一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法专利检索-植物植物学专利检索查询-专利查询网

一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法

阅读：783发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式引物对及方法。该特异性引物对，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。本检测方法具有较高的灵敏性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物对可以缩短对甘蔗屈恩柄锈菌进行鉴定的时间，较快地鉴定出甘蔗屈恩柄锈菌，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。，下面是一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一组检测甘蔗屈恩柄锈菌(Puccinia kuehnii)的单管巢式引物对，由序列表中序列
1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。
2.一种检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的试剂盒，包括权利要求1所述的单管巢式引物对。
3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
4.权利要求1所述的单管巢式引物对以及权利要求2或3所述的试剂盒在检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)中的应用。
5.检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的方法，包括下述步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的单管巢式引物对进行PCR扩增；
3)通过肉眼直接观察凝胶电泳检测扩增产物，从而判定样品中是否含有甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述单管巢式PCR扩增的反应体系为20μL，包括：dd H2O 13.3μL，10r Taq Buffer 2μL，
2.5mM/L d NTPs 1.6μL，rTaq DNA Polymerase 0.1μL，含浓度为0.1pM序列表中序列1所示的核苷酸和浓度为0.1pM的序列表中序列2所示的核苷酸的溶液1μL，含浓度为10μM序列表中序列3所示的核苷酸和浓度为10μM的序列表中序列4所示的核苷酸的溶液1μL，待测样品DNA 1μL。
反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火10s，72℃延伸25s，20个循环，72℃延伸4min；94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火10s，72℃延伸25s，45个循环，72℃延伸4min，12℃保存。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过将所测样品的单管巢式扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果，如果观察到条带大小与目的条带一致，则说明所述待测样品含有甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)；反之，则说明待测样品不含有甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)。

说明书全文

一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物病害流行监测领域，具体而言，本发明涉及一种用于检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式PCR引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

[0002] 由屈恩柄锈菌(P.kuehnii)引起的甘蔗黄锈病是一种世界性的真菌病害[Ryan C C,Egan B T.Rust.//Ricaud C,Egan B T,Gillaspie Jr AG,et al,eds.Diseases of
Sugarcane:Major Diseases[M].Amsterdam,the Netherlands:Elsevier,1989:189-
210.]。该病曾主要分布在亚洲与澳大利亚[Ryan C C,Egan B T.Rust.//Ricaud C,Egan B
T,Gillaspie Jr AG,et al,eds.Diseases of Sugarcane:Major Diseases[M]
.Amsterdam,the Netherlands:Elsevier,1989:189-210.]，近年来该病已逐渐扩散到美国
的弗罗里达州、危地马拉、哥斯达黎加、尼加拉瓜、萨尔瓦多、巴拿马、墨西哥、巴西、古巴、哥伦比亚、多米尼加、厄瓜多尔等国家和地区[Amaresh Chandra,Amber T.Keizerweerd,
Michael P.Grisham.Detection of Puccinia kuehnii causing sugarcane orange rust
with a loop-mediated isothermal amplification-based assay[J].Mol Biotechnol,
2016,58(3):188-196]。最初认为甘蔗黄锈病所导致的产量不及甘蔗褐锈病，如今随着甘蔗
黄锈病的不断扩散，大有赶超之趋势。目前，甘蔗锈病在我国甘蔗种植区广西、云南、广东、福建、四川以及海南等均有发生，且存在复合侵染现象[傅华英，肖胜华，刘营航，等.我国甘蔗锈病病原菌及甘蔗品系抗褐锈病基因Bru1的分子检测[J].热带作物学报，2016，37(5)：
958-963]。

