测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法
专利汇可以提供测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种测定平菇中吲哚乙酸 氧 化酶 活性的方法，利用 磷酸 缓冲液提取样品中的吲哚乙酸氧化酶，向样品提取中加入混合反应 试剂 进行酶促反应，然后采用分光光度计测定平菇样品的吸光值，通过该吸光值计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性。本发明充分利用吲哚乙酸在高氯酸环境中与三价 铁 离子生成红色络合物的原理，利用分光光度计法测定酶促反应液中吲哚乙酸在530nm处的吸光值，该方法不仅操作简单、成本低，还具有较高的灵敏度和检测 精度 ，为研究吲哚乙酸氧化酶对平菇生长发育机制的影响提供了研究 基础 ，也为吲哚乙酸氧化酶对其它食用菌（如香菇、草菇、金针菇等）生长发育机制的研究提供技术参考。，下面是测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法专利的具体信息内容。
1.一种测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：采用分光光度计测定平菇样品的吸光值，通过该吸光值计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性，具体步骤如下：
第一步，称取平菇样品于无菌研钵中，向无菌研钵中快速加入3～10mL预冷的pH=6.1磷酸缓冲液，低温研磨，将研磨后的平菇样品浆液离心，弃沉淀，得到含有吲哚乙酸氧化酶的样品提取液；
第二步，称取吲哚乙酸于烧杯中，用无水乙醇溶解后转移至容量瓶中，然后用蒸馏水定容，混匀，得到吲哚乙酸贮备液；将吲哚乙酸贮备液稀释得到不同浓度的吲哚乙酸标准溶液；
第三步，移取第二步稀释得到的各吲哚乙酸标准溶液于不同的反应管内，以等体积的蒸馏水作为空白，然后向吲哚乙酸标准液和空白中分别加入显色液，混匀，恒温显色反应20～40min后使混合液呈红色，用分光光度计测定吲哚乙酸标准液的吸光值，以吲哚乙酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制吲哚乙酸标准曲线；
第四步，移取第一步中的样品提取液于反应管内，以与样品提取液等体积的pH=6.1磷酸缓冲液为对照，向样品提取液和对照中分别加入混合反应试剂，混匀，恒温酶促反应20～
40min，得到样品酶促反应液和对照反应液；
第五步，移取第四步中的样品酶促反应液和对照反应液于反应管内，以蒸馏水为空白，分别加入显色液，混匀，恒温反应20～40min使反应液呈红色，用分光光度计测定各反应液的吸光值，根据第三步中绘制的吲哚乙酸标准曲线得到样品酶促反应液和对照反应液中吲哚乙酸的浓度，再利用下述公式计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性：
样品中吲哚乙酸氧化酶的活性（µmol/g/h）=（C对照－C样品）×VT×V/（W×t×V1×M）；
式中，C对照是对照反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；C样品是样品酶促反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；VT为第一步中样品提取液的总体积，mL；V为第四步中反应提取液与混合反应试剂的总体积，mL；W为平菇样品的重量，g；V1为第四步中参加酶促反应的样品提取液体积，mL；t为第四步中酶促反应时间，h；M为吲哚乙酸的摩尔质量，175.18µg/µmol。
2.根据权利要求1所述的测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：所述第二步中吲哚乙酸母液的浓度为100μg/mL，所述吲哚乙酸标准液的浓度梯度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL和25μg/mL。
3.根据权利要求1所述的测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：所述第三步和第五步中的显色液均为由浓度为0.5M的FeCl3和35%高氯酸按照1:50的体积比配制而成的混合液。
4.根据权利要求1所述的测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：所述第四步中的混合反应试剂为由1mL MnCl2、1mL 2,4-二氯酚、2mL IAA溶液和5mL、pH=6.1的磷酸缓冲液组成的混合液，其中MnCl2的浓度为1.0mM，2,4-二氯酚的浓度为1.0mM，IAA溶液的浓度为200μg/mL，磷酸缓冲液的浓度为0.02 M。
测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法
技术领域
背景技术
发明内容
第一步，称取平菇样品于无菌研钵中，向无菌研钵中快速加入5～10mL预冷的pH=6.1磷酸缓冲液，低温研磨，将研磨后的平菇样品浆液离心，弃沉淀，得到含有吲哚乙酸氧化酶的样品提取液；
第二步，称取吲哚乙酸于烧杯中，用无水乙醇溶解后转移至容量瓶中，然后用蒸馏水定容，混匀，得到吲哚乙酸贮备液；将吲哚乙酸贮备液稀释得到不同浓度的吲哚乙酸标准溶液；
第三步，移取第二步稀释得到的各吲哚乙酸标准溶液于不同的反应管内，以等体积的蒸馏水作为空白，然后向吲哚乙酸标准液和空白中分别加入显色液，混匀，恒温显色反应20～40min后使混合液呈红色，用分光光度计测定吲哚乙酸标准液的吸光值，以吲哚乙酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制吲哚乙酸标准曲线；
