具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
阅读：995发布：2024-02-23
专利汇可以提供具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 一般涉及分子 生物 学领域并且涉及增强多种经济上重要的 植物 中的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过在植物中调节编码产量增加多肽的核酸的表达来在植物中增强产量相关性状的方法。本发明还涉及具有核酸调节的表达的植物，所述核酸编码产量增加多肽，所述植物相对于 对照植物 具有增强的产量相关性状。，下面是具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法专利的具体信息内容。
1.在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中核酸的表达，所述核酸编码产量增加多肽，所述多肽选自：
-bHLH6样(碱性螺旋-环-螺旋6样)蛋白质；
-GRP(生长调节蛋白质)，其中所述GRP选自：
-RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/FtsJ多肽)
-碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽
-异戊烯基转移酶(IPT)多肽
-STO(盐耐受性，Salt Tolerance)蛋白质
-UGE(UDP-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-Glucose4-Epimerase)或UDP-Gal4-差向异构酶(UDP-Gal4-Epimerase))多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所述产量增加多肽选自：
-具有如表A1、A2、A3、A4、A5和/或A6所述的任意多肽的活性的多肽；
-具有根据表A1、A2、A3、A4、A5和/或A6所述的任意多肽的序列的多肽；
-由表A1、A2、A3、A4、A5和/或A6的任意核酸或能够与此类核酸杂交的核酸所编码的多肽；
-包含如基序1至12所述的或如图中所示的至少一个基序的多肽。
3.在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码bHLH6样多肽的核酸的表达，其中所述bHLH6样多肽包含HLH结构域。
4.根据权利要求1的方法，其中所述bHLH6-样多肽包含一个或多个下述基序：
(i)基序1(SEQ ID NO：3)，
(ii)基序2(SEQ ID NO：4)，
(iii)基序3：(SEQ ID NO：5)
(iv)基序7(SEQ ID NO：9)或与SEQ ID NO：9具有至少80％序列同一性的序列。
5.根据权利要求3的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达编码bHLH6样多肽的核酸来实现。
6.根据任何前述权利要求的方法，其中所述编码bHLH6样多肽的核酸编码表A1中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的一部分或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
7.根据任何前述权利要求的方法，其中所述核酸序列编码表A1中所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
8.根据任何前述权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的产量、优选提高的出苗萌发势和/或提高的种子产量。
9.根据权利要求1至8任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
10.根据权利要求5至9中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
11.根据任何前述权利要求的方法，其中所述编码bHLH6样多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae)，更优选来自拟南芥属(Arabidopsis)，最优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
12.植物或其部分，其包括种子，通过根据任何前述权利要求的方法可获得，其中所述植物或其部分包含编码bHLH6样多肽的重组核酸。
13.构建体，其包含
(i)编码在权利要求1至4中定义的bHLH6样多肽的核酸；
(ii)一个或多个调控序列，其能够驱动(a)的核酸序列的表达，以及任选地(iii)转录终止序列。
14.根据权利要求13的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
15.根据权利要求13或14的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的出苗萌发势和/或提高的种子产量的植物。
16.用根据权利要求13或14的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
17.用于产生转基因植物的方法，所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的生物量和/或提高的种子产量，所述方法包括：
(i)在植物中导入和表达编码如权利要求1至4中所定义的bHLH6样多肽的核酸；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
