一种植物抗逆锌指蛋白及其编码基因与应用
阅读：255发布：2020-10-04
专利汇可以提供一种植物抗逆锌指蛋白及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 植物 抗逆锌指蛋白及其编码基因与应用。该植物抗逆锌指蛋白，是如下(a)或(b)的 蛋白质 ：(a)由 序列表 中序列2的 氨 基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。将该植物抗逆锌指蛋白的编码基因导入植物中，可提高植物对各种非 生物 胁迫逆境的抗性。，下面是一种植物抗逆锌指蛋白及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1、植物抗逆锌指蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。
2、根据权利要求1所述的植物抗逆锌指蛋白，其特征在于：所述植物抗逆锌 指蛋白是由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质。
3、权利要求1或2所述的植物抗逆锌指蛋白的编码基因。
4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述植物抗逆锌指蛋白编码基 因，其核苷酸序列是编码序列表中序列2的蛋白质的多核苷酸。
5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述植物抗逆锌指蛋白编码基 因的编码序列为序列表中序列1的自5′端第1355位至1852位脱氧核苷酸组成的核 苷酸序列。
6、根据权利要求3、4或5所述的基因，其特征在于：所述植物抗逆锌指蛋 白编码基因，为如下1)或2)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物抗逆性相关的蛋白 质的DNA分子。
7、含有权利要求3至6中任一所述的植物抗逆锌指蛋白编码基因的表达载体。
8、含有权利要求3至6中任一所述的植物抗逆锌指蛋白编码基因的转基因细 胞系。
9、含有权利要求3至6中任一所述的植物抗逆锌指蛋白编码基因的转基因宿 主菌。
10、权利要求3至6中任一所述的植物抗逆锌指蛋白编码基因在培育抗逆植 物品种中的应用。
技术领域
本发明涉及植物生物工程领域中一种植物抗逆锌指蛋白及其编码基因与应 用。
背景技术
植物在生长过程中常常会受到各种环境因子的刺激，诸如一些干旱、低温、 高盐等非生物胁迫因子和病菌侵染、机械伤害、虫害等生物胁迫因子，植物在抵 抗这些逆境的过程中已经进化形成了一系列抗逆应答反应和防卫机制。转录因子 在调控植物这些抗逆和防卫反应的过程中处在一个中心调控的地位。锌指蛋白 (Zinc finger protein，ZnF)是植物中较大的转录因子家庭之一，参与植物的 形态建成、配子产生、胚及花器官的发育、光及抗逆反应等多种调控过程。从数 据库中的数据推测，拟南芥中编码C2H2型和C3H型的锌指蛋白转录因子基因分别有 231个和33个。
近年来，越来越多的证据表明锌指蛋白参与了一些与干旱、低温、高盐及病 虫害等逆境胁迫的相关反应，而且在这些反应中所起的作用也是多种多样的，有 些是作为激活子激活相关基因的表达，有些是作为抑制子抑制一些基因的表达， 也有些能与其它转录因子结合成同源或异源二聚体在调控逆境胁迫中发挥作用。 目前，有关锌指蛋白的研究主要集中在拟南芥、矮牵牛、金鱼草和水稻等模式物 种，在小麦等基因组复杂的作物中有关锌指蛋白开展的研究极少。
近年来，越来越多的证据表明锌指蛋白参与了一些与干旱、低温、高盐及病 虫害等逆境胁迫的相关反应，而且在这些反应中所起的作用也是多种多样的，有 些是作为激活子激活相关基因的表达，有些是作为抑制子抑制一些基因的表达， 也有些能与其它转录因子结合成同源或异源二聚体在调控逆境胁迫中发挥作用。 目前，有关锌指蛋白的研究主要集中在拟南芥、矮牵牛、金鱼草和水稻等模式物 种，在小麦等基因组复杂的作物中有关锌指蛋白开展的研究极少。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗逆锌指蛋白及其编码基因。
本发明所提供的植物抗逆锌指蛋白，名称为TaZnF(Triticum aestivum Zinc finger protein)，来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)，是如下(a)或 (b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。
序列表中序列2由165个氨基酸残基组成，如图7所示，共含有两个锌指结构域， 其中N端(序列2的自氨基端第22位至41位氨基酸残基)编码A-20锌指(C2C2型)， C端(序列2的自氨基端第106位至138位氨基酸残基)编码AN-1锌指(C2H2型)。图 7中，下划线分别表示N端的A20锌指和C端的AN-1锌指结构域，阴影部分表示形成 锌指结构的保守氨基酸。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述 两个锌指结构域之外进行一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物抗逆锌指蛋白的编码基因(TaZnF)也属于本发明的保护范围。
所述植物抗逆锌指蛋白编码基因，其核苷酸序列是编码序列表中序列2的蛋 白质的多核苷酸。
所述植物抗逆锌指蛋白编码基因的编码序列(ORF)为序列表中序列1的自5′ 端第1355位至1852位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列。
所述植物抗逆锌指蛋白编码基因，具体可为如下1)或2)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物抗逆性相关的蛋白 质的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃ 下杂交并洗膜。
序列表中的序列1由2147个脱氧核苷酸组成。自5′端第1位至1354位脱氧 核苷酸为启动子区，自5′端第1355位至1852位脱氧核苷酸为编码序列，自5′端 第1853位至2147位脱氧核苷酸。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增TaZnF中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内，其中，上游引 物和下游引物之间的距离在50到5000个碱基之间；该引物对中的每一个引物的 长度为15到30个碱基。如，引物1：5’-GCGGGATCACAAGCAGGAG-3’；引物2： 5’-GCCGCCGGAACATCAGCAT-3’。
利用可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的TaZnF基因导入植 物细胞，或将TaZnF基因过表达，植物表现为对各种非生物胁迫逆境(干旱、低 温、高盐等)的抗性增强。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记 物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基 因对培育植物抗逆新品种具有重要意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明所提供的植物抗逆锌指蛋白，名称为TaZnF(Triticum aestivum Zinc finger protein)，来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)，是如下(a)或 (b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。
序列表中序列2由165个氨基酸残基组成，如图7所示，共含有两个锌指结构域， 其中N端(序列2的自氨基端第22位至41位氨基酸残基)编码A-20锌指(C2C2型)， C端(序列2的自氨基端第106位至138位氨基酸残基)编码AN-1锌指(C2H2型)。图 7中，下划线分别表示N端的A20锌指和C端的AN-1锌指结构域，阴影部分表示形成 锌指结构的保守氨基酸。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述 两个锌指结构域之外进行一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物抗逆锌指蛋白的编码基因(TaZnF)也属于本发明的保护范围。
所述植物抗逆锌指蛋白编码基因，其核苷酸序列是编码序列表中序列2的蛋 白质的多核苷酸。
