美洲黑杨的促雌基因FERR和抑雌基因FERR-R及其应用
阅读：980发布：2020-05-08
专利汇可以提供美洲黑杨的促雌基因FERR和抑雌基因FERR-R及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种美洲黑杨的促雌基因FERR和抑雌基因FERR-R及其应用，属于 植物 基因工程技术领域。本发明通过家系连 锁 分析对美洲黑杨性别决定基因位点进行精细 定位 ，然后利用自然群体材料开展全基因组关联分析，结合转录组及基因组甲基化测序，首次公开杨树促雌基因FERR和抑雌基因FERR-R，FERR-R基因不编码蛋白，而是通过产生siRNAs对促雌基因FERR的启动序列进行甲基化并对其转录本进行剪切，从而抑制促雌基因FERR在杨树雄株中的表达。而杨树雌株不含FERR-R基因，FERR表达不受FERR-R抑制，所以雌株的雌花发育。本发明提供的杨树促雌基因和抑雌基因可应用于杨树性别早期鉴定及分子育种。，下面是美洲黑杨的促雌基因FERR和抑雌基因FERR-R及其应用专利的具体信息内容。
1.一种美洲黑杨的促雌基因FERR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的美洲黑杨的促雌基因FERR的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求1所述的美洲黑杨的促雌基因FERR的载体、重组菌或宿主细胞。
4.权利要求1所述的美洲黑杨的促雌基因FERR在杨树性别早期鉴定及杨树分子育种中的应用。
5.权利要求1所述的美洲黑杨的促雌基因FERR在杨树分子育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备FERR基因的敲除载体；
2)敲除杨树雌株中的促雌基因FERR；
3)培育筛选，得到雌花不发育或不产飞絮的杨树植株。
6.权利要求1所述的美洲黑杨的促雌基因FERR在促进植物雌花发育中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建杨树促雌基因FERR载体；
2)将所构建的促雌基因FERR载体转化到植物或植物细胞中；
3)培育筛选得到雌蕊增多或雌蕊发育增强的植株。
7.一种美洲黑杨的抑雌基因FERR-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，含有作用位点序列，其靶标基因为权利要求1所述美洲黑杨的促雌基因FERR。
8.含有权利要求7所述的美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列的载体、重组菌或宿主细胞。
9.权利要求7所述的美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列在杨树性别早期鉴定及杨树分子育种的应用。
10.根据权利要求9所述的美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列在杨树分子育种的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列的重组载体；
2)将所构建的美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列的重组载体转化到杨树雌株或杨树雌株细胞中；
3)培育筛选，得到雌花不发育或不产飞絮的杨树植株。
美洲黑杨的促雌基因FERR和抑雌基因FERR-R及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物性染色体起源假说认为，性染色体起源于一对常染色体。性染色体的进化是从该对常染色体的一条染色体上发生了一个雄性或者雌性不育突变开始。植物性染色体起源假说认为，性染色体起源于一对常染色体。性染色体的进化是从该对常染色体的一条染色体上发生了一个雄性或者雌性不育突变开始，由于某种未知原因造成突变部位的重组受到抑制，非重组区域逐渐扩展最终形成异型的性染色体。雌雄异株植物比近缘的雌雄同株植物在进化上出现的时间更短，雌雄异株植物是由雌雄同株植物进化而来。理论上植物性由雌雄同株进化为雌雄异株涉及两个功能相反的基因，即抑雌基因和促雄基因，这两个基因独立作用于雌花或雄花的发育。
