具有改变的生长特性的植物及其生产方法
阅读：190发布：2020-10-14
专利汇可以提供具有改变的生长特性的植物及其生产方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种通过调节 植物 中编码金属硫蛋白的核酸序列的表达和/或调节植物中金属硫蛋白的活性来改变植物的生长特性的方法。本发明还涉及具有改变的生长特性的转基因植物，该植物具有编码金属硫蛋白的核酸的经调节的表达。，下面是具有改变的生长特性的植物及其生产方法专利的具体信息内容。
1.一种改变植物生长和发育的方法，包括在所述的植物中引入遗 传修饰，并选择编码金属硫蛋白的核酸在所述植物中经调节的表达， 条件是所述改变的生长和发育并非增加的金属聚积或增加的对非生物 逆境的耐受性或抗性。
2.根据权利要求1的方法，其中所述改变的植物生长和发育为与 相应的野生型植物相比增加的产量，优选生物量和/或种子产量的增 加。
3.根据权利要求2的方法，其中所述增加的种子产量包括与相应 的野生型植物相比增加的种子总数和/或增加的种子总重。
4.根据权利要求1到3任一项的方法，其中所述经调节的表达为 增加的表达。
5.根据权利要求1到4任一项的方法，其中所述的遗传修饰包括 向植物中引入分离的编码金属硫蛋白的核酸。
6.根据权利要求1到5任一项的方法，其中所述的编码金属硫蛋 白的核酸编码2型金属硫蛋白。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的核酸来源于植物，优选来 自双子叶植物，更优选来自十字花科，该核酸序列最优选来自鼠耳芥。
8.根据权利要求5到7任一项的方法，其中所述的核酸序列和所 述的蛋白包括选自以下的变异体：
(i)SEQ ID NO：1所示或编码SEQ ID NO：2所示的金属硫 蛋白的核酸；
(ii)编码金属硫蛋白的核酸序列的可变剪接变异体或其中 所述的金属硫蛋白由剪接变异体编码；
(iii)编码金属硫蛋白的核酸序列的等位基因变异体或其中 所述的金属硫蛋白由等位基因变异体编码；
(iv)编码金属硫蛋白的功能部分的核酸；
(v)SEQ ID NO：2所示的金属硫蛋白；
(vi)金属硫蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
9.根据权利要求5到8任一项的方法，其中所述的编码金属硫蛋 白的核酸的表达由组成型启动子驱动，优选水稻GOS2启动子。
10.可通过根据权利要求1到9任一项的方法获得的植物。
11.一种构建体，包括：
(i)编码金属硫蛋白的核酸序列；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的GOS2启动子；以及任 选地
(iii)转录终止序列。
12.根据权利要求11的构建体，其中所述的编码金属硫蛋白的核 酸序列选自包括下列的组：
(i)SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其互补链；
(ii)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其同源物、衍 生物或活性片段的核酸序列；
(iii)根据以上(i)到(ii)由遗传密码简并的核酸序列；
(iv)为根据(i)到(iii)的核酸序列的等位基因变异体的核 酸序列；
(v)为根据(i)到(iv)的核酸序列的可变剪接变异体的核酸 序列。
13.含有SEQ ID NO 7所示的表达盒的构建体。
14.具有根据权利要求1的改变的生长和发育的转基因植物的生 产方法，该方法包括：
(i)向植物或植物细胞中引入编码金属硫蛋白或其同源物、 衍生物或活性片段的核酸序列或其一部分；
(ii)从转基因植物细胞再生和/或生长植物。
15.含有引入的编码金属硫蛋白的核酸和具有根据权利要求1的 改变的生长和发育的转基因植物，特征在于改变的生长和发育是编码 金属硫蛋白的核酸经调节的表达的结果。
16.根据权利要求15的转基因植物，选择编码金属硫蛋白的核酸 的增加表达。
17.根据权利要求15或16的转基因植物，其中所述的植物为农 作物，包括大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽或棉花，本发明的植 物优选为单子叶植物，例如甘蔗，最优选为谷物，例如水稻、玉米、 小麦、粟、大麦、燕麦、高梁。
18.根据权利要求15到17任一项的植物的转基因植物细胞、转 基因植物或转基因植物部分，包括可收获部分，繁殖体、种子或转基 因后代。
19.编码金属硫蛋白或编码其同源物、衍生物或活性片段的核酸 序列在改变植物生长特性中的应用，条件是所述改变的生长和发育并 非增加的金属聚积或增加的对非生物逆境的耐受性或抗性。
20.金属硫蛋白和其同源物、衍生物或活性片段在改变植物生长 特性中的应用，条件是所述改变的生长和发育并非增加的金属聚积或 增加的对非生物逆境的耐受性或抗性。
21.根据权利要求19或20的应用，其中所述改变的生长和发育 为与相应的野生型植物相比增加的产量和/或增加的生物量，优选增 加的种子产量。
22.根据权利要求21的应用，其中所述增加的种子产量包括与相 应的野生型植物相比增加的种子总数和/或增加的种子总重。
23.组合物，含有SEQ ID NO 1所示的核酸序列或其一部分或SEQ ID NO 2所示的序列或其同源物、衍生物和活性片段，用于改变植物 生长和发育，优选用于增加植物的产量和/或生物量，更优选用于增 加种子产量，条件是所述改变的生长和发育并非增加的金属聚积或增 加的对非生物逆境的耐受性或抗性。
24.SEQ ID NO 1所示的核酸序列或其一部分或SEQ ID NO 2所 示的序列或其同源物、衍生物和活性片段作为生长调节剂的应用。
发明领域
本发明涉及一种改变植物生长特性的方法。更为具体地说，本发 明涉及一种改变植物生长特性的方法，包括：向植物中引入编码金属 硫蛋白的核酸。本发明还涉及具有编码金属硫蛋白的核酸序列经调节 的表达和/或金属硫蛋白经调节的活性的植物，该植物相对于相应的 野生型植物具有改变的生长特性。本发明也提供适用于本发明的方法 的构建体。
发明背景
一些重金属，特别是铜和锌，是通过Cu-和Zn-依赖性酶的作用在 多种植物生理过程中扮演重要角色的必需微量营养物。这些和其它非 必需重金属离子，例如镉、铅和汞，具有高度反应性，并因此可对活 细胞具有毒性。因此植物同所有活的生物体一样，已经进化获得了一 套对必需和非必需重金属的摄入和聚积进行控制和反应的机制。这些 机制包括特定配体对重金属的螯合和多价螯合。两种在植物细胞中最 充分表征的重金属结合配体为植物螯合肽(PC)和金属硫蛋白(MT)。MT 为一族基因编码的富含半胱氨酸的多肽。相反，PC为一族酶合成的富 含半胱氨酸的多肽。
金属硫蛋白，mRNA翻译的产物，是低分子量，富含半胱氨酸的金 属结合蛋白。MT蛋白和基因在动物和植物王国以及原核生物聚球藻 (Synechococcus)中普遍存在。MT中大量的半胱氨酸残基通过硫醇键 结合多种金属。MT通常含有2个结合金属的、富含半胱氨酸的结构域， 赋予这些金属蛋白哑铃状的构象。现在可获得的数据倾向于支持MT 在铜耐受性中的作用(而PC防御镉)。
MT蛋白的分类基于Cys残基的排列。Cobbett和Goldsbrough (Annu Rev Plant Biol.53，159-82，2002)区分4种类别：1型到4 型。2型MT含有2个富含半胱氨酸的结构域，由一个大约40个氨基 酸的间隔分开，第一对半胱氨酸在氨基酸位置3和4作为Cys-Cys基 序存在。另外，2型MT的N末端结构域的序列(MSCCGGNCGCS-)高度保 守。
鼠耳芥、水稻和甘蔗含有编码所有4种类型的MT的基因。可以对 这些基因的表达模式进行通常的观察。4型MT限于发育的种子。1型 MT在根中的表达倾向于比芽苗中高，而2型MT的观察结果通常相反。 3型MT在肉果中或在非肉果生产植物(如鼠耳芥)的叶片中表达。多种 环境因素影响这些基因的表达。
已经生产了在AtMT2a启动子的控制下表达GUS的转基因植物。在 年幼植物中，染色仅仅在子叶和侧根尖发现。较老的植物中的GUS活 性在香毛簇的基底、排水器、萼片、花粉囊、柱头、根尖和侧根分枝 点的脉管组织中见到。随着叶子老化，GUS染色增强。
已经为两个目的生产出表达MT的转基因植物：
1)重金属污染的土壤的植物整治：转基因烟草和Brassica植 物，经工程改造以过表达MT，对镉等重金属的毒性具有中等抗性(Suh 等人，Mol Cells.8，678-684，1998)。
2)营养质量提高，当在水稻中与肌醇六磷酸酶和铁蛋白共表达 时，改善人类的铁膳食。金属硫蛋白样蛋白，富含半胱氨酸(富含硫的 氨基酸)有助于人体消化系统吸收铁(Potrykus I(2002)Nutritional improvement of rice to reduce malnutrition in developing countries.“Plant Biotechnology 2002 and Beyond”I.K.Vasil (ed.)pp 401-406)。
鉴于不断增长的世界人口，提高农业效率和增加园艺学植物的多 样性仍然是农业研究的一个主要目标。农作物和园艺改进的传统方式 采用选择育种技术来鉴定具有需要的特性的植物。然而，这种选择育 种技术具有几个缺点，即，这些技术通常是劳动密集型的，并导致产 生经常含有异质性遗传补充的植物，其不总能导致期望的性状从亲本 植物传承。分子生物学的进展已经允许人类操纵动物和植物的胚质。 植物的遗传工程使分离和操纵遗传材料(通常以DNA或RNA的形式)以 及随后将该遗传材料引入植物成为可能。这种技术已经导致具有多种 改良的经济学、农艺学或园艺学性质的植物的产生。一种具有特别经 济利益的性状为高产量。
发明详述
现在已经惊奇地发现，调节植物中编码金属硫蛋白的核酸的表达 使植物具有改变的生长和发育。因此，根据本发明的第一个具体实施 方式，提供了一种改变植物生长和发育的方法，包括在植物中引入遗 传修饰，并选择编码金属硫蛋白的核酸在植物中经调节的表达，附带 条件是该改变的生长和发育不是增加的金属聚积或对非生物逆境增加 的耐受性或抗性。增加的金属聚积是指为了生物整治的目的或为了提 高植物的营养质量的任何金属摄取，特别是设想重金属或离子的摄入。 术语非生物逆境代表由盐、寒冷或渗透压导致的逆境，也包括氧化逆 境。
本发明的方法包括植物或植物细胞的遗传修饰。术语“遗传修饰” 指与野生型细胞相比通过人工干预在细胞的遗传内容方面的改变，包 括遗传工程、育种或诱变等技术。遗传内容的改变包括基因组的修饰， 并包括植物细胞染色体以及游离体中遗传材料的添加、缺失和置换。 该术语也包括向植物细胞中加入染色体外信息。遗传修饰优选导致核 酸的经调节的表达。本发明的方法也包括后继的选择步骤，这期间选 择具有需要的特性的植物。选择步骤可以基于监测改变的生长特性的 存在或缺乏，或基于监测与引入的感兴趣核酸相关联的选择或筛选标 记基因的存在或缺乏。
在本发明中，设想核酸的经调节的表达，特别是增加的表达。调 节(增加或减少)编码金属硫蛋白的核酸的表达或调节金属硫蛋白本 身的活性和/或水平包括在特定的细胞或组织中改变的基因表达和/ 或基因产物即多肽改变的活性和/或水平。可以通过例如化学方法和/ 或重组方法来实现改变的基因表达和/或改变的基因产物的活性和/ 或水平。调节基因的表达和/或基因产物的水平和/或调节基因产物 的活性可以直接通过调节金属硫蛋白编码基因的表达和/或直接通过 调节金属硫蛋白的活性和/或水平而实现。经调节的表达可以由内源 性金属硫蛋白基因改变的表达水平而产生和/或可以由预先引入植物 的金属硫蛋白编码核酸的改变表达而产生。类似地，金属硫蛋白经调 节的活性和/或水平可以是内源性金属硫蛋白基因表达水平改变的结 果和/或可以由预先引入植物的金属硫蛋白编码核酸的表达改变而致。 另外或可选地，上述的表达的调节可以以间接方式达到，例如可作为 降低或增加调控金属硫蛋白基因表达或影响金属硫蛋白的活性和/或 水平的因子的水平和/或活性的结果而实现。
可以方便地通过化学方法实现编码金属硫蛋白核酸的表达的调节 和/或金属硫蛋白本身的活性和/或水平的调节，即通过外源性应用一 种或多种能调节金属硫蛋白的活性和/或水平和/或能够调节金属硫蛋 白编码核酸(该核酸可以是内源性基因或引入植物中的转基因)的表达 的化合物或因子。术语“外源性应用”以其最广义包括将使细胞、组 织、器官或生物体与合适的化合物或因子接触或对其施用。该化合物 或元素可以以适合摄入的方式应用于植物(例如通过施用到土壤中通 过根来摄取，或通过直接施用于叶子，如通过喷雾)。
适合外源性应用的化合物或因子包括金属硫蛋白编码核酸和能够 与其杂交的核酸；金属硫蛋白基因产物或其同源物、衍生物或活性片 段和/或能识别或模拟所述基因产物的抗体。这些抗体可以包括“植 物抗体(plantibodies)”、单链抗体、IgG抗体和重链抗体(来自 骆驼或Camelidae的其它成员)，以及它们的片段。另外或可选地， 用相互作用蛋白或用基因/基因产物的抑制剂或活化剂接触或给予细 胞、组织、器官或生物体提供了调节编码金属硫蛋白的核酸的表达和 /或调节金属硫蛋白本身的活性和/或水平的另一外源性方式。调节 编码金属硫蛋白的核酸的表达和/或调节金属硫蛋白本身的活性和/ 或水平也可以作为直接或间接活化或灭活金属硫蛋白的因子的水平改 变的结果而实现。
植物、种子或其它植物材料也可以用诱变物质处理，实现诱变的 化学物质包括N-亚硝基-N-乙脲、乙烯亚胺、甲基磺酸乙酯或硫酸耳 二乙酯。作为选择，也可以采用电离辐射，例如γ射线或X线。引入 突变和检测突变效果(例如改变的蛋白表达和/或改变的蛋白活性)的 方法是现有技术中已知的。诱变包括采用化学致突变剂以及物理致突 变剂如辐照的方法。金属硫蛋白的任何特性均可以通过诱变而改变， 例如表达水平可以增加或降低，蛋白活性可以被改变，或金属结合性 质可调适。根据本发明的一个优选方面，诱变导致金属硫蛋白表达和 /或活性的增加。
另外或作为选择，根据本发明的一个优选具体实施方式，调节编 码金属硫蛋白的核酸的表达和/或调节金属硫蛋白本身的活性可以通 过重组方法实现。这种重组方法可以包括直接或间接途径来调节核酸 序列的表达和/或调节蛋白的活性。
例如，一种间接途径可以包括向植物中引入一种能够调节目的蛋 白(金属硫蛋白)活性和/或水平和/或目的基因(编码金属硫蛋白 的基因)表达的核酸序列。这些被引入植物中的核酸的例子包括编码 转录因子、与金属硫蛋白基因启动子结合或与金属硫蛋白相互作用的 活化剂或抑制剂的核酸。检测这些类型的相互作用和分离编码这种相 互作用物的核酸的方法为例如酵母单杂交或酵母双杂交筛选。调节金 属硫蛋白活性和/或金属硫蛋白基因表达的间接途径还包括抑制或刺 激驱动天然基因或转基因表达的调控序列，这种调控序列可以被引入 植物，例如，被引入植物的调控序列可以是能够驱动内源性金属硫蛋 白基因表达的启动子。另外，可以通过改变植物中能够与金属硫蛋白 相互作用的因子的水平而实现调节金属硫蛋白的活性。这种因子可以 包括金属硫蛋白的配体(调节物、亚单位、底物、靶标)。
另一方面，调节金属硫蛋白基因表达或调节金属硫蛋白的活性和 /或水平的直接和优选的途径包括向植物中引入编码金属硫蛋白或其 同源物、衍生物或其活性片段的核酸序列。该核酸序列可以被引入植 物，例如通过转化。因此，根据本发明的一个优选方面，提供了一种 改变植物的生长和发育的方法，特别是提高含有对植物的遗传修饰的 植物的植物产量和/或生物量的方法，该遗传修饰包括向植物中引入 金属硫蛋白编码核酸。
根据本发明的一个优选方面，设想核酸表达增强或提高。现有技 术中已经有许多文件记载了获得提高或增加的基因表达或基因产物的 方法，例如通过(强)启动子驱动的过表达以及转录增强子或翻译增 强子的应用。这里采用的术语“过表达”表示原始野生型表达水平额 外的任意形式的表达。相对于它所可操作地连接的启动子，优选引入 植物的核酸和/或在植物中过表达的核酸为有义方向。过表达的核酸优 选编码金属硫蛋白，优选下述的2型金属硫蛋白，编码金属硫蛋白的 核酸序列更优选分离自植物，优选来自双子叶植物，优选为十字花科， 进一步优选所述序列分离自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，最优 选该核酸序列如SED ID NO 1所示或其一部分，或编码如SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段。然而，应当注意 本发明的应用并非止于使用SEQ ID NO 1所示的核酸，也不止于编码 SEQ ID NO 2的氨基酸序列的核酸序列，而其它编码SED ID NO 2的 同源物、衍生物或活性片段的核酸序列或SEQ ID NO：1的部分，或与 SEQ ID NO：1杂交的序列均可应用于本发明的方法中。特别是来自其 它植物种类，例如烟草、玉米或水稻的同源物也可以用于本发明。
可选地或另外地，植物细胞中增加的金属硫蛋白编码基因的表达 或提高的金属硫蛋白的活性和/或水平可通过植物细胞的诱变而实现。 例如这些突变可造成金属硫蛋白编码基因的调控改变，导致基因更高 表达。突变也可导致蛋白构象的改变，导致蛋白更高的活性和/或水平。
术语金属硫蛋白包括与SEQ ID NO 2所示的金属硫蛋白同源的蛋 白质。金属硫蛋白在现有技术中广为人知，最近的总结和分类参见 Cobbett和Goldsbrough(2002)。金属硫蛋白是具有哑铃状构象的 小蛋白，发现其来自保守的N末端和C末端富含半胱氨酸的结构域， 由长度和氨基酸组成可变的区域彼此分开。基于一级结构可区分4种 类型的金属硫蛋白，图1中显示了不同植物金属硫蛋白的序列对比。 SEQ ID NO 2的金属硫蛋白包括保守的N末端结构域，是如Cobbett 和Goldsbrough(2002)所定义的2型金属硫蛋白典型的，该结构域包 括共有序列“MSCCGG(N/S)CGCG(T/S/A)(G/A/S)C(K/Q/S)C”，相应地， 优选可用于本发明的方法的同源物为包括该保守结构域的金属硫蛋 白。另外地和/或可选地，金属硫蛋白同源物具有金属结合活性，可 以在金属饱和测试中检测(Scheuhammer等人，Toxicol.Appl Pharmacol.82，417-425，1986)和/或可以功能作为氧化还原作用 感受器(Fabisiak等人，Methods Enzymol.353，268-281(2002))。
搜索和识别金属硫蛋白同源物的方法完全在本领域熟练技术人员 所掌握的技术范围内。这种方法包括将计算机可读形式的SEQ ID NO 1 或2代表的序列与可以在公共数据库中得到的序列进行比较，所述数 据库例如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(苷 http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核酸序列数据库 (http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)，采用现有技术中已知的 序列对比和比较的算法，例如，GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol. Biol.48，443-453(1970))、BESTFIT(采用Smith和Waterman (Advances in Applied Mathema tics 2，482-489(1981))的局部同 源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.，Gi sh，W.，Miller，W.，Myers， E.W.&Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))、FASTA 和TFASTA(W.R.Pearson and D.J.Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85，2444-2448(1988))。公众可以通过美国国立生物技术信息中 心获得进行BLAST分析的软件。采用blast默认参数(BLOSUM62矩阵， 缺口开放罚分11和缺口延伸罚分1)鉴定上述的同源物，且优选用全 长序列进行分析。
金属硫蛋白的“同源物”包括相对于未修饰的目的蛋白具有氨基 酸置换、缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，且具有与它 们衍生自的未修饰蛋白类似的生物学和功能活性。为生产这种同源物， 蛋白质的氨基酸可以被其它具有类似性质(例如类似的疏水性、亲水 性、抗原性、形成或打破α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的氨 基酸替代。现有技术中熟知保守置换表(例如参见Creighton(1984) 蛋白质，W.H.Freeman and Company)。可用于本发明的方法的同源物 与未修饰的蛋白质具有至少50％的序列同一性或相似性(功能同一 性)，或与未修饰的蛋白质具有至少60％的序列同一性或相似性，或 与未修饰的蛋白质具有至少70％的序列同一性或相似性，通常同源物 与未修饰的蛋白质具有至少80％的序列同一性或相似性，优选至少85％ 的序列同一性或相似性，进一步优选与未修饰的蛋白质具有至少90％ 的序列同一性或相似性，最优选与未修饰的蛋白质具有至少95％的序 列同一性或相似性。优选的同源物包括这样的蛋白，其含有保守序列 “MSCCGG(N/S)CGCG(T/S/A)(G/A/S)C(K/Q/S)C”，例如SEQ ID NO 4 或GenBank登录号CAA71803、AAP94016、CAA71804、NP_195858、 AAM62956、AAB61212、CAA65009、CAA92243。
同源蛋白可以被分组为“蛋白家族”，一个蛋白家族可以通过功 能和序列相似性分析例如Clustal W而定义。与金属硫蛋白同源的蛋 白的邻近关系树可由Clustal W程序产生，给出了其结构和祖先遗传 关系的良好概括。在本发明的一个特定的具体实施方式中，金属硫蛋 白同源物属于2型金属硫蛋白家族(Cobbett和Goldsbrough，2002)。 在鼠耳芥基因组中，鉴定了金属硫蛋白家族的2种2型家族成员 (GenBank登录号AAA50250、NP_195858)。在例如水稻或其它单子叶植 物的植物中，也可以鉴定金属硫蛋白的家族成员，这些家族成员都可 以方便地用于本发明的方法中。
两种特殊形式的同源-直向同源(orthologous)和共生同源 (paralogous)是用来描述基因的祖先遗传关系的进化概念。术语“共 生同源”涉及由物种基因组内一个或多个基因重复复制所产生同源基 因。术语“直向同源”涉及由这些基因的祖先遗传关系所致在不同生 物体中的同源基因。这里采用的术语“同源物”也包括了可用于本发 明方法的蛋白的共生同源物和直向同源物。
