稀释30倍的浓缩洗涤液，洗涤30s后弃液，风干10min；
[0163] 步骤5.4，显色：风干后每个标准孔和测样孔加入酶标试剂50uL，再分别加入50uL显色剂A,50uL显色剂B,混匀后37℃避光显色10min；
[0164] 步骤5.4，测定：每个标准孔和测样孔加终止液50uL，用紫外-可见光分光光度计检测450nm处OD值，重复三次，测定时长不超过15min，根据测定的OD450值，绘制不同时间节点该酶活性曲线图(见图10)，即完成对运城盐湖杜氏盐藻二酰甘油酰基转移酶活性进行测定；
[0165] 由图10可知，运城盐湖杜氏藻LS的OD450值最高为0.9±0.01，增速较缓；运城盐湖杜氏藻MS的OD450值最高为2.3±0.09，增速较快，在30-40天的区间内发生轻微波动；运城盐湖杜氏藻HS的OD450值最高为1.8±0.05，增速较快，但在45-90天的区间内发生较大波动。OD450值的大小反映了二酰甘油酰基转移酶活性的高低，以上结果表明，第30，60和90天的酶活顺序由高到低均为：MS>HS>LS，盐藻MS的酶活性整体高于低盐藻LS和高盐藻HS。
[0166] 步骤6，对运城盐湖杜氏盐藻不同生长时期的总脂含量进行测定。
[0167] 步骤6.1，分别取低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS的藻液各100mL，8000r/min离心5min后，ddH2O冲洗1次，再离心2min弃上清液；
[0168] 步骤6.2，每个离心管中都加入体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶液3mL，涡旋震荡2min充分混匀；加ddH2O至ddH2O与氯仿的体积比为1:0.9，混合液10000r/min离心5min，弃上清并收集下层含脂溶液，风干后分别称量每个离心管中的固态总脂重量；
[0169] 步骤6.3，比较杜氏盐藻不同生长周期的DsDGAT基因相对表达量，二酰甘油酰基转移酶活大小及总脂含量，从而获得不同盐浓度胁迫下的DsDGAT基因表达模式及其对二酰甘油酰基转移酶活性及脂类代谢的影响，根据不同样本在不同时期的总脂重量，绘制其总脂含量曲线图(见图11)，即完成对运城盐湖杜氏盐藻不同生长时期的总脂含量进行测定。
[0170] 由图11可知，运城盐湖杜氏藻LS的总脂含量最高为1.2±0.02g/L，增速较缓；运城盐湖杜氏藻MS的总脂含量最高为2.9±0.06g/L，增速较快；运城盐湖杜氏藻HS的总脂含量最高为2.3±0.04g/L，增速最快。第30，60和90天的总脂含量顺序由高到低均为：MS>HS>LS，盐藻MS的总脂积累量高于低盐藻LS和高盐藻HS。
[0171] 本实施例结果显示：低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS三个样本的DsDGAT基因表达模式均为：随着外界盐浓度的增加基因的表达先升高后降低，60天左右各样本中该基因的表达量最高，相较低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS的表达量最高；低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS三个样本的二酰甘油酰基转移酶活性随时间推移整体增加，到第60～75天后趋于平稳，其中中盐度胁迫下的酶活性最强。随着培养时间的增加，低盐藻LS、中盐藻MS和高盐藻HS三个样本的总脂累积量逐渐增加，其中中盐藻MS样本的总脂积累量最大，高盐藻HS的油脂累积速率最快。
[0172] 本实施例结果表明：运城盐湖杜氏藻DsDGAT基因的表达水平与二酰甘油酰基转移酶活性及其总脂含量正相关，中盐度(6g/LNaCl)的胁迫环境有利于杜氏藻油脂的积累，60天左右杜氏藻脂类代谢水平最旺盛，该时间节点可用于高产油藻株的筛选。
[0173] 利用DsDGAT基因相对表达水平筛选高富油盐藻藻株：
[0174] 基于实例4表明的DsDGAT基因表达量与藻细胞总脂含量的正相关性特征，我们利用中盐度(NaCl：6g/L)胁迫不同来源的杜氏藻株，并在第60天检测其DsDGAT基因的相对表达量，以此来筛选高富油藻株，并通过测定总脂含量对其进行验证，具体步骤如下：
[0175] 步骤1，搜集来自不同来源的杜氏藻样本20例，D.m培养基配方配制培养液，其中NaCl浓度为6g/L，光照静置培养。
[0176] 步骤2，测定培养至第60天时各杜氏藻DsDGAT基因的相对表达量，筛选基因表达量最高的藻株D.salina_SHU作为候选高富油藻株(见表8)。
[0177] 步骤3，测定培养至第60天时各杜氏藻的总脂含量，检测到的高富油藻株D.salina_SHU与步骤的筛选结果一致(见表8)，初步验证本实例操作的可行性。
[0178] 继续培养至各藻株的总脂含量不再升高，D.salina_SHU同样为最高富油藻株；监测各品系的培育周期可知，高富油藻株筛选的平均周期为85.1天，较本发明利用DsDGAT基因表达量差异的指示时间平均缩短了25.1天，再次证实本实例的可行性。
[0179] 本实施例的结果显示，在盐藻富油能力未知的前提下，通过设定以下优化的室内培养条件，即：D.m培养基，6g/LNaCl盐度，光照静置培养60天，每个光周期光照16小时，光强度20000lx，温度控制在25±5℃，通过检测DsDGAT基因的相对表达量可以间接判断某一杜氏藻株是否为高富油品系，获得的高富油特色杜氏藻品系筛选周期平均缩短25.1天，大大提高了其工业生产效率。
[0180] 表8 20株杜氏藻DsDGAT基因相对表达量、总脂含量及培育周期
[0181]
[0182]
[0183] 注：藻株名称加粗并标注*的为本实例筛选到的高富油杜氏藻品系
[0184] 序列信息表：
[0185] SEQ ID NO.1：