[0003] 近年来，对植物性别基因克隆研究取得了一定进展，如2014年SCIENCE杂志上发表了柿子的性别决定基因OGI，该基因是一个Y特异的半合子，编码一个miRNA，其调控的靶基因是位于常染色体上的MeGI基因，MeGI基因编码一个具有同源异形结构域的、调控花药育性的转录因子。因此柿子雌性性别的发生是由位于Y染色体上OGI基因编码的miRNA，对位于常染色体上的靶基因MeGI的抑制引起的。但柿子中仅发现了一个性别调控基因，论文的作者认为柿子中可能还存在另外一个没有被发现的性别决定基因。另外，2017和2018年发表的对芦笋和对弥猴桃性别分化的研究，分别发现了两个性别决定候选基因，且基因功能研究结果显示两个性别决定基因相互独立且功能相反，分别作用于雌性或雄性花器官发育。芦笋和弥猴桃均为假性雌雄异株，即雌花和雄花分别具有相反性别花器官的正常结构，但两个性别决定基因分别使相反性别的花器官败育，导致了雌雄分化。这两种植物的性别分化在花发育早期没有明显差异，雌雄性别的差异是在花发育的后期出现的。
[0004] 杨树为典型的雌雄异株植物，雄花和雌花都没有相反性别的花器官发育。杨树花芽发育过程的动态观察显示，杨树虽然在早春开花，但石蜡切片显微观察发现，杨树花芽分化在上一年的6月份就已经完成。因此，杨树性别决定基因在花发育早期即产生作用，分别决定雌花和雄花原基的形成。以往开展的细胞学观察研究发现，杨树基因组中都没有形态上有显著差异的性染色体，其性染色体尚处于进化的早期阶段。虽然杨树的性别二型性主要表现在花器官的形态差异上，但有很多研究发现杨树的雌、雄株在环境适应性、生长速度和生物量产量性状上存在显著差异。性别对生长性状有显著影响，雄株总体上优于雌株。雌株达到性成熟后会产生大量飞絮，造成严重的空气污染，已引发越来越多的社会关注。因此，利用杨树植树造林或绿化，应充分考虑性别的重要影响。但杨树的性别决定基因一直未被克隆和确定。
[0005] 杨树分布广泛，生长迅速，高大挺拔，用途很广，是重要的人工林造林树种，其木材主要用于工业用材，已成为胶合板、纤维板、造纸等行业重要加工原料。我国是世界上杨树栽培面积最大的国家，杨树人工林面积已达853万公顷(第八次全国森林资源清查结果)。由于杨树的童期很长，长达6～7年，阐明其性别调控分子基础，对杨树性别早期鉴定及分子育种具有重要应用价值，有助于对不同性别的杨树资源加以开发和利用。
发明内容
[0006] 针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供美洲黑杨的促雌基因FERR。本发明所要解决的另一技术问题在于提供美洲黑杨的抑雌基因FERR-R。本发明还要解决的一技术问题在于提供美洲黑杨的促雌基因FERR的应用。本发明所要解决的最后一技术问题在于提供美洲黑杨的抑雌基因FERR-R的应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0008] 一种美洲黑杨的促雌基因FERR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 所述的美洲黑杨的促雌基因FERR的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
[0010] 含有所述的美洲黑杨的促雌基因FERR的载体、重组菌或宿主细胞。
[0011] 所述的美洲黑杨的促雌基因FERR在杨树性别早期鉴定及杨树分子育种中的应用。
[0012] 优选地，所述的美洲黑杨的促雌基因FERR在杨树分子育种中的应用，包括以下步骤：
[0013] 1)制备FERR基因的敲除载体；