直向同源基因可以通过用感兴趣的查询基因查询一个或多个基因 数据库而鉴定，采用诸如BLAST程序。从搜索中得到的最高级别的目 标基因接着再进行BLAST分析，只有那些与查询基因再次匹配的目标 基因被保留为真正的直向同源基因。例如，为了找到鼠耳芥基因的水 稻直向同源物，可以对水稻数据库进行BLASTN或TBLASTX分析，例如 (但并不限于)在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可获得的 水稻Nipponbare数据库，或水稻的基因组序列(indica或japonica 栽培种)。下一步，得到的水稻序列被用来用鼠耳芥数据库进行反向 BLAST分析。当得到的序列用ClustalW分析并在邻近关系树状图中显 示时，结果可以被进一步精确。该方法可以用来鉴定来自许多不同物 种的直向同源物。
金属硫蛋白的“同源物”包括相对于未修饰的蛋白质具有氨基酸 置换、插入和/或缺失的蛋白质。蛋白质的“置换变异体”指那些氨 基酸序列中至少一个残基被去除且一个不同的残基插入其位置的变异 体。氨基酸置换通常为单个残基，但可以根据位于多肽的功能限制而 成簇；插入通常以大约1-10个氨基酸残基的数量级，而缺失在大约 1-20个残基的范围。氨基酸置换优选包括保守氨基酸置换。蛋白质 的“插入变异体”为那些所述蛋白质的预先确定的位置引入了一个或 多个氨基酸残基的蛋白质。插入可以包括氨基末端和/或羧基末端的融 合以及序列内单个或多个氨基酸的插入。通常在氨基酸序列内的插入 比氨基-或羧基-末端融合小，为大约1到10个残基的数量级。氨基 -或羧基-末端融合蛋白或肽的例子包括在酵母双杂交系统中采用的 转录活化剂的结合结构域或活化结构域、噬菌体外壳蛋白，(组氨酸)6- 标签，谷胱甘肽S转移酶标签，蛋白A，麦芽糖结合蛋白，双氢叶酸 还原酶，标签·100表位，c-myc表位，FLAG-表位，lacZ，CMP(钙调 蛋白结合肽)，HA表位，蛋白C表位和VSV表位。蛋白的“缺失变异 体”以从蛋白中去除一个或多个氨基酸为特征。蛋白的氨基酸变异体 可以容易地用现有技术中已知的肽合成技术制成，例如固相肽合成等 等，或通过重组DNA操作。现有技术中熟知操作DNA序列来产生蛋白 的置换、插入或缺失变异体的方法。例如，在DNA中预先确定的位点 产生置换突变的技术为本领域技术人员熟知，包括M13诱变，T7-Gen 体外诱变(USB，Cleveland，OH)，QuickChange定点诱变(Stratagene， San Diego，CA)，PCR-介导的定点诱变或其它定点诱变方案。
术语“衍生物”指与天然存在形式的蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO 2所示)相比，可以含有天然或非天然存在的氨基酸残基的置换、 缺失或添加的肽，寡肽，多肽，蛋白和酶。金属硫蛋白的“衍生物” 包括与天然存在形式多肽的氨基酸序列相比，可以含有天然存在的改 变的、糖基化、酰基化或非天然存在的氨基酸残基的肽、寡肽，多肽， 蛋白和酶。与其来源的氨基酸序列相比，衍生物也可以包括一个或多 个非氨基酸取代基，例如，与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分 子或其它配体，例如结合的促进其检测的报道分子，以及相对于天然 存在蛋白的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。
金属硫蛋白的“活性片段”或“功能片段”包括蛋白质的至少15 个，优选20个、25个，更优选30个或更多个连续邻接的氨基酸残基， 所述残基保留了与天然存在的蛋白质类似的生物学和/或功能活性。优 选的金属硫蛋白的片段至少含有上述的保守N末端结构域。
这里所定义的术语金属硫蛋白编码核酸/基因指编码金属硫蛋白 的任何核酸或其互补序列。该核酸可以从任何来源获得(直接或间接 (如果随后进行修饰))，只要该核酸在植物中表达时导致金属硫蛋 白编码核酸/基因经调节的表达或金属硫蛋白经调节的活性和/或水 平。该核酸可以从真核生物中分离，例如酵母或真菌，植物(包括藻 类)或动物(包括人类)。与其天然形式相比，通过精密的人工操作， 该核酸的组成和/或基因组环境可以被充分地改变。该核酸序列优选 为同源核酸序列，即，结构和/或功能相关的核酸序列，优选来自植 物，无论来自相同或不同的植物物种。该核酸序列优选从双子叶植物 物种中分离，优选来自十字花科(Brassiaceae)，进一步优选来自 鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，更优选该核酸为SEQ ID NO 1所 代表的核酸或其一部分，或能够与其杂交的核酸序列，该杂交序列编 码具有金属硫蛋白活性的蛋白质，即与SEQ ID NO：1类似的生物学活 性，或它是编码SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的核酸，或编码其同 源物、衍生物或活性片段。该术语也包括由于遗传密码简并性产生的 编码金属硫蛋白的核酸的变异体；编码金属硫蛋白的核酸的等位基因 变异体；编码金属硫蛋白的核酸的不同的剪接变异体及被一个或多个 间插序列中断的变异体。
本发明的方法也可以有利地采用DNA或核酸序列的部分来实施， 所述部分编码保留了金属硫蛋白活性的肽，即与SEQ ID NO：2相似的 生物学功能。DNA序列的部分指从原始(较大的)DNA分子来源或制备 的DNA片段，当在植物中表达时，该DNA部分产生具有改变的生长特 性的植物。该部分可以包括许多基因，含有或不含另外的调控元件， 或可以只包括间隔序列等。
本发明也包括能够与编码金属硫蛋白的核酸序列杂交的核酸序 列，所述核酸序列也可用于实施本发明的方法。这里定义的术语“杂 交”是实质上同源的互补核苷酸序列彼此相互退火的过程。杂交过程 可以完全在溶液中进行，即，互补核酸都在溶液中。依赖于这一过程 的分子生物学工具包括聚合酶链式反应(PCR；以及所有以此为基础的 方法)、差减杂交、随机引物延伸、核酸酶S1作图、引物延伸、反转 录、cDNA合成、RNA差异显示、以及DNA序列确定。杂交过程的发生 也可以其中一个互补核酸固定于基质例如磁珠、琼脂糖凝胶珠或任何 其它树脂。依赖于这一过程的分子生物学工具包括分离多聚(A+)mRNA。 此外，杂交过程的发生可以其中一个互补核酸固定于固体支持物，例 如硝酸纤维素或尼龙膜，或者通过如光能无机照相固定于例如硅玻璃 支持物(后者已知为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)。依赖于这一过程 的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交、噬菌斑 杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了允许杂交的发生，核酸分子通常 被加热或用化学方法变性从而由双链熔解为两条单链和/或从单链核 酸中去除发卡结构或其它二级结构。例如温度、盐浓度和杂交缓冲液 组成的条件影响着杂交的严格性。
对于需要高选择性的应用，人们通常期望采用相对严格的条件来 形成杂交体，例如，将选择相对低的盐和/或高的温度条件，如由大 约0.02M到大约0.15M NaCl在大约50℃到大约70℃的温度提供的。
因此杂交的高度严格性条件包括高温和/或低盐浓度(盐包括 NaCl和柠檬酸三钠)，但也可受到杂交缓冲液中包括甲酰胺和/或降低 杂交缓冲液中例如SDS(去污剂)的化合物的浓度和/或从杂交缓冲液 中排除诸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇等化合物(提高分子拥挤度)的影 响。特别优选足够低严格性杂交条件来分离与上文定义的本发明DNA 序列同源的核酸。导致同源性的因素包括等位性、遗传密码简并和优 选密码子应用的不同等。
在核酸杂交试验，例如Southern和Northern杂交的情形下，“严 格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”取决于序列，在不同的环境参 数下也不同。例如，较长的序列在较高的温度下特异性地杂交。Tm是 在定义的离子浓度和pH下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温 度。特异性通常受到杂交后洗涤的影响，这种洗涤的关键因素包括最 终洗涤溶液的离子浓度和温度。
通常，选择的严格条件比在定义的离子浓度和pH下特异性序列 的热熔点(Tm)低大约50℃。Tn是在定义的离子浓度和pH下，50％的 靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱 基组成，可以用下列等式计算：
Tm-79.8℃+(18.5xlog[Na+])+(58.4℃x％[G+C])-(820x(双链体中 的#bp)-1)-(0.5x％甲酰胺)
更优选的严格条件为当温度低于Tm20℃时，最优选的严格条件 为当温度低于Tm10℃时。也可以采用一些已知技术的任意一种来控 制非特异性结合，例如用含有蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中 加入异源性RNA、DNA，以及SDS，以及用Rnase处理。
洗涤条件通常在杂交严格度条件或低于杂交严格度条件实行。通 常，核酸杂交分析或基因扩增检测程序的适宜严格度条件如上所述， 可选择严格度更高或更低的条件。
为了确定严格度的水平，可以方便地参考Sambrook等人(2001) 分子克隆：实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约， 或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons， N.Y.(1989)。低严格度条件的例子为4-6×SSC/0.1-0.5％w/v SDS， 37-45℃，2-3小时。根据杂交中涉及的核酸的来源和浓度，可以采用 其它的严格度条件，例如中等严格度条件。中等严格度条件的例子包 括1-4×SSC/0.25％w/v SDS，≥45℃，2-3小时。高严格度条件的 例子包括0.1-1×SSC/0.1％w/v SDS，60℃，1-3小时。熟练技术人 员知道杂交及冲洗期间可以改变的多种参数，以及维持或改变严格度 条件的参数。例如，另一严格杂交条件是在4×SSC，65°杂交，然后 在0.1×SSC中，65℃洗涤大约1小时。另外，例示性的严格杂交条 件为在50％的甲酰胺，4×SSC中，42℃。另一严格条件的例子包括在 62℃，6×SSC、0.05×BLOTTO中杂交和在2×SSC、0.1％w/v SDS中， 62℃洗涤。
本发明的方法也可应用编码金属硫蛋白的核酸序列的可变剪接变 异体实行。这里应用的术语“可变剪接变异体”包括选择的内含子和/ 或外显子已经被切除、替代或加入的核酸序列的变异体。这种变异体 将是其中蛋白的生物活性保持不受影响的变异体，可以通过选择性地 保留蛋白的功能片段而实现。这种剪接变异体可以在自然界中发现或 人工制造。现有技术中众所周知制造这类剪接变异体的方法。因此根 据本发明的另一方面，提供了改变植物的生长特性的方法，包括调节 植物中编码金属硫蛋白的核酸序列的可变剪接变异体的表达和/或调 节由所述可变剪接变异体编码的金属硫蛋白的活性和/或水平。该剪 接变异体优选为SEQ ID NO：1所示序列的剪接变异体。
本发明的方法也可方便地采用编码金属硫蛋白的核酸序列的等位 基因变异体施行，优选SEQ ID NO：1所示的序列的等位基因变异体。 自然界中存在等位基因变异体，本发明的方法包括使用这些天然等位 基因。等位基因变异体包括单核苷酸多态性(SNPs)，以及小插入/缺失 多态性(INDBLs；INDELs的大小通常小于100bp)。在多数有机体的自 然发生的多态株系中，SNPs和INDELs组成了最大一组的序列变异体。 它们有助于基因作图和发现基因和基因功能。它们另外还有助于识别 遗传基因座，例如植物基因，涉及生长率、植物大小和植物产量、植 物活力、抗病性、逆境耐受等等的确定过程。现在可以获得识别SNPs 和/或INDELs的许多技术，包括(i)PCR，然后进行变性高效液相色 谱(DHPLC；例如Cho等人(1999)Nature Genet.23，203-207)； (ii)连续变性毛细管电泳(CDCE)与高保真PCR结合(例如， Li-Sucholeiki等人(1999)Electrophoresis 20，1224-1232)；(iii) 变性梯度凝胶电泳(Fischer和Lerman(1983)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80，1579-1583)；(iv)矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析 (MALDI-TOF MS；例如，Ross等人(2000)Biotechniques 29，620-629)； (v)实时荧光监测PCR分析(Tapp等人，(2000)Biotechniques 28， 732-738)；(vi)AcryditeTM凝胶技术(Kenney等人，(1998) Biotechniques 25，516-521)；(vii)循环双脱氧指纹识别(CddF； Langemeier等人，(1994)Biotechniques 17，484-490)；(viii)单 链构象多态性(SSCP)分析(Vidal-Puig和Moller(1994) Biotechniques 17，490-496)以及(ix)迷你测序引物延伸反应 (Syvanen(1999)Hum.Mutat.13，1-10)。‘基因组靶向诱导位点 损伤’技术(TILLING；McCallum等人，(2000)Nat.Biotechnol.18， 455-457；Plant Physiol.123，439-442)是上述(i)的变体，也可以 用于迅速地在例如表现出感兴趣表型的化学诱变的植物个体中识别改 变的基因。
在特定的常规育种程序中，例如在标志物辅助育种中，上述的等 位基因变异体的运用也包含在本发明内；这可以是它们在本发明方法 中的应用以外附加的。这种育种程序有时要求通过对植物进行诱变处 理向植物中引入等位基因变异体。一种合适的诱变方法为BMS诱变， 接着可通过例如PCR的方法来鉴定等位基因变异体，之后为选择步 骤，来选择所讨论的金属硫蛋白序列的优异等位基因变异体，该变异 体可以使植物的生长和发育发生改变。选择通常通过监测含有所讨论 序列的不同等位基因变异体的植物的生长表现进行，例如，SEQ ID NO：1的不同等位基因变异体。监测生长表现可以在温室或田野中进 行。另外可选择的步骤包括将其中鉴定了优异等位基因变异体的植物 与其它植物杂交，这可以被用于例如将感兴趣的表型特征组合起来。 因此，由于金属硫蛋白基因中的突变可以天然发生，它们可以构成选 择表现出更高产量的植物的基础。因此本发明包括编码金属硫蛋白或 能够调节金属硫蛋白的活性和/或水平的核酸在育种工程中的应用。
根据本发明的另一方面，可以在育种工程中利用能够调节编码金 属硫蛋白的核酸的表达的核苷酸序列。该核酸序列可以在染色体上， 或其一部分上，至少含有编码金属硫蛋白的核酸序列，优选还有一个 或多个相关家族成员。在一个这种育种工程的例子中，识别了一个可 以与能够调节植物中编码金属硫蛋白的核酸的表达的基因遗传连锁的 DNA标记，该基因可以是编码金属硫蛋白的基因本身或可以直接或间 接地影响编码金属硫蛋白的基因表达和/或金属硫蛋白本身的活性的 任意其它基因。接着该DNA标记可以用于育种工程中，以选择具有改 变的生长特性的植物。
本发明的方法也可以通过向植物中引入(天然或人工)染色体(例 如细菌人工染色体(BAC))的至少一部分来施行，该染色体至少含有编 码金属硫蛋白的基因/核酸序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)， 优选与一个或多个相关基因基因家族成员一起。因此，根据本发明的 另一方面，提供了一种通过向植物中引入含有至少编码金属硫蛋白的 基因/核酸的染色体的至少一部分来改变植物的生长和发育的方法。
因此，作为本发明的另一方面，提供了一种改变生长和发育的方 法，优选增加植物产量和/或生物量，包括调节、优选增加编码金属 硫蛋白的核酸序列在植物中的表达和/或调节植物中金属硫蛋白的活 性和/或水平，其中所述的核酸序列和所述的蛋白质包括选自下列的 变异体：
(i)SEQ ID NO：1所示的或编码SEQ ID NO：2所示的金属硫蛋 白的核酸；
(ii)编码金属硫蛋白的核酸序列的可变剪接变异体或其中所述 的金属硫蛋白由剪接变异体编码；
(iii)编码金属硫蛋白的核酸序列的等位基因变异体或其中所述 的金属硫蛋白由等位基因变异体编码；
(iv)编码金属硫蛋白的功能部分的核酸；
(v)SBQ ID NO：2所示的金属硫蛋白；
(vi)金属硫蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
根据本发明的一个方面，设想核酸的表达增强或提高。现有技术 中已经有许多文件记载了获得增强或提高的基因或基因产物表达的方 法，包括例如(强)启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子 的应用。这里采用的术语过表达表示原始野生型表达水平附加的任意 形式的表达。相对于它所可操作地连接的启动子，优选引入植物和/ 或在植物中过表达的核酸为有义方向。过表达的核酸优选编码金属硫 蛋白，该编码金属硫蛋白的核酸序列更优选从双子叶植物中分离，优 选来自十字花科，更优选其中该序列分离自鼠耳芥，该核酸序列最优 选如SED ID NO 1所示或其一部分，或编码SEQ ID NO 2所示的氨基 酸序列或其同源物、衍生物或活性片段。可选地，该编码金属硫蛋白 的核酸序列如SED ID NO 3所示或是其一部分，或编码SEQ ID NO 4 所示的氨基酸序列或编码其同源物、衍生物或活性片段。应当注意本 发明的应用并非仅限于SEQ ID NO 1所示的核酸的应用，也不限于编 码SBQ ID NO 2的氨基酸序列的核酸序列，而其它编码SED ID NO 2 的同源物、衍生物或活性片段的核酸序列或SEQ ID NO：1的部分，或 与SEQ ID NO：1杂交的序列均可应用于本发明的方法中。
根据本发明的另一方面，设想核酸序列表达下降。调节基因表达 (通过直接或间接方法)包括改变基因的转录物水平。改变转录物水平 可能足以诱导某些表型效应，例如通过共抑制机理。这里转基因过表 达的总体效应是，细胞中与引入的转基因有同源性的天然基因编码的 蛋白质的活性较小，其它降低表达的例子在现有技术中也已经有许多 文件说明，包括，例如通过反义技术、共抑制技术、RNAi技术、小干 扰RNAs(siRNAs)和微RNA(miRNA)、核酶的应用等等下调表达。因 此根据本发明的一个特定方面，提供了调节植物生长特性的方法，包 括基于反义转录物(与金属硫蛋白基因的mRNA互补)的合成、或基于 RNA干扰的技术。本发明的方法可以方便地通过下调编码金属硫蛋白 的核酸序列来施行。具有改变的生长特性的植物可以通过以有义或反 义方向表达编码金属硫蛋白的核酸序列而获得。下调技术是现有技术 中众所周知的。这里采用的术语表达的“基因静默”或“下调”指降 低基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的 水平。这种表达的降低可以通过例如加入有义方向(如果需要实现共抑 制)的编码序列或其部分来完成。因此，根据本发明的一个方面，可以 通过向植物中引入额外拷贝的(全长或部分)宿主植物中已经存在的 金属硫蛋白基因而改变植物的生长。额外的基因将使内源性基因静默， 产生已知为共抑制的现象。
以基因表达静默为目的的遗传构建体可以包括金属硫蛋白核苷酸 序列，例如SEQ ID NO：1所示(或其一个或多个部分)，相对于启动 子序列为有义和/或反义方向。本发明的方法中也可以利用正向或反向 重复形式的内源基因的至少一部分的有义或反义拷贝。植物的生长特 性也可以通过向植物中引入例如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的反 义形式的至少一部分而改变。应当清楚部分核酸(一部分)可以达到需 要的结果。同源反义基因优于异源反义基因，同源基因为植物基因， 优选来自同样植物物种的植物基因，异源基因为来自非植物物种的基 因。
另一个下调基因表达或基因静默的方法包括采用核酶，如Atkins 等人1994(WO 94/00012)，Lenee等人1995(WO 95/03404)，Lutziger 等人2000(WO 00/00619)，Prinsen等人1997(WO 97/3865)以及 Scott等人1997(WO 97/38116)所描述的。
基因静默也可以通过插入诱变而达到(例如，T-DNA插入或转座子 插入)，或通过Angell和Baulcombe 1998(WO 98/36083)，Lowe等 人1989(WO 98/53083)，Lederer等人1999(WO 99/15682)或Wang 等人1999(WO 99/53050)所描述的基因静默策略。如果内源基因含有 突变，则内源基因的表达也可以下降，为了得到具有改良的生长特性 的植物，这样的突变基因可以被分离并引入同样或不同的植物物种。
本发明的方法的实行可以方便地导致植物具有多种改变的生长特 性，这些改变的生长特性包括各自相对于相应的野生型植物改变的生 长、改变的产量/生物量、改变的结构和改变的细胞分裂。改变的生 长特性优选为改善的生长特性，包括改变的结构；增加的产量/生物 量，条件是增加的产量并非增加的金属聚积；改变的逆境反应，条件 是逆境并非非生物逆境；以及更快的生长，均相对于相应的野生型植 物而言。
本发明涉及改变植物的生长特性的方法或生产具有改变的生长特 性的植物的方法，其中生长特性包括选自下列的任意一种或多种：增 加的产量、增加的生物量、增加的总地上面积、增加的植物高度、增 加的分蘖数目、增加的初级圆锥花序的数目、增加的第二圆锥花序的 数目、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的每株植物的总种 子产量、增加的收获指数、增加的千粒重、增加的Tmid、增加的T45 或A90、增加的A42、改变的周期时间和/或改变的生长曲线。本发明 也提供了改变上述生长特性其中之一的方法，而不导致对其它生长特 性之一不利，例如地上绿色组织面积的增加而保持同样数目的饱满种 子数和同样的种子产量。