18.相对于对照植物具有提高的产量、特别是提高的生物量和/或提高的种子产量的转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物获得自编码如权利要求1至4所定义的bHLH6样多肽的核酸的调节的表达。
19.根据权利要求12、16或18的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦、黑麦属、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
20.根据权利要求19的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
21.来自根据权利要求19的植物和/或来自根据权利要求20的植物可收获部分的产品。
22.编码bHLH6样多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高产量，特别是提高种子产量和/或枝条生物量中的用途。
具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
[0003] -GRP(生长调节蛋白质)，其中所述GRP选自：
[0004] -RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/FtsJ多肽)
[0005] -碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽
[0006] -异戊烯基转移酶(IPT)多肽
[0007] -STO(盐耐受性，Salt Tolerance)蛋白质
[0010] 持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。 但
是，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植
物，其经常含有异源的遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的受欢迎性状。
分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。 植物的遗传工程使得可以分离和
操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。 此类
技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
是，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植
物，其经常含有异源的遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的受欢迎性状。
分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。 植物的遗传工程使得可以分离和
操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。 此类
技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
[0011] 具有特殊经济意义的性状是提高的产量。 产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。 该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。 产量直接取决于几个因
素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。 根发
育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。
优化前述因素因而可以对提高作物产量有贡献。
素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。 根发
育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。
优化前述因素因而可以对提高作物产量有贡献。
[0012] 种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直
接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。 作物也是糖、油及工业加
工中所用许多类型代谢物的来源。 种子含有胚(新枝条和新根的起源)和胚乳(萌发期
间及籽苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物
从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。 胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并
且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。 作物也是糖、油及工业加
工中所用许多类型代谢物的来源。 种子含有胚(新枝条和新根的起源)和胚乳(萌发期
间及籽苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物
从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。 胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并
且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
[0013] 另一感兴趣的性状是植物的开花时间。 植物的生存期可以被按阶段被分为例如萌发、营养生长、繁殖生长和变老。 开花时间是在播种和繁殖生长开始之间经过的时