所述植物抗逆锌指蛋白编码基因的编码序列(ORF)为序列表中序列1的自5′ 端第1355位至1852位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列。
所述植物抗逆锌指蛋白编码基因，具体可为如下1)或2)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物抗逆性相关的蛋白 质的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃ 下杂交并洗膜。
序列表中的序列1由2147个脱氧核苷酸组成。自5′端第1位至1354位脱氧 核苷酸为启动子区，自5′端第1355位至1852位脱氧核苷酸为编码序列，自5′端 第1853位至2147位脱氧核苷酸。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增TaZnF中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内，其中，上游引 物和下游引物之间的距离在50到5000个碱基之间；该引物对中的每一个引物的 长度为15到30个碱基。如，引物1：5’-GCGGGATCACAAGCAGGAG-3’；引物2： 5’-GCCGCCGGAACATCAGCAT-3’。
利用可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的TaZnF基因导入植 物细胞，或将TaZnF基因过表达，植物表现为对各种非生物胁迫逆境(干旱、低 温、高盐等)的抗性增强。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记 物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基 因对培育植物抗逆新品种具有重要意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为TaZnF因的胁迫诱导表达模式
图2为TaZnF与GFP的融合蛋白的亚细胞定位结果
图3为转化pGEX-4T-1-TaZnF和pGEX-4T-1的大肠杆菌细胞胁迫条件下的生 长变化曲线
图4为野生型和转基因株系在干旱处理一个月，重复浇水一周后，植株恢复 生长的状态照片
图5为野生型和转基因植株在低温处理前，以及低温处理后置于正常生长环 境中恢复生长5天及10天后的植株生长状态照片
图6为野生型和转基因植株在高盐处理前，以及处理后7天和14天的植株生 长状态照片
图7为TaZnF的氨基酸序列
图2为TaZnF与GFP的融合蛋白的亚细胞定位结果
图3为转化pGEX-4T-1-TaZnF和pGEX-4T-1的大肠杆菌细胞胁迫条件下的生 长变化曲线
图4为野生型和转基因株系在干旱处理一个月，重复浇水一周后，植株恢复 生长的状态照片
图5为野生型和转基因植株在低温处理前，以及低温处理后置于正常生长环 境中恢复生长5天及10天后的植株生长状态照片
图6为野生型和转基因植株在高盐处理前，以及处理后7天和14天的植株生 长状态照片
图7为TaZnF的氨基酸序列
具体实施方式
下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、TaZnF基因的克隆
(1)小麦TaZnF基因序列的电子克隆
以水稻中OSISAP1基因的全长cDNA序列为查询序列，然后登录GenBank数据 库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，对EST数据库进行序列同源性比 对进行查找(blastn)，共得到12个与水稻的序列高度同源的小麦的EST序列， 分别为CD904159、CD934857、CA733262、BQ803525、BQ802055、BQ800826、CD870668、 CD868128、BQ838331、AL825727、BJ322156、BJ320036，用DNAMAN软件进行序列 拼接；利用第一次拼接的结果进行第二次序列同源性比对查找(blastn)，得到 25个小麦的EST序列，利用DNAMAN软件把这25个EST序列分别与第一次比对的 结果进行拼接，其中的1个EST序列(BJ27846)与第1次拼接的结果拼接后延伸 序列的最长，然后把此拼接结果提交到NCBI，利用blastx预测功能域。
(2)小麦TaZnF基因的cDNA及非翻译区序列克隆
根据电子克隆得到的序列设计引物，以小麦品种农大3432(Triticum aestivum L.)(购自北京市通州区种子公司)叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产 物经过测序验证后，得到TaZnF基因的ORF区段。利用3’RACE得到TaZnF基因 的3’端的非翻译区序列为295bp，带有19个polyA尾巴。利用Genome walker技术 得到5’端的启动子区域1354bp，全序列信息见序列分析表中的SEQ ID №：1，同 时对启动子区域的顺式作用成分进行了分析；TaZnF的ORF序列编码的蛋白质序列 如序列表中的SEQ ID №：2，共含有两个锌指结构域，其中N端(序列2的自氨 基端第22位至41位氨基酸残基)编码A-20锌指(C2C2型)，C端(序列2的自氨 基端第106位至138位氨基酸残基)编码AN-1锌指(C2H2型)，并且TaZnF基因 是一个不含有内含子的锌指蛋白基因。
实施例2、TaZnF基因的胁迫诱导表达模式
以25％PEG-6000、250mM NaCl、4℃低温及100uM ABA分别处理小麦幼苗，并 取不同处理时间的小麦根系，提取RNA反转录cDNA后，用引物1： 5’-GCGGGATCACAAGCAGGAG-3’和引物2：5’-GCCGCCGGAACATCAGCAT-3’，采用实 时荧光定量PCR检测TaZnF基因的时空表达特征。其中胁迫处理的具体方法为如 下：
实验材料为普通小麦品种农大3432(Triticum aestivum L.)，种子表面消 毒采用5％的次氯酸钠处理10分钟，用蒸馏水冲洗4遍后，置于4℃冰箱中暗培养 一周。培养瓶的底部事先放好浸湿的棉花，把小麦的种子移入培养瓶，置于培养 室中(温度25℃，相对湿度60％-70％，光强7000-8000Lux)水培养。在小麦生长 至二叶一心期以后，进行胁迫处理：
高盐处理：在培养瓶中加入NaCl溶液至终浓度为250mM。
PEG处理：在培养瓶中加入PEG-6000溶液至终浓度为25％(质量百分含量)。
ABA处理：把ABA溶解在DMSO中制成10mM贮存液，然后加入到培养瓶中至终 浓度为100uM。
在加入上述溶液以后，分别在处理0.5、1、2、12，24小时选取小麦的根系， 用吸水纸吸干残余溶液后迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存，待用。同时以未 处理的小麦根系(即只生长在水中)，作为对照组。
低温处理是将小麦的幼苗置于4℃低温光照培养箱中，处理的时间和取材方法 同上，对照组为在正常培养室的温度(25℃)和光照条件(7000-8000Lux)。
实时定量荧光PCR的结果如图1所示，TaZnF基因受PEG(25％)、高盐(NaCl， 250mM)、低温(4℃)及ABA(100μM)处理均有相应的响应。对于PEG(25％) 的处理，在处理的初期(0.5小时)，基因的表达迅速增加到最高水平，然后随着 处理时间的延长，基因的表达量开始下降，到了后期(12小时)，基因表达量基 本上保持在一个相对稳定的水平上(图1中A)。在植物激素ABA处理以后(100uM)， 基因的表达逐渐升高到最高水平后(2小时)，缓慢下降(图1中B)。低温处理 时(4℃)，在最初处理的阶段(0.5小时)，基因的表达迅速增加到最高水平， 然后又快速下降，到后期(12小时)又略有升高，然后维持在一个相对稳定的水 平上(图1中C)。高盐处理时(NaCl，250mM)，基因表达随着处理时间的增加 缓慢升高到最高(12小时)，然后开始下降，直到后期(24小时)表达量甚至要 低于本底水平(图1中D)。图1中，横坐标胁迫处理的时间分别为0.5、1、2、 12、24小时，纵坐标表示在不同处理条件下TaZnF基因的相对表达水平。
实施例3、TaZnF基因的亚细胞定位