术语“增加的产量”包括相对于相应的野生型植物的生物量而言 植物的一个或多个部分的生物量的提高。该术语也包括种子产量的提 高，包括种子的生物量(种子重量)的增加和/或(饱满)种子数目 的增加和/或种子大小和/或种子体积的增加，每种均相对于相应的 野生型植物而言。对玉米，种子产量的增加可反映在每穗的行数(种子) 的增加和/或每行的谷粒数的增加。种子大小和/或体积的增加也可 能影响种子的组成。种子产量的增加可以是由于花的数目和/或大小 的增加。产量的增加也可以增加收获指数，表示为总生物量相对于诸 如种子等可收获部分的产量的比例；或千粒重。增加的产量也包括以 更高密度(每公顷或每亩的植物数)种植的能力。
改变的细胞分裂也可以有助于产量提高。术语“改变的细胞分裂” 包括细胞分裂的增加或降低或异常的细胞分裂/胞质分裂、改变的分 裂平面、改变的细胞极性、改变的细胞分化。该术语也包括例如核内 有丝分裂、非胞质分裂(acytokinesis)、多倍性、多线性和核内复 制等的现象。可以设想具有增加的生物量和高度的植物与相应的野生 型植物相比表现出改变的生长率。这里采用的术语“改变的生长率” 包括但不仅限于在植物生命周期中的一个或多个阶段，植物的一个或 多个部分(包括绿色生物量和包括种子)更快的生长率。术语“改变的 生长”包括增加的活力、更早的开花、改变的周期时间。具有改变的 生长的植物可以表现出改变的生长曲线并可以具有改变的Tmid或T90 值(分别为达到它们的最大面积的一半或它们面积的90％所需要的时 间，均相对于相应的野生型植物)。
根据本发明的一个优选的特征，本发明的方法的完成导致植物具 有增加的产量和/或增加的生物量。特别地，本发明的方法的完成导 致植物具有增加的种子产量，增加的产量优选包括相对于对照植物增 加的种子总数和/或增加的种子总重。因此，根据本发明，提供了一 种提高植物产量的方法，该方法包括在植物中调节编码金属硫蛋白的 核酸序列的表达和/或调节金属硫蛋白本身的活性，优选其中金属硫 蛋白由SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其一部分或由能够与其杂交 的序列编码，或其中金属硫蛋白为如SEQ ID NO：2所示或其同源物、 衍生物或活性片段。可选地，金属硫蛋白可以由如SED ID NO 3所示 的核酸序列或其一部分或能够与其杂交的序列编码，或其中金属硫蛋 白为SEQ ID NO 4所示或任何其同源物、衍生物或活性片段。
“改变的结构”可以由于细胞分裂的变化所致。这里采用的术语 “结构(architecture)”包括植物的外观或形态学，包括任何一个或 多个结构特征或其结构特征的组合。这种结构特征包括植物的任意细 胞、组织或器官或细胞、组织或器官的组的形状、大小、数量、位置、 质地、排列和模式，包括根、叶、芽、茎或分蘖、叶柄、毛状体、花、 花序(对于单子叶和双子叶植物)、圆锥花序、花瓣、柱头、花柱、 雄性花蕊、花粉、胚珠、种子、胚芽、胚乳、种子表皮、糊粉、须根、 形成层、木质、赤木质、薄壁组织、通气组织、筛分子、韧皮部或者 脉管组织等等。因此改变的结构包括植物的改变的生长的所有方面。
改变的结构优选包括改变的初级圆锥花序的数目、改变的植物高 度和改变的总面积，均相对于对照植物而言。因此，根据本发明，提 供了一种改变植物的结构的方法，特别是初级圆锥花序的数目、植物 高度和植物面积，该方法包括调节植物中编码金属硫蛋白的核酸序列 的表达和/或调节金属硫蛋白本身的活性，优选其中金属硫蛋白由 SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其一部分或由能够与其杂交的序列编 码，或其中金属硫蛋白为如SEQ ID NO：2所示或其同源物、衍生物或 活性片段。可选地，金属硫蛋白可以由如SED ID NO 3所示的核酸序 列或其一部分或能与上述序列杂交的序列编码，或其中金属硫蛋白为 SEQ ID NO 4所示或其同源物、衍生物或活性片段。
根据本发明的第二具体实施方式，提供了有助于在本发明方法有 用的核酸序列的引入和/或表达的遗传构建体和载体，因此根据本发明 的第二种具体实施方式，提供了一种基因构建体，包括：
(i)编码金属硫蛋白的核酸序列；
(ii)驱动(i)的核酸序列表达的GOS2启动子；以及任选地
(iii)转录终止序列。
用于本发明的方法的构建体可以用本领域技术人员熟知的重组 DNA技术构建。该基因构建体可以被插入载体，载体可以购买得到， 适合于转化入植物并适合感兴趣基因在转化细胞中表达。遗传构建体 可以为表达载体，其中核酸序列可操作性地与一个或多个允许在原核 和/或真核宿主细胞中表达的调控序列连接。
根据本发明的一个优选的具体实施方式，遗传构建体为表达载体， 设计用于过表达所述核酸序列。能够调节编码金属硫蛋白的核酸的表 达和/或金属硫蛋白本身的活性的核酸序列可以为编码金属硫蛋白或 其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列，例如这里前述的任意的核 酸序列。优选的核酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列或其一部分，或 能够与其杂交的序列，或编码SEQ ID NO：2所示的序列或其同源物、 衍生物或活性片段的核酸序列。该核酸优选相对于它操作性连接的调 控序列以有义方向克隆。
用含有感兴趣序列(即能够调节编码金属硫蛋白的核酸的表达的 核酸序列)的载体转化植物，该序列与一个或多个调控序列(至少启 动子)可操作地连接。术语“调控元件”、“调控序列”、“控制序 列”和“启动子”在这里均可互换使用并以其广义理解为指能够实现 它们所连接的序列的表达的调节核酸序列。被前述术语包括的有来源 于经典的真核基因组基因的转录调节序列(包括精确的转录起始所需 的TATA框，具有或不具有CCAAT框序列)以及附加的调控元件(即， 上游活化序列，增强子和静默子)，其响应发育和/或外部刺激或以组 织特异性的方式而改变基因表达。一种经典的原核基因的转录调控序 列也包含在该术语范围内，在该情形下，它可以包括一个-35框序列 和/或-10框转录调节序列。术语“调控元件”也包含赋予、活化或 增强细胞、组织或器官中核酸分子表达的合成融合分子或衍生物。术 语“控制序列”、“调控序列”、“调控元件”和“启动子”这里可 互换使用。这里采用的术语“可操作性连接”指在启动子序列和感兴 趣基因之间的功能性连接，从而使启动子序列能够起始感兴趣基因的 转录。
可以根据需要的结果方便地采用任意类型的启动子来驱动核酸序 列的表达。能够调节编码金属硫蛋白的基因表达的核酸序列优选与组 成型启动子可操作性地连接。这里定义的术语“组成型”指在植物至 少一种组织或器官中和在任意生命阶段占支配地位表达的启动子。启 动子优选在整个植物中占优势表达。组成型启动子优选为来自水稻的 GOS2启动子，或具有相似强度的启动子和/或具有相似表达模式的启 动子。可选地，可以采用组织特异性启动子。例如，在设想增加的种 子产量的情况下，可以想到采用种子优先、花优先、分生组织优先的 启动子，或在分裂细胞中有活性的启动子。启动子强度和/或表达模 式可以通过例如将该启动子与报道基因偶联并检测报道基因在不同的 植物组织中的表达来分析。一个本领域技术人员熟知的合适的报道基 因为β-葡糖醛酸糖苷酶。
可选的组成型启动子的例子列于表1，这些启动子或其衍生物均 可用于本发明的方法。
表1：可用于实施本发明的组成型启动子 基因来源 参考文献 肌动蛋白 McElroy等人，Plant Cell，2： 163-171，1990 CAMV 35S Odell等人，Nature，313：810-812， 1985 CaMV 19S Nilsson等人，Physiol.Plant. 100：456-462，1997 GOS2 dePater等人，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992 遍在蛋白 Christensen等人，Plant Mol. Biol.18：675-689，1992 水稻亲环蛋白 Buchholz等人，Plant Mol Biol. 25(5)：837-43，1994 玉米H 3组蛋白 Lepetit等人，Mol.Gen.Genet. 231：276-285，1992 肌动蛋白2 An等人，Plant J.10(1)；107-121， 1996
任选地，在引入植物的构建体中还可以采用一个或多个终止序列。 术语“终止子”包括为在转录单位末端的DNA序列的控制序列，它发 出初级转录物的3’加工处理和聚腺苷酸化以及转录终止的信号。其它 调控元件可以包括转录和翻译增强子。本领域技术人员已知适合用于 本发明的终止子和增强子序列，本领域技术人员会知道并容易得到这 种序列。
本发明的遗传构建体可以进一步包括复制起点序列，它是在特定 细胞类型中保持和/或复制所需的，例如细菌细胞，当遗传构建体需 要在细胞中作为游离型遗传元件(如，质粒或粘粒分子)保持的时候。 优选的复制起点包括但并不限于fl-ori和colE1复制起点。
该遗传构建体可以任选地包括选择标志基因，这里采用的术语“选 择标志基因”包括赋予细胞一种表型的任意基因，它在该细胞中表达 以协助识别和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。合 适的标志物可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标志物，其引入新的 代谢性状或允许观察选择。选择标志基因的例子包括赋予对抗生素的 抗性(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或能够磷酸化潮霉素的 hpt)，对除草剂的抗性(例如bar，提供对Basta的抗性；aroA或gox， 提供对草甘膦的抗性)的基因，或提供代谢性状的基因(如manA，允许 植物利用甘露糖作为唯一的碳源)。可见的标志基因导致颜色的形成 (例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)，发光(例如荧光素酶)或荧光(绿色荧 光蛋白，GFP，和其衍生物)。
在一个优选的具体实施方式中，上述的遗传构建体包括以有义方 向与启动子偶联的金属硫蛋白基因，该启动子优选为组成型启动子， 例如水稻GOS2启动子。因此，本发明的另一方面为一种含有SEQ ID NO 7的表达盒的载体构建体，该表达盒含有水稻GOS2启动子，SEQ ID NO 2所示的鼠耳芥金属硫蛋白基因以及T-zein+T-rubisco deltaGA转 录终止序列。
另外，本发明提供了一种含有基本上与SEQ ID NO 7相似的表达 盒的载体构建体，基本上与SEQ ID NO 7相似的序列包括编码与SEQ ID NO 2同源的蛋白质或与SEQ ID NO 1杂交的第一核酸序列，该第一核 酸序列与水稻GOS2启动子或具有类似的表达模式的启动子可操作性 地连接和/或该第一核酸序列与转录终止序列连接。因此根据本发明 的另一方面，提供了一种基本上与SEQ ID NO 7相似的基因构建体， 其包含编码金属硫蛋白的核酸序列位于其中的表达盒，所述核酸序列 选自包括以下核酸序列的组：
(i)SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其互补链；
(ii)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其同源物、衍生物 或活性片段的核酸序列；
(iii)根据以上(i)到(ii)作为遗传密码结果简并的核酸序列；
(iv)为根据(i)到(iii)的核酸序列的等位基因变异体的核酸序 列；
(v)为根据(i)到(iv)的核酸序列的可变剪接变异体的核酸序 列；
本发明还包括可通过本发明的方法得到的植物。本发明因此提供 可通过本发明的方法所得到的植物，该植物具有改变的生长和发育， 该植物具有改变的金属硫蛋白活性和/或改变的编码金属硫蛋白的核 酸序列的表达。该植物优选为含有引入的编码金属硫蛋白的核酸序列 的转基因植物，具有增加的产量和/或生物量，其特征在于根据编码 金属硫蛋白的核酸序列的经调节的表达和/或金属硫蛋白经调节的活 性选择了转基因植物。进一步优选根据编码金属硫蛋白的核酸的增加 的表达选择了转基因植物。
根据本发明的第三个具体实施方式，提供了一种生产具有改变的 生长特性的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达上述的编码 金属硫蛋白的核酸分子。
更具体而言，本发明提供了一种生产具有改变的生长特性的转基 因植物的方法，该方法包括：
(i)向植物或植物细胞中引入编码金属硫蛋白或其同源物、衍 生物或活性片段的核酸序列或其一部分；
(ii)从转基因植物细胞再生和/或生长植物。
蛋白本身和/或核酸本身可以被直接引入植物细胞或植物本身 (包括引入植物的组织、器官或任何其它部分)。根据本发明的一个优 选特征，核酸序列优选通过转化引入植物。核酸序列优选为SEQ ID NO： 1所示或其一部分或能够与其杂交的序列，或是编码SEQ ID NO：2所 示的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列。可选地， 核酸序列为如SED ID NO 3所示或其一部分，或能够与任何上述序列 杂交的序列。可选地氨基酸序列可以为SEQ ID NO 4所示的序列或其 同源物、衍生物或活性片段。
这里涉及的术语“转化”包括将外源性多核苷酸转移到宿主细胞 中，而不考虑用来转移的方法。能够随后进行无性繁殖的植物组织， 无论通过器官形成或胚胎形成，都可以用本发明的基因构建体来转化， 整株植物从其再生。选择的特定组织将根据对于所转化的特定物种可 利用且最适的无性繁殖系统而变化。例示性的组织靶包括叶片、花粉、 胚、子叶、胚轴、雌配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如，尖分 生组织，叶腋芽，以及根分生组织)，和诱导的分生组织(例如，子叶 分生组织和胚轴分生组织)。多核苷酸可以被瞬时或稳定引入宿主细胞 并可以保持非整合，例如，作为质粒。可选地，它可以整合入宿主基 因组，获得的转化植物细胞可以用于以本领域技术人员已知的方式再 生转化植物。
目前植物物种的转化是一种相当常规的技术，可以方便地采用几 种转化方法的任意一种来将感兴趣基因引入合适的祖先细胞。转化方 法包括运用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄入的化学物质、将DNA 直接注射入植物中、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化或显微发射。方 法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等， 1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol. Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；向植物材料微注射(Crossway A.等， 1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA-包被粒子轰击 (Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)用(非整合)病毒感染等 等。表达金属硫蛋白编码基因的转基因水稻植物优选采用任何已知的 水稻转化方法通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化产生，例如任 何下列文献所描述的：公开的欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita 和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人.(Plant Mol. Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人.(Plant J.6(2)271-282， 1994)，其公开内容在这里作为参考引用，如同全部列出一样。在玉 米转化的情形，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)：745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002May；129(1)： 13-22)所描述，其公开内容在这里作为参考引用，如同全部列出一样。
通常转化后，选择植物细胞或细胞组中一个或多个标志物的存在， 该标志物由与感兴趣基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化 材料再生为完整的植株。
DNA转移和再生后，可以运用例如Southern分析等评估推定转化 植物中感兴趣基因的存在、拷贝数和/或基因组结构构成，可选地或 附加地，新引入的DNA的表达水平可以用Northern和/或Western 分析监测，两种技术都为本领域普通技术人员所熟知。
本发明因此还包括含有引入的编码金属硫蛋白的核酸和具有如上 定义的改变的生长和发育的转基因植物，特征在于改变的生长和发育 是编码金属硫蛋白的核酸经调节的表达的结果。进一步选择转基因植 物编码金属硫蛋白的核酸经调节的表达。优选选择转基因植物编码金 属硫蛋白的核酸的增加表达。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过无性繁殖或经典 育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花受精产生纯合的第 二代(或T2)转化体，T2植物进一步通过经典育种技术繁殖。
产生的转化生物体可以采取多种形式，例如它们可以是转化细胞 和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有细胞都被转化含有表 达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如，在植物中，将转化的根茎 嫁接到未转化的幼芽上)。
本发明显然延伸至这里描述的任意方法所产生的任意植物细胞或 植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明进一步延伸，包含了 由任意的前述方法产生的初级转化或转染细胞、组织、器官或整株植 物的后代，唯一的要求为后代表现出与通过本发明的方法在亲本中产 生的同样的基因型和/或表型特征。本发明也包括含有分离的编码能够 调节金属硫蛋白的蛋白的核酸分子的宿主细胞，优选其中该蛋白为金 属硫蛋白。本发明的优选的宿主细胞为植物细胞。因此，本发明也包 括具有改变的生长特性的宿主细胞或转基因植物，其特征在于所述的 宿主细胞或转基因植物具有编码金属硫蛋白的核酸序列的经调节的表 达和/或金属硫蛋白的经调节的活性和/或水平。本发明也扩展到植 物的可收获部分，例如但并不限于种子、叶、果实、花、茎培养、根 茎、块茎和鳞茎。
这里采用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代以及 植物部分，包括种子、枝条、茎、根(包括块茎)和植物细胞、组织 和器官。术语“植物”因此也包括悬浮培养物、胚胎、分生组织区域、 愈伤组织、叶、种子、根、枝条、配偶体、孢子体、花粉以及小孢子。 本发明的方法中特别有用的植物包括藻类、蕨类植物以及所有属于 Viridiplantae超家族的植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包 括饲料或草料豆类、装饰植物、食用农作物、树木、或灌木，从包括 下列植物的列表中选择：金合欢属(Acacia spp.)，槭树属(Acer spp.)，猕猴桃属(Actinidia spp.)，七叶树属(Aesculus spp.)， 新西兰贝壳杉(Agathis australis)，Albizia amara，Alsophila tricolor，须芒草属(Andropogon spp.)，落花生属(Arachis spp.)， 槟榔(Areca catechu)，Astelia fragrans，Astragalus cider， Baikiaea plurijuga，桦木属(Betula spp.)，芸苔属(Brassica spp.)， 木榄(Bruguiera gymnorrhiza)，Burkea africana，紫铆(Butea frondosa)，Cadaba farinosa，朱缨花属(Calliandra spp，)，大叶 茶(Camellia sinensis)，美入蕉(Canna indica)，辣椒属(Capsicum spp.)，决明属(Cassia spp.)，Centroema pubescens，木瓜属 (Chaenomeles spp.)，肉桂(Cinnamomum cassia)，小果咖啡(Coffea arabica)，Colophospermum mopane，变异小冠花(Coronillia varia)， Cotoneaster serotina，山楂属(Crataegsu spp.)，香瓜属(Cucumis spp.)，柏木属(Cupressus spp.)，Cyathea dealbata，榅桲(Cydonia oblonga)，日本柳杉(Cryptomeria japonica)，香茅属(Cymbopogon spp.)，Cynthea dealbata，榅桲(Cydonia oblonga)，Dalbergia monetaria，大叶骨碎补(Davallia divaricata)，角丝鼓藻属 (Desmodium spp.)，粗糙蚌壳蕨(Dicksonia squarosa)， Diheteropogon amplectens，Dioclea spp，镰扁豆属(Dolichos spp.)， Dorycnium rectum，Echinochloa Pyramidalis，Ehrartia spp.，移 子(Eleusine coracana)，Eragrestis spp.，刺桐属(Erythrina spp.)， 桉属(Eucalyptus spp.)，Euclea schimperi，Eulalia villosa，荞 麦属(Fagopyrum spp.)，费约果(Feijoa sellowiana)，草莓属 (Fragaria spp.)，千斤拔属(Flemingia spp)，Freycinetia banksii， Geraniun thunbergii，银杏(Ginkgo biloba)，Glycine javanica， Gliricidia spp，陆地棉(Gossypium hirsutum)，银桦属(Grevillea spp.)，Guibourtia coleosperma，岩黄芪属(Hedysarum spp.)