[0186] gagtaaaataaaatattggtaggagccagagtttaaatcgaaatgagcttgatgtaaaattgggggcacattctttgatgtggcccttcaagcccacacagagaggaggtggaaaggcacccagctcctctgtaagtttggccgaggatctgtacagatggaagagcgacccttgtctgcccctctctggtccaaactgggaggagacatttgttctgctgcagggtacatgcttaaggttctacaaaagcaagctggacgttggattttcaccgcgggaggagctcgatatcaaggggtgtgcagtggattaccagggcagcgagttaaaggagtttgtggtgatctcgattaaggatgcaggcgggagcacacttgtccggctggcttctgaacaccagccagtggctttgaagtggatgtgtgtgctgctggctgcaagcaccaggcctactgcttcatcattgcaggagctagcgtcacacgcagcccacattgctggagcacaagaggagatggggcagccatcgcccgcacagcgcagctccaatggagacagctacaaacaaggggggggcaggccacgcaggaagcaagttcaaaaagtggaggacagggatgggacaagctactccagccagtcagagggattgaaggagggggtggagcaggaagagctaggagagcaagagaggcagaaagcaagtgcccggaggcatgaacctatgagtgggagcagcccggttcatgtggtggcaaggccctcctacttgtcctccgaacgcatgtggtatgaaaagcacacggggctggtgaacctcatggcagtgattgtggtggcaacaaacttccgtctagcgctggagaatgcttttaagtatgggctgcgcatccagactcctttaagagcgctgaattccctgactattggaaacccaaacatccctctggctctgtgctacccctgtatgcttttgatagccctctcagcactcttttttgagcaatgcggcgcctggagcttgaaatcggatgcccagctcaaggccgcaatttccaagaagattgatgggagcagagcctcctaccaacagctcactcacaagctgtcctcacgcgtgtcaagattcgagtgggtgctgtttgtggcaaacttggtgaacaccagtgcggctgtagttgtcccttgggcagttatacactacacacaggcagagcctctcccgggcggggtactgatagccgtgtccattgtgctttggatgaagcttgtatcctatcatcactgctgcgctgacttgcgcgcagctcgtaggaatgggcaggttcgccctggtgaggaaggtttctcgggtgactcgtcattgaccaatcaaaagtcaagccaacgcctgctccgctaccctgaaaatgtcacagtttccaatctcatctactttcttgcgctgcccacgctctgctaccagatcaattatcctcggagccccaccatccgcaagcgctggctggcgcgtcgagtggcggagctggttctcatgcttaccttgctgtccctgctgctccagcagtacatgatccctgcaatctccaattccatgagccctatgcgcacgatggactggcctcgtctgtgtgagagggtgcttaagcttgcgctgccaaacatttactgctggttggtatctttctattgcttgttccatttatggctgaacatcgtagcagaggtgctccattttggcgacagggaattttacaaggactggtggaacgctgcgactgtgggcgagtactggaaattgtggaacatgccagtgcataagtggctgttgaggcatgtgtacttccccacgctcaggctcggtctgcccaggtgggcatctatcatactggtcttttttgtgagcgccgtctttcatgagttagtccttggagtacccttgcacttggtgcgcatgtgggcgtttttgggcatcatgctgcaagtgcccctggtgcttattacagagcacatacacaagcgccttaaacgtgacgaagcaggcaacattgtcttctggctaaccttttgtgttgttgggcaaccactgtccgttctgctttactaccacgactacttgtatgaggtgcatccttacctcaaaggctcaagctcgtgatcttagacctggctctcactcgcctctgctttgtggaaaacaatcttcatctgtatgtgattgctgcatatgctatgcaatatagccctcacgtcgagagtatgttggcatggccgttcacctggggcatggaaccgagattgatctgcgtttcccttactggctggggtttgttgacctcttatggcaatcagcctgaatttcaagagcatcagcggctctttgtccttttgttgcatgcccctcatgctggcacctgcccagtttaattttgataagaagtatatgataaccagctggaaaaaagtgtgcacttagtagggaacagtcaggtttactctgggtattagctcacccaggctgatatgcaccattcatgcgtaacaaagcaacacaattgaaagcctgatgcacgacctattacatttttatttgacacactcaatggtttaatggaggtcttttttgggggggggcgatttgatttaaacatggggcaataagggattcgtttgattttaagtgccatcaggggcgtctttcttgcatttcaatttttattaatccaatcgtactgtgttgagtcacaccgtcttggcaattgctgatgaggggagctctgcaaacttggtatcgacttcatcatcctatccagggatctgaagaagaggttgaccgctgttgccggcttgctgctccatgaatatcaggaggttctgtaagaggtgctttaattctaaaaaaaaaaaaaaaaaa