为验证TaZnF基因在细胞中的作用部位，将TaZnF的编码区插入pEGAD(Sean R. Cutler，David W.Ehrhardt，Joel S.Griffitts，and Chris R.Somerville Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency，PNAS，2000，(97)3718-3723) 的35S启动子和绿色荧光蛋白GFP基因之间得到含有GFP-TaZnF融合基因的重组表 达载体pEGAD-TaZnF，通过GFP表达部位确定TaZnF蛋白在细胞内的定位情况，同时 以pEGAD表达载体为对照。将上述两种载体分别经基因枪法转入洋葱表皮细胞，结 果显示转pEGAD-TaZnF的洋葱表皮的绿色荧光分布在细胞核中(图2中A～C)，而 对照组的GFP蛋白发出的绿色荧光均匀地分布在整个细胞中(图2中D)。表明TaZnF 基因编码的蛋白是一个核蛋白。图2中，A、B、C分别表示TaZnF蛋白定位在洋葱表 皮细胞的细胞核中，A是暗场照片，B是明场照片，C是A和B叠加后的照片。D为空 载体pEGAD在洋葱表皮细胞的定位情况，均匀地分散在整个细胞中。
实施例4、TaZnF基因的表达增强原核生物大肠杆菌细胞的抗逆性
为了验证TaZnF在原核生物中抗渗透、抗高盐和抗低温的作用，构建了原核 表达载体pGEX4T-1-TaZnF。pGEX4T-1-TaZnF的构建方法如下：以小麦品种农大3432 (Triticum aestivum L.)叶片的cDNA为模板，利用引物2： 5’-CGGAATTCATGGCGCAGCGGGATCACAG-3’和 5’-CCCAAGCTTTCAGAACCTGACGATCTTGGC-3’，PCR扩增得到TaZnF的编码序列(序 列表中序列1的自5′端第1355位至1852位脱氧核苷酸)，将得到的TaZnF片段 插入pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)的限制型内切酶EcoRI与HindIII酶切位 点之间，得到含有TaZnF编码区片段的重组表达载体pGEX4T-1-TaZnF。
用pGEX4T-1-TaZnF转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞，同时用pGEX-4T-1 (购自Pharmacia公司)转化大肠杆菌细胞(E.coli)BL21(DE3)，作为对照。将 转化的大肠杆菌在LB培养基、37℃培养至OD600值为0.6时，加入0.1mmol/L IPTG 进行诱导。IPTG诱导2hr后分别对培养液进行下述任一种处理：1)在培养液中加 入1M甘露醇；2)在培养液中加入0.3M LiCl溶液；3)把菌液置于10℃的低温振 荡培养箱中培养24hr后取出置于37℃的振荡培养箱中恢复生长。分别检测 pGEX4T-1-TaZnF转化的大肠杆菌细胞和pGEX-4T-1转化的大肠杆菌细胞在高渗、 高盐和低温环境中的生长情况。实验结果如图3中A-C所示：图3中A表示在加 入1M的Mannitol以后，每隔两小时测菌液的OD600值；图3中B表示在加入300mM 的LiCl以后，每隔两个小时测菌液OD600值；图3中C表示在10℃条件下培养 24小时后，移到37℃的环境中培养，每隔1小时测菌液的OD600值。
图3中A表明加入1mol/L甘露醇2hr内，被转化的大肠杆菌继续生长，2hr 后生长速度减慢，部分被转化的大肠杆菌细胞受甘露醇影响，逐渐死亡；与 pGEX4T-1-TaZnF转化的大肠杆菌菌液吸收值相比，对照菌液吸收值的下降速度快； 6hr后大部分细菌细胞开始恢复生长，但是pGEX4T-1-TaZnF转化的大肠杆菌细胞 恢复生长的速度也快于转化空载体pGEX4T-1的细胞。表明TaZnF提高了大肠杆菌 细胞抗渗透的能力。
图3中B表明加入0.3M LiCl 2hr内，两类细胞基本上处于一个停滞的生长 状态，2hr后，转化pGEX4T-1-TaZnF的细胞开始慢慢地恢复生长，而转化空载体 pGEX-4T-1的细胞基本上处于停滞生长的状态。表明TaZnF增强了大肠杆菌细胞对 于盐离子(Li+)的忍受能力。
图3中C表明把菌液置于10℃的低温振荡培养箱中培养24hr，处理初期部分 大肠杆菌细胞生长，而后基本上处于停滞状态。24hr后取出置于37℃的振荡培养 箱中恢复生长，结果显示，转化pGEX4T-1-TaZnF的细胞恢复生长速度比转化空载 体pGEX-4T-1的细胞生长速度快。表明转化pGEX4T-1-TaZnF的大肠杆菌细胞在低 温胁迫后恢复生长的能力要比含有空载体的大肠杆菌细胞生长快。表明TaZnF增 强了大肠杆菌细胞对于低温的抵抗力。
在正常生长环境中(LB培养基，37℃)，转化pGEX4T-1-TaZnF的大肠杆菌细 胞与对照细胞的生长状态和生长速度基本一致，没有很大的差别，但是在高渗、 高盐或低温胁迫下，转化pGEX4T-1-TaZnF的大肠杆菌细胞比对照组细胞普遍表现 出较强的生长能力和较快的生长速度。
实施例5、野生型和转基因植物在不同胁迫处理条件下的表型及生理鉴定
1、转基因植株的获得
(1)pCAMBIA-35S-TaZnF表达载体的构建
以小麦品种农大3432(Triticum aestivum L.)叶片的cDNA为模板，利用引 物3：5’-GCTCTAGAATGGCGCAGCGGGATCACA-3’和 5’-GGGGTACCTCAGAACCTGACGAGCTTG-3’，PCR扩增得到TaZnF的编码序列(序列 表中序列1的自5′端第1355位至1852位脱氧核苷酸)，将得到的TaZnF片段经 限制性内切酶XbaI和KpnI消化后，插入质粒pCAMBIA-1300(购自CAMBIA公司) 的限制型内切酶XbaI和KpnI酶切位点之间，得到含有TaZnF编码区片段的表达 载体pCAMBIA-TaZnF；以限制性内切酶Hind III和Xba I消化质粒pBI121(购自 Clontech公司)，回收CaMV35S片段，并插入质粒pCAMBIA-TaZnF的限制型内切 酶Hind III和XbaI酶切位点之间，得到含有CaMV35S启动子和TaZnF编码区片 段的超表达载体pCAMBIA-35S-TaZnF。
用pCAMBIA-35S-TaZnF转化根癌农杆菌LBA4404，利用农杆菌侵染方法转化 Columbia生态型拟南芥(Arabidopsis Biological Resource Center)，经50ug/l 潮霉素和PCR筛选共得到了30个转pCAMBIA-35S-TaZnF株系(简称转TaZnF基因 株系)(T3代)。将野生型(WT)和T3代转TaZnF基因植株种子平铺在MS培养基 上，4℃下春化5d后，移入生长箱中(22℃恒温，24hr光照，光强为30-40umol.m-2s-1) 培养十天后移入土壤中。与野生型对比，转TaZnF基因株系没有明显的表型变化。 选取30个转TaZnF基因株系中的5个株系(#2、#4、#13、#14、#28)进行下述 步骤2的转基因植株抗逆性鉴定。
其中，得到的第一代转基因植株为T1代，T1代转基因植株所结的种子和由该 种子长成的植株为T2代，依此类推，T3表示转基因植株第3代。
2、转基因植株的抗逆性鉴定
(1)过表达TaZnF的转基因拟南芥抗旱性分析
通过35S启动子启动TaZnF基因在转基因植株中的表达，来检测TaZnF基因 在干旱胁迫中的作用。具体方法如下：首先将WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、 #4、#13、#14、#28)种子种在培养皿中春化5天，移入培养箱中(22℃恒温，24 小时光照，光强为30-40umol.m-2s-1)培养十天后移入土壤中再生长14天。在 干旱处理之前，挑选同样大小，生长状态一致的WT和#2、#4、#13、#14、#28转 TaZnF基因株系植株(各81株)置于同一托盘中，设置3个重复；停止浇水30天 进行干旱处理，然后重复浇水7天，统计株系的存活率(见表1)，从存活率的统 计结果来看，野生型的存活率为22.38％，转TaZnF基因株系的存活率分别为 53.73％，65.15％，76.47％，89.87％和100％，T-检测的结果表明：转TaZnF基因株 系#2、#4、#14、#28的存活率和野生型相比均有显著的差异(P＜0.05)。从外观 上观察，转TaZnF基因株系和野生型的表型一致。WT和转TaZnF基因株系在干旱 处理以后，植株的叶片都逐渐失水萎蔫，转TaZnF基因株系的植株失水的速度稍 比WT植株慢一些，但是差别不明显，但是在干旱以后，重复浇水一周以后，大部 分WT植株叶片开始变黄，发白，逐渐死去，而转TaZnF基因株系大部分植株能恢 复正常的生长水平，并完成整个生活周期(图4)。以上的结果证明，转TaZnF基 因株系的存活率普遍大于WT，重复浇水后恢复生长的能力远远大于WT，说明在拟 南芥中过表达TaZnF基因显著地提高了转基因植株的抗旱能力。
表1：野生型(WT)和转TaZnF基因株系在干旱条件下的存活率 株系 存活率 WT #2 #4 #13 #14 #28 22.38％ 84.31％* 100％* 53.73％ 65.15％* 89.87％*
注：*代表显著性差异(P＜0.05)
(2)抗低温鉴定
①低温条件下的存活率测定
WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株的前期培养同前， 在低温处理之前，挑选同样大小，生长状态一致的WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、 #4、#13、#14、#28)(各81株)置于同一托盘中，设置3个重复；将植株置于 -10℃培养箱中4小时，取出后置于-5℃的培养箱中低温处理30个小时，然后取 出置于正常培养条件下(22℃)生长10天后，统计整个株系的存活率(表2)。 从外观上观察，转TaZnF基因株系植株和野生型的表型一致。WT和转TaZnF基因 株系在低温处理以后，植株的叶片都有不同程度的冻伤，WT和转TaZnF基因株系 差别不明显，但是在正常环境中培养5天以后，大部分的WT植株叶片开始变白， 并逐渐死去，而大部分转TaZnF基因株系植株基本上可以恢复正常的生长水平， 并完成整个生活周期(图5)。T-检测的结果表明：转TaZnF基因株系在低温胁迫 以后恢复生长的存活率普遍大于WT，并且有三个株系(#4、#13和#28)的存活率 与野生型相比均有显著的差异(P＜0.05)，一个株系(#14)与野生型和相比为极 显著性的差异(P＜0.01)，而且低温胁迫后TaZnF基因株系恢复生长的能力也大 于WT，说明在拟南芥中过表达TaZnF基因显著地提高了转基因植株的抗低温的能 力。
②低温胁迫处理下离体叶片电导率的测定
植物的细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用，在正常情况 下，细胞膜对物质具有选择透性能力，当植物受到低温等逆境影响时，细胞膜会 遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电 导率增大。电导率的变化与植物在相同胁迫条件下的抗逆性有关，即抗逆性强的 品系细胞膜受伤害的程度小，细胞膜的稳定性(Cell membrane stability，CMS) 强。
对WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株(每株系各5 株)在低温胁迫时离体叶片的电导率进行了测定，CMS＝[1-(T1/T2)]/[1-(C1/C2)]。 电导率的测定采用如下方法：1)用打孔器从转基因和野生型植株的第5片和第6 片叶子上打下直径为0.5厘米的圆盘(每个基因型做五个重复，分别取自五株不 同的植株，每株取下两片叶子，一片叶子作为处理组，一片叶子作为对照组)， 用去离子水冲洗2-3次，吸水纸吸干后，置于10ml的离心管中，加入去离子水5ml， 置于-10℃条件下暗处理24小时。2)对照组的叶片的电导率的测定是直接向离心 管中加入去离水5ml，使整个叶片全部浸没在水中后，放在4℃冰箱中24小时后， 在室温下平衡1-2小时，然后用电导率仪测定每个离心管中溶液的电导率，记下 的电导率的读数为C1；然后，在15Psi，121℃条件下灭菌15分钟，再用电导率 仪测定此时溶液的电导率，记为C2。3)处理组的电导率的测定按如上操作进行， 高压灭菌前后的电导率为T1和T2。
结果显示野生型植株叶片在低温处理后的CMS值为27.04％，而转TaZnF基因 株系的CMS值都分别为53.35％、54.94％、57.78％、64.72％和73.77％，并且3个转 TaZnF基因株系(#2、#4和#13)的CMS值与野生型相比有显著性差异，2个转TaZnF 基因株系(#14和#28)有极显著性差异(表2)，说明在低温胁迫条件下，转TaZnF 基因株系的细胞膜的稳定性普遍要高于野生型。
表2：野生型(WT)和转TaZnF基因株系在低温条件下的存活率和离体叶片的
CMS值测定 株系 存活率 CMS WT #2 #4 #13 64.71％ 85.71％* 100％* 91.18％* 27.04％ 57.78％* 54.94％* 53.35％*
#14 #28 96.42％** 92.86％* 64.72％** 73.77％**
注：*和**分别代表显著性差异(P＜0.05)和极显著性差异(P＜0.01)
(3)抗盐性鉴定
①高盐胁迫处理下的存活率测定
WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株的前期培养同前， 在高盐处理之前，挑选同样大小，生长状态一致的WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、 #4、#13、#14、#28)(各81株)置于同一托盘中，设置3个重复，培养5天后， 向托盘中施浇400mM的NaCl溶液，每隔五天浇一次，每次浇500ml，14天后统计 整个株系的存活率(表3)。野生型和转TaZnF基因株系的表型一致。在盐溶液处 理7天以后，野生型和转TaZnF基因株系植株的个别叶片开始变白，处理14天后， 大部分转TaZnF基因株系植株部分的叶片都变白，但是相比之下WT叶片发白的程 度比转TaZnF基因株系要相对严重一些，受伤害的比例也要大一些(图6)。以上 的结果表明，转TaZnF基因株系在高盐处理后的存活率稍大于WT，并且叶片变白 的速度也比WT慢，说明在拟南芥中过表达TaZnF基因对转基因植株的抗高盐的能 力略有提高。
②高盐胁迫条件下叶片叶绿素含量的测定
按照文献《植物生理生化实验原理和技术》(李合生等，2000，北京，高等 教育出版社，134-137)描述的方法对WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、#4、#13、 #14、#28)(每株系各5株)在高盐胁迫后7天的叶片的叶绿素含量进行了测定， 结果显示WT在高盐处理后的叶绿素的含量为1.30mg/g，而转基因株系的叶绿素的 含量分别为1.48mg/g、1.79mg/g、1.78mg/g、1.94mg/g和1.95mg/g以上(表3)， 并且#2、#13、#14和#28转基因株系在高胁迫后，叶绿素含量和野生型相比均有 显著性差异，这些结果表明，转TaZnF基因株系在高盐胁迫下拥有比WT更高的叶 绿素含量，也说明转TaZnF基因株系比WT有更强的忍受盐离子胁迫的能力。
表3：野生型(WT)和转TaZnF基因株系在高盐条件下的存活率和叶绿素测定 株系 存活率 叶绿素含量 (mg/g) WT #2 #4 #13 80.65％ 97.22％* 86.11％ 88.89％ 1.30 1.95* 1.48 1.79* #14 #28 91.67％* 95.56％* 1.94* 1.78*
注：*代表显著性差异(P＜0.05)
上述结果说明小麦TaZnF基因在拟南芥中的表达提高了转基因植株抗干旱、 低温和高盐的能力，而且在提高抗性的同时转基因植株的生长发育过程没有受到 影响。
序列表
<160>2
<210>1
<211>2147
<212>DNA
<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)
<400>1
ccgtgggatt agccgtccgc ggaaatgata cggccgccga atttctgctc gccgcgatgc 60
gaccttggct tcgtgcggct gctgtctccg ggccggccgg gagaatctgc tggattgctt 120
acccagttcg ctctgctgtt ggcctgtctg ttcctgattt gccgccgcgc cctaccgacc 180
gaattcagca cctgaagact agctaatgga agtttttttt tccttaaaaa aaagttagca 240
gcagctagcc gggatgcgtg ggcagaatgg cccggccgtg cggttgggac tatgcacgag 300
tttgccgtgt cgacactcaa atcggatcgt aattgagtat tcccgtctag cgatattttc 360
tactagtact attagcgata agataaacga atgggcgaga ggtgaagagg ggagcagccg 420
tgctaatccg gacagctcag aggcggacaa ggacggggcg ccgatccagc ttcccttaat 480
tttatcccga ccctggccgc aacgtgcggg ctatggtatg gtggtacgta cgcacggaag 540
aagccgcgac gacgccttcc aagttccaac tcgcaggccc cgacaagccg acgcgcccga 600
tggtttggcc cggtggtttc gtcccaaatt cccagccatc ttctcgctcg ctttcggccg 660
ccatactagt cagcttcggg cggcggctac ttgctccccc acacggcgcg gccggccgtg 720
cgggtccaac cagcacacgg cacacacggc ccgtccgtgc ccacgaagcg ccacctgacc 780