，牛 鞭草(Hemarthia altissima)，扭黄茅(Heteropogon contortus)， 大麦(Hordeum vulgare)，Hyparrhenia rufa，小连翘(Hypericum erectum)，Hyperthelia dissoluta，Indigo incarnata，鸢尾属(Iris spp.)，Leptarrhena Pyrolifolia，胡枝子属(Lespediza spp.)， Lettuca spp.，Leucaena leucocephala，Loudetiasimplex，Lotonus bainesii，百脉根属(Lotus spp.)，Macrotyloma axillare，苹果 属(Malus spp.)，Manihot esculenta，紫苜蓿(Medicago sativa)， 水杉(Metasequoia glyptostroboides)，大蕉(Msa sapientum)，烟 草属(Nicotiana spp.)，驴食豆属(onobrychis spp.)，ornithopus spp.，稻属(Oryza spp.)，Peltophorum africanum，狼尾草属 (Pennisetum spp.)，Persea gratissima，碧冬茄属(Petunia spp.)， 菜豆属(Phaseolus spp.)，槟榔竹(Phoenix canariensis)，Phormium cookianum，石楠属(Photinia spp.)，白云杉(Picea glauca)，松 属(Pinus spp.)，豌豆(Pisum sativum)，新西兰罗汉松(Podocarpus totara)，Pogonarthria fleckii，Pogonarthria squarrosa，杨属 (Populus spp.)，牧豆树(Prosopis cineraria)，花旗松(Pseudotsuga menziesii)，Pterolobium stellatum，西洋梨(Pyrus communis)， 栎属(Quercus spp.)，Rhaphiolepsis umbellata，美味棒花棕 (Rhopalostylis sapida)，Rhus natalensis，欧洲醋栗(Ribes grossularia)，茶藨子属(Ribes spp.)，洋槐(Robinia pseudoacacia)，蔷薇属(Rosa spp.)，悬钩子属(Rubus spp.)，柳属 (Salix spp.)，Schyzachyrium sanguineum，金松(Sciadopitys verticillata)，北美红杉(Sequoia sempervirens)，巨杉 (Sequoiadendron giganteum)，两色蜀黍(Sorghum bicolor)，菠菜 属(spinacia spp.)，sporobolus fimbriatus，Stiburus alopecuroides，Stylosanthos humilis，葫芦茶属(金属硫蛋白ehagi spp)，落羽杉(Taxodium distichum)，阿拉伯黄背草(Themeda triandra)，车轴草属(Trifolium spp.)，小麦属(Triticum spp.)， 异叶铁杉(Tsuga heterophylla)，越桔属(Vaccinium spp.)，野豌豆 属(Vicia spp.)，葡萄(Vitis vinifera)，锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)，马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)，玉蜀黍(Zea mays)，苋属(amaranth)，朝鲜蓟、芦笋、茎椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、 油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、绿叶菜、亚麻、散叶甘蓝、 小扁豆、含油种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜 菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜和茶、树木和藻类等。根据本发明的 优选特征，植物为农作物，包括大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽 或棉花。进一步优选地，根据本发明的植物为单子叶植物，例如甘蔗， 最优选为谷类，如水稻、玉米、小麦、粟、大麦、燕麦、高梁。
然而，设想本发明的方法可以应用于广泛种类的植物，因为在已 知的真核生物金属硫蛋白同源物中的高度序列保守性提示其在细胞代 谢中同样保守的功能。
本发明也涉及金属硫蛋白或编码金属硫蛋白的核酸在改变植物的 生长和发育中的应用，优选在改变植物的生长特性中的应用，优选提 高产量和/或生物量和改变植物的结构，条件是所述改变的生长和发 育并非增加的金属的聚积或对非生物逆境增加的耐受性和抗性。核酸 序列优选为SEQ ID NO：1所示或其一部分，或能够与之杂交的序列， 或为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段。 优选地，产量和/或生物量的提高为种子产量的增加，更优选种子产 量的增加包括种子总数、种子总重以及更高数目的初级圆锥花序中的 一项或多项。
本发明也涉及编码金属硫蛋白及其同源物、衍生物和活性片段的 核酸序列的应用和金属硫蛋白本身及其同源物、衍生物和活性片段的 应用，作为生长调节剂。这里前文所述的核酸序列(及其部分和能够 与其杂交的序列)以及这里前述的氨基酸序列(及其同源物、衍生物 和活性片段)均可用于改变植物的生长特性，如前文所述。因此该序 列可以用作生长调节剂，刺激或抑制植物生长。因此本发明提供了含 有SEQ ID NO 2所示的蛋白质或其同源物、衍生物或活性片段的组合 物，用于提高植物的产量和/或生物量。本发明另外提供了含有SEQ ID NO 1所示的核酸或其部分或能够与其杂交的序列的组合物，用于提高 植物的产量和/或生物量。本发明也提供了一种含有任意上述氨基酸 序列所示的蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的组合物，用作生长 调节剂。
相反地，本发明的序列也可以为农用化学化合物的感兴趣靶标， 例如除草剂或生长刺激剂。相应地，本发明包含将前述的核酸序列(或 其一部分和能够与其杂交的序列)或前述的氨基酸序列(或其同源物、 衍生物和活性片段)作为农用化学化合物例如除草剂或生长刺激剂的 靶标的应用。
如上所述，本发明的方法导致具有改变的植物生长特性的植物， 这些有利的生长特性还可以与其它的经济学上有利的性状相结合，例 如进一步增加产量的性状、对各种逆境的耐受性、改变各种结构特征 和/或生物化学和/或生理学特征的性状。本发明的方法也可以通过 将编码金属硫蛋白的基因与至少一种与编码金属硫蛋白的基因协作的 其它基因在植物中共表达而实施。
附图说明
本发明将参考下列附图进行描述，其中：
图1：不同植物金属硫蛋白序列的对比(Cobbett和Goldsbrough， 2002)。N末端和C末端区域的保守半胱氨酸用星号表示。缩写：At， Arabidopsis vulgaris，Bn，油菜(Brassica napus)，Os，稻(Oryza sativa)，Ps，豌豆(Pisum sativum)，Ms，紫花苜蓿(Medicago sativa)， Bo，卷心菜(Brassica oleracea)，Ph，矮牵牛(Petunia hybrida)， Sv，蝇子草(Silene vulgaris )，Ma，香蕉(Musa acuminata)， Ad，猕猴桃(Actinidia deliciosa)，Gh，Gossipium hirsutum， Pg，白云杉(Picea glauca)，Zm，玉米(Zea mays)，Ta，小麦(Triticum aestivum)。
图2：进入克隆p33的示意图，在AttL1和AttL2位点内含有在 pDONR201的主链内进行Gateway克隆的CDS1585，。CDS1585为鼠耳 芥(Arabidopsis thaliana)金属硫蛋白样AtMT2a编码序列的内在 密码子。该载体还含有一个细菌卡那霉素抗性盒和细菌复制起点。
图3：在水稻GOS2启动子(PR00129)的控制下，在水稻(Oryza sativa)中表达鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)金属硫蛋白样AtMT2a 基因(CDS1585)的二元载体。该载体含有来源于Ti质粒的T-DNA，被 左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界(RB重复，RB Ti C58))限定。 从左边界到右边界，该T-DNA含有：用于转化植物的抗生素选择的盒； 用于转化植物的视觉观察筛选的盒；表达鼠耳芥金属硫蛋白样AtMT2a 基因的PRO0129-CDS1585-zein和rbcS-deltaGA双终止子表达盒 (SEQ ID NO 7)。该载体还含有来自pBR322的复制起点以进行细菌复 制，以及一个选择标记物(Spe/SmeR)，以用壮观霉素和链霉素进行细 菌选择。
图4：序列表。
实施例
本发明将参考仅作为例示的下列实施例加以描述。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001) 分子克隆：实验室手册，第三版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约) 或第1和2卷的Ausubel等人(1984)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols中所描述的标准操作程序进 行。植物分子工作的标准材料和方法在Plant Molecular Biology Labfase(1993)中描述，作者R.D.D. Croy，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK) 出版。
实施例1.CDS0851的克隆
采用鼠耳芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板 通过PCR技术扩增鼠耳芥金属硫蛋白编码序列AtMT2a(CDS1585)。
从幼苗中提取的RNA反转录后，将cDNA克隆入pCMV Sport 6.0。库 的平均插入物大小为1.5kb，克隆的原始数目为1.59×107cfu。原始 效价测定为9.6×105cfu/ml，在第一次扩增后变为6×1011cfu/ml。提 取质粒后，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。包括用于Gateway 重组的AttB位点的引物prm03240(SEQ ID NO 5)和prm03241(SEQ ID NO 6)用于PCR扩增。用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下进行 PCR。246bp的PCR片段被扩增并也用标准方法纯化。接着进行 Gateway操作程序的第一步，BP反应，其中PCR片段在体内与pDONR201 质粒重组产生按照Gateway术语学命名的“进入克隆(entry clone)” p33(图1)。质粒PDONR201从Invitrogen购买，作为Gateway技术 的一部分。
实施例2：载体构建用于PRO0129-CDS1585盒转化
随后进入克隆p33被用于与p0640-一个用于水稻转化的目的载 体(destination vector)-的LR反应。该载体在T-DNA界限的范围 内含有作为功能元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒；以及旨在 与已经克隆入进入克隆感兴趣序列进行LR体内重组的Gateway盒。用 于组成性表达的水稻GOS2启动子(PRO0129)位于该Gateway盒的上游。
LR重组步骤后，得到的表达载体p34(图2)可以被转化入农杆 菌属菌株LBA4044，并随后引入水稻植株中。
实施例3：用PRO0129-CDS1585转化水稻
将水稻japonica栽培种Nipponbare的成熟干种子脱壳。通过 将种子在70％乙醇中孵育1分钟，然后在0.2％HgCl2中30分钟，并用 无菌蒸馏水15分钟洗涤6次，进行灭菌。接着使无菌的种子在含有 2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)中发芽。在黑暗中孵育4周后， 将形成胚胎的、来源于子叶盘的愈伤组织切下并在同样的培养基中繁 殖。2周后，通过在同样的培养基中再培养2周而增殖或繁殖愈伤组 织。在共同培养前3天，将胚胎形成的愈伤组织片在新鲜的培养基中 再培养以加强细胞分裂活性。携带二元载体p3076的农杆菌属菌株 LBA4044用于共培养。在28℃将农杆菌菌株在含适宜抗生素的AB培 养基上培养3天。接着收集细菌并以大约为1的OD600悬浮在液体共培 养培养基中。将悬浮液转移到陪替氏培养皿，将愈伤组织在悬浮液中 沉浸15分钟。接着将愈伤组织在滤纸上点干，转移到固化的共培养培 养基中，并在黑暗中25℃孵育3天。
然后将共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中在合适浓度的 选择试剂的存在下，在28℃的黑暗中生长4周。在此期间，迅速生长 的抗性愈伤组织岛发育。在将该材料转移到再生培养基和在光照下孵 育后，释放了胚胎形成的潜力，在接下去的4到5周内发出枝条。从 愈伤组织剪除枝条，并在含有植物生长素的培养基上孵育2到3周， 然后转移到土壤中。使变硬的枝条在温室中高湿度和短日照下生长。 最后在移植后3到5个月收获种子。该方法以超过50％的比率生产单 基因座转化体(Aldemita和Hodges，1996，Chan等，1993，Hiei等， 1994)。
实施例4.以PRO0129-CDS1585转化的转基因水稻的评估
大约产生15到20株独立的T0转化株。将原代转化株从组织培养 室转移到温室，以培育和收获T1种子。保留T1后代按转基因的存在 /缺乏3∶1分离的7个事件。对其中每种事件，通过可视标记筛选选 择含有转基因10株T1幼苗(杂合子和纯合子)，以及缺乏转基因的 10株T1幼苗(零合子)。将选择的T1植物转移到温室中，每株植物都 接受独特的条形码标记以将表型数据和相应植物清楚无误地联系起 来。选择的T1植物在10cm直径罐中的土壤中栽培，环境设置如下： 光周期＝11.5h，光照强度＝30,000lux或更大，日间温度＝28℃或更 高，夜间温度＝22℃，相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的零合 子在随机位置并行培育。从播种期直到成熟期，植物通过数字成像室 数次。每一时间点从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像 (2048×1536像素，16百万颜色)。
收获、装袋、并用条形码标记成熟的初级圆锥花序，然后在烤箱 中37℃干燥3天。圆锥花序接着被脱粒，并收集所有种子。用吹风 装置将饱满的壳与空壳分离。分离后，将两批种子用可商业化购买得 到的计数器计数。将空壳丢弃，饱满的壳在分析天平上称重，对种子 的横截面积用数字成像进行测量。该操作步骤获得了下面描述的种子 相关参数。
这些参数均采用图像分析软件以自动的方式来自数字图像并作统 计学分析。用经不均衡设计矫正的双因素ANOVA(方差分析)作为植物 表型特征的总体评估的统计模型。对用该基因转化的所有事件的所有 植物测定的所有参数进行F检验。进行F检验来检测基因在所有转化 事件中的效应并验证基因的总体效应，这里也称为“总体(global) 基因效应”。如果F检验值显示数据是显著的，则得出结论-存在“基 因”效应，表示不仅是基因的存在或位置引起所述效应。对于F检验， 总体基因效应的显著性的阈值设置为5％概率水平。
为检测每一事件内基因的效应，即株系(line)特异性效应，采 用从转基因植物以及相应的空载植物中获得的数据在每一事件内进行 t检验。“空载植物”或“空载分离株”或“零合子”为以与转基因 植物同样的方式处理的植物，但转基因从其中分离。空载植物也可以 被描述为纯合阴性转化植物。T检验的显著阈值设为10％概率水平。一 些事件的结果可能在该阈值之上或之下。这基于基因可能只在基因组 的特定位置时才有效应的假设，该位置依赖性效应的发生并非罕见。 这种基因效应在此也命名为“基因的株系效应(line effect)”。p 值通过比较t-分布与t值，或者比较F分布与F值而得到。然后p值 给出无效假设(即没有转基因的效应)正确的概率。
按照上述的方法测量植物生长和种子产量。发明人惊讶地发现在 用金属硫蛋白基因转化的水稻植株中，种子的总数和总重以及初级圆 锥花序的数目与没有AtMt2a基因的对照植物相比都提高了。
在第一个试验中获得的数据在以T2植物进行的第二个试验中得 到证实。选择具有正确表达模式的3个株系进行进一步的分析。通过 监测标志物的表达筛选来自T1阳性植物(杂合子和纯合子)的种子批 次。对每一选择的事件，保留杂合种子批次进行T2评估。在每一种子 批次内，在温室中培育相等数目的阳性和阴性植物进行评估。
T2代中总共评估了120株Mt2a转化植物，每一事件40株植物， 其中20株为转基因阳性，20株为阴性。
由于进行了有重复事件的两个试验，除了上述的分析外还进行了 组合分析。这有助于检查在2个试验中的效应的一致性，且如果是这 样的话，可以从2个试验中积累证据，以增加结论的可信度。采用的 方法为混合模型方法，其考虑数据的多级结构(即试验-事件-分离 子)。通过将可能性比率检验与x2分布比较而获得P值。
实施例5.用PRO0129-CDS1585转化的转基因植物的评估结果
通过上述的对种子的分析，发明人发现与缺乏Mt2a转基因的植物 相比，用Mt2a基因构建体转化的植物具有更高数目的初级圆锥花序、 更高的种子总数和更高的种子总重量。从T1代植物中获得的阳性结果 再次在T2代中获得。不仅各转基因系的得分显著优于相应的零合子对 照系，而且当评估所有检测的T2事件的所有植物时，也有显著的阳性 总体效应，强烈表明总体基因效应。表2中列出了数据的概括。
表2 T1植物 T2植物 组合分析 参数 ％差异 p值 ％差异 p值 p值 种子总数 14 0.0404 16 0.0184 0.0003 种子总重 9 0.2092 24 0.0091 0.0017 初级圆锥花序数 16 0.0958 13 0.0907 0.0002
％增加代表了对于所有检测事件的平均增加。T1和T2植物的p值 代表了来自F检验的p值，通过将可能性比率检验与x2分布作比较而 获得组合分析的p值。
种子总数
通过计数从植物收获的壳的数目而测量每株植物的总种子数。转 基因T1系植物表现出14％的总种子数的总体增加，该增加具有显著性。 该增加在以T2植物进行的试验中被证实，其中检测到了16％的显著增 长。T1和T2植物的组合分析显示出总体基因效应(p值为0.0003)。
总种子产量
通过称量从植物收获的所有饱满壳的重量来测量总种子产量(种 子总重)。平均而言，T1植物的种子产量的增加为9％。这些结果也在 T2代中观察到。3个检测株系具有24％的平均产量增长。这一平均增 长具有统计学显著性(p值为0.0091)，T1和T2植物的组合分析显示 出存在总体基因效应(p值为0.0017)。
初级圆锥花序的数目
最高的圆锥花序和所有垂直排列时与最高的圆锥花序交迭的圆锥 花序被认为是初级圆锥花序，并手工计数。转基因对圆锥花序的数目 具有总体效应：T1植物的增加为16％，T2植物为13％。p值(分别为 0.0958和0.0907)证明这些增加是显著的。组合分析表现出总体基因 效应(p值为0.0002)。
观察到不同的转化事件(各自用AtMT2a基因转化的不同的植物事 件)之间的差异。本领域技术人员已知植物中转基因的表达以及由于 该转基因表达导致的表型效应在不同的独立获得的转基因系和其后代 中可以不同。在不同的独立获得的转基因植物中存在的转基因的染色 体插入位点以及插入该位点的转基因拷贝数和那些转基因拷贝在该位 点的构型彼此不同。表达水平的差异可以归因于来自转基因的染色体 环境的影响(所谓的位置效应)或来自某些转基因构型触发的静默机制 的影响(例如，转基因的内向面对串联插入倾向于在转录或转录后水平 静默)。尽管有这种可变性，对T1和T2植物的分析和组合分析表明观 察到的产量的增加是由真正的总体基因效应导致的。
实施例6：在玉米中改变谷粒产量：
这里所述的发明也可用于玉米。为达到这一目的，将Mt2a基因 或其玉米直向同源物，在如水稻GOS2启动子或另一组成型启动子的合 适的启动子的控制下，克隆到适合于农杆菌属介导的玉米转化的植物 转化载体中。这种用于玉米转化的载体和方法在文献中已经记载 (EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676、Ishida 等人，1996；Frame等人，2002)。通过这些方法制备的转基因植物在 温室中生长，用于T1种子生产。通过后代分离分析检测遗传率。通过 定量实时PCR和/或Southern印迹分析来检测转基因的拷贝数。通过 反转录PCR和/或Northern分析确定转基因的表达水平。选择具有转 基因的单拷贝插入和具有不同水平转基因表达的转基因系，通过自花 受精进行T2种子生产或与不同种质杂交。使后代种子发育，在田野或 温室中以非常适合玉米的条件(16∶8小时光周期，26-28℃日间温度 和22-24℃夜间温度)以及在缺乏水、缺乏氮以及过量NaCl的条件下 生长。在自花受精的情况下，用来自同一母系的无效分离子以及同一 栽培种的野生型植物作为对照。在杂交的情况下，转基因株、无效分 离子和同一栽培种的野生型植物与选择的亲本杂交，且将来自转基因 杂交的F1植物与来自无效分离子和野生型杂交的F1植物相比较。对 自花受精或杂交产生的后代植物的不同的生物量和生长参数进行评 估，包括植物高度，茎厚度，叶片数目，总地上面积，叶子的绿色度， 成熟时间，开花时间，抽穗数目，收获时间。也对这些株系的种子的 多种参数进行测定，例如谷粒大小，每株植物的总谷粒产量和谷粒质 量(淀粉含量，蛋白含量和油含量)。选择对于任何上述参数与对照相 比最显著改善的植物系进行进一步的田间测验和标记辅助育种，目标 是将田间证实有效的转基因性状转移到商品化的种质。在田间对玉米 生长和产量相关参数进行检测的方法在现有技术中已经良好地确立， 将特定基因座(例如含有转基因的基因座)从一种种质渐渗到另一种质 的技术也已充分建立。
序列表
<110>CropDesign N.V.