间。 其是植物生命中的关键时期，决定了营养生长向繁殖生长的转变，在一些植物中这
与变老的起始同时。 在许多植物中，这是其中枝条顶端分生组织停止产生叶并且开始产
生花的时间点，这对于形态具有重要作用，影响例如植物形成的器官的数量以及整体大
小和形状。 开花时间还影响植物中的其他产量相关性状。 通常早期开花品种显示较少
的分支或分蘖，因此较少的丛状分支。 此类性状对于农民而言是有利的，例如简化了作
物的管理。 另一方面，延迟的开花可能导致植物具有更多的营养器官，例如更多的叶，
这在许多作物中是希望的性状，特别是在其中收获营养器官的作物中，例如莴苣中。 植
物的营养和繁殖阶段的相对持续时间直接影响了其种子产量。 在一些植物中，开花时间
的控制为用于避免胁迫例如干旱的不利影响的机制。 开花时间还可以影响作物的质量性
状，例如饲料作物中的草(herbage)的质量，其中开花延迟可以导致更高的可消化性。开
花时间影响培养季节的长度。 作物开花时间的改变可以导致扩展培养的地理区域的可能
性并且因此增加培养的栽培面积。 还可以导致植物更加适应给定环境中的农业，例如早
期开花可以允许在作物的建立可能被低温不利影响的区域中晚种植，或者可能允许早收
获以避免季节末尾的生物和非生物压力，因此产生了作物产量的增加。 因此控制开花时
间的能力是农业领域中许多工业应用的重要因素。
间。 其是植物生命中的关键时期，决定了营养生长向繁殖生长的转变，在一些植物中这
与变老的起始同时。 在许多植物中，这是其中枝条顶端分生组织停止产生叶并且开始产
生花的时间点，这对于形态具有重要作用，影响例如植物形成的器官的数量以及整体大
小和形状。 开花时间还影响植物中的其他产量相关性状。 通常早期开花品种显示较少
的分支或分蘖，因此较少的丛状分支。 此类性状对于农民而言是有利的，例如简化了作
物的管理。 另一方面，延迟的开花可能导致植物具有更多的营养器官，例如更多的叶，
这在许多作物中是希望的性状，特别是在其中收获营养器官的作物中，例如莴苣中。 植
物的营养和繁殖阶段的相对持续时间直接影响了其种子产量。 在一些植物中，开花时间
的控制为用于避免胁迫例如干旱的不利影响的机制。 开花时间还可以影响作物的质量性
状，例如饲料作物中的草(herbage)的质量，其中开花延迟可以导致更高的可消化性。开
花时间影响培养季节的长度。 作物开花时间的改变可以导致扩展培养的地理区域的可能
性并且因此增加培养的栽培面积。 还可以导致植物更加适应给定环境中的农业，例如早
期开花可以允许在作物的建立可能被低温不利影响的区域中晚种植，或者可能允许早收
获以避免季节末尾的生物和非生物压力，因此产生了作物产量的增加。 因此控制开花时
间的能力是农业领域中许多工业应用的重要因素。
[0014] 对于许多作物的另一个重要性状是早期萌发势。 改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。 长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。
在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长
的枝条与萌发势相关。 在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对
于良好出幼苗是重要的。 将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要
的。 例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)在欧洲
大西洋地区引种玉米(Zea mayes L.)杂种。
在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长
的枝条与萌发势相关。 在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对
于良好出幼苗是重要的。 将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要
的。 例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)在欧洲
大西洋地区引种玉米(Zea mayes L.)杂种。
[0015] 又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。 非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等、
Planta(2003)218：1-14)。 非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性、来自
59348：营养物(常量元素和微量元素)的过量或缺乏、辐射和氧化胁迫引起。提高植物
对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大经济优势并且会允许在不利
条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
Planta(2003)218：1-14)。 非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性、来自
59348：营养物(常量元素和微量元素)的过量或缺乏、辐射和氧化胁迫引起。提高植物
对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大经济优势并且会允许在不利
条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
[0016] 作物产量因而可以通过优化前述因素之一而提高。
[0017] 取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。 例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对