atcctacccc tccttcgcac ctacgcgacg tccgtgcgtg ctccggcgcc cctctggatc 840
cagcccagtt gacccttctc cccaccaccc gcggccacgg gcgtcgcacg tcgctcacgt 900
ttcttccatg gagggcctaa acgggcgtgc ctttaccggc ctgcagcaca gccgtcgctt 960
ttcgggggcg gccactgacc gaaacggagg gcagcgtcgc ccatttacgc gagcccccgg 1020
gtgacgcgag gccaaaaccg gaaatcccaa cccaagacgc ggagggagac ggcagctggg 1080
caggtcgtta tcgcccctcc tccagggagc gcgtccccgt ccgtctcccg cctagccctc 1140
ggcaccgata aaaagggccc cggtctcccc tccattcccc acccacgccc atccaattct 1200
cctctcggcc tctcctcctc tcctcgcatc ggcctcccga tccctcacag accacccgcg 1260
gcgcgcacac gcccggacct cctaccggcc ggcaccggtt caaccaacaa accagcccag 1320
gcacctccgg ccgcgcgtgc gtgtttgaca taccatggcg cagcgggatc acaagcagga 1380
ggagcccacg gagctgcggg cgccggagat cacgctctgc gccaacagct gcggcttccc 1440
gggcaacccg gccacgcaga acctctgcca gaactgcttc ttggccggcc cggcgtccac 1500
gtcgccgtct tcctcctcct cctcctcctc ttctctgccg ggcgtgtccg cgccgacccc 1560
cgtcatcgac aggccgaggc cggcgccgtt ggaggcggag ctggcacgcc ccgccgtcga 1620
ccttgctccg gcgacggagg cgaagccggc gaggacgtcg gtgaaccggt gctccagctg 1680
ccggaagcgc gtggggctga cggggttccg gtgccggtgc ggcgacatgt tctgcggcga 1740
gcaccggtac tcggaccggc acgggtgcag ctacgactac aaggccgccg ccagggacgc 1800
catcgccagg gacaaccccg tcgtgcgcgc cgccaagctc gtcaggttct gaagctgaaa 1860
ccaaggggaa agaagaattc agaattcagc cagaggcaaa gcaaagaatc atctcatcga 1920
ggcagtgggc cgccgtgcga gccgctagta ttatgctgtt gttctccgga gtgcttccct 1980
ttttaattaa aaaaatcttt atttattgga aggaaaaaaa tgggaggtaa agatgtggat 2040
gaaaaggaaa gaatagcgtg tgtgatgtaa tatcaacggg tggttgaggc ggaggagcaa 2100
gcaatgaaat ggattggatg tgtatgtcaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2147
<210>2
<211>165
<212>PRT
<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)
<400>2
Met Ala Gln Arg Asp His Lys Gln Glu Glu Pro Thr Glu Leu Arg Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ile Thr Leu Cys Ala Asn Ser Cys Gly Phe Pro Gly Asn Pro
20 25 30
Ala Thr Gln Asn Leu Cys Gln Asn Cys Phe Leu Ala Gly Pro Ala Ser
35 40 45
Thr Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Pro Gly Val
50 55 60
Ser Ala Pro Thr Pro Val Ile Asp Arg Pro Arg Pro Ala Pro Leu Glu
65 70 75 80
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Ala Val Asp Leu Ala Pro Ala Thr Glu Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Arg Thr Ser Val Asn Arg Cys Ser Ser Cys Arg Lys Arg
100 105 110
Val Gly Leu Thr Gly Phe Arg Cys Arg Cys Gly Asp Met Phe Cys Gly
115 120 125
Glu His Arg Tyr Ser Asp Arg His Gly Cys Ser Tyr Asp Tyr Lys Ala
130 135 140
Ala Ala Arg Asp Ala Ile Ala Arg Asp Asn Pro Val Val Arg Ala Ala
145 150 155 160
Lys Leu Val Arg Phe
165
实施例1、TaZnF基因的克隆
(1)小麦TaZnF基因序列的电子克隆
以水稻中OSISAP1基因的全长cDNA序列为查询序列，然后登录GenBank数据 库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，对EST数据库进行序列同源性比 对进行查找(blastn)，共得到12个与水稻的序列高度同源的小麦的EST序列， 分别为CD904159、CD934857、CA733262、BQ803525、BQ802055、BQ800826、CD870668、 CD868128、BQ838331、AL825727、BJ322156、BJ320036，用DNAMAN软件进行序列 拼接；利用第一次拼接的结果进行第二次序列同源性比对查找(blastn)，得到 25个小麦的EST序列，利用DNAMAN软件把这25个EST序列分别与第一次比对的 结果进行拼接，其中的1个EST序列(BJ27846)与第1次拼接的结果拼接后延伸 序列的最长，然后把此拼接结果提交到NCBI，利用blastx预测功能域。
(2)小麦TaZnF基因的cDNA及非翻译区序列克隆
根据电子克隆得到的序列设计引物，以小麦品种农大3432(Triticum aestivum L.)(购自北京市通州区种子公司)叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产 物经过测序验证后，得到TaZnF基因的ORF区段。利用3’RACE得到TaZnF基因 的3’端的非翻译区序列为295bp，带有19个polyA尾巴。利用Genome walker技术 得到5’端的启动子区域1354bp，全序列信息见序列分析表中的SEQ ID №：1，同 时对启动子区域的顺式作用成分进行了分析；TaZnF的ORF序列编码的蛋白质序列 如序列表中的SEQ ID №：2，共含有两个锌指结构域，其中N端(序列2的自氨 基端第22位至41位氨基酸残基)编码A-20锌指(C2C2型)，C端(序列2的自氨 基端第106位至138位氨基酸残基)编码AN-1锌指(C2H2型)，并且TaZnF基因 是一个不含有内含子的锌指蛋白基因。
实施例2、TaZnF基因的胁迫诱导表达模式
以25％PEG-6000、250mM NaCl、4℃低温及100uM ABA分别处理小麦幼苗，并 取不同处理时间的小麦根系，提取RNA反转录cDNA后，用引物1： 5’-GCGGGATCACAAGCAGGAG-3’和引物2：5’-GCCGCCGGAACATCAGCAT-3’，采用实 时荧光定量PCR检测TaZnF基因的时空表达特征。其中胁迫处理的具体方法为如 下：