<120>具有改变的生长特性的植物及其生产方法
<130>CD-089-PCT
<150>EP 030760862
<151>2003-04-14
<160>7
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>336
<212>DNA
<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>misc_feature
<223>MT2a DNA序列
<400>1
ttttcattca taaatttttc ttcaatttga attttctcga gaaaaatgtc ttgctgtgga 60
ggaaactgcg gatgtggatc tggctgcaag tgcggcaacg gttgtggagg ttgcaaaatg 120
taccctgact tgggattctc cggcgagaca accacaactg agacttttgt cttgggcgtt 180
gcaccggcga tgaagaatca gtacgaggct tcaggggaga gtaacaacgc tgagaacgat 240
gcttgcaagt gtggatctga ctgcaagtgt gatccttgca cctgcaagtg aagaagcctt 300
tttaaataag cagagataat cgagtctctt taatta 336
<210>2
<211>81
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>MT2a蛋白质序列
<400>2
Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Lys Cys
1 5 10 15
Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Leu Gly Phe Ser
20 25 30
Gly Glu Thr Thr Thr Thr Glu Thr Phe Val Leu Gly Val Ala Pro Ala
35 40 45
Met Lys Asn Gln Tyr Glu Ala Ser Gly Glu Ser Asn Asn Ala Glu Asn
50 55 60
Asp Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asp Cys Lys Cys Asp Pro Cys Thr Cys
65 70 75 80
Lys
<210>3
<211>545
<212>DNA
<213>鼠耳芥
<220>
<221>misc_feature
<223>MT1 DNA序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(331)..(331)
<223>n为a，c，g，或t
<400>3
cattcataaa tttttcttca atttgaattt tctcgagaaa aatgtcttgc tgtggaggaa 60
actgcggatg tggatctggc tgcaagtgcg gcaacggttg tggaggttgc aaaatgtacc 120
ctgacttggg attctccggc gagacaacca caactgagac ttttgtcttg ggcgttgcac 180
cggcgatgaa gaatcagtac gaggcttcag gggagagtaa caacgctgag agcgatgctt 240
gcaagtgtgg atctgactgc aagtgtgatc cttgcacctg caagtgaaga agccttttta 300
aataagcaga gataatcgag tctctttaat ntaattaagt tattcaataa gtaaaccata 360
tataggatgg tgtttttagg tttggtttat gtgtaataat ggcttcagct tatcttttag 420
ccgatcattg tcttttgtgt ttgttttgat catatctttt agatgtctag caaatctgcc 480
atgtgatgag tttgtacttc cagtggaatg ataataatat tatagtttta aatcaaaaaa 540
aaaaa 545
<210>4
<211>81
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>MT1蛋白质序列
<400>4
Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Lys Cys
1 5 10 15
Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Leu Gly Phe Ser
20 25 30
Gly Glu Thr Thr Thr Thr Glu Thr Phe Val Leu Gly Val Ala Pro Ala
35 40 45
Met Lys Asn Gln Tyr Glu Ala Ser Gly Glu Ser Asn Asn Ala Glu Ser
50 55 60
Asp Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asp Cys Lys Cys Asp Pro Cys Thr Cys
65 70 75 80
Lys
<210>5
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物 prm03240
<400>5
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtct tgctgtggag gaa 53
<210>6
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物 prm03241
<400>6
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcacttgcag gtgcaag 47
<210>7
<211>3032
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MT2a的表达盒
<400>7
aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60
aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120
catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180
tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 240
tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300
aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360
atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 420
ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480
ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540
gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600
tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660
tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 720
aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780
aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840
acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900
tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960
aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020
ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080
cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc 1140
cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg 1200
tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg 1260
gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat 1320
ggttttcaat cgtctggaga gctctatgga aatgaaatgg tttagggtac ggaatcttgc 1380
gattttgtga gtaccttttg tttgaggtaa aatcagagca ccggtgattt tgcttggtgt 1440
aataaaagta cggttgtttg gtcctcgatt ctggtagtga tgcttctcga tttgacgaag 1500
ctatcctttg tttattccct attgaacaaa aataatccaa ctttgaagac ggtcccgttg 1560
atgagattga atgattgatt cttaagcctg tccaaaattt cgcagctggc ttgtttagat 1620
acagtagtcc ccatcacgaa attcatggaa acagttataa tcctcaggaa caggggattc 1680
cctgttcttc cgatttgctt tagtcccaga attttttttc ccaaatatct taaaaagtca 1740
ctttctggtt cagttcaatg aattgattgc tacaaataat gcttttatag cgttatccta 1800
gctgtagttc agttaatagg taatacccct atagtttagt caggagaaga acttatccga 1860
tttctgatct ccatttttaa ttatatgaaa tgaactgtag cataagcagt attcatttgg 1920
attatttttt ttattagctc tcaccccttc attattctga gctgaaagtc tggcatgaac 1980
tgtcctcaat tttgttttca aattcacatc gattatctat gcattatcct cttgtatcta 2040
cctgtagaag tttctttttg gttattcctt gactgcttga ttacagaaag aaatttatga 2100
agctgtaatc gggatagtta tactgcttgt tcttatgatt catttccttt gtgcagttct 2160
tggtgtagct tgccactttc accagcaaag ttcatttaaa tcaactaggg atatcacaag 2220
tttgtacaaa aaagcaggct tcacaatgtc ttgctgtgga ggaaactgcg gatgtggatc 2280
tggctgcaag tgcggcaacg gttgtggagg ttgcaaaatg taccctgact tgggattctc 2340
cggcgagaca accacaactg agacttttgt cttgggcgtt gcaccggcga tgaagaatca 2400
gtacgaggct tcaggggaga gtaacaacgc tgagaacgat gcttgcaagt gtggatctga 2460
ctgcaagtgt gatccttgca cctgcaagtg aaacccagct ttcttgtaca aagtggtgat 2520
atcacaagcc cgggcggtct tctagggata acagggtaat tatatccctc tagatcacaa 2580
gcccgggcgg tcttctacga tgattgagta ataatgtgtc acgcatcacc atgggtggca 2640
gtgtcagtgt gagcaatgac ctgaatgaac aattgaaatg aaaagaaaaa aagtactcca 2700
tctgttccaa attaaaattc attttaacct tttaataggt ttatacaata attgatatat 2760
gttttctgta tatgtctaat ttgttatcat ccgggcggtc ttctagggat aacagggtaa 2820
ttatatccct ctagacaaca cacaacaaat aagagaaaaa acaaataata ttaatttgag 2880
aatgaacaaa aggaccatat cattcattaa ctcttctcca tccatttcca tttcacagtt 2940
cgatagcgaa aaccgaataa aaaacacagt aaattacaag cacaacaaat ggtacaagaa 3000
aaacagtttt cccaatgcca taatactcga ac 3032
金属硫蛋白，mRNA翻译的产物，是低分子量，富含半胱氨酸的金 属结合蛋白。MT蛋白和基因在动物和植物王国以及原核生物聚球藻 (Synechococcus)中普遍存在。MT中大量的半胱氨酸残基通过硫醇键 结合多种金属。MT通常含有2个结合金属的、富含半胱氨酸的结构域， 赋予这些金属蛋白哑铃状的构象。现在可获得的数据倾向于支持MT 在铜耐受性中的作用(而PC防御镉)。
MT蛋白的分类基于Cys残基的排列。Cobbett和Goldsbrough (Annu Rev Plant Biol.53，159-82，2002)区分4种类别：1型到4 型。2型MT含有2个富含半胱氨酸的结构域，由一个大约40个氨基 酸的间隔分开，第一对半胱氨酸在氨基酸位置3和4作为Cys-Cys基 序存在。另外，2型MT的N末端结构域的序列(MSCCGGNCGCS-)高度保 守。
鼠耳芥、水稻和甘蔗含有编码所有4种类型的MT的基因。可以对 这些基因的表达模式进行通常的观察。4型MT限于发育的种子。1型 MT在根中的表达倾向于比芽苗中高，而2型MT的观察结果通常相反。 3型MT在肉果中或在非肉果生产植物(如鼠耳芥)的叶片中表达。多种 环境因素影响这些基因的表达。
已经生产了在AtMT2a启动子的控制下表达GUS的转基因植物。在 年幼植物中，染色仅仅在子叶和侧根尖发现。较老的植物中的GUS活 性在香毛簇的基底、排水器、萼片、花粉囊、柱头、根尖和侧根分枝 点的脉管组织中见到。随着叶子老化，GUS染色增强。
已经为两个目的生产出表达MT的转基因植物：
1)重金属污染的土壤的植物整治：转基因烟草和Brassica植 物，经工程改造以过表达MT，对镉等重金属的毒性具有中等抗性(Suh 等人，Mol Cells.8，678-684，1998)。
2)营养质量提高，当在水稻中与肌醇六磷酸酶和铁蛋白共表达 时，改善人类的铁膳食。金属硫蛋白样蛋白，富含半胱氨酸(富含硫的 氨基酸)有助于人体消化系统吸收铁(Potrykus I(2002)Nutritional improvement of rice to reduce malnutrition in developing countries.“Plant Biotechnology 2002 and Beyond”I.K.Vasil (ed.)pp 401-406)。
鉴于不断增长的世界人口，提高农业效率和增加园艺学植物的多 样性仍然是农业研究的一个主要目标。农作物和园艺改进的传统方式 采用选择育种技术来鉴定具有需要的特性的植物。然而，这种选择育 种技术具有几个缺点，即，这些技术通常是劳动密集型的，并导致产 生经常含有异质性遗传补充的植物，其不总能导致期望的性状从亲本 植物传承。分子生物学的进展已经允许人类操纵动物和植物的胚质。 植物的遗传工程使分离和操纵遗传材料(通常以DNA或RNA的形式)以 及随后将该遗传材料引入植物成为可能。这种技术已经导致具有多种 改良的经济学、农艺学或园艺学性质的植物的产生。一种具有特别经 济利益的性状为高产量。
发明详述
现在已经惊奇地发现，调节植物中编码金属硫蛋白的核酸的表达 使植物具有改变的生长和发育。因此，根据本发明的第一个具体实施 方式，提供了一种改变植物生长和发育的方法，包括在植物中引入遗 传修饰，并选择编码金属硫蛋白的核酸在植物中经调节的表达，附带 条件是该改变的生长和发育不是增加的金属聚积或对非生物逆境增加 的耐受性或抗性。增加的金属聚积是指为了生物整治的目的或为了提 高植物的营养质量的任何金属摄取，特别是设想重金属或离子的摄入。 术语非生物逆境代表由盐、寒冷或渗透压导致的逆境，也包括氧化逆 境。
本发明的方法包括植物或植物细胞的遗传修饰。术语“遗传修饰” 指与野生型细胞相比通过人工干预在细胞的遗传内容方面的改变，包 括遗传工程、育种或诱变等技术。遗传内容的改变包括基因组的修饰， 并包括植物细胞染色体以及游离体中遗传材料的添加、缺失和置换。 该术语也包括向植物细胞中加入染色体外信息。遗传修饰优选导致核 酸的经调节的表达。本发明的方法也包括后继的选择步骤，这期间选 择具有需要的特性的植物。选择步骤可以基于监测改变的生长特性的 存在或缺乏，或基于监测与引入的感兴趣核酸相关联的选择或筛选标 记基因的存在或缺乏。
在本发明中，设想核酸的经调节的表达，特别是增加的表达。调 节(增加或减少)编码金属硫蛋白的核酸的表达或调节金属硫蛋白本 身的活性和/或水平包括在特定的细胞或组织中改变的基因表达和/ 或基因产物即多肽改变的活性和/或水平。可以通过例如化学方法和/ 或重组方法来实现改变的基因表达和/或改变的基因产物的活性和/ 或水平。调节基因的表达和/或基因产物的水平和/或调节基因产物 的活性可以直接通过调节金属硫蛋白编码基因的表达和/或直接通过 调节金属硫蛋白的活性和/或水平而实现。经调节的表达可以由内源 性金属硫蛋白基因改变的表达水平而产生和/或可以由预先引入植物 的金属硫蛋白编码核酸的改变表达而产生。类似地，金属硫蛋白经调 节的活性和/或水平可以是内源性金属硫蛋白基因表达水平改变的结 果和/或可以由预先引入植物的金属硫蛋白编码核酸的表达改变而致。 另外或可选地，上述的表达的调节可以以间接方式达到，例如可作为 降低或增加调控金属硫蛋白基因表达或影响金属硫蛋白的活性和/或 水平的因子的水平和/或活性的结果而实现。
可以方便地通过化学方法实现编码金属硫蛋白核酸的表达的调节 和/或金属硫蛋白本身的活性和/或水平的调节，即通过外源性应用一 种或多种能调节金属硫蛋白的活性和/或水平和/或能够调节金属硫蛋 白编码核酸(该核酸可以是内源性基因或引入植物中的转基因)的表达 的化合物或因子。术语“外源性应用”以其最广义包括将使细胞、组 织、器官或生物体与合适的化合物或因子接触或对其施用。该化合物 或元素可以以适合摄入的方式应用于植物(例如通过施用到土壤中通 过根来摄取，或通过直接施用于叶子，如通过喷雾)。
适合外源性应用的化合物或因子包括金属硫蛋白编码核酸和能够 与其杂交的核酸；金属硫蛋白基因产物或其同源物、衍生物或活性片 段和/或能识别或模拟所述基因产物的抗体。这些抗体可以包括“植 物抗体(plantibodies)”、单链抗体、IgG抗体和重链抗体(来自 骆驼或Camelidae的其它成员)，以及它们的片段。另外或可选地， 用相互作用蛋白或用基因/基因产物的抑制剂或活化剂接触或给予细 胞、组织、器官或生物体提供了调节编码金属硫蛋白的核酸的表达和 /或调节金属硫蛋白本身的活性和/或水平的另一外源性方式。调节 编码金属硫蛋白的核酸的表达和/或调节金属硫蛋白本身的活性和/ 或水平也可以作为直接或间接活化或灭活金属硫蛋白的因子的水平改 变的结果而实现。
植物、种子或其它植物材料也可以用诱变物质处理，实现诱变的 化学物质包括N-亚硝基-N-乙脲、乙烯亚胺、甲基磺酸乙酯或硫酸耳 二乙酯。作为选择，也可以采用电离辐射，例如γ射线或X线。引入 突变和检测突变效果(例如改变的蛋白表达和/或改变的蛋白活性)的 方法是现有技术中已知的。诱变包括采用化学致突变剂以及物理致突 变剂如辐照的方法。金属硫蛋白的任何特性均可以通过诱变而改变， 例如表达水平可以增加或降低，蛋白活性可以被改变，或金属结合性 质可调适。根据本发明的一个优选方面，诱变导致金属硫蛋白表达和 /或活性的增加。
另外或作为选择，根据本发明的一个优选具体实施方式，调节编 码金属硫蛋白的核酸的表达和/或调节金属硫蛋白本身的活性可以通 过重组方法实现。这种重组方法可以包括直接或间接途径来调节核酸 序列的表达和/或调节蛋白的活性。
例如，一种间接途径可以包括向植物中引入一种能够调节目的蛋 白(金属硫蛋白)活性和/或水平和/或目的基因(编码金属硫蛋白 的基因)表达的核酸序列。这些被引入植物中的核酸的例子包括编码 转录因子、与金属硫蛋白基因启动子结合或与金属硫蛋白相互作用的 活化剂或抑制剂的核酸。检测这些类型的相互作用和分离编码这种相 互作用物的核酸的方法为例如酵母单杂交或酵母双杂交筛选。调节金 属硫蛋白活性和/或金属硫蛋白基因表达的间接途径还包括抑制或刺 激驱动天然基因或转基因表达的调控序列，这种调控序列可以被引入 植物，例如，被引入植物的调控序列可以是能够驱动内源性金属硫蛋 白基因表达的启动子。另外，可以通过改变植物中能够与金属硫蛋白 相互作用的因子的水平而实现调节金属硫蛋白的活性。这种因子可以 包括金属硫蛋白的配体(调节物、亚单位、底物、靶标)。
另一方面，调节金属硫蛋白基因表达或调节金属硫蛋白的活性和 /或水平的直接和优选的途径包括向植物中引入编码金属硫蛋白或其 同源物、衍生物或其活性片段的核酸序列。该核酸序列可以被引入植 物，例如通过转化。因此，根据本发明的一个优选方面，提供了一种 改变植物的生长和发育的方法，特别是提高含有对植物的遗传修饰的 植物的植物产量和/或生物量的方法，该遗传修饰包括向植物中引入 金属硫蛋白编码核酸。
根据本发明的一个优选方面，设想核酸表达增强或提高。现有技 术中已经有许多文件记载了获得提高或增加的基因表达或基因产物的 方法，例如通过(强)启动子驱动的过表达以及转录增强子或翻译增 强子的应用。这里采用的术语“过表达”表示原始野生型表达水平额 外的任意形式的表达。相对于它所可操作地连接的启动子，优选引入 植物的核酸和/或在植物中过表达的核酸为有义方向。过表达的核酸优 选编码金属硫蛋白，优选下述的2型金属硫蛋白，编码金属硫蛋白的 核酸序列更优选分离自植物，优选来自双子叶植物，优选为十字花科， 进一步优选所述序列分离自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，最优 选该核酸序列如SED ID NO 1所示或其一部分，或编码如SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段。然而，应当注意 本发明的应用并非止于使用SEQ ID NO 1所示的核酸，也不止于编码 SEQ ID NO 2的氨基酸序列的核酸序列，而其它编码SED ID NO 2的 同源物、衍生物或活性片段的核酸序列或SEQ ID NO：1的部分，或与 SEQ ID NO：1杂交的序列均可应用于本发明的方法中。特别是来自其 它植物种类，例如烟草、玉米或水稻的同源物也可以用于本发明。
可选地或另外地，植物细胞中增加的金属硫蛋白编码基因的表达 或提高的金属硫蛋白的活性和/或水平可通过植物细胞的诱变而实现。 例如这些突变可造成金属硫蛋白编码基因的调控改变，导致基因更高 表达。突变也可导致蛋白构象的改变，导致蛋白更高的活性和/或水平。
术语金属硫蛋白包括与SEQ ID NO 2所示的金属硫蛋白同源的蛋 白质。金属硫蛋白在现有技术中广为人知，最近的总结和分类参见 Cobbett和Goldsbrough(2002)。金属硫蛋白是具有哑铃状构象的 小蛋白，发现其来自保守的N末端和C末端富含半胱氨酸的结构域， 由长度和氨基酸组成可变的区域彼此分开。基于一级结构可区分4种 类型的金属硫蛋白，图1中显示了不同植物金属硫蛋白的序列对比。 SEQ ID NO 2的金属硫蛋白包括保守的N末端结构域，是如Cobbett 和Goldsbrough(2002)所定义的2型金属硫蛋白典型的，该结构域包 括共有序列“MSCCGG(N/S)CGCG(T/S/A)(G/A/S)C(K/Q/S)C”，相应地， 优选可用于本发明的方法的同源物为包括该保守结构域的金属硫蛋 白。另外地和/或可选地，金属硫蛋白同源物具有金属结合活性，可 以在金属饱和测试中检测(Scheuhammer等人，Toxicol.Appl Pharmacol.82，417-425，1986)和/或可以功能作为氧化还原作用 感受器(Fabisiak等人，Methods Enzymol.353，268-281(2002))。
搜索和识别金属硫蛋白同源物的方法完全在本领域熟练技术人员 所掌握的技术范围内。这种方法包括将计算机可读形式的SEQ ID NO 1 或2代表的序列与可以在公共数据库中得到的序列进行比较，所述数 据库例如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(苷 http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核酸序列数据库 (http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)，采用现有技术中已知的 序列对比和比较的算法，例如，GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol. Biol.48，443-453(1970))、BESTFIT(采用Smith和Waterman (Advances in Applied Mathema tics 2，482-489(1981))的局部同 源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.，Gi sh，W.，Miller，W.，Myers， E.W.&Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))、FASTA 和TFASTA(W.R.Pearson and D.J.Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85，2444-2448(1988))。公众可以通过美国国立生物技术信息中 心获得进行BLAST分析的软件。采用blast默认参数(BLOSUM62矩阵， 缺口开放罚分11和缺口延伸罚分1)鉴定上述的同源物，且优选用全 长序列进行分析。