于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的提高可能是特别希望的。 即便在种子参
数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。 多种机制可以对提高种子产
量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是提高的种子数目。
于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的提高可能是特别希望的。 即便在种子参
数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。 多种机制可以对提高种子产
量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是提高的种子数目。
[0019] 现在发现可以通过调节核酸在植物中的表达来在植物中增强多种产量相关性状，所述核酸编码选自下述的产量增加多肽：
[0020] -bHLH6样(碱性-螺旋-环-螺旋6样)蛋白质；
[0021] -GRP(生长调节蛋白质)，其中所述GRP选自：
[0022] -RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/FtsJ多肽)
[0023] -碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽
[0024] -异戊烯基转移酶(IPT)多肽
[0025] -STO(盐耐受性，Salt Tolerance)蛋白质
[0026] -UGE(UDP-葡萄糖4-差向异构酶或UDP-Gal 4-差向异构酶)多肽。
[0027] 背景
[0028] bHLH6样(碱性螺旋-环-螺旋6样)蛋白质
[0029] 转录因子通常定义为显示序列特异性DNA结合作用并且能够激活和/或阻遏转录的蛋白质。 碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族是最大的转录因子家族之一，已经
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中表征(Toledo-Ortiz等人，Plant Cell 15，1749-1770，
2003；Bailey等人，Plant Cell 15，2497-2501，2003)和已经在稻中表征(Li等Plant
Physiol.141，1167-1184，2006)。 bHLH转录因子家族的区别性特征是存在由大约60个
氨基酸构成的二分(bipartite)结构域。 这种二分结构域由与共有的六核苷酸E框相结合
的DNA结合碱性区域和在该碱性结构域羧基末端存在的两个α-螺旋构成，其中所述的
两个α-螺旋由可变环区隔开。 这两个α-螺旋促进二聚化，允许不同家族成员之间形
成同二聚体和异二聚体。 尽管bHLH结构域是进化保守的，然而除这个结构域之外，进
化枝之间存在很少序列相似性。 基于bHLH结构域的序列，Li等人(2006)将稻和拟南
芥属(Arabidopsis)bHLH转录因子分成22个亚家族。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中表征(Toledo-Ortiz等人，Plant Cell 15，1749-1770，
2003；Bailey等人，Plant Cell 15，2497-2501，2003)和已经在稻中表征(Li等Plant
Physiol.141，1167-1184，2006)。 bHLH转录因子家族的区别性特征是存在由大约60个
氨基酸构成的二分(bipartite)结构域。 这种二分结构域由与共有的六核苷酸E框相结合
的DNA结合碱性区域和在该碱性结构域羧基末端存在的两个α-螺旋构成，其中所述的
两个α-螺旋由可变环区隔开。 这两个α-螺旋促进二聚化，允许不同家族成员之间形
成同二聚体和异二聚体。 尽管bHLH结构域是进化保守的，然而除这个结构域之外，进
化枝之间存在很少序列相似性。 基于bHLH结构域的序列，Li等人(2006)将稻和拟南
芥属(Arabidopsis)bHLH转录因子分成22个亚家族。
[0030] AtbHLH6(AtMYC2)是68kDa MYC-相关的转录激活子，具有bHLH型DNA-结合结构域(Abe等人，Plant Cell 9，1859-1868，1997)。 其通过脱水胁迫并且被用脱落酸
(ABA)处理时被诱导。 AtMYC2识别rd22基因的启动子的MYC识别位点，所述rd22
基因是在启动子中无ABRE-元件的ABA响应蛋白质。 过量表达AtMYC2的植物具有
对ABA更高的敏感性，具有增强的ABA诱导的基因表达，而插入突变体显示相反(降
低的ABA敏感性和减少的ABA诱导的基因表达)；此外，AtMYC2过量表达的植物对
于渗透胁迫更有抗性(Abe等人，Plant Ceoll 15，63-78，2003)。 过量表达AtMYC2的
植物被报道与野生型植物相比不显示形态改变，而且叶中的细胞形状也不受影响。 此
外，显示AtMYC2参与病原体和创伤应答，色氨酸和色氨酸衍生的二级代谢以及对百草
枯类(Methyl viologen)(Paraquat)的耐受性(Dombrecht等人，Plant Cell 19，2225-2245，
2007)。
(ABA)处理时被诱导。 AtMYC2识别rd22基因的启动子的MYC识别位点，所述rd22
基因是在启动子中无ABRE-元件的ABA响应蛋白质。 过量表达AtMYC2的植物具有
对ABA更高的敏感性，具有增强的ABA诱导的基因表达，而插入突变体显示相反(降
低的ABA敏感性和减少的ABA诱导的基因表达)；此外，AtMYC2过量表达的植物对