实验材料为普通小麦品种农大3432(Triticum aestivum L.)，种子表面消 毒采用5％的次氯酸钠处理10分钟，用蒸馏水冲洗4遍后，置于4℃冰箱中暗培养 一周。培养瓶的底部事先放好浸湿的棉花，把小麦的种子移入培养瓶，置于培养 室中(温度25℃，相对湿度60％-70％，光强7000-8000Lux)水培养。在小麦生长 至二叶一心期以后，进行胁迫处理：
高盐处理：在培养瓶中加入NaCl溶液至终浓度为250mM。
PEG处理：在培养瓶中加入PEG-6000溶液至终浓度为25％(质量百分含量)。
ABA处理：把ABA溶解在DMSO中制成10mM贮存液，然后加入到培养瓶中至终 浓度为100uM。
在加入上述溶液以后，分别在处理0.5、1、2、12，24小时选取小麦的根系， 用吸水纸吸干残余溶液后迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存，待用。同时以未 处理的小麦根系(即只生长在水中)，作为对照组。
低温处理是将小麦的幼苗置于4℃低温光照培养箱中，处理的时间和取材方法 同上，对照组为在正常培养室的温度(25℃)和光照条件(7000-8000Lux)。
实时定量荧光PCR的结果如图1所示，TaZnF基因受PEG(25％)、高盐(NaCl， 250mM)、低温(4℃)及ABA(100μM)处理均有相应的响应。对于PEG(25％) 的处理，在处理的初期(0.5小时)，基因的表达迅速增加到最高水平，然后随着 处理时间的延长，基因的表达量开始下降，到了后期(12小时)，基因表达量基 本上保持在一个相对稳定的水平上(图1中A)。在植物激素ABA处理以后(100uM)， 基因的表达逐渐升高到最高水平后(2小时)，缓慢下降(图1中B)。低温处理 时(4℃)，在最初处理的阶段(0.5小时)，基因的表达迅速增加到最高水平， 然后又快速下降，到后期(12小时)又略有升高，然后维持在一个相对稳定的水 平上(图1中C)。高盐处理时(NaCl，250mM)，基因表达随着处理时间的增加 缓慢升高到最高(12小时)，然后开始下降，直到后期(24小时)表达量甚至要 低于本底水平(图1中D)。图1中，横坐标胁迫处理的时间分别为0.5、1、2、 12、24小时，纵坐标表示在不同处理条件下TaZnF基因的相对表达水平。
实施例3、TaZnF基因的亚细胞定位
为验证TaZnF基因在细胞中的作用部位，将TaZnF的编码区插入pEGAD(Sean R. Cutler，David W.Ehrhardt，Joel S.Griffitts，and Chris R.Somerville Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency，PNAS，2000，(97)3718-3723) 的35S启动子和绿色荧光蛋白GFP基因之间得到含有GFP-TaZnF融合基因的重组表 达载体pEGAD-TaZnF，通过GFP表达部位确定TaZnF蛋白在细胞内的定位情况，同时 以pEGAD表达载体为对照。将上述两种载体分别经基因枪法转入洋葱表皮细胞，结 果显示转pEGAD-TaZnF的洋葱表皮的绿色荧光分布在细胞核中(图2中A～C)，而 对照组的GFP蛋白发出的绿色荧光均匀地分布在整个细胞中(图2中D)。表明TaZnF 基因编码的蛋白是一个核蛋白。图2中，A、B、C分别表示TaZnF蛋白定位在洋葱表 皮细胞的细胞核中，A是暗场照片，B是明场照片，C是A和B叠加后的照片。D为空 载体pEGAD在洋葱表皮细胞的定位情况，均匀地分散在整个细胞中。
实施例4、TaZnF基因的表达增强原核生物大肠杆菌细胞的抗逆性
为了验证TaZnF在原核生物中抗渗透、抗高盐和抗低温的作用，构建了原核 表达载体pGEX4T-1-TaZnF。pGEX4T-1-TaZnF的构建方法如下：以小麦品种农大3432 (Triticum aestivum L.)叶片的cDNA为模板，利用引物2： 5’-CGGAATTCATGGCGCAGCGGGATCACAG-3’和 5’-CCCAAGCTTTCAGAACCTGACGATCTTGGC-3’，PCR扩增得到TaZnF的编码序列(序 列表中序列1的自5′端第1355位至1852位脱氧核苷酸)，将得到的TaZnF片段 插入pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)的限制型内切酶EcoRI与HindIII酶切位 点之间，得到含有TaZnF编码区片段的重组表达载体pGEX4T-1-TaZnF。
用pGEX4T-1-TaZnF转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞，同时用pGEX-4T-1 (购自Pharmacia公司)转化大肠杆菌细胞(E.coli)BL21(DE3)，作为对照。将 转化的大肠杆菌在LB培养基、37℃培养至OD600值为0.6时，加入0.1mmol/L IPTG 进行诱导。IPTG诱导2hr后分别对培养液进行下述任一种处理：1)在培养液中加 入1M甘露醇；2)在培养液中加入0.3M LiCl溶液；3)把菌液置于10℃的低温振 荡培养箱中培养24hr后取出置于37℃的振荡培养箱中恢复生长。分别检测 pGEX4T-1-TaZnF转化的大肠杆菌细胞和pGEX-4T-1转化的大肠杆菌细胞在高渗、 高盐和低温环境中的生长情况。实验结果如图3中A-C所示：图3中A表示在加 入1M的Mannitol以后，每隔两小时测菌液的OD600值；图3中B表示在加入300mM 的LiCl以后，每隔两个小时测菌液OD600值；图3中C表示在10℃条件下培养 24小时后，移到37℃的环境中培养，每隔1小时测菌液的OD600值。
图3中A表明加入1mol/L甘露醇2hr内，被转化的大肠杆菌继续生长，2hr 后生长速度减慢，部分被转化的大肠杆菌细胞受甘露醇影响，逐渐死亡；与 pGEX4T-1-TaZnF转化的大肠杆菌菌液吸收值相比，对照菌液吸收值的下降速度快； 6hr后大部分细菌细胞开始恢复生长，但是pGEX4T-1-TaZnF转化的大肠杆菌细胞 恢复生长的速度也快于转化空载体pGEX4T-1的细胞。表明TaZnF提高了大肠杆菌 细胞抗渗透的能力。
图3中B表明加入0.3M LiCl 2hr内，两类细胞基本上处于一个停滞的生长 状态，2hr后，转化pGEX4T-1-TaZnF的细胞开始慢慢地恢复生长，而转化空载体 pGEX-4T-1的细胞基本上处于停滞生长的状态。表明TaZnF增强了大肠杆菌细胞对 于盐离子(Li+)的忍受能力。
图3中C表明把菌液置于10℃的低温振荡培养箱中培养24hr，处理初期部分 大肠杆菌细胞生长，而后基本上处于停滞状态。24hr后取出置于37℃的振荡培养 箱中恢复生长，结果显示，转化pGEX4T-1-TaZnF的细胞恢复生长速度比转化空载 体pGEX-4T-1的细胞生长速度快。表明转化pGEX4T-1-TaZnF的大肠杆菌细胞在低 温胁迫后恢复生长的能力要比含有空载体的大肠杆菌细胞生长快。表明TaZnF增 强了大肠杆菌细胞对于低温的抵抗力。
在正常生长环境中(LB培养基，37℃)，转化pGEX4T-1-TaZnF的大肠杆菌细 胞与对照细胞的生长状态和生长速度基本一致，没有很大的差别，但是在高渗、 高盐或低温胁迫下，转化pGEX4T-1-TaZnF的大肠杆菌细胞比对照组细胞普遍表现 出较强的生长能力和较快的生长速度。
实施例5、野生型和转基因植物在不同胁迫处理条件下的表型及生理鉴定
1、转基因植株的获得
(1)pCAMBIA-35S-TaZnF表达载体的构建
以小麦品种农大3432(Triticum aestivum L.)叶片的cDNA为模板，利用引 物3：5’-GCTCTAGAATGGCGCAGCGGGATCACA-3’和 5’-GGGGTACCTCAGAACCTGACGAGCTTG-3’，PCR扩增得到TaZnF的编码序列(序列 表中序列1的自5′端第1355位至1852位脱氧核苷酸)，将得到的TaZnF片段经 限制性内切酶XbaI和KpnI消化后，插入质粒pCAMBIA-1300(购自CAMBIA公司) 的限制型内切酶XbaI和KpnI酶切位点之间，得到含有TaZnF编码区片段的表达 载体pCAMBIA-TaZnF；以限制性内切酶Hind III和Xba I消化质粒pBI121(购自 Clontech公司)，回收CaMV35S片段，并插入质粒pCAMBIA-TaZnF的限制型内切 酶Hind III和XbaI酶切位点之间，得到含有CaMV35S启动子和TaZnF编码区片 段的超表达载体pCAMBIA-35S-TaZnF。
用pCAMBIA-35S-TaZnF转化根癌农杆菌LBA4404，利用农杆菌侵染方法转化 Columbia生态型拟南芥(Arabidopsis Biological Resource Center)，经50ug/l 潮霉素和PCR筛选共得到了30个转pCAMBIA-35S-TaZnF株系(简称转TaZnF基因 株系)(T3代)。将野生型(WT)和T3代转TaZnF基因植株种子平铺在MS培养基 上，4℃下春化5d后，移入生长箱中(22℃恒温，24hr光照，光强为30-40umol.m-2s-1) 培养十天后移入土壤中。与野生型对比，转TaZnF基因株系没有明显的表型变化。 选取30个转TaZnF基因株系中的5个株系(#2、#4、#13、#14、#28)进行下述 步骤2的转基因植株抗逆性鉴定。