金属硫蛋白的“同源物”包括相对于未修饰的目的蛋白具有氨基 酸置换、缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，且具有与它 们衍生自的未修饰蛋白类似的生物学和功能活性。为生产这种同源物， 蛋白质的氨基酸可以被其它具有类似性质(例如类似的疏水性、亲水 性、抗原性、形成或打破α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的氨 基酸替代。现有技术中熟知保守置换表(例如参见Creighton(1984) 蛋白质，W.H.Freeman and Company)。可用于本发明的方法的同源物 与未修饰的蛋白质具有至少50％的序列同一性或相似性(功能同一 性)，或与未修饰的蛋白质具有至少60％的序列同一性或相似性，或 与未修饰的蛋白质具有至少70％的序列同一性或相似性，通常同源物 与未修饰的蛋白质具有至少80％的序列同一性或相似性，优选至少85％ 的序列同一性或相似性，进一步优选与未修饰的蛋白质具有至少90％ 的序列同一性或相似性，最优选与未修饰的蛋白质具有至少95％的序 列同一性或相似性。优选的同源物包括这样的蛋白，其含有保守序列 “MSCCGG(N/S)CGCG(T/S/A)(G/A/S)C(K/Q/S)C”，例如SEQ ID NO 4 或GenBank登录号CAA71803、AAP94016、CAA71804、NP_195858、 AAM62956、AAB61212、CAA65009、CAA92243。
同源蛋白可以被分组为“蛋白家族”，一个蛋白家族可以通过功 能和序列相似性分析例如Clustal W而定义。与金属硫蛋白同源的蛋 白的邻近关系树可由Clustal W程序产生，给出了其结构和祖先遗传 关系的良好概括。在本发明的一个特定的具体实施方式中，金属硫蛋 白同源物属于2型金属硫蛋白家族(Cobbett和Goldsbrough，2002)。 在鼠耳芥基因组中，鉴定了金属硫蛋白家族的2种2型家族成员 (GenBank登录号AAA50250、NP_195858)。在例如水稻或其它单子叶植 物的植物中，也可以鉴定金属硫蛋白的家族成员，这些家族成员都可 以方便地用于本发明的方法中。
两种特殊形式的同源-直向同源(orthologous)和共生同源 (paralogous)是用来描述基因的祖先遗传关系的进化概念。术语“共 生同源”涉及由物种基因组内一个或多个基因重复复制所产生同源基 因。术语“直向同源”涉及由这些基因的祖先遗传关系所致在不同生 物体中的同源基因。这里采用的术语“同源物”也包括了可用于本发 明方法的蛋白的共生同源物和直向同源物。
直向同源基因可以通过用感兴趣的查询基因查询一个或多个基因 数据库而鉴定，采用诸如BLAST程序。从搜索中得到的最高级别的目 标基因接着再进行BLAST分析，只有那些与查询基因再次匹配的目标 基因被保留为真正的直向同源基因。例如，为了找到鼠耳芥基因的水 稻直向同源物，可以对水稻数据库进行BLASTN或TBLASTX分析，例如 (但并不限于)在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可获得的 水稻Nipponbare数据库，或水稻的基因组序列(indica或japonica 栽培种)。下一步，得到的水稻序列被用来用鼠耳芥数据库进行反向 BLAST分析。当得到的序列用ClustalW分析并在邻近关系树状图中显 示时，结果可以被进一步精确。该方法可以用来鉴定来自许多不同物 种的直向同源物。
金属硫蛋白的“同源物”包括相对于未修饰的蛋白质具有氨基酸 置换、插入和/或缺失的蛋白质。蛋白质的“置换变异体”指那些氨 基酸序列中至少一个残基被去除且一个不同的残基插入其位置的变异 体。氨基酸置换通常为单个残基，但可以根据位于多肽的功能限制而 成簇；插入通常以大约1-10个氨基酸残基的数量级，而缺失在大约 1-20个残基的范围。氨基酸置换优选包括保守氨基酸置换。蛋白质 的“插入变异体”为那些所述蛋白质的预先确定的位置引入了一个或 多个氨基酸残基的蛋白质。插入可以包括氨基末端和/或羧基末端的融 合以及序列内单个或多个氨基酸的插入。通常在氨基酸序列内的插入 比氨基-或羧基-末端融合小，为大约1到10个残基的数量级。氨基 -或羧基-末端融合蛋白或肽的例子包括在酵母双杂交系统中采用的 转录活化剂的结合结构域或活化结构域、噬菌体外壳蛋白，(组氨酸)6- 标签，谷胱甘肽S转移酶标签，蛋白A，麦芽糖结合蛋白，双氢叶酸 还原酶，标签·100表位，c-myc表位，FLAG-表位，lacZ，CMP(钙调 蛋白结合肽)，HA表位，蛋白C表位和VSV表位。蛋白的“缺失变异 体”以从蛋白中去除一个或多个氨基酸为特征。蛋白的氨基酸变异体 可以容易地用现有技术中已知的肽合成技术制成，例如固相肽合成等 等，或通过重组DNA操作。现有技术中熟知操作DNA序列来产生蛋白 的置换、插入或缺失变异体的方法。例如，在DNA中预先确定的位点 产生置换突变的技术为本领域技术人员熟知，包括M13诱变，T7-Gen 体外诱变(USB，Cleveland，OH)，QuickChange定点诱变(Stratagene， San Diego，CA)，PCR-介导的定点诱变或其它定点诱变方案。
术语“衍生物”指与天然存在形式的蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO 2所示)相比，可以含有天然或非天然存在的氨基酸残基的置换、 缺失或添加的肽，寡肽，多肽，蛋白和酶。金属硫蛋白的“衍生物” 包括与天然存在形式多肽的氨基酸序列相比，可以含有天然存在的改 变的、糖基化、酰基化或非天然存在的氨基酸残基的肽、寡肽，多肽， 蛋白和酶。与其来源的氨基酸序列相比，衍生物也可以包括一个或多 个非氨基酸取代基，例如，与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分 子或其它配体，例如结合的促进其检测的报道分子，以及相对于天然 存在蛋白的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。
金属硫蛋白的“活性片段”或“功能片段”包括蛋白质的至少15 个，优选20个、25个，更优选30个或更多个连续邻接的氨基酸残基， 所述残基保留了与天然存在的蛋白质类似的生物学和/或功能活性。优 选的金属硫蛋白的片段至少含有上述的保守N末端结构域。
这里所定义的术语金属硫蛋白编码核酸/基因指编码金属硫蛋白 的任何核酸或其互补序列。该核酸可以从任何来源获得(直接或间接 (如果随后进行修饰))，只要该核酸在植物中表达时导致金属硫蛋 白编码核酸/基因经调节的表达或金属硫蛋白经调节的活性和/或水 平。该核酸可以从真核生物中分离，例如酵母或真菌，植物(包括藻 类)或动物(包括人类)。与其天然形式相比，通过精密的人工操作， 该核酸的组成和/或基因组环境可以被充分地改变。该核酸序列优选 为同源核酸序列，即，结构和/或功能相关的核酸序列，优选来自植 物，无论来自相同或不同的植物物种。该核酸序列优选从双子叶植物 物种中分离，优选来自十字花科(Brassiaceae)，进一步优选来自 鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，更优选该核酸为SEQ ID NO 1所 代表的核酸或其一部分，或能够与其杂交的核酸序列，该杂交序列编 码具有金属硫蛋白活性的蛋白质，即与SEQ ID NO：1类似的生物学活 性，或它是编码SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的核酸，或编码其同 源物、衍生物或活性片段。该术语也包括由于遗传密码简并性产生的 编码金属硫蛋白的核酸的变异体；编码金属硫蛋白的核酸的等位基因 变异体；编码金属硫蛋白的核酸的不同的剪接变异体及被一个或多个 间插序列中断的变异体。
本发明的方法也可以有利地采用DNA或核酸序列的部分来实施， 所述部分编码保留了金属硫蛋白活性的肽，即与SEQ ID NO：2相似的 生物学功能。DNA序列的部分指从原始(较大的)DNA分子来源或制备 的DNA片段，当在植物中表达时，该DNA部分产生具有改变的生长特 性的植物。该部分可以包括许多基因，含有或不含另外的调控元件， 或可以只包括间隔序列等。
本发明也包括能够与编码金属硫蛋白的核酸序列杂交的核酸序 列，所述核酸序列也可用于实施本发明的方法。这里定义的术语“杂 交”是实质上同源的互补核苷酸序列彼此相互退火的过程。杂交过程 可以完全在溶液中进行，即，互补核酸都在溶液中。依赖于这一过程 的分子生物学工具包括聚合酶链式反应(PCR；以及所有以此为基础的 方法)、差减杂交、随机引物延伸、核酸酶S1作图、引物延伸、反转 录、cDNA合成、RNA差异显示、以及DNA序列确定。杂交过程的发生 也可以其中一个互补核酸固定于基质例如磁珠、琼脂糖凝胶珠或任何 其它树脂。依赖于这一过程的分子生物学工具包括分离多聚(A+)mRNA。 此外，杂交过程的发生可以其中一个互补核酸固定于固体支持物，例 如硝酸纤维素或尼龙膜，或者通过如光能无机照相固定于例如硅玻璃 支持物(后者已知为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)。依赖于这一过程 的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交、噬菌斑 杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了允许杂交的发生，核酸分子通常 被加热或用化学方法变性从而由双链熔解为两条单链和/或从单链核 酸中去除发卡结构或其它二级结构。例如温度、盐浓度和杂交缓冲液 组成的条件影响着杂交的严格性。
对于需要高选择性的应用，人们通常期望采用相对严格的条件来 形成杂交体，例如，将选择相对低的盐和/或高的温度条件，如由大 约0.02M到大约0.15M NaCl在大约50℃到大约70℃的温度提供的。
因此杂交的高度严格性条件包括高温和/或低盐浓度(盐包括 NaCl和柠檬酸三钠)，但也可受到杂交缓冲液中包括甲酰胺和/或降低 杂交缓冲液中例如SDS(去污剂)的化合物的浓度和/或从杂交缓冲液 中排除诸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇等化合物(提高分子拥挤度)的影 响。特别优选足够低严格性杂交条件来分离与上文定义的本发明DNA 序列同源的核酸。导致同源性的因素包括等位性、遗传密码简并和优 选密码子应用的不同等。
在核酸杂交试验，例如Southern和Northern杂交的情形下，“严 格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”取决于序列，在不同的环境参 数下也不同。例如，较长的序列在较高的温度下特异性地杂交。Tm是 在定义的离子浓度和pH下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温 度。特异性通常受到杂交后洗涤的影响，这种洗涤的关键因素包括最 终洗涤溶液的离子浓度和温度。
通常，选择的严格条件比在定义的离子浓度和pH下特异性序列 的热熔点(Tm)低大约50℃。Tn是在定义的离子浓度和pH下，50％的 靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱 基组成，可以用下列等式计算：
Tm-79.8℃+(18.5xlog[Na+])+(58.4℃x％[G+C])-(820x(双链体中 的#bp)-1)-(0.5x％甲酰胺)
更优选的严格条件为当温度低于Tm20℃时，最优选的严格条件 为当温度低于Tm10℃时。也可以采用一些已知技术的任意一种来控 制非特异性结合，例如用含有蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中 加入异源性RNA、DNA，以及SDS，以及用Rnase处理。
洗涤条件通常在杂交严格度条件或低于杂交严格度条件实行。通 常，核酸杂交分析或基因扩增检测程序的适宜严格度条件如上所述， 可选择严格度更高或更低的条件。
为了确定严格度的水平，可以方便地参考Sambrook等人(2001) 分子克隆：实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约， 或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons， N.Y.(1989)。低严格度条件的例子为4-6×SSC/0.1-0.5％w/v SDS， 37-45℃，2-3小时。根据杂交中涉及的核酸的来源和浓度，可以采用 其它的严格度条件，例如中等严格度条件。中等严格度条件的例子包 括1-4×SSC/0.25％w/v SDS，≥45℃，2-3小时。高严格度条件的 例子包括0.1-1×SSC/0.1％w/v SDS，60℃，1-3小时。熟练技术人 员知道杂交及冲洗期间可以改变的多种参数，以及维持或改变严格度 条件的参数。例如，另一严格杂交条件是在4×SSC，65°杂交，然后 在0.1×SSC中，65℃洗涤大约1小时。另外，例示性的严格杂交条 件为在50％的甲酰胺，4×SSC中，42℃。另一严格条件的例子包括在 62℃，6×SSC、0.05×BLOTTO中杂交和在2×SSC、0.1％w/v SDS中， 62℃洗涤。
本发明的方法也可应用编码金属硫蛋白的核酸序列的可变剪接变 异体实行。这里应用的术语“可变剪接变异体”包括选择的内含子和/ 或外显子已经被切除、替代或加入的核酸序列的变异体。这种变异体 将是其中蛋白的生物活性保持不受影响的变异体，可以通过选择性地 保留蛋白的功能片段而实现。这种剪接变异体可以在自然界中发现或 人工制造。现有技术中众所周知制造这类剪接变异体的方法。因此根 据本发明的另一方面，提供了改变植物的生长特性的方法，包括调节 植物中编码金属硫蛋白的核酸序列的可变剪接变异体的表达和/或调 节由所述可变剪接变异体编码的金属硫蛋白的活性和/或水平。该剪 接变异体优选为SEQ ID NO：1所示序列的剪接变异体。
本发明的方法也可方便地采用编码金属硫蛋白的核酸序列的等位 基因变异体施行，优选SEQ ID NO：1所示的序列的等位基因变异体。 自然界中存在等位基因变异体，本发明的方法包括使用这些天然等位 基因。等位基因变异体包括单核苷酸多态性(SNPs)，以及小插入/缺失 多态性(INDBLs；INDELs的大小通常小于100bp)。在多数有机体的自 然发生的多态株系中，SNPs和INDELs组成了最大一组的序列变异体。 它们有助于基因作图和发现基因和基因功能。它们另外还有助于识别 遗传基因座，例如植物基因，涉及生长率、植物大小和植物产量、植 物活力、抗病性、逆境耐受等等的确定过程。现在可以获得识别SNPs 和/或INDELs的许多技术，包括(i)PCR，然后进行变性高效液相色 谱(DHPLC；例如Cho等人(1999)Nature Genet.23，203-207)； (ii)连续变性毛细管电泳(CDCE)与高保真PCR结合(例如， Li-Sucholeiki等人(1999)Electrophoresis 20，1224-1232)；(iii) 变性梯度凝胶电泳(Fischer和Lerman(1983)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80，1579-1583)；(iv)矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析 (MALDI-TOF MS；例如，Ross等人(2000)Biotechniques 29，620-629)； (v)实时荧光监测PCR分析(Tapp等人，(2000)Biotechniques 28， 732-738)；(vi)AcryditeTM凝胶技术(Kenney等人，(1998) Biotechniques 25，516-521)；(vii)循环双脱氧指纹识别(CddF； Langemeier等人，(1994)Biotechniques 17，484-490)；(viii)单 链构象多态性(SSCP)分析(Vidal-Puig和Moller(1994) Biotechniques 17，490-496)以及(ix)迷你测序引物延伸反应 (Syvanen(1999)Hum.Mutat.13，1-10)。‘基因组靶向诱导位点 损伤’技术(TILLING；McCallum等人，(2000)Nat.Biotechnol.18， 455-457；Plant Physiol.123，439-442)是上述(i)的变体，也可以 用于迅速地在例如表现出感兴趣表型的化学诱变的植物个体中识别改 变的基因。
在特定的常规育种程序中，例如在标志物辅助育种中，上述的等 位基因变异体的运用也包含在本发明内；这可以是它们在本发明方法 中的应用以外附加的。这种育种程序有时要求通过对植物进行诱变处 理向植物中引入等位基因变异体。一种合适的诱变方法为BMS诱变， 接着可通过例如PCR的方法来鉴定等位基因变异体，之后为选择步 骤，来选择所讨论的金属硫蛋白序列的优异等位基因变异体，该变异 体可以使植物的生长和发育发生改变。选择通常通过监测含有所讨论 序列的不同等位基因变异体的植物的生长表现进行，例如，SEQ ID NO：1的不同等位基因变异体。监测生长表现可以在温室或田野中进 行。另外可选择的步骤包括将其中鉴定了优异等位基因变异体的植物 与其它植物杂交，这可以被用于例如将感兴趣的表型特征组合起来。 因此，由于金属硫蛋白基因中的突变可以天然发生，它们可以构成选 择表现出更高产量的植物的基础。因此本发明包括编码金属硫蛋白或 能够调节金属硫蛋白的活性和/或水平的核酸在育种工程中的应用。
根据本发明的另一方面，可以在育种工程中利用能够调节编码金 属硫蛋白的核酸的表达的核苷酸序列。该核酸序列可以在染色体上， 或其一部分上，至少含有编码金属硫蛋白的核酸序列，优选还有一个 或多个相关家族成员。在一个这种育种工程的例子中，识别了一个可 以与能够调节植物中编码金属硫蛋白的核酸的表达的基因遗传连锁的 DNA标记，该基因可以是编码金属硫蛋白的基因本身或可以直接或间 接地影响编码金属硫蛋白的基因表达和/或金属硫蛋白本身的活性的 任意其它基因。接着该DNA标记可以用于育种工程中，以选择具有改 变的生长特性的植物。
本发明的方法也可以通过向植物中引入(天然或人工)染色体(例 如细菌人工染色体(BAC))的至少一部分来施行，该染色体至少含有编 码金属硫蛋白的基因/核酸序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)， 优选与一个或多个相关基因基因家族成员一起。因此，根据本发明的 另一方面，提供了一种通过向植物中引入含有至少编码金属硫蛋白的 基因/核酸的染色体的至少一部分来改变植物的生长和发育的方法。
因此，作为本发明的另一方面，提供了一种改变生长和发育的方 法，优选增加植物产量和/或生物量，包括调节、优选增加编码金属 硫蛋白的核酸序列在植物中的表达和/或调节植物中金属硫蛋白的活 性和/或水平，其中所述的核酸序列和所述的蛋白质包括选自下列的 变异体：
(i)SEQ ID NO：1所示的或编码SEQ ID NO：2所示的金属硫蛋 白的核酸；
(ii)编码金属硫蛋白的核酸序列的可变剪接变异体或其中所述 的金属硫蛋白由剪接变异体编码；
(iii)编码金属硫蛋白的核酸序列的等位基因变异体或其中所述 的金属硫蛋白由等位基因变异体编码；
(iv)编码金属硫蛋白的功能部分的核酸；
(v)SBQ ID NO：2所示的金属硫蛋白；
(vi)金属硫蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
根据本发明的一个方面，设想核酸的表达增强或提高。现有技术 中已经有许多文件记载了获得增强或提高的基因或基因产物表达的方 法，包括例如(强)启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子 的应用。这里采用的术语过表达表示原始野生型表达水平附加的任意 形式的表达。相对于它所可操作地连接的启动子，优选引入植物和/ 或在植物中过表达的核酸为有义方向。过表达的核酸优选编码金属硫 蛋白，该编码金属硫蛋白的核酸序列更优选从双子叶植物中分离，优 选来自十字花科，更优选其中该序列分离自鼠耳芥，该核酸序列最优 选如SED ID NO 1所示或其一部分，或编码SEQ ID NO 2所示的氨基 酸序列或其同源物、衍生物或活性片段。可选地，该编码金属硫蛋白 的核酸序列如SED ID NO 3所示或是其一部分，或编码SEQ ID NO 4 所示的氨基酸序列或编码其同源物、衍生物或活性片段。应当注意本 发明的应用并非仅限于SEQ ID NO 1所示的核酸的应用，也不限于编 码SBQ ID NO 2的氨基酸序列的核酸序列，而其它编码SED ID NO 2 的同源物、衍生物或活性片段的核酸序列或SEQ ID NO：1的部分，或 与SEQ ID NO：1杂交的序列均可应用于本发明的方法中。
根据本发明的另一方面，设想核酸序列表达下降。调节基因表达 (通过直接或间接方法)包括改变基因的转录物水平。改变转录物水平 可能足以诱导某些表型效应，例如通过共抑制机理。这里转基因过表 达的总体效应是，细胞中与引入的转基因有同源性的天然基因编码的 蛋白质的活性较小，其它降低表达的例子在现有技术中也已经有许多 文件说明，包括，例如通过反义技术、共抑制技术、RNAi技术、小干 扰RNAs(siRNAs)和微RNA(miRNA)、核酶的应用等等下调表达。因 此根据本发明的一个特定方面，提供了调节植物生长特性的方法，包 括基于反义转录物(与金属硫蛋白基因的mRNA互补)的合成、或基于 RNA干扰的技术。本发明的方法可以方便地通过下调编码金属硫蛋白 的核酸序列来施行。具有改变的生长特性的植物可以通过以有义或反 义方向表达编码金属硫蛋白的核酸序列而获得。下调技术是现有技术 中众所周知的。这里采用的术语表达的“基因静默”或“下调”指降 低基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的 水平。这种表达的降低可以通过例如加入有义方向(如果需要实现共抑 制)的编码序列或其部分来完成。因此，根据本发明的一个方面，可以 通过向植物中引入额外拷贝的(全长或部分)宿主植物中已经存在的 金属硫蛋白基因而改变植物的生长。额外的基因将使内源性基因静默， 产生已知为共抑制的现象。
以基因表达静默为目的的遗传构建体可以包括金属硫蛋白核苷酸 序列，例如SEQ ID NO：1所示(或其一个或多个部分)，相对于启动 子序列为有义和/或反义方向。本发明的方法中也可以利用正向或反向 重复形式的内源基因的至少一部分的有义或反义拷贝。植物的生长特 性也可以通过向植物中引入例如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的反 义形式的至少一部分而改变。应当清楚部分核酸(一部分)可以达到需 要的结果。同源反义基因优于异源反义基因，同源基因为植物基因， 优选来自同样植物物种的植物基因，异源基因为来自非植物物种的基 因。
另一个下调基因表达或基因静默的方法包括采用核酶，如Atkins 等人1994(WO 94/00012)，Lenee等人1995(WO 95/03404)，Lutziger 等人2000(WO 00/00619)，Prinsen等人1997(WO 97/3865)以及 Scott等人1997(WO 97/38116)所描述的。
基因静默也可以通过插入诱变而达到(例如，T-DNA插入或转座子 插入)，或通过Angell和Baulcombe 1998(WO 98/36083)，Lowe等 人1989(WO 98/53083)，Lederer等人1999(WO 99/15682)或Wang 等人1999(WO 99/53050)所描述的基因静默策略。如果内源基因含有 突变，则内源基因的表达也可以下降，为了得到具有改良的生长特性 的植物，这样的突变基因可以被分离并引入同样或不同的植物物种。
本发明的方法的实行可以方便地导致植物具有多种改变的生长特 性，这些改变的生长特性包括各自相对于相应的野生型植物改变的生 长、改变的产量/生物量、改变的结构和改变的细胞分裂。改变的生 长特性优选为改善的生长特性，包括改变的结构；增加的产量/生物 量，条件是增加的产量并非增加的金属聚积；改变的逆境反应，条件 是逆境并非非生物逆境；以及更快的生长，均相对于相应的野生型植 物而言。
本发明涉及改变植物的生长特性的方法或生产具有改变的生长特 性的植物的方法，其中生长特性包括选自下列的任意一种或多种：增 加的产量、增加的生物量、增加的总地上面积、增加的植物高度、增 加的分蘖数目、增加的初级圆锥花序的数目、增加的第二圆锥花序的 数目、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的每株植物的总种 子产量、增加的收获指数、增加的千粒重、增加的Tmid、增加的T45 或A90、增加的A42、改变的周期时间和/或改变的生长曲线。本发明 也提供了改变上述生长特性其中之一的方法，而不导致对其它生长特 性之一不利，例如地上绿色组织面积的增加而保持同样数目的饱满种 子数和同样的种子产量。
术语“增加的产量”包括相对于相应的野生型植物的生物量而言 植物的一个或多个部分的生物量的提高。该术语也包括种子产量的提 高，包括种子的生物量(种子重量)的增加和/或(饱满)种子数目 的增加和/或种子大小和/或种子体积的增加，每种均相对于相应的 野生型植物而言。对玉米，种子产量的增加可反映在每穗的行数(种子) 的增加和/或每行的谷粒数的增加。种子大小和/或体积的增加也可 能影响种子的组成。种子产量的增加可以是由于花的数目和/或大小 的增加。产量的增加也可以增加收获指数，表示为总生物量相对于诸 如种子等可收获部分的产量的比例；或千粒重。增加的产量也包括以 更高密度(每公顷或每亩的植物数)种植的能力。
改变的细胞分裂也可以有助于产量提高。术语“改变的细胞分裂” 包括细胞分裂的增加或降低或异常的细胞分裂/胞质分裂、改变的分 裂平面、改变的细胞极性、改变的细胞分化。该术语也包括例如核内 有丝分裂、非胞质分裂(acytokinesis)、多倍性、多线性和核内复 制等的现象。可以设想具有增加的生物量和高度的植物与相应的野生 型植物相比表现出改变的生长率。这里采用的术语“改变的生长率” 包括但不仅限于在植物生命周期中的一个或多个阶段，植物的一个或 多个部分(包括绿色生物量和包括种子)更快的生长率。术语“改变的 生长”包括增加的活力、更早的开花、改变的周期时间。具有改变的 生长的植物可以表现出改变的生长曲线并可以具有改变的Tmid或T90 值(分别为达到它们的最大面积的一半或它们面积的90％所需要的时 间，均相对于相应的野生型植物)。
根据本发明的一个优选的特征，本发明的方法的完成导致植物具 有增加的产量和/或增加的生物量。特别地，本发明的方法的完成导 致植物具有增加的种子产量，增加的产量优选包括相对于对照植物增 加的种子总数和/或增加的种子总重。因此，根据本发明，提供了一 种提高植物产量的方法，该方法包括在植物中调节编码金属硫蛋白的 核酸序列的表达和/或调节金属硫蛋白本身的活性，优选其中金属硫 蛋白由SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其一部分或由能够与其杂交 的序列编码，或其中金属硫蛋白为如SEQ ID NO：2所示或其同源物、 衍生物或活性片段。可选地，金属硫蛋白可以由如SED ID NO 3所示 的核酸序列或其一部分或能够与其杂交的序列编码，或其中金属硫蛋 白为SEQ ID NO 4所示或任何其同源物、衍生物或活性片段。
“改变的结构”可以由于细胞分裂的变化所致。这里采用的术语 “结构(architecture)”包括植物的外观或形态学，包括任何一个或 多个结构特征或其结构特征的组合。这种结构特征包括植物的任意细 胞、组织或器官或细胞、组织或器官的组的形状、大小、数量、位置、 质地、排列和模式，包括根、叶、芽、茎或分蘖、叶柄、毛状体、花、 花序(对于单子叶和双子叶植物)、圆锥花序、花瓣、柱头、花柱、 雄性花蕊、花粉、胚珠、种子、胚芽、胚乳、种子表皮、糊粉、须根、 形成层、木质、赤木质、薄壁组织、通气组织、筛分子、韧皮部或者 脉管组织等等。因此改变的结构包括植物的改变的生长的所有方面。
改变的结构优选包括改变的初级圆锥花序的数目、改变的植物高 度和改变的总面积，均相对于对照植物而言。因此，根据本发明，提 供了一种改变植物的结构的方法，特别是初级圆锥花序的数目、植物 高度和植物面积，该方法包括调节植物中编码金属硫蛋白的核酸序列 的表达和/或调节金属硫蛋白本身的活性，优选其中金属硫蛋白由 SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其一部分或由能够与其杂交的序列编 码，或其中金属硫蛋白为如SEQ ID NO：2所示或其同源物、衍生物或 活性片段。可选地，金属硫蛋白可以由如SED ID NO 3所示的核酸序 列或其一部分或能与上述序列杂交的序列编码，或其中金属硫蛋白为 SEQ ID NO 4所示或其同源物、衍生物或活性片段。