[0003] 针对甘蔗锈菌的检测与鉴定，以往常常依赖常规的形态学并结合传统的鉴别寄主法。该方法需经过病原菌的分离(获得)—形态鉴定—回接与再分离等过程，整个过程中费
时费力同时还需要具备专业的分类学知识以及丰富的经验。尽管如此，其结果的准确性和
可信度易受外界因素的影响，难以满足快速、高通量鉴定与检测的实际需求。近年来随着分
子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速地发展和应用。这类方
法普遍具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点。目前，已建立了2种甘蔗锈菌特异性常规PCR检测方法[[Glynn NC,Dixon LJ,Castlebury LA,Castlebury Lisa
A,Comstock Jack.PCR assays for the sugarcane rust pathogens Puccinia
melanocephala and P.Melanocephala and detection of a SNP associated with
geographical distribution in P.kuehnii[J].Plant Pathology,2010,59(4):703-
711.]、以及甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的实时荧光定量PCR分子检测方法。本实验室前期
针对甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)设计了传统PCR引物并建立了比较可靠的PCR检测方法。
然而，此检测方法仍然存在灵敏度不高，以及可能存在假阳性等问题。所以有必要对甘蔗屈
恩柄锈菌的检测与监测技术做进一步的开发与优化。

[0004] 巢式PCR检测技术由于具有较高的灵敏度，是一种常用来检测植物病害的分子检测技术。但是，由于巢式PCR需要进行2轮独立的PCR扩增反应，第二轮PCR扩增反应是以第一
轮PCR扩增产物为模板，这过程中需要开管进行模板转移，这增加了污染的概率。而单管巢
式PCR是在巢式PCR基础上发展而来。比较而言，由于单管巢式PCR不需要转管这一步，因而
降低了被污染的风险。这就使得单管巢式PCR检测技术不仅具有巢式PCR检测技术的特异
性、灵敏性，还能节省时间、节约成本，又可降低污染的风险，具有较好的发展前景[Aloyce R C,Tairo F,Sseruwagi P,Rey M.E.C,Ndunguru J.Asingle-tube duplex and
multiplex PCR for simultaneous detection of four cassava mosaic begomovirus
species in cassava plants[J].Journal of Virological Methods,2013,189(1):148-
156.]。目前，单管巢式PCR检测技术在病原真菌检测方面已有应用。但是，该技术还没有在
甘蔗屈恩柄锈菌的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，为了更加快速、准确、实用地检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)。本发明提供一种特异性好、灵敏度高的甘蔗屈恩柄锈菌
(P.kuehnii)单管巢式PCR引物对，以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的分子检
测方法。

[0006] 本发明首先提供一组用于快速检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式PCR检测引物对，该特异引物对由正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物对组成，
其中，正向外引物为序列表中序列1所示的核苷酸，反向内引物为序列表中序列2所示的核
苷酸，正向内引物为序列表中序列3所示的核苷酸，反向内引物序列表中序列4所示的核苷
酸组成。

[0007] 具体地，所述引物对的序列如下所示：

[0008] 正向外引物(PkF1)：5’-AACTTGTTAATATGGGGGAAACCTCA-3’(序列表中序列1)；

[0009] 反向外引物(PkR1)：5’-TGTGTGTGTTTTTTTAGTAGTCCCATTC-3’(序列表中序列2)。

[0010] 正向内引物(PkF2)：5’-AAAATGGATGTTGAGTGTTGC-3’(序列表中序列3)；

[0011] 反向内引物(PkR2)：5’-CACCTTCCTTGATGTGATTTT-3’(序列表中序列4)。

[0012] 本发明的另一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)单管巢式PCR检测方法。

[0013] 本发明的甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)单管巢式PCR检测方法，是以待测甘蔗叶片或未知病原菌孢子DNA为模板，应用上述的特异引物对，在单个PCR反应管内进行PCR扩增，
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得136bp的目的条带。

[0014] 上述正向外引物与正向内引物的摩尔比为1：1；上述正向外引物与反向内引物的摩尔比为1：1；外引物与内引物终浓度比为5fM：0.5μM。

[0015] 上述PCR检测方法中，PCR反应体系为：dd H2O 13.3μL，10rTaq Buffer 2μL，2.5mM/L d NTPs 1.6μL，rTaq DNAPolymerase 0.1μL，0.1pM PkF1/PkR1 1μL，10μM的Pk F2/PkR2 1μL，待测模板DNA 1μL。

[0016] 反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火10s，72℃延伸25s，20个循环，72℃延伸4min；94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火10s，72℃延伸25s，45个循环，
72℃延伸4min，12℃保存。

[0017] 本发明的第三个方面是提供一种用于快速检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式PCR检测方法，该方法包括使用本发明第一个方面所述的引物对或者本发明第二个
方面所述的试剂盒中的引物对进行PCR扩增的步骤。