其中，得到的第一代转基因植株为T1代，T1代转基因植株所结的种子和由该 种子长成的植株为T2代，依此类推，T3表示转基因植株第3代。
2、转基因植株的抗逆性鉴定
(1)过表达TaZnF的转基因拟南芥抗旱性分析
通过35S启动子启动TaZnF基因在转基因植株中的表达，来检测TaZnF基因 在干旱胁迫中的作用。具体方法如下：首先将WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、 #4、#13、#14、#28)种子种在培养皿中春化5天，移入培养箱中(22℃恒温，24 小时光照，光强为30-40umol.m-2s-1)培养十天后移入土壤中再生长14天。在 干旱处理之前，挑选同样大小，生长状态一致的WT和#2、#4、#13、#14、#28转 TaZnF基因株系植株(各81株)置于同一托盘中，设置3个重复；停止浇水30天 进行干旱处理，然后重复浇水7天，统计株系的存活率(见表1)，从存活率的统 计结果来看，野生型的存活率为22.38％，转TaZnF基因株系的存活率分别为 53.73％，65.15％，76.47％，89.87％和100％，T-检测的结果表明：转TaZnF基因株 系#2、#4、#14、#28的存活率和野生型相比均有显著的差异(P＜0.05)。从外观 上观察，转TaZnF基因株系和野生型的表型一致。WT和转TaZnF基因株系在干旱 处理以后，植株的叶片都逐渐失水萎蔫，转TaZnF基因株系的植株失水的速度稍 比WT植株慢一些，但是差别不明显，但是在干旱以后，重复浇水一周以后，大部 分WT植株叶片开始变黄，发白，逐渐死去，而转TaZnF基因株系大部分植株能恢 复正常的生长水平，并完成整个生活周期(图4)。以上的结果证明，转TaZnF基 因株系的存活率普遍大于WT，重复浇水后恢复生长的能力远远大于WT，说明在拟 南芥中过表达TaZnF基因显著地提高了转基因植株的抗旱能力。
表1：野生型(WT)和转TaZnF基因株系在干旱条件下的存活率 株系 存活率 WT #2 #4 #13 #14 #28 22.38％ 84.31％* 100％* 53.73％ 65.15％* 89.87％*
注：*代表显著性差异(P＜0.05)
(2)抗低温鉴定
①低温条件下的存活率测定
WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株的前期培养同前， 在低温处理之前，挑选同样大小，生长状态一致的WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、 #4、#13、#14、#28)(各81株)置于同一托盘中，设置3个重复；将植株置于 -10℃培养箱中4小时，取出后置于-5℃的培养箱中低温处理30个小时，然后取 出置于正常培养条件下(22℃)生长10天后，统计整个株系的存活率(表2)。 从外观上观察，转TaZnF基因株系植株和野生型的表型一致。WT和转TaZnF基因 株系在低温处理以后，植株的叶片都有不同程度的冻伤，WT和转TaZnF基因株系 差别不明显，但是在正常环境中培养5天以后，大部分的WT植株叶片开始变白， 并逐渐死去，而大部分转TaZnF基因株系植株基本上可以恢复正常的生长水平， 并完成整个生活周期(图5)。T-检测的结果表明：转TaZnF基因株系在低温胁迫 以后恢复生长的存活率普遍大于WT，并且有三个株系(#4、#13和#28)的存活率 与野生型相比均有显著的差异(P＜0.05)，一个株系(#14)与野生型和相比为极 显著性的差异(P＜0.01)，而且低温胁迫后TaZnF基因株系恢复生长的能力也大 于WT，说明在拟南芥中过表达TaZnF基因显著地提高了转基因植株的抗低温的能 力。
②低温胁迫处理下离体叶片电导率的测定
植物的细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用，在正常情况 下，细胞膜对物质具有选择透性能力，当植物受到低温等逆境影响时，细胞膜会 遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电 导率增大。电导率的变化与植物在相同胁迫条件下的抗逆性有关，即抗逆性强的 品系细胞膜受伤害的程度小，细胞膜的稳定性(Cell membrane stability，CMS) 强。
对WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株(每株系各5 株)在低温胁迫时离体叶片的电导率进行了测定，CMS＝[1-(T1/T2)]/[1-(C1/C2)]。 电导率的测定采用如下方法：1)用打孔器从转基因和野生型植株的第5片和第6 片叶子上打下直径为0.5厘米的圆盘(每个基因型做五个重复，分别取自五株不 同的植株，每株取下两片叶子，一片叶子作为处理组，一片叶子作为对照组)， 用去离子水冲洗2-3次，吸水纸吸干后，置于10ml的离心管中，加入去离子水5ml， 置于-10℃条件下暗处理24小时。2)对照组的叶片的电导率的测定是直接向离心 管中加入去离水5ml，使整个叶片全部浸没在水中后，放在4℃冰箱中24小时后， 在室温下平衡1-2小时，然后用电导率仪测定每个离心管中溶液的电导率，记下 的电导率的读数为C1；然后，在15Psi，121℃条件下灭菌15分钟，再用电导率 仪测定此时溶液的电导率，记为C2。3)处理组的电导率的测定按如上操作进行， 高压灭菌前后的电导率为T1和T2。
结果显示野生型植株叶片在低温处理后的CMS值为27.04％，而转TaZnF基因 株系的CMS值都分别为53.35％、54.94％、57.78％、64.72％和73.77％，并且3个转 TaZnF基因株系(#2、#4和#13)的CMS值与野生型相比有显著性差异，2个转TaZnF 基因株系(#14和#28)有极显著性差异(表2)，说明在低温胁迫条件下，转TaZnF 基因株系的细胞膜的稳定性普遍要高于野生型。
表2：野生型(WT)和转TaZnF基因株系在低温条件下的存活率和离体叶片的
CMS值测定 株系 存活率 CMS WT #2 #4 #13 64.71％ 85.71％* 100％* 91.18％* 27.04％ 57.78％* 54.94％* 53.35％*
#14 #28 96.42％** 92.86％* 64.72％** 73.77％**
注：*和**分别代表显著性差异(P＜0.05)和极显著性差异(P＜0.01)
(3)抗盐性鉴定
①高盐胁迫处理下的存活率测定
WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株的前期培养同前， 在高盐处理之前，挑选同样大小，生长状态一致的WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、 #4、#13、#14、#28)(各81株)置于同一托盘中，设置3个重复，培养5天后， 向托盘中施浇400mM的NaCl溶液，每隔五天浇一次，每次浇500ml，14天后统计 整个株系的存活率(表3)。野生型和转TaZnF基因株系的表型一致。在盐溶液处 理7天以后，野生型和转TaZnF基因株系植株的个别叶片开始变白，处理14天后， 大部分转TaZnF基因株系植株部分的叶片都变白，但是相比之下WT叶片发白的程 度比转TaZnF基因株系要相对严重一些，受伤害的比例也要大一些(图6)。以上 的结果表明，转TaZnF基因株系在高盐处理后的存活率稍大于WT，并且叶片变白 的速度也比WT慢，说明在拟南芥中过表达TaZnF基因对转基因植株的抗高盐的能 力略有提高。
②高盐胁迫条件下叶片叶绿素含量的测定
按照文献《植物生理生化实验原理和技术》(李合生等，2000，北京，高等 教育出版社，134-137)描述的方法对WT和T3代转TaZnF基因株系(#2、#4、#13、 #14、#28)(每株系各5株)在高盐胁迫后7天的叶片的叶绿素含量进行了测定， 结果显示WT在高盐处理后的叶绿素的含量为1.30mg/g，而转基因株系的叶绿素的 含量分别为1.48mg/g、1.79mg/g、1.78mg/g、1.94mg/g和1.95mg/g以上(表3)， 并且#2、#13、#14和#28转基因株系在高胁迫后，叶绿素含量和野生型相比均有 显著性差异，这些结果表明，转TaZnF基因株系在高盐胁迫下拥有比WT更高的叶 绿素含量，也说明转TaZnF基因株系比WT有更强的忍受盐离子胁迫的能力。
表3：野生型(WT)和转TaZnF基因株系在高盐条件下的存活率和叶绿素测定 株系 存活率 叶绿素含量 (mg/g) WT #2 #4 #13 80.65％ 97.22％* 86.11％ 88.89％ 1.30 1.95* 1.48 1.79* #14 #28 91.67％* 95.56％* 1.94* 1.78*