根据本发明的第二具体实施方式，提供了有助于在本发明方法有 用的核酸序列的引入和/或表达的遗传构建体和载体，因此根据本发明 的第二种具体实施方式，提供了一种基因构建体，包括：
(i)编码金属硫蛋白的核酸序列；
(ii)驱动(i)的核酸序列表达的GOS2启动子；以及任选地
(iii)转录终止序列。
用于本发明的方法的构建体可以用本领域技术人员熟知的重组 DNA技术构建。该基因构建体可以被插入载体，载体可以购买得到， 适合于转化入植物并适合感兴趣基因在转化细胞中表达。遗传构建体 可以为表达载体，其中核酸序列可操作性地与一个或多个允许在原核 和/或真核宿主细胞中表达的调控序列连接。
根据本发明的一个优选的具体实施方式，遗传构建体为表达载体， 设计用于过表达所述核酸序列。能够调节编码金属硫蛋白的核酸的表 达和/或金属硫蛋白本身的活性的核酸序列可以为编码金属硫蛋白或 其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列，例如这里前述的任意的核 酸序列。优选的核酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列或其一部分，或 能够与其杂交的序列，或编码SEQ ID NO：2所示的序列或其同源物、 衍生物或活性片段的核酸序列。该核酸优选相对于它操作性连接的调 控序列以有义方向克隆。
用含有感兴趣序列(即能够调节编码金属硫蛋白的核酸的表达的 核酸序列)的载体转化植物，该序列与一个或多个调控序列(至少启 动子)可操作地连接。术语“调控元件”、“调控序列”、“控制序 列”和“启动子”在这里均可互换使用并以其广义理解为指能够实现 它们所连接的序列的表达的调节核酸序列。被前述术语包括的有来源 于经典的真核基因组基因的转录调节序列(包括精确的转录起始所需 的TATA框，具有或不具有CCAAT框序列)以及附加的调控元件(即， 上游活化序列，增强子和静默子)，其响应发育和/或外部刺激或以组 织特异性的方式而改变基因表达。一种经典的原核基因的转录调控序 列也包含在该术语范围内，在该情形下，它可以包括一个-35框序列 和/或-10框转录调节序列。术语“调控元件”也包含赋予、活化或 增强细胞、组织或器官中核酸分子表达的合成融合分子或衍生物。术 语“控制序列”、“调控序列”、“调控元件”和“启动子”这里可 互换使用。这里采用的术语“可操作性连接”指在启动子序列和感兴 趣基因之间的功能性连接，从而使启动子序列能够起始感兴趣基因的 转录。
可以根据需要的结果方便地采用任意类型的启动子来驱动核酸序 列的表达。能够调节编码金属硫蛋白的基因表达的核酸序列优选与组 成型启动子可操作性地连接。这里定义的术语“组成型”指在植物至 少一种组织或器官中和在任意生命阶段占支配地位表达的启动子。启 动子优选在整个植物中占优势表达。组成型启动子优选为来自水稻的 GOS2启动子，或具有相似强度的启动子和/或具有相似表达模式的启 动子。可选地，可以采用组织特异性启动子。例如，在设想增加的种 子产量的情况下，可以想到采用种子优先、花优先、分生组织优先的 启动子，或在分裂细胞中有活性的启动子。启动子强度和/或表达模 式可以通过例如将该启动子与报道基因偶联并检测报道基因在不同的 植物组织中的表达来分析。一个本领域技术人员熟知的合适的报道基 因为β-葡糖醛酸糖苷酶。
可选的组成型启动子的例子列于表1，这些启动子或其衍生物均 可用于本发明的方法。
表1：可用于实施本发明的组成型启动子 基因来源 参考文献 肌动蛋白 McElroy等人，Plant Cell，2： 163-171，1990 CAMV 35S Odell等人，Nature，313：810-812， 1985 CaMV 19S Nilsson等人，Physiol.Plant. 100：456-462，1997 GOS2 dePater等人，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992 遍在蛋白 Christensen等人，Plant Mol. Biol.18：675-689，1992 水稻亲环蛋白 Buchholz等人，Plant Mol Biol. 25(5)：837-43，1994 玉米H 3组蛋白 Lepetit等人，Mol.Gen.Genet. 231：276-285，1992 肌动蛋白2 An等人，Plant J.10(1)；107-121， 1996
任选地，在引入植物的构建体中还可以采用一个或多个终止序列。 术语“终止子”包括为在转录单位末端的DNA序列的控制序列，它发 出初级转录物的3’加工处理和聚腺苷酸化以及转录终止的信号。其它 调控元件可以包括转录和翻译增强子。本领域技术人员已知适合用于 本发明的终止子和增强子序列，本领域技术人员会知道并容易得到这 种序列。
本发明的遗传构建体可以进一步包括复制起点序列，它是在特定 细胞类型中保持和/或复制所需的，例如细菌细胞，当遗传构建体需 要在细胞中作为游离型遗传元件(如，质粒或粘粒分子)保持的时候。 优选的复制起点包括但并不限于fl-ori和colE1复制起点。
该遗传构建体可以任选地包括选择标志基因，这里采用的术语“选 择标志基因”包括赋予细胞一种表型的任意基因，它在该细胞中表达 以协助识别和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。合 适的标志物可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标志物，其引入新的 代谢性状或允许观察选择。选择标志基因的例子包括赋予对抗生素的 抗性(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或能够磷酸化潮霉素的 hpt)，对除草剂的抗性(例如bar，提供对Basta的抗性；aroA或gox， 提供对草甘膦的抗性)的基因，或提供代谢性状的基因(如manA，允许 植物利用甘露糖作为唯一的碳源)。可见的标志基因导致颜色的形成 (例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)，发光(例如荧光素酶)或荧光(绿色荧 光蛋白，GFP，和其衍生物)。
在一个优选的具体实施方式中，上述的遗传构建体包括以有义方 向与启动子偶联的金属硫蛋白基因，该启动子优选为组成型启动子， 例如水稻GOS2启动子。因此，本发明的另一方面为一种含有SEQ ID NO 7的表达盒的载体构建体，该表达盒含有水稻GOS2启动子，SEQ ID NO 2所示的鼠耳芥金属硫蛋白基因以及T-zein+T-rubisco deltaGA转 录终止序列。
另外，本发明提供了一种含有基本上与SEQ ID NO 7相似的表达 盒的载体构建体，基本上与SEQ ID NO 7相似的序列包括编码与SEQ ID NO 2同源的蛋白质或与SEQ ID NO 1杂交的第一核酸序列，该第一核 酸序列与水稻GOS2启动子或具有类似的表达模式的启动子可操作性 地连接和/或该第一核酸序列与转录终止序列连接。因此根据本发明 的另一方面，提供了一种基本上与SEQ ID NO 7相似的基因构建体， 其包含编码金属硫蛋白的核酸序列位于其中的表达盒，所述核酸序列 选自包括以下核酸序列的组：
(i)SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其互补链；
(ii)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其同源物、衍生物 或活性片段的核酸序列；
(iii)根据以上(i)到(ii)作为遗传密码结果简并的核酸序列；
(iv)为根据(i)到(iii)的核酸序列的等位基因变异体的核酸序 列；
(v)为根据(i)到(iv)的核酸序列的可变剪接变异体的核酸序 列；
本发明还包括可通过本发明的方法得到的植物。本发明因此提供 可通过本发明的方法所得到的植物，该植物具有改变的生长和发育， 该植物具有改变的金属硫蛋白活性和/或改变的编码金属硫蛋白的核 酸序列的表达。该植物优选为含有引入的编码金属硫蛋白的核酸序列 的转基因植物，具有增加的产量和/或生物量，其特征在于根据编码 金属硫蛋白的核酸序列的经调节的表达和/或金属硫蛋白经调节的活 性选择了转基因植物。进一步优选根据编码金属硫蛋白的核酸的增加 的表达选择了转基因植物。
根据本发明的第三个具体实施方式，提供了一种生产具有改变的 生长特性的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达上述的编码 金属硫蛋白的核酸分子。
更具体而言，本发明提供了一种生产具有改变的生长特性的转基 因植物的方法，该方法包括：
(i)向植物或植物细胞中引入编码金属硫蛋白或其同源物、衍 生物或活性片段的核酸序列或其一部分；
(ii)从转基因植物细胞再生和/或生长植物。
蛋白本身和/或核酸本身可以被直接引入植物细胞或植物本身 (包括引入植物的组织、器官或任何其它部分)。根据本发明的一个优 选特征，核酸序列优选通过转化引入植物。核酸序列优选为SEQ ID NO： 1所示或其一部分或能够与其杂交的序列，或是编码SEQ ID NO：2所 示的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列。可选地， 核酸序列为如SED ID NO 3所示或其一部分，或能够与任何上述序列 杂交的序列。可选地氨基酸序列可以为SEQ ID NO 4所示的序列或其 同源物、衍生物或活性片段。
这里涉及的术语“转化”包括将外源性多核苷酸转移到宿主细胞 中，而不考虑用来转移的方法。能够随后进行无性繁殖的植物组织， 无论通过器官形成或胚胎形成，都可以用本发明的基因构建体来转化， 整株植物从其再生。选择的特定组织将根据对于所转化的特定物种可 利用且最适的无性繁殖系统而变化。例示性的组织靶包括叶片、花粉、 胚、子叶、胚轴、雌配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如，尖分 生组织，叶腋芽，以及根分生组织)，和诱导的分生组织(例如，子叶 分生组织和胚轴分生组织)。多核苷酸可以被瞬时或稳定引入宿主细胞 并可以保持非整合，例如，作为质粒。可选地，它可以整合入宿主基 因组，获得的转化植物细胞可以用于以本领域技术人员已知的方式再 生转化植物。
目前植物物种的转化是一种相当常规的技术，可以方便地采用几 种转化方法的任意一种来将感兴趣基因引入合适的祖先细胞。转化方 法包括运用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄入的化学物质、将DNA 直接注射入植物中、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化或显微发射。方 法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等， 1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol. Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；向植物材料微注射(Crossway A.等， 1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA-包被粒子轰击 (Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)用(非整合)病毒感染等 等。表达金属硫蛋白编码基因的转基因水稻植物优选采用任何已知的 水稻转化方法通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化产生，例如任 何下列文献所描述的：公开的欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita 和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人.(Plant Mol. Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人.(Plant J.6(2)271-282， 1994)，其公开内容在这里作为参考引用，如同全部列出一样。在玉 米转化的情形，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)：745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002May；129(1)： 13-22)所描述，其公开内容在这里作为参考引用，如同全部列出一样。
通常转化后，选择植物细胞或细胞组中一个或多个标志物的存在， 该标志物由与感兴趣基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化 材料再生为完整的植株。
DNA转移和再生后，可以运用例如Southern分析等评估推定转化 植物中感兴趣基因的存在、拷贝数和/或基因组结构构成，可选地或 附加地，新引入的DNA的表达水平可以用Northern和/或Western 分析监测，两种技术都为本领域普通技术人员所熟知。
本发明因此还包括含有引入的编码金属硫蛋白的核酸和具有如上 定义的改变的生长和发育的转基因植物，特征在于改变的生长和发育 是编码金属硫蛋白的核酸经调节的表达的结果。进一步选择转基因植 物编码金属硫蛋白的核酸经调节的表达。优选选择转基因植物编码金 属硫蛋白的核酸的增加表达。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过无性繁殖或经典 育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花受精产生纯合的第 二代(或T2)转化体，T2植物进一步通过经典育种技术繁殖。
产生的转化生物体可以采取多种形式，例如它们可以是转化细胞 和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有细胞都被转化含有表 达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如，在植物中，将转化的根茎 嫁接到未转化的幼芽上)。
本发明显然延伸至这里描述的任意方法所产生的任意植物细胞或 植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明进一步延伸，包含了 由任意的前述方法产生的初级转化或转染细胞、组织、器官或整株植 物的后代，唯一的要求为后代表现出与通过本发明的方法在亲本中产 生的同样的基因型和/或表型特征。本发明也包括含有分离的编码能够 调节金属硫蛋白的蛋白的核酸分子的宿主细胞，优选其中该蛋白为金 属硫蛋白。本发明的优选的宿主细胞为植物细胞。因此，本发明也包 括具有改变的生长特性的宿主细胞或转基因植物，其特征在于所述的 宿主细胞或转基因植物具有编码金属硫蛋白的核酸序列的经调节的表 达和/或金属硫蛋白的经调节的活性和/或水平。本发明也扩展到植 物的可收获部分，例如但并不限于种子、叶、果实、花、茎培养、根 茎、块茎和鳞茎。
这里采用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代以及 植物部分，包括种子、枝条、茎、根(包括块茎)和植物细胞、组织 和器官。术语“植物”因此也包括悬浮培养物、胚胎、分生组织区域、 愈伤组织、叶、种子、根、枝条、配偶体、孢子体、花粉以及小孢子。 本发明的方法中特别有用的植物包括藻类、蕨类植物以及所有属于 Viridiplantae超家族的植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包 括饲料或草料豆类、装饰植物、食用农作物、树木、或灌木，从包括 下列植物的列表中选择：金合欢属(Acacia spp.)，槭树属(Acer spp.)，猕猴桃属(Actinidia spp.)，七叶树属(Aesculus spp.)， 新西兰贝壳杉(Agathis australis)，Albizia amara，Alsophila tricolor，须芒草属(Andropogon spp.)，落花生属(Arachis spp.)， 槟榔(Areca catechu)，Astelia fragrans，Astragalus cider， Baikiaea plurijuga，桦木属(Betula spp.)，芸苔属(Brassica spp.)， 木榄(Bruguiera gymnorrhiza)，Burkea africana，紫铆(Butea frondosa)，Cadaba farinosa，朱缨花属(Calliandra spp，)，大叶 茶(Camellia sinensis)，美入蕉(Canna indica)，辣椒属(Capsicum spp.)，决明属(Cassia spp.)，Centroema pubescens，木瓜属 (Chaenomeles spp.)，肉桂(Cinnamomum cassia)，小果咖啡(Coffea arabica)，Colophospermum mopane，变异小冠花(Coronillia varia)， Cotoneaster serotina，山楂属(Crataegsu spp.)，香瓜属(Cucumis spp.)，柏木属(Cupressus spp.)，Cyathea dealbata，榅桲(Cydonia oblonga)，日本柳杉(Cryptomeria japonica)，香茅属(Cymbopogon spp.)，Cynthea dealbata，榅桲(Cydonia oblonga)，Dalbergia monetaria，大叶骨碎补(Davallia divaricata)，角丝鼓藻属 (Desmodium spp.)，粗糙蚌壳蕨(Dicksonia squarosa)， Diheteropogon amplectens，Dioclea spp，镰扁豆属(Dolichos spp.)， Dorycnium rectum，Echinochloa Pyramidalis，Ehrartia spp.，移 子(Eleusine coracana)，Eragrestis spp.，刺桐属(Erythrina spp.)， 桉属(Eucalyptus spp.)，Euclea schimperi，Eulalia villosa，荞 麦属(Fagopyrum spp.)，费约果(Feijoa sellowiana)，草莓属 (Fragaria spp.)，千斤拔属(Flemingia spp)，Freycinetia banksii， Geraniun thunbergii，银杏(Ginkgo biloba)，Glycine javanica， Gliricidia spp，陆地棉(Gossypium hirsutum)，银桦属(Grevillea spp.)，Guibourtia coleosperma，岩黄芪属(Hedysarum spp.)，牛 鞭草(Hemarthia altissima)，扭黄茅(Heteropogon contortus)， 大麦(Hordeum vulgare)，Hyparrhenia rufa，小连翘(Hypericum erectum)，Hyperthelia dissoluta，Indigo incarnata，鸢尾属(Iris spp.)，Leptarrhena Pyrolifolia，胡枝子属(Lespediza spp.)， Lettuca spp.，Leucaena leucocephala，Loudetiasimplex，Lotonus bainesii，百脉根属(Lotus spp.)，Macrotyloma axillare，苹果 属(Malus spp.)，Manihot esculenta，紫苜蓿(Medicago sativa)， 水杉(Metasequoia glyptostroboides)，大蕉(Msa sapientum)，烟 草属(Nicotiana spp.)，驴食豆属(onobrychis spp.)，ornithopus spp.，稻属(Oryza spp.)，Peltophorum africanum，狼尾草属 (Pennisetum spp.)，Persea gratissima，碧冬茄属(Petunia spp.)， 菜豆属(Phaseolus spp.)，槟榔竹(Phoenix canariensis)，Phormium cookianum，石楠属(Photinia spp.)，白云杉(Picea glauca)，松 属(Pinus spp.)，豌豆(Pisum sativum)，新西兰罗汉松(Podocarpus totara)，Pogonarthria fleckii，Pogonarthria squarrosa，杨属 (Populus spp.)，牧豆树(Prosopis cineraria)，花旗松(Pseudotsuga menziesii)，Pterolobium stellatum，西洋梨(Pyrus communis)， 栎属(Quercus spp.)，Rhaphiolepsis umbellata，美味棒花棕 (Rhopalostylis sapida)，Rhus natalensis，欧洲醋栗(Ribes grossularia)，茶藨子属(Ribes spp.)，洋槐(Robinia pseudoacacia)，蔷薇属(Rosa spp.)，悬钩子属(Rubus spp.)，柳属 (Salix spp.)，Schyzachyrium sanguineum，金松(Sciadopitys verticillata)，北美红杉(Sequoia sempervirens)，巨杉 (Sequoiadendron giganteum)，两色蜀黍(Sorghum bicolor)，菠菜 属(spinacia spp.)，sporobolus fimbriatus，Stiburus alopecuroides，Stylosanthos humilis，葫芦茶属(金属硫蛋白ehagi spp)，落羽杉(Taxodium distichum)，阿拉伯黄背草(Themeda triandra)，车轴草属(Trifolium spp.)，小麦属(Triticum spp.)， 异叶铁杉(Tsuga heterophylla)，越桔属(Vaccinium spp.)，野豌豆 属(Vicia spp.)，葡萄(Vitis vinifera)，锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)，马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)，玉蜀黍(Zea mays)，苋属(amaranth)，朝鲜蓟、芦笋、茎椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、 油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、绿叶菜、亚麻、散叶甘蓝、 小扁豆、含油种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜 菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜和茶、树木和藻类等。根据本发明的 优选特征，植物为农作物，包括大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽 或棉花。进一步优选地，根据本发明的植物为单子叶植物，例如甘蔗， 最优选为谷类，如水稻、玉米、小麦、粟、大麦、燕麦、高梁。
然而，设想本发明的方法可以应用于广泛种类的植物，因为在已 知的真核生物金属硫蛋白同源物中的高度序列保守性提示其在细胞代 谢中同样保守的功能。
本发明也涉及金属硫蛋白或编码金属硫蛋白的核酸在改变植物的 生长和发育中的应用，优选在改变植物的生长特性中的应用，优选提 高产量和/或生物量和改变植物的结构，条件是所述改变的生长和发 育并非增加的金属的聚积或对非生物逆境增加的耐受性和抗性。核酸 序列优选为SEQ ID NO：1所示或其一部分，或能够与之杂交的序列， 或为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段。 优选地，产量和/或生物量的提高为种子产量的增加，更优选种子产 量的增加包括种子总数、种子总重以及更高数目的初级圆锥花序中的 一项或多项。
本发明也涉及编码金属硫蛋白及其同源物、衍生物和活性片段的 核酸序列的应用和金属硫蛋白本身及其同源物、衍生物和活性片段的 应用，作为生长调节剂。这里前文所述的核酸序列(及其部分和能够 与其杂交的序列)以及这里前述的氨基酸序列(及其同源物、衍生物 和活性片段)均可用于改变植物的生长特性，如前文所述。因此该序 列可以用作生长调节剂，刺激或抑制植物生长。因此本发明提供了含 有SEQ ID NO 2所示的蛋白质或其同源物、衍生物或活性片段的组合 物，用于提高植物的产量和/或生物量。本发明另外提供了含有SEQ ID NO 1所示的核酸或其部分或能够与其杂交的序列的组合物，用于提高 植物的产量和/或生物量。本发明也提供了一种含有任意上述氨基酸 序列所示的蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的组合物，用作生长 调节剂。
相反地，本发明的序列也可以为农用化学化合物的感兴趣靶标， 例如除草剂或生长刺激剂。相应地，本发明包含将前述的核酸序列(或 其一部分和能够与其杂交的序列)或前述的氨基酸序列(或其同源物、 衍生物和活性片段)作为农用化学化合物例如除草剂或生长刺激剂的 靶标的应用。
如上所述，本发明的方法导致具有改变的植物生长特性的植物， 这些有利的生长特性还可以与其它的经济学上有利的性状相结合，例 如进一步增加产量的性状、对各种逆境的耐受性、改变各种结构特征 和/或生物化学和/或生理学特征的性状。本发明的方法也可以通过 将编码金属硫蛋白的基因与至少一种与编码金属硫蛋白的基因协作的 其它基因在植物中共表达而实施。
附图说明
本发明将参考下列附图进行描述，其中：
图1：不同植物金属硫蛋白序列的对比(Cobbett和Goldsbrough， 2002)。N末端和C末端区域的保守半胱氨酸用星号表示。缩写：At， Arabidopsis vulgaris，Bn，油菜(Brassica napus)，Os，稻(Oryza sativa)，Ps，豌豆(Pisum sativum)，Ms，紫花苜蓿(Medicago sativa)， Bo，卷心菜(Brassica oleracea)，Ph，矮牵牛(Petunia hybrida)， Sv，蝇子草(Silene vulgaris )，Ma，香蕉(Musa acuminata)， Ad，猕猴桃(Actinidia deliciosa)，Gh，Gossipium hirsutum， Pg，白云杉(Picea glauca)，Zm，玉米(Zea mays)，Ta，小麦(Triticum aestivum)。
图2：进入克隆p33的示意图，在AttL1和AttL2位点内含有在 pDONR201的主链内进行Gateway克隆的CDS1585，。CDS1585为鼠耳 芥(Arabidopsis thaliana)金属硫蛋白样AtMT2a编码序列的内在 密码子。该载体还含有一个细菌卡那霉素抗性盒和细菌复制起点。