[0014] 2)敲除杨树雌株中的促雌基因FERR；
[0015] 3)培育筛选，得到雌花不发育或不产飞絮的杨树植株。
[0016] 所述的美洲黑杨的促雌基因FERR在促进植物雌花发育中的应用，包括以下步骤：
[0017] 1)构建杨树促雌基因FERR载体；
[0018] 2)将所构建的促雌基因FERR载体转化到植物或植物细胞中；
[0019] 3)培育筛选得到雌蕊增多或雌蕊发育增强的植株。
[0020] 一种美洲黑杨的抑雌基因FERR-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，含有作用位点序列，其靶标基因为所述美洲黑杨的促雌基因FERR。
[0021] 含有所述的美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列的载体、重组菌或宿主细胞。
[0022] 所述的美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列在杨树性别早期鉴定及杨树分子育种的应用。
[0023] 优选地，所述的美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列在杨树分子育种的应用，包括以下步骤：
[0024] 1)构建美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列的重组载体；
[0025] 2)将所构建的美洲黑杨的抑雌基因FERR-R或其作用位点序列的重组载体转化到杨树雌株或杨树雌株细胞中；
[0026] 3)培育筛选，得到雌花不发育或不产飞絮的杨树植株。
[0027] 有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
[0028] 本发明通过构建美洲黑杨全同胞作图群体进行家系连锁分析，对美洲黑杨性别决定基因位点进行精细定位，然后利用自然群体材料开展全基因组关联分析，结合转录组及基因组甲基化测序，首次公开了杨树促雌基因FERR和杨树雄性特异的抑雌基因FERR-R，FERR-R基因不编码蛋白，而是通过产生siRNAs对促雌基因FERR的启动序列进行甲基化并对其转录本进行剪切，从而抑制促雌基因FERR在杨树雄株中的表达。而杨树雌株不含FERR-R基因，FERR表达不受FERR-R抑制，所以雌株的雌花发育。在拟南芥中过表达FERR基因，显示该基促进植物雌蕊发育。FERR为促雌基因，而FERR-R为抑雌基因，对促雌基因或抑雌基因进行遗传操作，可得雌花不发育或不产飞絮的杨树植株。附图说明
[0029] 图1为杨树性别决定基因定位示意图；
[0030] 图2为杨树性别决定基因精细定位与性别决定区染色体单倍型构建示意图；图2A显示杨树性别决定基因精细定位，图中竖线上方文字显示标记名称，竖线下方数字显示在对应区间内检测到的重组个体数量；右侧深红色区域指示促雌基因FERR的位置；图2B所示为杨树性别决定区染色体单倍型构建。左端橙色部分显示端粒区，SDR-X上的灰色片段显示该区域与SDR-Y的对应区域序列变化比染色体的其他部分大；SDR-Y上的环状片段为Y特异的半合子区，黑色间断线表示测序个体间SDR-Y在对应区域的长度短于SDR-X。绿色部分指示TCP，CLC和MET1三个基因的位置；
[0031] 图3为杨树性别决定基因全基因组关联分析结果图；
[0032] 图4为TCP，CLC，and MET1和FERR-R的转录动态表达图；FERR repressor(FERR-R)为抑雌基因；T1-T9代表了9个取样时间点，分别为T1(2018年6月3号)，T2(2018年6月18号)，T3(2018年7月3号)，T4(2018年7月18号)，T5(2018年8月3号)，T6(2018年8月18号)，T7(2018年9月3号)，T8(2018年12月1号)，T9(2019年1月15号)T5期显示了对应基因在去掉鳞片和不去掉鳞片的花芽中的表达水平对比；