第四步，移取第一步中的样品提取液于反应管内，以与样品提取液等体积的磷酸缓冲液为对照，向样品提取液和对照中分别加入混合反应试剂，混匀，恒温酶促反应20～40min，得到样品酶促反应液和对照反应液；
第五步，移取第四步中的样品酶促反应液和对照反应液于反应管内，以蒸馏水为空白，分别加入显色液，混匀，恒温反应20～40min使反应液呈红色，用分光光度计测定各反应液的吸光值，根据第三步中绘制的吲哚乙酸标准曲线得到样品酶促反应液和对照反应液中吲哚乙酸的浓度，再利用下述公式计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性：
样品中吲哚乙酸氧化酶的活性（µmol/g/h）=（C对照－C样品）×VT×V/（W×t×V1×M）；
式中，C对照是对照反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；C样品是样品酶促反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；VT为第一步中样品提取液的总体积，mL；V为第四步中反应提取液与混合反应试剂的总体积，mL；W为平菇样品的重量，g；V1为第四步中参加酶促反应的样品提取液体积，mL；t为第四步中酶促反应时间，h；M为吲哚乙酸的摩尔质量，175.18µg/µmol。
具体实施方式
1.0mM，IAA溶液的浓度为200μg/mL，磷酸缓冲液的浓度为0.02 M，其中各试剂的具体配制方法为：
1.0mM的MnCl2溶液：称取19.8 mg MnCl2·4H2O于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至
100mL容量瓶内，用蒸馏水定容；
1.0mM 的2,4-二氯酚：称取16.3mg 2,4-二氯酚于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至
100mL容量瓶内，用蒸馏水定容；
200μg/mL的IAA溶液：称取20mg 吲哚乙酸与烧杯中，用少量无水乙醇溶解后转移至
100mL容量瓶内，用蒸馏水定容；
pH=6.1的磷酸缓冲液（浓度为0.02M）：分别称取8.34g 磷酸二氢钾和0.87g磷酸氢二钾于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容。
4000rpm下离心20min，弃沉淀，再将上清液于4℃、4000rpm下离心20min，弃沉淀，得到的上清液即为含有吲哚乙酸氧化酶的样品提取液；
第二步，将10mg吲哚乙酸置于烧杯中，用无水乙醇溶解后转移至容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL，混匀，得到浓度为100μg/mL的吲哚乙酸贮备液；
依次移取不同体积的吲哚乙酸贮备液于八个容量瓶内，分别用蒸馏水稀释，得到浓度依次为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL和25μg/mL的吲哚乙酸标准溶液，备用；
第三步，分别移取2mL第二步中的吲哚乙酸标准溶液于反应管内，移取2mL蒸馏水于反应管内作为空白（即CK），向吲哚乙酸标准液和空白中分别加入4mL的显色液，混匀，于40℃恒温显色反应30min，用分光光度计测定每个吲哚乙酸标准液在530nm处的吸光值，测定时将空白清零，读取吲哚乙酸标准液的吸光值，具体见表1；
表1 吲哚乙酸标准液的吸光值
然后以吲哚乙酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制吲哚乙酸标准曲线如图1所示，其标准曲线具体为：y = 0.041χ - 0.002（相关性系数R2=0.999），其中y为吸光值，χ为吲哚乙酸的浓度；
第四步，移取1.0mL第一步中的样品提取液于反应管内，以与样品提取液等体积的pH=
6.1磷酸缓冲液（浓度为0.02M）为对照，向样品提取液和对照中分别加入混合反应试剂，具体见表2；将各反应管混匀，于25℃恒温水浴条件下酶促反应30min，得到样品酶促反应液和对照反应液；
表2 各平菇样品的酶促反应体系
第五步，移取第四步中的样品酶促反应液和对照反应液于反应管内，以蒸馏水为空白，分别加入4.0mL的显色液，混匀，恒温反应30min使反应液呈红色；用分光光度计测定各反应液在530nm处的吸光值；
根据第三步中绘制的吲哚乙酸标准曲线得到样品酶促反应液和对照反应液中吲哚乙酸的浓度，再利用下述公式计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性：
样品中吲哚乙酸氧化酶的活性（µmol/g/h）=（C对照－C样品）×VT×V/（W×t×V1×M）；
式中，C对照是对照反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；C样品是样品酶促反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；VT为第一步中样品提取液的总体积，mL；V为第四步中反应提取液与混合反应试剂的总体积，mL；W为平菇样品的重量，g；V1为第四步中参加酶促反应的样品提取液体积，mL；t为第四步中酶促反应时间，h；M为吲哚乙酸的摩尔质量，175.18µg/µmol；
经计算，各平菇样品中吲哚乙酸氧化酶活性见表3。
第二步，同实施例1；
第三步，同实施例1；
第四步，同实施例1；
第五步，将每个样品的提取液平行处理三个显色反应，具体步骤同实施例1，然后蒸馏水为空白，利用分光光度计测定吸光值，并根据第三步中绘制得到的吲哚乙酸标准曲线计算各样品中吲哚乙酸的浓度，根据实施例1第五步中的公式计算得到各样品中吲哚乙酸的含量，结果见表4。
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