于渗透胁迫更有抗性(Abe等人，Plant Ceoll 15，63-78，2003)。 过量表达AtMYC2的
植物被报道与野生型植物相比不显示形态改变，而且叶中的细胞形状也不受影响。 此
外，显示AtMYC2参与病原体和创伤应答，色氨酸和色氨酸衍生的二级代谢以及对百草
枯类(Methyl viologen)(Paraquat)的耐受性(Dombrecht等人，Plant Cell 19，2225-2245，
2007)。
[0031] STO(盐耐受性)蛋白质
[0032] STO蛋白质，即盐耐受性蛋白质，首先从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中在针对基因的筛选中被鉴定出来，所述基因在酵母中阻抑calcienurin突变体中的缺陷性盐应答
(Lippuner等人1996)。通过表达拟南芥属STO在植物中赋予盐耐受性的方法已经在之前
被公开(US5,859,337；Nagaoka和Takano 2003，J.Exp.Bot.54，391-396)。
(Lippuner等人1996)。通过表达拟南芥属STO在植物中赋予盐耐受性的方法已经在之前
被公开(US5,859,337；Nagaoka和Takano 2003，J.Exp.Bot.54，391-396)。
[0033] 结构上STO通过存在被称为B框(B-box)结构域的众所周知的结构域而被表征，所述结构域中CX2CX16CX2C结构是保守的。 B框结构域是古细菌、原核和真核
起源的蛋白质中存在的非种系选择性结构域。 其主要在转录因子、核糖核蛋白和原癌
蛋白质中发现。 STO中的B框结构域在结构上类似于在拟南芥蛋白质CONSTANS中发
现的结构域，所述CONSTANS是在开花时间的阻遏中涉及的转录因子。 但是，STO和
CONSTAN属于不同的蛋白质家族，其中CONSTANS由植物特异性保守的结构域的存在
而表征，即除B框外的所谓的CCT框，而在蛋白质的STO家族中仅存在B框(Griffiths
等 人 2003，Plant Phys，131，1855-1867；Lagercrants 等 人 2000Mol.Biol.Evol.17，
1499-1507)。
起源的蛋白质中存在的非种系选择性结构域。 其主要在转录因子、核糖核蛋白和原癌
蛋白质中发现。 STO中的B框结构域在结构上类似于在拟南芥蛋白质CONSTANS中发
现的结构域，所述CONSTANS是在开花时间的阻遏中涉及的转录因子。 但是，STO和
CONSTAN属于不同的蛋白质家族，其中CONSTANS由植物特异性保守的结构域的存在
而表征，即除B框外的所谓的CCT框，而在蛋白质的STO家族中仅存在B框(Griffiths
等 人 2003，Plant Phys，131，1855-1867；Lagercrants 等 人 2000Mol.Biol.Evol.17，
1499-1507)。
[0034] 已经使用功能突变体的得失来进一步研究拟南芥属中的STO的生物学功能(Indorf等人2007，Plant J.51(4)：563-74.)。 从这些研究中报道的数据显示了STO在光
信号传导中的作用，其中提及STO可以作用为植物光敏素和蓝光信号传导的负调节子。
这些研究涉及理解STO在盐胁迫和光应答中的作用。
信号传导中的作用，其中提及STO可以作用为植物光敏素和蓝光信号传导的负调节子。
这些研究涉及理解STO在盐胁迫和光应答中的作用。
[0035] UGE(UDP-葡萄糖4-差向异构酶或UDP-Gal 4-差向异构酶)多肽
[0036] 在植物中的碳水化合物的生物合成需要特异性的糖基转移酶，其作用于被激活的糖，通常是尿苷(UDP)、腺苷或鸟苷二磷酸己糖和戊糖。 通过核苷酸糖互变酶在其
糖基部分修饰核苷酸糖，以产生不同的糖类，所述糖类是摄入游离糖类的中间产物，所
述游离糖类释放自营养或贮存碳水化合物和其他来源的降解。 一种最佳表征的核苷酸糖
互变酶是UGE(EC.5.1.3.2，根据IUBMB-International Union of Biochemistry andMolecular
Biology-Enzyme Nomenclature)。
糖基部分修饰核苷酸糖，以产生不同的糖类，所述糖类是摄入游离糖类的中间产物，所
述游离糖类释放自营养或贮存碳水化合物和其他来源的降解。 一种最佳表征的核苷酸糖
互变酶是UGE(EC.5.1.3.2，根据IUBMB-International Union of Biochemistry andMolecular
Biology-Enzyme Nomenclature)。
[0037] UGE(UDP-葡萄糖4-差向异构酶或UDP-Gal 4-差向异构酶)(EC.5.1.3.2)催化了UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的互变。 辅因子NAD+/NADH(氧化型/还原型烟酰
胺腺嘌呤二核苷酸-NicotinamideAdenine Dinucleotide-oxidized/reduced-)的不同浓度可
以产生反应的差异性刺激。 X-射线晶体学和其他研究表明UGE是二聚的，尽管在某些
实验条件下也已经报道了活性单体和更高的聚合物(Thoden等人2005J.Biol.Chem 280，
21900-21907)。
胺腺嘌呤二核苷酸-NicotinamideAdenine Dinucleotide-oxidized/reduced-)的不同浓度可
以产生反应的差异性刺激。 X-射线晶体学和其他研究表明UGE是二聚的，尽管在某些
实验条件下也已经报道了活性单体和更高的聚合物(Thoden等人2005J.Biol.Chem 280，
21900-21907)。
[0038] UGE对于UDP-Gal(多种不同的碳水化合物，糖脂类和糖苷类的生物合成的前体)的从头生物合成很重要。 UGE也是半乳糖至中央代谢的分解代谢摄入所需的，因此
UGE缺乏加剧了植物中(Dormann和Benning，1998；Plant J.13，641-652)和酵母中的半