[0033] 图5为杨树FERR基因与杨树雄株中特有的抑雌基因位点的同源关系图；
[0034] 图6为杨树雌、雄花芽分化过程图；6A显示对应时期雌、雄花芽的形态变化；6B显示对应时期雌、雄花芽石蜡切片的纵切面显微观察；右下箭头指示雄花的花药，其余箭头指示雌、雄花芽的小花花原基；
[0035] 图7为FERR基因在杨树雌、雄花芽中的动态表达测定结果图；
[0036] 图8为在拟南芥中转化杨树FERR基因的功能验证结果图；8A显示FERR过表达对雌蕊伸长的影响，8B显示FERR过表达出现的雌蕊增加的极端表型；
[0037] 图9为基于转录表达及基因组甲基化测序的FERR-R调控分析图；e1-e6分别代表FERR基因的外显子，图中映射区域分别代表了FERR-R和FERR间的同源复制片段；
[0038] 图10为FERR-R基因的分子调控模型图；e1-e6分别代表FERR-R和FERR基因间复制的外显子；Chr19_X上的间断线表示X染色单体缺失FERR-R基因位点；DRM2连线指示的区域显示FERR-R产生的siRNAs对FERR基因的对应区域进行了甲基化修饰；红色的小刷子代表siRNAs，其对应的连线指示FERR-R产生的siRNAs还对FERR基因转录本的外显子发生剪切；
[0039] 图11为FERR基因与杨树雄株中特有的抑雌基因位点互作关系验证；siFERR：FERR-R位点产生siRNA的一段序列；FERR’：FERR中改变siFERR靶位点DNA序列但不改变氨基酸序列的基因。
具体实施方式
[0040] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0041] 实施例1：
[0042] (1)美洲黑杨全同胞作图群体构建及性别决定基因初步定位
[0043] 我们于2012年构建了一个由1077株子代构成的美洲黑杨全同胞作图群体，该群体按6×6米株行距种植在江苏泗洪林场，群体均已达到性成熟年龄。针对该群体构建了覆盖全基因组的遗传图谱，从作图群体中随机抽取部分个体，进行了杨树性别决定基因的全基组扫描。性别决定基因被定位于第十九染色体的末端，位于端粒和N110标记之间(图1)。性别连锁分析还发现杨树性别决定基因为雄性杂合，说明美洲黑杨性别为XY决定系统。
[0044] (2)性别决定基因精细定位与性别决定区染色体单倍型构建
[0045] 对作图群体的母本和一株雄性子代分别进行了全基因组测序，每个个体分别获得了超过75×PacBio reads。对测序个体的基因组分别进行了组装与注释，获得了美洲黑杨雌、雄个体的参照基因组。其中雌性个体的contig N50为1.4Mb，组装基因组大小为431Mb，雄性个体的contig N50为2.8Mb，组装基因组大小为414Mb。测序雄株没有选父本而是选了一株雄性子代，是因为子代雄株中的1染色体来源于母本，这样可减小测序个体X染色体间的差异。参照雄株的基因组序列，在性别决定区设计了SSR标记，然后对所有1077株子代，包括550棵雌株和527棵雄株进行了基因型分析，实现了性别决定基因的精细定位。性别决定基因被定位于端粒和N362标记之间，对应的物理长度为236kb(图2A)，这一区间为杨树的性别决定基因区(sex determination region，SDR)。根据测序个体中该区间的SNP信息，我们分别构建了X和Y染色单体在SDR区的单倍型(图2B)。SDR-X与SDR-Y单倍型比对发现，X染色单体的端粒比Y染色单体的端粒短，且靠近端粒的序列在两个染色单体间分化大于其他区域。另外，Y染色单体有一段Y特异的半合子片段。
[0046] (3)杨树性别决定基因全基因组关联分析
[0047] 对45雄株和53雌株开展了二代测序，每一植株的测序深度超过23×。以测序个体的基因组为参照，查找SNP位点进行性别基因的全基因组关联分析，SNP关联分析的结果显示，所有与性别完全关联的SNPs都来源于位于SDR区的TCP，CLC，and MET1基因(图3)。单倍型构建结果显示X和Y染色单体都含这三个基因，且转录组动态表达测序结果显示，这三个基因在雌、雄个体中均表达，但它们在雌、雄个体间没有稳定的差异表达模式(图4)。因此，这三个基因与性别决定无关，关联信号的出现是由于这三个基因位于重组抑制区，重组抑制导致了X和Y染色单体在该区域的序列分化，从而使这三个基因在雌、雄植株间的杂合度出现差异。