[0018] 进一步地，所述方法包括以下步骤：

[0019] 步骤1，从样品中提取DNA；

[0020] 步骤2，用第一个方面所述的引物对或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物对进行单管巢式PCR扩增，得到扩增产物；

[0021] 步骤3，反应完成后，1.2％凝胶电泳检测扩增产物，从而判定样品中是否含有136bp的甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)特异性条带。

[0022] 本发明中，提取待测样品的DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的DNA提取方法或试剂盒进行。

[0023] 本发明中，将所述待测样品的模板DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述的PCR扩增反应体系(20μL)：dd H2O 13.3μL，10rTaq Buffer 2μL，2.5mM/L d NTPs 1.6μL，rTaq DNA Polymerase 0.1μL，0.1pM PkF1/R1(序列表中序列1、
2所示的核苷酸等体积混合液)1μL，10μM的PkF2/R2(序列表中序列3、4所示的核苷酸等体积混合液)1μL。

[0024] 实验证明，在本发明中对所述一种检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式试剂盒及其专用引物对能特异性的检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)，而从其它供试菌株
DNA中不能检测出任何条带，如甘蔗褐锈病菌(Puccinia melanocephala)、葡萄层锈菌
(Phakopsora ampelopsidis)。根据本发明的一些具体示例，本发明提供一种检测甘蔗屈恩
柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式试剂盒及其专用引物对甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)DNA的
最小检测量为10fg/μL，比普通PCR检测方法的灵敏度(10pg/μL)高1,000倍。具有较高的灵
敏性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物可以缩短对甘蔗屈恩柄锈菌
(P.kuehnii)进行鉴定的时间，较快地鉴定出甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)，从而克服传统
鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。使用本发明的引物对进行检测，具有灵敏度高、特
异性强的特点，且本发明的检测方法具有高效、快速和敏感度高的优点，特别适合于批量检
测。
附图说明

[0025] 图1为本发明提供的单管巢式PCR检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)引物

[0026] 图2为本发明提供的内引物退火温度筛选的结果

[0027] M,DL2000标准分子量；CK,ddH2O；1，52℃；2，53℃；3，54.7℃；4，57.3℃；5，60.9℃；6，63.2℃；7，64.9℃；8，66℃

[0028] 图3为本发明提供的外引物退火温度范围筛选的结果

[0029] M,DL2000标准分子量；CK,ddH2O；1，61℃；2，61.9℃；3，63.4℃；4，65.5℃；5，68.2℃；6，70.7℃；7，72.1℃；8，73℃

[0030] 图4为单管巢式PCR外内引物浓度检测结果

[0031] M,DL2000标准分子量；CK,ddH2O；1，10nM：10μM；2，10nM：5μM；3，10nM：1μM；4，1pM：10μM；5，1pM：5μM；6，1pM：1μM；7，0.1pM：10μM；8，0.1pM：5μM；9，0.1pM：1μM；10，1fM：10μM；11，
1fM：5μM；12，1fM：1μM；13，0.01fM：10μM；14，0.01fM：5μM；15，0.01fM：1μM

[0032] 图5为甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)单管巢式PCR检测技术特异性分析M，DL2000标准分子量；CK，ddH2O；1-2，甘蔗屈恩柄锈菌(Puccinia kuehnii)；3-4，甘蔗黑顶柄锈菌
(Puccinia melanocephala)；5，鸡蛋花鞘锈菌(Coleosporium plumierae)；6，葡萄层锈菌
(Phakopsora ampelopsidis)；7-8，咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；9-10，橡胶炭疽
病菌(Colletotrichum gloeosporioides)；11-12，咖啡褐斑病菌(Cerospora
coffeicola)；13-14，稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；15，甘蔗黑穗病菌(Ustilago
scitaminea)；16，剑麻茎腐病菌(Aspergillus niger)

[0033] 图6为普通PCR检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的灵敏度结果。

[0034] M,DL2000标准分子量；CK,ddH2O；1，10ng/μL；2，1ng/μL；3，100pg/μL；4，10pg/μL；5，1pg/μL；6，100fg/μL；7，10fg/μL；8，1fg/μL