注：*代表显著性差异(P＜0.05)
上述结果说明小麦TaZnF基因在拟南芥中的表达提高了转基因植株抗干旱、 低温和高盐的能力，而且在提高抗性的同时转基因植株的生长发育过程没有受到 影响。
序列表
<160>2
<210>1
<211>2147
<212>DNA
<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)
<400>1
ccgtgggatt agccgtccgc ggaaatgata cggccgccga atttctgctc gccgcgatgc 60
gaccttggct tcgtgcggct gctgtctccg ggccggccgg gagaatctgc tggattgctt 120
acccagttcg ctctgctgtt ggcctgtctg ttcctgattt gccgccgcgc cctaccgacc 180
gaattcagca cctgaagact agctaatgga agtttttttt tccttaaaaa aaagttagca 240
gcagctagcc gggatgcgtg ggcagaatgg cccggccgtg cggttgggac tatgcacgag 300
tttgccgtgt cgacactcaa atcggatcgt aattgagtat tcccgtctag cgatattttc 360
tactagtact attagcgata agataaacga atgggcgaga ggtgaagagg ggagcagccg 420
tgctaatccg gacagctcag aggcggacaa ggacggggcg ccgatccagc ttcccttaat 480
tttatcccga ccctggccgc aacgtgcggg ctatggtatg gtggtacgta cgcacggaag 540
aagccgcgac gacgccttcc aagttccaac tcgcaggccc cgacaagccg acgcgcccga 600
tggtttggcc cggtggtttc gtcccaaatt cccagccatc ttctcgctcg ctttcggccg 660
ccatactagt cagcttcggg cggcggctac ttgctccccc acacggcgcg gccggccgtg 720
cgggtccaac cagcacacgg cacacacggc ccgtccgtgc ccacgaagcg ccacctgacc 780
atcctacccc tccttcgcac ctacgcgacg tccgtgcgtg ctccggcgcc cctctggatc 840
cagcccagtt gacccttctc cccaccaccc gcggccacgg gcgtcgcacg tcgctcacgt 900
ttcttccatg gagggcctaa acgggcgtgc ctttaccggc ctgcagcaca gccgtcgctt 960
ttcgggggcg gccactgacc gaaacggagg gcagcgtcgc ccatttacgc gagcccccgg 1020
gtgacgcgag gccaaaaccg gaaatcccaa cccaagacgc ggagggagac ggcagctggg 1080
caggtcgtta tcgcccctcc tccagggagc gcgtccccgt ccgtctcccg cctagccctc 1140
ggcaccgata aaaagggccc cggtctcccc tccattcccc acccacgccc atccaattct 1200
cctctcggcc tctcctcctc tcctcgcatc ggcctcccga tccctcacag accacccgcg 1260
gcgcgcacac gcccggacct cctaccggcc ggcaccggtt caaccaacaa accagcccag 1320
gcacctccgg ccgcgcgtgc gtgtttgaca taccatggcg cagcgggatc acaagcagga 1380
ggagcccacg gagctgcggg cgccggagat cacgctctgc gccaacagct gcggcttccc 1440
gggcaacccg gccacgcaga acctctgcca gaactgcttc ttggccggcc cggcgtccac 1500
gtcgccgtct tcctcctcct cctcctcctc ttctctgccg ggcgtgtccg cgccgacccc 1560
cgtcatcgac aggccgaggc cggcgccgtt ggaggcggag ctggcacgcc ccgccgtcga 1620
ccttgctccg gcgacggagg cgaagccggc gaggacgtcg gtgaaccggt gctccagctg 1680
ccggaagcgc gtggggctga cggggttccg gtgccggtgc ggcgacatgt tctgcggcga 1740
gcaccggtac tcggaccggc acgggtgcag ctacgactac aaggccgccg ccagggacgc 1800
catcgccagg gacaaccccg tcgtgcgcgc cgccaagctc gtcaggttct gaagctgaaa 1860
ccaaggggaa agaagaattc agaattcagc cagaggcaaa gcaaagaatc atctcatcga 1920
ggcagtgggc cgccgtgcga gccgctagta ttatgctgtt gttctccgga gtgcttccct 1980
ttttaattaa aaaaatcttt atttattgga aggaaaaaaa tgggaggtaa agatgtggat 2040
gaaaaggaaa gaatagcgtg tgtgatgtaa tatcaacggg tggttgaggc ggaggagcaa 2100
gcaatgaaat ggattggatg tgtatgtcaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2147
<210>2
<211>165
<212>PRT
<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)
<400>2
Met Ala Gln Arg Asp His Lys Gln Glu Glu Pro Thr Glu Leu Arg Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ile Thr Leu Cys Ala Asn Ser Cys Gly Phe Pro Gly Asn Pro
20 25 30
Ala Thr Gln Asn Leu Cys Gln Asn Cys Phe Leu Ala Gly Pro Ala Ser
35 40 45
Thr Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Pro Gly Val
50 55 60
Ser Ala Pro Thr Pro Val Ile Asp Arg Pro Arg Pro Ala Pro Leu Glu
65 70 75 80
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Ala Val Asp Leu Ala Pro Ala Thr Glu Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Arg Thr Ser Val Asn Arg Cys Ser Ser Cys Arg Lys Arg
100 105 110
Val Gly Leu Thr Gly Phe Arg Cys Arg Cys Gly Asp Met Phe Cys Gly
115 120 125
Glu His Arg Tyr Ser Asp Arg His Gly Cys Ser Tyr Asp Tyr Lys Ala
130 135 140
Ala Ala Arg Asp Ala Ile Ala Arg Asp Asn Pro Val Val Arg Ala Ala
145 150 155 160
Lys Leu Val Arg Phe
165
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