[0187] SEQ ID NO.2：
[0188] Met Gly Gln Pro Ser Pro Ala Gln Arg Ser Ser Asn Gly Asp Ser Tyr[0189] Lys Gln Gly Gly Gly Arg Pro Arg Arg Lys Gln Val Gln Lys Val Glu[0190] Asp Arg Asp Gly Thr Ser Tyr Ser Ser Gln Ser Glu Gly Leu Lys Glu[0191] Gly Val Glu Gln Glu Glu Leu Gly Glu Gln Glu Arg Gln Lys Ala Ser[0192] Ala Arg Arg His Glu Pro Met Ser Gly Ser Ser Pro Val His Val Val[0193] Ala Arg Pro Ser Tyr Leu Ser Ser Glu Arg Met Trp Tyr Glu Lys His[0194] Thr Gly Leu Val Asn Leu Met Ala Val Ile Val Val Ala Thr Asn Phe[0195] Arg Leu Ala Leu Glu Asn Ala Phe Lys Tyr Gly Leu Arg Ile Gln Thr[0196] Pro Leu Arg Ala Leu Asn Ser Leu Thr Ile Gly Asn Pro Asn Ile Pro[0197] Leu Ala Leu Cys Tyr Pro Cys Met Leu Leu Ile Ala Leu Ser Ala Leu[0198] Phe Phe Glu Gln Cys Gly Ala Trp Ser Leu Lys Ser Asp Ala Gln Leu[0199] Lys Ala Ala Ile Ser Lys Lys Ile Asp Gly Ser Arg Ala Ser Tyr Gln[0200] Gln Leu Thr His Lys Leu Ser Ser Arg Val Ser Arg Phe Glu Trp Val[0201] Leu Phe Val Ala Asn Leu Val Asn Thr Ser Ala Ala Val Val Val Pro[0202] Trp Ala Val Ile His Tyr Thr Gln Ala Glu Pro Leu Pro Gly Gly Val[0203] Leu Ile Ala Val Ser Ile Val Leu Trp Met Lys Leu Val Ser Tyr His[0204] His Cys Cys Ala Asp Leu Arg Ala Ala Arg Arg Asn Gly Gln Val Arg[0205] Pro Gly Glu Glu Gly Phe Ser Gly Asp Ser Ser Leu Thr Asn Gln Lys[0206] Ser Ser Gln Arg Leu Leu Arg Tyr Pro Glu Asn Val Thr Val Ser Asn[0207] Leu Ile Tyr Phe Leu Ala Leu Pro Thr Leu Cys Tyr Gln Ile Asn Tyr[0208] Pro Arg Ser Pro Thr Ile Arg Lys Arg Trp Leu Ala Arg Arg Val Ala[0209] Glu Leu Val Leu Met Leu Thr Leu Leu Ser Leu Leu Leu Gln Gln Tyr[0210] Met Ile Pro Ala Ile Ser Asn Ser Met Ser Pro Met Arg Thr Met Asp[0211] Trp Pro Arg Leu Cys Glu Arg Val Leu Lys Leu Ala Leu Pro Asn Ile[0212] Tyr Cys Trp Leu Val Ser Phe Tyr Cys Leu Phe His Leu Trp Leu Asn[0213] Ile Val Ala Glu Val Leu His Phe Gly Asp Arg Glu Phe Tyr Lys Asp[0214] Trp Trp Asn Ala Ala Thr Val Gly Glu Tyr Trp Lys Leu Trp Asn Met[0215] Pro Val His Lys Trp Leu Leu Arg His Val Tyr Phe Pro Thr Leu Arg[0216] Leu Gly Leu Pro Arg Trp Ala Ser Ile Ile Leu Val Phe Phe Val Ser[0217] Ala Val Phe His Glu Leu Val Leu Gly Val Pro Leu His Leu Val Arg[0218] Met Trp Ala Phe Leu Gly Ile Met Leu Gln Val Pro Leu Val Leu Ile[0219] Thr Glu His Ile His Lys Arg Leu Lys Arg Asp Glu Ala Gly Asn Ile[0220] Val Phe Trp Leu Thr Phe Cys Val Val Gly Gln Pro Leu Ser Val Leu[0221] Leu Tyr Tyr His Asp Tyr Leu Tyr Glu Val His Pro Tyr Leu Lys Gly[0222] Ser Ser Ser