[0035] 图7为本发明所提供的引物对单管巢式PCR灵敏性检测结果。

[0036] M,DL2000标准分子量；CK,ddH2O；1，10ng/μL；2，1ng/μL；3，100pg/μL；4，10pg/μL；5，1pg/μL；6,100fg/μL；7，10fg/μL；8，1fg/μL

具体实施方式

[0037] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按
照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产
品。

[0038] 实施例1、检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式引物对制备

[0039] 1、引物设计：

[0040] 本发明所设计的引物对，具体如下所示：

[0041] 外引物：

[0042] 正向(PkF1)：5’-AACTTGTTAATATGGGGGAAACCTCA-3’(序列表中序列1)

[0043] 反向(PkR1)：5’-TGTGTGTGTTTTTTTAGTAGTCCCATTC-3’(序列表中序列2)

[0044] 内引物：

[0045] 正向(PkF2)：5’-AAAATGGATGTTGAGTGTTGC-3’(序列表中序列3)

[0046] 反向(PkR2)：5’-CACCTTCCTTGATGTGATTTT-3’(序列表中序列4)

[0047] 上述引物设计的具体位置详见图1。

[0048] 2、引物合成

[0049] 将设计好的引物PkF1、PkR1、PkF2、PkR2引物，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司广州合成部合成。

[0050] 实施例2、甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式PCR退火温度确定

[0051] 一、甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)内引物对最佳最火温度筛选

[0052] 利用实施例1制备所得引物对，以甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)孢子提取的DNA模板进行PCR梯度扩增。

[0053] 其中，PCR扩增的反应体系为20μL，具体如下：

[0054]

[0055] 反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，52℃～66℃退火10s，72℃延伸25s，35个循环，72℃延伸4min，12℃保存。

[0056] 实验结果通过凝胶成像观察是否扩增出136bp的甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)目的条带，从而判定内引物退火温度最高限。结果表明，在供试的8个退火温度中，内引物
PkF2/R2在退火温度为52℃至63.2℃时，均能扩增出特异目的条带，其扩增条带随退火温度
升高其强度逐渐变弱；退火温度为64.9℃时扩增不出条带(图2)。因此，内引物的最高退火
温度为64.9℃。据此，选取53℃作为内引物的最佳退火温度。

[0057] 二、甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)外引物对最佳退火温度筛选

[0058] 利用实例1制备所得引物对，以甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)孢子提取的DNA模板进行梯度退火温度PCR扩增。

[0059] 其中，PCR扩增的反应体系为20μL，具体如下：

[0060]

[0061] 反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃～73℃退火10s，72℃延伸25s，35个循环，72℃延伸4min，12℃保存。

[0062] 实验结果通过凝胶成像观察是否扩增出517bp的甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)目的条带，进而判定外引物的最佳退火温度。结果表明，在供试的8个退火温度中，61℃、61.9℃、63.4℃、65.5℃时均能扩增出预期大小的条带，而其余的4个退火温度均未出现目的条
带(图3)。基于内引物的最高退火温度64.9.℃，结合单管巢式PCR内外引物退火温度的基本
准则，故将外引物的最佳退火温度定为65℃。

[0063] 实施例3：甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式PCR外内引物浓度比筛选

[0064] 基于实例1制备所得引物对以及实例2所确定的内外引物退火温度，对甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)孢子提取的DNA模板进行外内引物最佳浓度比筛选。

[0065] 将内引物浓度设为10μM、5μM、1μM，外引物浓度分别为10nM、1pM、0.1pM、1fM、0.01fM 5个浓度梯度交叉组合后进行甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)最佳浓度比观察。采用
20μL反应体系：dd H2O 13.3μL，10r Taq Buffer 2μL，2.5mM/L d NTPs 1.6μL，rTaq DNA Polymerase 0.1μL，PkF1/R1 1μL，PkF2/R2 1μL，模板DNA 1μL。

[0066] 反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火10s，72℃延伸25s，20个循环，72℃延伸4min；94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火10s，72℃延伸25s，45个循环，
72℃延伸4min，12℃保存。