[0048] (4)FERR-R与FERR基因的发现
[0049] 杨树性别为XY决定系统，理论上Y染色单体应会进化出特化的区域，单倍型构建的结果也显示Y染色单体有一段Y特异的半合子片段。因此，利用重测序数据，进行全基因组Reads覆盖度与性别基因的关联分析(Read-coverage based genome-wide association study，rc-GWAS)。rc-GWAS分析显示，雌株中没有出现雌性特异的半合子片段，而单倍型构建检测到的Y特异的半合子片段在群体水平上是保守的，即所有雄性个体均含这一Y特异的半合子片段。通过序列注释从Y特异的半合子片段中得到两个非编码基因，其中一个(命名为FERR-R)与19号染色体另一端重组区的一个基因(命名为FERR)同源，两个基因位点间共有7个同源复制片段(图5)。已有研究表明，基因复制产生的旁系同源基因可能会对基因本身产生调控作用。因此，推测其中一个基因为促雌基因FERR(全长为498bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)；另一个为抑雌基因FERR-R(全长为18614bp，具体序列如SEQ ID NO.3所示)。
[0050] (5)转录组动态表达测序分析FERR基因表达
[0051] 为测定FERR基因在杨树雌、雄株中的表达，对美洲黑杨雌、雄花芽从2018年6月份开始取样，一直取到2019年1月份，共设置了9个取样时间点，分别为T1(2018年6月3日)，T2(2018年6月18日)，T3(2018年7月3日)，T4(2018年7月18日)，T5(2018年8月3日)，T6(2018年8月18日)，T7(2018年9月3日)，T8(2018年12月1日)，T9(2019年1月15日)。花芽发育形态变化见图6A，石蜡切片显微观察显示，雄花芽在6月3日即可分辨，而雌花分化晚于雄花，在6月
18日采集的样品中才可以分辨(图6B)。利用时实定量分析技术对FERR基因的表达在上述不同时间点所取的样品中进行了测定。以上所采集样品中，7月18日之前花器官占整个花芽的比例极低，取样时花芽未剥去鳞片。8月3日以后的样品取样时剥去鳞片。为比较剥掉和未剥掉鳞片的样品对照，T5时间点的样品分别用了剥掉和未剥掉鳞片的花芽作为对照。对采集的样品，提取RNA后，采用一步法去除gDNA和进行cDNA反转录合成。对目的基因FERR设计定量引物N809F：5′-AAACGGAAAGAGAGCATTGGA-3′；N809R：5′-TCATAACCTGTCATTCCTGGCA-3′。以PtUBQ基因为内参基因，内参基因引物序列PtUBQF：5′-GTTGATTTTTGCTGGGAAGC-3′；PtUBQR：
5′-GATCTTGGCCTTCACGTTGT-3′。时实定量PCR实验程序如下：配置20μL反应体系包括100ng的cDNA、4pmol的上下游引物，10μL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，无菌超纯水补齐至20μL。反应步骤，首先95℃变性3分钟，然后进行40个反应循环包括95℃变性15秒、60℃退火15秒、72℃延伸30秒。基因的表达计算使用2-ΔCT方法，即ΔCT＝CT目的基因-CT内参基因。利用T测验的方法检测在同一取样点雌、雄样品之间的表达差异是否显著。