[0223] SEQ ID NO.3：
[0224] gcctgcagcgcgggacaagaacaagggagcaccgacagattcctgatcaacactgaggtccatgacccagaaagaggcttggacagtggcattcagatgcaagaggatggagacatcacggtgcccctcaccagccttggcttgatgtgccacaggggctggcggagtaagcgcctgaaccctgcaggaatgcgcatagtatccagggagtacaagcatgtgcaagtgcctcagaatttgctgagcaatccgcggggccctgcctcggcgcagcatgtcgacatcctgggaaacgaggaaatgctgtcagatgtgctgcgtgtggcaacagggcatggagatgaggttcgggataggatagtttctcggatcgatgaaattgcaaacaacatagattttgaagatcctgatggatgggaatag
[0225] SEQ ID NO.4：
[0226] ggaactactatagggcgattgagctgcccttacagatagtggttgcccaacaacacaaaaggttagccagaagacaatgttgcctgcttcgtcacgtttaaggcgcttgtgtatgtgctctgtaataagcaccaggggcacttgcagcatgatgcccaaaaacgcccacatgcgcaccaagtgcaagggtactccaaggactaactcatgaaagacggcgctcacaaaaaagaccagtatgatagatgcccacctgggcagaccgagcctgagcgtggggaagtacacatgcctcaacagccacttatgcactggcatgttccacaatttccagtactcgcccacagtcgcagcgttccaccagtccttgtaaaattccctgtcgccaaaatggagcacctctgctacgatgttcagccataaatggaacaagcaatagaaagataccaaccagcagtaaatgtttggcagcgcaagcttaagcaccctctcacacagacgaggccagtccatcgtgcgcatagggctcatggaattggagattgcagggatcatgtactgctggagcagcagggacagcaaggtaagcatgagaaccagctccgccactcgacgcgccagccagcgcttgcggatggtggggctccgaggataattgatctggtagcagagcgtgggcagcgcaagaaagtagatgagattggaaactgtgacattttcagggtagcggagcaggcgttggcttgacttttgattggtcaatgacgagtcacccgagaaaccttcctcaccagggcgaacctgcccattcctacgagctgcgcgcaagtcagcgcagcagtgatgataggatacaagctgcatccaaagcacaaagggcagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaatttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgatcggcacgcgcggggagaggcggtttgcgtatgggcgctcttcgctcctcgcctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctggcggcgagcggtattcag
[0227] SEQ ID NO.5：
[0228] ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagtacatgggggagtaaaataaaatattggtaggagccagagtttaaatcgaaatgagcttgatgtaaaattgggggcacattctttgatgtggcccttcaagcccacacagagaggaggtggaaaggcacccagctcctctgtaagtttggccgaggatctgtacagatggaagagcgacccttgtctgcccctctctggtccaaactgggaggagacatttgttctgctgcagggtacatgcttaaggttctacaaaagcaagctggacgttggattttcaccgcgggaggagctcgatatcaaggggtgtgcagtggattaccagggcagcgagttaaaggagtttgtggtgatctcgattaaggatgcaggcgggagcacacttgtccggctggcttctgaacaccagccagtggctttgaagtggatgtgtgtgctgctggctgcaagcaccaggcctactgcttcatcattgcaggagctagcgtcacacgccgcccacattgctggagcacaagaggagatggggcagccatcgcccgcacagcgcagctccaatggagacagctacaaacaaggggggggcaggccacgcaggaagcaagttcaaaaagtggaggacagggatgggacaagctactccagccagtcagagggattgaaggagggggtggagcaggaagagctaggagagcaagagaggcagaaagcaagtgcccggaggcatgaacctatgagtgggagcagcccggttcatgtggtggcaaggccctcctacttgtcctccgaacgcatgtggtatgaaaagcacacggggctggtgaacctcatggcagtgattgtggtggcaacaaacttccgtctagcgctggagaatgcttttaagtatgggctgcgcatccagactcctttaagagcgctgaattccctgactattggaaacccaaacatccctctggctctgtgctacccctgtatgcttttgatagccctctcagcactcttttttgagcaatgcggcgcctggagcttgaaatcggatgcccagctcaaggccgcaatttccaagaagattgatgggagcagagcctcctaccaacagctcactcacaagctgtcctcacgcgtgtcaagattcgagtgggtgctgtttgtggcaaacttggtgaacaccagtgcggctgtagttgtcccttgggcagttatacactacacacaggcagagcctctcccgggcggggtactgatagccgtgtccattgtgctttggatgaagcttgtatcctatcatcactgctgcgct
[0229] SEQ ID NO.6：
[0230] acgcccagggtttttcccagtcccggacgttgtaaaacgacggcccagtgaatttgtaatacgactccattataagggcgaattgaagctgcccttacattgtcttctggctaccttttgtgttgttgggcaaccactgtccgttctgctttactaccacgactacttgtatgaggtgcatccttacctcaaaggctcaagctcgtgatcttagacctggctctcactcgcctctgctttgtggaaaacaatcttcatctgtatgtgattgctgcatatgctatgcaatatagccctcacgtcgagagtatgttggcatggccgttcacctggggcatggaaccgagattgatctgcgtttcccttactggctggggtttgttgacctcttatggcaatcagcctgaatttcaagagcatcagcggctctttgtccttttgttgcatgcccctcatgctggcacctgcccagtttaattttgataagaagtatatgataaccagctggaaaaaagtgtgcacttaatagggaacagtcaggtttactctgggtattagctcacccaggctgatatgcaccattcatgcgtaacaaagcaacacaattgaaagcctgatgcacgacctattacatttttatttgacacactcaatggtttaatggaggtcttttttgggggggggcgatttgatttaaacatggggcaataagggattcgtttgattttaagtgccatcaggggcgtctttcttgcatttcaatttttattaatccaatcgtactgtgttgagtcacaccgtcttggcaattgctgatgaggggagctctgcaaacttggtatcgacttcatcatcctatccagggatctgaagaagaggttgaccgctgttgccggcttgctgctccatgaatatcaggaggttctgtaagaggtgctttaataaaaaaaaaaaaaaaaaataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtactctgcgttgataccact
[0231] SEQ ID.7：
[0232] DsDGAT-1F：5’-tgtgctttggatgcagcttg-3’
[0233] SEQ ID.8：
[0234] DsDGAT-1R：5’-acagatagtggttgcccaac-3’
[0235] SEQ ID.9：
[0236] DsDGAT-5GSP1：5’-cgagaaaccttcctcaccag-3’
[0237] SEQ ID.10：
[0238] DsDGAT-3GSP1：5’-agagcacatacacaagcgcc-3’
[0239] SEQ ID.11：
[0240] UPM-Long UP：5’-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3’[0241] SEQ ID.12：
[0242] UPM-Short UP:5’-ctaatacgactcactatagggc-3’
[0243] SEQ ID.13：
[0244] DsDGAT-5GSP2：5’-agcgcagcagtgatgatagg-3’
[0245] SEQ ID.14：
[0246] DsDGAT-3GSP2：5’-acattgtcttctggctaacc-3’
[0247] SEQ ID.15：
[0248] Ds_F：5’-cagccatcgcccgcacagcgca-3’
[0249] SEQ ID.16：
[0250] Ds_R：5’-tcacgagcttgagcctttgag-3’。
[0251] 本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施例仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的检测方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
[0252] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0253] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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