[0067] 实验结果通过凝胶成像系统观察条带是否与预期大小相同且条带最为清晰来确定内外引物浓度的最佳比例。结果如图4所示，供试的15组外内引物浓度比中，均能扩增出
相应的目的条带。而当外内引物浓度比为0.1pM：10μM时，条带最为清晰，所以将外引物的最佳浓度定为0.1pM。因此，外内引物的最终浓度比为5fM：0.5μM。

[0068] 实施例4：甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式PCR的特异性检测利用实施例1制备所得引物对，采用实施例2和3所优化的内外引物退火温度及其比例，对甘蔗屈恩柄锈
菌(Puccinia kuehnii)；甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala)；鸡蛋花鞘锈菌
(Coleosporium plumierae)；葡萄层锈菌(Phakopsora ampelopsidis)；咖啡驼孢锈菌
(Hemileia vastatrix)；橡胶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)；咖啡褐斑病
菌(Cerospora coffeicola)；稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；甘蔗黑穗病菌(Ustilago
scitaminea)；剑麻茎腐病菌(Aspergillus niger)等DNA模板进行单管巢式PCR扩增。

[0069] PCR反应体系(20μL)：dd H2O 13.3μL，10r Taq Buffer 2μL，2.5mM/L d NTPs 1.6μL，r Taq DNA Polymerase 0.1μL，含浓度0.1pM的PkF1/浓度0.1pM的PkR1的溶液1μL，含浓度10μM PkF2和10μM PkR2溶液1μL，模板DNA1μL。

[0070] 扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火10s，72℃延伸25s，20个循环，72℃延伸4min；94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火10s，72℃延伸25s，45个循环，
72℃延伸4min，12℃保存。

[0071] 实验结果通过肉眼观察是否扩增出136bp的目的条带，从而判定其特异性。结果表明，引物对仅能从模板为甘蔗屈恩柄锈菌DNA的产物中检测出目的条带，而从其它菌株DNA
中均未检测出任何条带(图5)，表明引物对可特异性地检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)。

[0072] 实施例5：普通PCR检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的灵敏性结果。

[0073] 利用实施例1制备所得的内引物PkF2/PkR2对，通过普通PCR检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的灵敏性。将甘蔗屈恩柄锈菌菌株ITS质粒DNA初始浓度调整为10ng/μL，按10
的数量级逐步向下稀释至10-6ng/μL作为模板，进行普通PCR扩增。结果表明，当质粒模板浓度为10pg/μL时，仅检测出一条弱的条带；而当质粒模板浓度低于10pg/μL时，则检测不出任何条带(图6)。结果表明，普通PCR可特异性地检测甘蔗屈恩柄锈菌基因组DNA浓度最低限为
10pg/μL，最低检测终浓度为0.5pg/μL。

[0074] 实施例6：检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式PCR的灵敏性

[0075] 利用实例1制备所得引物对，将甘蔗屈恩柄锈菌ITS重组质粒pEASY-ITS DNA浓度调整为10ng/μL，按10的数量级逐步向下稀释至10-6ng/μL作为模板，进行单管巢式PCR扩增，分析本发明所提供的引物对的灵敏度。PCR体系和反应程序与实施例4相同，PCR产物用
1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，当质粒模板浓度为10fg/μL时，仅检测出一条微弱的条带；而当质粒模板浓度大于10fg/μL时，则检测不出任何条带(图7)。由此可见，本发明引物对可特异性地检测甘蔗屈恩柄锈菌最低检测限为10fg/μL，最低检测终浓度为0.5fg/μ
L。较实施例5高1,000倍，说明本发明单管巢式引物对具有非常高的灵敏度。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种太阳能电池背板用耐候膜的制备方法	2020-05-08	431
一株植物乳杆菌DNB1及其胞外多糖和应用	2020-05-11	238
一种数据中心的噪音污染控制系统	2020-05-08	407
美洲黑杨的促雌基因FERR和抑雌基因FERR-R及其应用	2020-05-08	980
包含阿拉酸式苯-S-甲基作为有效成分的松材线虫病防治用组合物及利用其的松材线虫防治方法	2020-05-08	725
一种简便的植物根边缘细胞提取器	2020-05-11	87
一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法	2020-05-08	783
测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法	2020-05-08	292
一种天然植物染料腈纶纤维染色方法	2020-05-08	22
一种植物适宜生长区域评价方法和设备	2020-05-08	865

一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法

一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：