18日采集的样品中才可以分辨(图6B)。利用时实定量分析技术对FERR基因的表达在上述不同时间点所取的样品中进行了测定。以上所采集样品中，7月18日之前花器官占整个花芽的比例极低，取样时花芽未剥去鳞片。8月3日以后的样品取样时剥去鳞片。为比较剥掉和未剥掉鳞片的样品对照，T5时间点的样品分别用了剥掉和未剥掉鳞片的花芽作为对照。对采集的样品，提取RNA后，采用一步法去除gDNA和进行cDNA反转录合成。对目的基因FERR设计定量引物N809F：5′-AAACGGAAAGAGAGCATTGGA-3′；N809R：5′-TCATAACCTGTCATTCCTGGCA-3′。以PtUBQ基因为内参基因，内参基因引物序列PtUBQF：5′-GTTGATTTTTGCTGGGAAGC-3′；PtUBQR：
5′-GATCTTGGCCTTCACGTTGT-3′。时实定量PCR实验程序如下：配置20μL反应体系包括100ng的cDNA、4pmol的上下游引物，10μL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，无菌超纯水补齐至20μL。反应步骤，首先95℃变性3分钟，然后进行40个反应循环包括95℃变性15秒、60℃退火15秒、72℃延伸30秒。基因的表达计算使用2-ΔCT方法，即ΔCT＝CT目的基因-CT内参基因。利用T测验的方法检测在同一取样点雌、雄样品之间的表达差异是否显著。
[0052] 测定结果显示，FERR基因在雄花芽发育过程中一直不表达。说明在杨树雄花中该基因被抑雌基因完全抑制。在雌花芽中，T5时间点剥掉和未剥掉鳞片的花芽对照显示，FERR基因在该时间点之前高表达，直到9月3日前都维持较高的表达水平，但在12月份和1月份的样品中几乎不表达(图7)。说明该基因在杨树雌花中，在雌花原基形成和雌花发育的早期高表达，而在雌花的后期发育中表达量很低。FERR基因在叶片中不表达，在花芽鳞片中也不表达，因此，FERR基因的表达具有很强的组织特异性，同时具有性别特异性，只在雌株中表达，而且在雌株中的表达具有时空特异性。FERR基因表达分析显示该基因决定雌花原基形成和控制雌花早期发育。杨树雄株中FERR因受到FERR-R的抑制，雄株中雌蕊不发育，而雌株中FERR正常表达，雌蕊发育。
[0053] (6)在拟南芥中转化杨树FERR基因进行功能验证
[0054] 拟南芥转化受体采用Col-0。转化前，拟南芥在19-23℃下培养，并在白天给予16小时的光照。将FERR基因的CDS序列克隆到p2301-35Splus载体上，然后载体导入根癌农杆菌GV3101(pMP90)中。野生型拟南芥转化采用花器官浸染法。阳性植株筛选在含50mg/mL卡那霉素的MS培养基上进行，卡那霉素筛选阳性的植株进一步用GUS染色确定。阳性植株在19-23℃下培养，并在白天给予16小时光照。植株开花时，利用体式显微镜对花器官进行观察。
转化植株花器官表型观察显示，其雌蕊普遍在花未开时露出与野生型相比，转化FERR基因对拟南芥花器官的雌蕊伸长有显著影响(图8)，甚至出现多个雌蕊的表型，或萼片雌蕊化的现象。FERR基因转化拟南芥结果显示，其对雌蕊的发育有显著促进作用，为促雌基因。
转化植株花器官表型观察显示，其雌蕊普遍在花未开时露出与野生型相比，转化FERR基因对拟南芥花器官的雌蕊伸长有显著影响(图8)，甚至出现多个雌蕊的表型，或萼片雌蕊化的现象。FERR基因转化拟南芥结果显示，其对雌蕊的发育有显著促进作用，为促雌基因。
[0055] (7)基于转录表达及基因组甲基化测序的FERR-R调控分析
[0056] 由于在Y特异的半合子片段上与FERR同源的基因FERR-R是非编码基因，其转录本不含polyA尾巴。所以采用了lncRNA-Seq技术来检测该基因的表达水平。测序结果显示这一基因仅在雄花芽中组成性表达(图4)。其与FERR位点的复制片段分析显示该基因可能编码siRNAs，siRNAs测序结果证实该基因产生siRNAs。siRNAs可能通过对靶基因的甲基化和对靶基因转录本的剪切产生抑制，因此我们命名该基因为FERR-R，它会抑制促雌基因FERR的表达。基因组甲基化测序显示，FERR-R产生的siRNAs对FERR基因的启动子区，3’UTR区和第一个外显子区进行了甲基化修饰，甲基化修饰会导致基因沉默(图9)。同时，FERR-R产生的siRNAs还对FERR基因转录本的第1，第2和第3外显子发生剪切(图9)。因此，杨树的FERR-R基因为抑雌基因，其分子调控模型见图10。FERR-R基因在杨树雄株中以半合子的形式存在，仅存在于Y染色单体上，因此，该基因抑制FERR在杨树雄株中的表达；而X染色单体不含FERR-R基因，促雌基因FERR在雌株中表达，使雌株的雌花发育。杨树雌株达到性成熟年龄后，每年5-7月份会产生大量飞絮，且持续时间长，FERR-R基因可用于培育不飞絮的杨树。