图3：在水稻GOS2启动子(PR00129)的控制下，在水稻(Oryza sativa)中表达鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)金属硫蛋白样AtMT2a 基因(CDS1585)的二元载体。该载体含有来源于Ti质粒的T-DNA，被 左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界(RB重复，RB Ti C58))限定。 从左边界到右边界，该T-DNA含有：用于转化植物的抗生素选择的盒； 用于转化植物的视觉观察筛选的盒；表达鼠耳芥金属硫蛋白样AtMT2a 基因的PRO0129-CDS1585-zein和rbcS-deltaGA双终止子表达盒 (SEQ ID NO 7)。该载体还含有来自pBR322的复制起点以进行细菌复 制，以及一个选择标记物(Spe/SmeR)，以用壮观霉素和链霉素进行细 菌选择。
图4：序列表。
实施例
本发明将参考仅作为例示的下列实施例加以描述。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001) 分子克隆：实验室手册，第三版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约) 或第1和2卷的Ausubel等人(1984)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols中所描述的标准操作程序进 行。植物分子工作的标准材料和方法在Plant Molecular Biology Labfase(1993)中描述，作者R.D.D. Croy，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK) 出版。
实施例1.CDS0851的克隆
采用鼠耳芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板 通过PCR技术扩增鼠耳芥金属硫蛋白编码序列AtMT2a(CDS1585)。
从幼苗中提取的RNA反转录后，将cDNA克隆入pCMV Sport 6.0。库 的平均插入物大小为1.5kb，克隆的原始数目为1.59×107cfu。原始 效价测定为9.6×105cfu/ml，在第一次扩增后变为6×1011cfu/ml。提 取质粒后，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。包括用于Gateway 重组的AttB位点的引物prm03240(SEQ ID NO 5)和prm03241(SEQ ID NO 6)用于PCR扩增。用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下进行 PCR。246bp的PCR片段被扩增并也用标准方法纯化。接着进行 Gateway操作程序的第一步，BP反应，其中PCR片段在体内与pDONR201 质粒重组产生按照Gateway术语学命名的“进入克隆(entry clone)” p33(图1)。质粒PDONR201从Invitrogen购买，作为Gateway技术 的一部分。
实施例2：载体构建用于PRO0129-CDS1585盒转化
随后进入克隆p33被用于与p0640-一个用于水稻转化的目的载 体(destination vector)-的LR反应。该载体在T-DNA界限的范围 内含有作为功能元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒；以及旨在 与已经克隆入进入克隆感兴趣序列进行LR体内重组的Gateway盒。用 于组成性表达的水稻GOS2启动子(PRO0129)位于该Gateway盒的上游。
LR重组步骤后，得到的表达载体p34(图2)可以被转化入农杆 菌属菌株LBA4044，并随后引入水稻植株中。
实施例3：用PRO0129-CDS1585转化水稻
将水稻japonica栽培种Nipponbare的成熟干种子脱壳。通过 将种子在70％乙醇中孵育1分钟，然后在0.2％HgCl2中30分钟，并用 无菌蒸馏水15分钟洗涤6次，进行灭菌。接着使无菌的种子在含有 2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)中发芽。在黑暗中孵育4周后， 将形成胚胎的、来源于子叶盘的愈伤组织切下并在同样的培养基中繁 殖。2周后，通过在同样的培养基中再培养2周而增殖或繁殖愈伤组 织。在共同培养前3天，将胚胎形成的愈伤组织片在新鲜的培养基中 再培养以加强细胞分裂活性。携带二元载体p3076的农杆菌属菌株 LBA4044用于共培养。在28℃将农杆菌菌株在含适宜抗生素的AB培 养基上培养3天。接着收集细菌并以大约为1的OD600悬浮在液体共培 养培养基中。将悬浮液转移到陪替氏培养皿，将愈伤组织在悬浮液中 沉浸15分钟。接着将愈伤组织在滤纸上点干，转移到固化的共培养培 养基中，并在黑暗中25℃孵育3天。
然后将共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中在合适浓度的 选择试剂的存在下，在28℃的黑暗中生长4周。在此期间，迅速生长 的抗性愈伤组织岛发育。在将该材料转移到再生培养基和在光照下孵 育后，释放了胚胎形成的潜力，在接下去的4到5周内发出枝条。从 愈伤组织剪除枝条，并在含有植物生长素的培养基上孵育2到3周， 然后转移到土壤中。使变硬的枝条在温室中高湿度和短日照下生长。 最后在移植后3到5个月收获种子。该方法以超过50％的比率生产单 基因座转化体(Aldemita和Hodges，1996，Chan等，1993，Hiei等， 1994)。
实施例4.以PRO0129-CDS1585转化的转基因水稻的评估
大约产生15到20株独立的T0转化株。将原代转化株从组织培养 室转移到温室，以培育和收获T1种子。保留T1后代按转基因的存在 /缺乏3∶1分离的7个事件。对其中每种事件，通过可视标记筛选选 择含有转基因10株T1幼苗(杂合子和纯合子)，以及缺乏转基因的 10株T1幼苗(零合子)。将选择的T1植物转移到温室中，每株植物都 接受独特的条形码标记以将表型数据和相应植物清楚无误地联系起 来。选择的T1植物在10cm直径罐中的土壤中栽培，环境设置如下： 光周期＝11.5h，光照强度＝30,000lux或更大，日间温度＝28℃或更 高，夜间温度＝22℃，相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的零合 子在随机位置并行培育。从播种期直到成熟期，植物通过数字成像室 数次。每一时间点从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像 (2048×1536像素，16百万颜色)。
收获、装袋、并用条形码标记成熟的初级圆锥花序，然后在烤箱 中37℃干燥3天。圆锥花序接着被脱粒，并收集所有种子。用吹风 装置将饱满的壳与空壳分离。分离后，将两批种子用可商业化购买得 到的计数器计数。将空壳丢弃，饱满的壳在分析天平上称重，对种子 的横截面积用数字成像进行测量。该操作步骤获得了下面描述的种子 相关参数。
这些参数均采用图像分析软件以自动的方式来自数字图像并作统 计学分析。用经不均衡设计矫正的双因素ANOVA(方差分析)作为植物 表型特征的总体评估的统计模型。对用该基因转化的所有事件的所有 植物测定的所有参数进行F检验。进行F检验来检测基因在所有转化 事件中的效应并验证基因的总体效应，这里也称为“总体(global) 基因效应”。如果F检验值显示数据是显著的，则得出结论-存在“基 因”效应，表示不仅是基因的存在或位置引起所述效应。对于F检验， 总体基因效应的显著性的阈值设置为5％概率水平。
为检测每一事件内基因的效应，即株系(line)特异性效应，采 用从转基因植物以及相应的空载植物中获得的数据在每一事件内进行 t检验。“空载植物”或“空载分离株”或“零合子”为以与转基因 植物同样的方式处理的植物，但转基因从其中分离。空载植物也可以 被描述为纯合阴性转化植物。T检验的显著阈值设为10％概率水平。一 些事件的结果可能在该阈值之上或之下。这基于基因可能只在基因组 的特定位置时才有效应的假设，该位置依赖性效应的发生并非罕见。 这种基因效应在此也命名为“基因的株系效应(line effect)”。p 值通过比较t-分布与t值，或者比较F分布与F值而得到。然后p值 给出无效假设(即没有转基因的效应)正确的概率。
按照上述的方法测量植物生长和种子产量。发明人惊讶地发现在 用金属硫蛋白基因转化的水稻植株中，种子的总数和总重以及初级圆 锥花序的数目与没有AtMt2a基因的对照植物相比都提高了。
在第一个试验中获得的数据在以T2植物进行的第二个试验中得 到证实。选择具有正确表达模式的3个株系进行进一步的分析。通过 监测标志物的表达筛选来自T1阳性植物(杂合子和纯合子)的种子批 次。对每一选择的事件，保留杂合种子批次进行T2评估。在每一种子 批次内，在温室中培育相等数目的阳性和阴性植物进行评估。
T2代中总共评估了120株Mt2a转化植物，每一事件40株植物， 其中20株为转基因阳性，20株为阴性。
由于进行了有重复事件的两个试验，除了上述的分析外还进行了 组合分析。这有助于检查在2个试验中的效应的一致性，且如果是这 样的话，可以从2个试验中积累证据，以增加结论的可信度。采用的 方法为混合模型方法，其考虑数据的多级结构(即试验-事件-分离 子)。通过将可能性比率检验与x2分布比较而获得P值。
实施例5.用PRO0129-CDS1585转化的转基因植物的评估结果
通过上述的对种子的分析，发明人发现与缺乏Mt2a转基因的植物 相比，用Mt2a基因构建体转化的植物具有更高数目的初级圆锥花序、 更高的种子总数和更高的种子总重量。从T1代植物中获得的阳性结果 再次在T2代中获得。不仅各转基因系的得分显著优于相应的零合子对 照系，而且当评估所有检测的T2事件的所有植物时，也有显著的阳性 总体效应，强烈表明总体基因效应。表2中列出了数据的概括。
表2 T1植物 T2植物 组合分析 参数 ％差异 p值 ％差异 p值 p值 种子总数 14 0.0404 16 0.0184 0.0003 种子总重 9 0.2092 24 0.0091 0.0017 初级圆锥花序数 16 0.0958 13 0.0907 0.0002
％增加代表了对于所有检测事件的平均增加。T1和T2植物的p值 代表了来自F检验的p值，通过将可能性比率检验与x2分布作比较而 获得组合分析的p值。
种子总数
通过计数从植物收获的壳的数目而测量每株植物的总种子数。转 基因T1系植物表现出14％的总种子数的总体增加，该增加具有显著性。 该增加在以T2植物进行的试验中被证实，其中检测到了16％的显著增 长。T1和T2植物的组合分析显示出总体基因效应(p值为0.0003)。
总种子产量
通过称量从植物收获的所有饱满壳的重量来测量总种子产量(种 子总重)。平均而言，T1植物的种子产量的增加为9％。这些结果也在 T2代中观察到。3个检测株系具有24％的平均产量增长。这一平均增 长具有统计学显著性(p值为0.0091)，T1和T2植物的组合分析显示 出存在总体基因效应(p值为0.0017)。
初级圆锥花序的数目
最高的圆锥花序和所有垂直排列时与最高的圆锥花序交迭的圆锥 花序被认为是初级圆锥花序，并手工计数。转基因对圆锥花序的数目 具有总体效应：T1植物的增加为16％，T2植物为13％。p值(分别为 0.0958和0.0907)证明这些增加是显著的。组合分析表现出总体基因 效应(p值为0.0002)。
观察到不同的转化事件(各自用AtMT2a基因转化的不同的植物事 件)之间的差异。本领域技术人员已知植物中转基因的表达以及由于 该转基因表达导致的表型效应在不同的独立获得的转基因系和其后代 中可以不同。在不同的独立获得的转基因植物中存在的转基因的染色 体插入位点以及插入该位点的转基因拷贝数和那些转基因拷贝在该位 点的构型彼此不同。表达水平的差异可以归因于来自转基因的染色体 环境的影响(所谓的位置效应)或来自某些转基因构型触发的静默机制 的影响(例如，转基因的内向面对串联插入倾向于在转录或转录后水平 静默)。尽管有这种可变性，对T1和T2植物的分析和组合分析表明观 察到的产量的增加是由真正的总体基因效应导致的。
实施例6：在玉米中改变谷粒产量：
这里所述的发明也可用于玉米。为达到这一目的，将Mt2a基因 或其玉米直向同源物，在如水稻GOS2启动子或另一组成型启动子的合 适的启动子的控制下，克隆到适合于农杆菌属介导的玉米转化的植物 转化载体中。这种用于玉米转化的载体和方法在文献中已经记载 (EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676、Ishida 等人，1996；Frame等人，2002)。通过这些方法制备的转基因植物在 温室中生长，用于T1种子生产。通过后代分离分析检测遗传率。通过 定量实时PCR和/或Southern印迹分析来检测转基因的拷贝数。通过 反转录PCR和/或Northern分析确定转基因的表达水平。选择具有转 基因的单拷贝插入和具有不同水平转基因表达的转基因系，通过自花 受精进行T2种子生产或与不同种质杂交。使后代种子发育，在田野或 温室中以非常适合玉米的条件(16∶8小时光周期，26-28℃日间温度 和22-24℃夜间温度)以及在缺乏水、缺乏氮以及过量NaCl的条件下 生长。在自花受精的情况下，用来自同一母系的无效分离子以及同一 栽培种的野生型植物作为对照。在杂交的情况下，转基因株、无效分 离子和同一栽培种的野生型植物与选择的亲本杂交，且将来自转基因 杂交的F1植物与来自无效分离子和野生型杂交的F1植物相比较。对 自花受精或杂交产生的后代植物的不同的生物量和生长参数进行评 估，包括植物高度，茎厚度，叶片数目，总地上面积，叶子的绿色度， 成熟时间，开花时间，抽穗数目，收获时间。也对这些株系的种子的 多种参数进行测定，例如谷粒大小，每株植物的总谷粒产量和谷粒质 量(淀粉含量，蛋白含量和油含量)。选择对于任何上述参数与对照相 比最显著改善的植物系进行进一步的田间测验和标记辅助育种，目标 是将田间证实有效的转基因性状转移到商品化的种质。在田间对玉米 生长和产量相关参数进行检测的方法在现有技术中已经良好地确立， 将特定基因座(例如含有转基因的基因座)从一种种质渐渗到另一种质 的技术也已充分建立。
序列表
<110>CropDesign N.V.
<120>具有改变的生长特性的植物及其生产方法
<130>CD-089-PCT
<150>EP 030760862
<151>2003-04-14
<160>7
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>336
<212>DNA
<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>misc_feature
<223>MT2a DNA序列
<400>1
ttttcattca taaatttttc ttcaatttga attttctcga gaaaaatgtc ttgctgtgga 60
ggaaactgcg gatgtggatc tggctgcaag tgcggcaacg gttgtggagg ttgcaaaatg 120
taccctgact tgggattctc cggcgagaca accacaactg agacttttgt cttgggcgtt 180
gcaccggcga tgaagaatca gtacgaggct tcaggggaga gtaacaacgc tgagaacgat 240
gcttgcaagt gtggatctga ctgcaagtgt gatccttgca cctgcaagtg aagaagcctt 300
tttaaataag cagagataat cgagtctctt taatta 336
<210>2
<211>81
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>MT2a蛋白质序列
<400>2
Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Lys Cys
1 5 10 15
Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Leu Gly Phe Ser
20 25 30
Gly Glu Thr Thr Thr Thr Glu Thr Phe Val Leu Gly Val Ala Pro Ala
35 40 45
Met Lys Asn Gln Tyr Glu Ala Ser Gly Glu Ser Asn Asn Ala Glu Asn
50 55 60
Asp Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asp Cys Lys Cys Asp Pro Cys Thr Cys
65 70 75 80
Lys
<210>3
<211>545
<212>DNA
<213>鼠耳芥
<220>
<221>misc_feature
<223>MT1 DNA序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(331)..(331)
<223>n为a，c，g，或t
<400>3
cattcataaa tttttcttca atttgaattt tctcgagaaa aatgtcttgc tgtggaggaa 60
actgcggatg tggatctggc tgcaagtgcg gcaacggttg tggaggttgc aaaatgtacc 120
ctgacttggg attctccggc gagacaacca caactgagac ttttgtcttg ggcgttgcac 180
cggcgatgaa gaatcagtac gaggcttcag gggagagtaa caacgctgag agcgatgctt 240
gcaagtgtgg atctgactgc aagtgtgatc cttgcacctg caagtgaaga agccttttta 300
aataagcaga gataatcgag tctctttaat ntaattaagt tattcaataa gtaaaccata 360
tataggatgg tgtttttagg tttggtttat gtgtaataat ggcttcagct tatcttttag 420
ccgatcattg tcttttgtgt ttgttttgat catatctttt agatgtctag caaatctgcc 480
atgtgatgag tttgtacttc cagtggaatg ataataatat tatagtttta aatcaaaaaa 540
aaaaa 545
<210>4
<211>81
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>MT1蛋白质序列
<400>4
Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Lys Cys
1 5 10 15
Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Leu Gly Phe Ser
20 25 30
Gly Glu Thr Thr Thr Thr Glu Thr Phe Val Leu Gly Val Ala Pro Ala
35 40 45
Met Lys Asn Gln Tyr Glu Ala Ser Gly Glu Ser Asn Asn Ala Glu Ser
50 55 60
Asp Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asp Cys Lys Cys Asp Pro Cys Thr Cys
65 70 75 80
Lys
<210>5
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物 prm03240
<400>5
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtct tgctgtggag gaa 53
<210>6
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物 prm03241
<400>6
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcacttgcag gtgcaag 47
<210>7
<211>3032
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MT2a的表达盒
<400>7
aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60
aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120
catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180
tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 240
tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300
aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360
atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 420
ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480
ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540
gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600
tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660
tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 720
aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780
aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840
acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900
tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960
aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020
ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080
cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc 1140
cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg 1200
tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg 1260
gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat 1320
ggttttcaat cgtctggaga gctctatgga aatgaaatgg tttagggtac ggaatcttgc 1380
gattttgtga gtaccttttg tttgaggtaa aatcagagca ccggtgattt tgcttggtgt 1440
aataaaagta cggttgtttg gtcctcgatt ctggtagtga tgcttctcga tttgacgaag 1500
ctatcctttg tttattccct attgaacaaa aataatccaa ctttgaagac ggtcccgttg 1560
atgagattga atgattgatt cttaagcctg tccaaaattt cgcagctggc ttgtttagat 1620
acagtagtcc ccatcacgaa attcatggaa acagttataa tcctcaggaa caggggattc 1680
cctgttcttc cgatttgctt tagtcccaga attttttttc ccaaatatct taaaaagtca 1740
ctttctggtt cagttcaatg aattgattgc tacaaataat gcttttatag cgttatccta 1800
gctgtagttc agttaatagg taatacccct atagtttagt caggagaaga acttatccga 1860
tttctgatct ccatttttaa ttatatgaaa tgaactgtag cataagcagt attcatttgg 1920
attatttttt ttattagctc tcaccccttc attattctga gctgaaagtc tggcatgaac 1980
tgtcctcaat tttgttttca aattcacatc gattatctat gcattatcct cttgtatcta 2040
cctgtagaag tttctttttg gttattcctt gactgcttga ttacagaaag aaatttatga 2100
agctgtaatc gggatagtta tactgcttgt tcttatgatt catttccttt gtgcagttct 2160
tggtgtagct tgccactttc accagcaaag ttcatttaaa tcaactaggg atatcacaag 2220
tttgtacaaa aaagcaggct tcacaatgtc ttgctgtgga ggaaactgcg gatgtggatc 2280
tggctgcaag tgcggcaacg gttgtggagg ttgcaaaatg taccctgact tgggattctc 2340
cggcgagaca accacaactg agacttttgt cttgggcgtt gcaccggcga tgaagaatca 2400
gtacgaggct tcaggggaga gtaacaacgc tgagaacgat gcttgcaagt gtggatctga 2460
ctgcaagtgt gatccttgca cctgcaagtg aaacccagct ttcttgtaca aagtggtgat 2520
atcacaagcc cgggcggtct tctagggata acagggtaat tatatccctc tagatcacaa 2580
gcccgggcgg tcttctacga tgattgagta ataatgtgtc acgcatcacc atgggtggca 2640
gtgtcagtgt gagcaatgac ctgaatgaac aattgaaatg aaaagaaaaa aagtactcca 2700
tctgttccaa attaaaattc attttaacct tttaataggt ttatacaata attgatatat 2760
gttttctgta tatgtctaat ttgttatcat ccgggcggtc ttctagggat aacagggtaa 2820
ttatatccct ctagacaaca cacaacaaat aagagaaaaa acaaataata ttaatttgag 2880
aatgaacaaa aggaccatat cattcattaa ctcttctcca tccatttcca tttcacagtt 2940
cgatagcgaa aaccgaataa aaaacacagt aaattacaag cacaacaaat ggtacaagaa 3000
aaacagtttt cccaatgcca taatactcga ac 3032
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