[0057] (8)杨树促雌基因FERR及抑雌基因FERR-R的互作验证
[0058] 制用杨树原生质体对FERR-R和FERR间的互作进行了瞬时表达验证。首先在南林895的无菌苗上取生长状态良好的叶片中间部位，用刀片切成0.5-1mm的小条，放入含有纤维素酶(3％)和离析酶(0.8％)的酶解溶液里，在黑暗条件下，真空渗透30min，随后继续黑暗酶解5h，在酶解过程中不要晃动培养皿，避免细胞破碎。待酶解结束后，利用70μm细胞筛网进行过滤，去掉未消化的叶片和杂质，收集完整的原生质体，最后将原生质体悬浮在转染缓冲液中。
[0059] 构建基因瞬时表达载体。FERR基因序列是在美洲黑杨基因组注释中得到。通过比较FERR-R和FERR序列同源性，得到siFERR的作用位点序列为：5′-TGCGATCTATCA-3′。FERR中与siFERR作用位点序列对应的靶序列为：5′-TTTGATAGATCGCA-3′。将FERR中对应靶位点的DNA序列进行了改变，得到可抵抗siFERR产生的siRNA剪切的FERR’(靶序列变为：5′-TCTTATCGACCGGA-3′)。与FERR相比，FERR’只是对上述靶序列进行了改造，但没有改变翻译的氨基酸序列。对三个基因序列通过人工合成的方法进行合成，然后通过同源重组的方法连入p2GWF7载体，载体上携带GFP绿色荧光蛋白基因。对构建的载体分四次转化杨树原生质体，包括：FERR表达载体转化杨树原生质体，FERR’表达载体转化杨树原生质体，siFERR表达载体+FERR表达载体共转化杨树原生质体和siFERR表达载体+FERR’表达载体共转化杨树原生质体。结果显示，FERR表达载体转化杨树原生质体，FERR’表达载体转化杨树原生质体，以及siFERR表达载体+FERR’表达载体共转化杨树原生质体均能产生绿色萤光信号，但siFERR表达载体+FERR表达载体共转化杨树原生质体时没有产生绿色萤光信号，表明siFERR产生的siRNA可降解FERR的转录本(图11)。杨树原生质体瞬时表达实验证实了杨树抑雌基因FERR-R与促雌基因FERR间的分子互作。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种生态环保型集成房屋墙板及其制备工艺 | 2020-05-08 | 616 |
| 水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1、该基因编码的蛋白质及其用途 | 2020-05-08 | 852 |
| 一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法 | 2020-05-08 | 126 |
| 一种数据中心的噪音污染控制系统 | 2020-05-08 | 407 |
| 增强的水飞蓟提取物的溶解性 | 2020-05-08 | 842 |
| 一株植物乳杆菌DNB1及其胞外多糖和应用 | 2020-05-11 | 238 |
| 一种利用废纸再生产的节能环保型广告纸及其生产方法 | 2020-05-08 | 898 |
| 一种环保型多用途除油精练剂及其制备方法 | 2020-05-08 | 734 |
| 一种天然植物染料腈纶纤维染色方法 | 2020-05-08 | 22 |
| 碳-碳环合酶及其编码基因与应用 | 2020-05-08 | 730 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