乳糖毒性，其还导致不同形式的人半乳糖血症。
UGE缺乏加剧了植物中(Dormann和Benning，1998；Plant J.13，641-652)和酵母中的半
乳糖毒性，其还导致不同形式的人半乳糖血症。
[0040] 已经在生物研究中以及通过表征功能突变体的得失而在拟南芥中得到了UGE同种型的酶促性质和遗传作用。 所有5种拟南芥属UGE在类似的温度(30-40C)和
pH(PH7-PH9)范围中是有酶促活性的。 在UGE同种型之间可以形成同二聚体和异二聚
体。 这5种同种型在体内有功能并且可以补偿酵母GAL10突变体(缺乏UGE功能)的
功能损失。 后者反映了微生物和高等植物的UGE之间的UGE酶促活性的功能保守性
(Barber等人2006；JBC 281，17276-17285)。 在拟南芥属种，5种编码UGE的旁系同
源基因在根中优先表达。 UGE功能的突变或损失通常导致营养器官的一般性生长缺陷，
并且花更小且为异常形状。 令人惊讶地，花的数量和位置没有被改变，尽管报道了不育
(Rosti等人2007；The Plant Cell 19，1565-1579)。 根据UGE活性，改变了这些突变体
中细胞壁半乳糖含量。 专利US，6,9922,36公开了来自植物的UGE基因并且教导了在植
物表达它们以允许在植物中碳水化合物代谢改变的方法。
pH(PH7-PH9)范围中是有酶促活性的。 在UGE同种型之间可以形成同二聚体和异二聚
体。 这5种同种型在体内有功能并且可以补偿酵母GAL10突变体(缺乏UGE功能)的
功能损失。 后者反映了微生物和高等植物的UGE之间的UGE酶促活性的功能保守性
(Barber等人2006；JBC 281，17276-17285)。 在拟南芥属种，5种编码UGE的旁系同
源基因在根中优先表达。 UGE功能的突变或损失通常导致营养器官的一般性生长缺陷，
并且花更小且为异常形状。 令人惊讶地，花的数量和位置没有被改变，尽管报道了不育
(Rosti等人2007；The Plant Cell 19，1565-1579)。 根据UGE活性，改变了这些突变体
中细胞壁半乳糖含量。 专利US，6,9922,36公开了来自植物的UGE基因并且教导了在植
物表达它们以允许在植物中碳水化合物代谢改变的方法。
[0041] 概述
[0042] 令人惊讶地，发现调节核酸表达提供了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，所述核酸编码产量增加多肽，所述多肽选自：
[0043] -bHLH6样(碱性螺旋-环-螺旋6样)蛋白质；
[0044] -GRP(生长调节蛋白质)，其中所述GRP选自：
[0045] -RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/FtsJ多肽)
[0046] -碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽
[0047] -异戊烯基转移酶(IPT)多肽
[0048] -STO(盐耐受性，Salt Tolerance)蛋白质
[0049] -UGE(UDP-葡萄糖4-差向异构酶或UDP-Gal 4-差向异构酶)多肽。
[0050] 根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节编码bHLH6-样多肽的核酸的表达。 增强的产量相关性状包含
增加的提高的产量和提高的出苗萌发势(emergencevigour)。
增加的提高的产量和提高的出苗萌发势(emergencevigour)。
[0051] 根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节编码GRP多肽的核酸序列的表达，其中所述GRP多肽为RrmJ/
FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/FtsJ多肽)。 增强的产量相关性状包括提高的种
子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率和提高的收获指数。
FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/FtsJ多肽)。 增强的产量相关性状包括提高的种
子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率和提高的收获指数。
[0052] 根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达，其中所述GRP
多肽为碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽。增强的产量相关性状优选为增强的种子产
量相关性状，包括一种或多种：提高的早期萌发势、提高的绿度指数、提高的每株植物
的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率、提高的以及提高的收获指数。
多肽为碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽。增强的产量相关性状优选为增强的种子产
量相关性状，包括一种或多种：提高的早期萌发势、提高的绿度指数、提高的每株植物
的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率、提高的以及提高的收获指数。
[0053] 根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达，其中所述GRP
多肽为异戊烯基转移酶(IPT)多肽。 增强的产量相关性状为一种或多种：提高的每株植
物的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子总数以及提高的收获指数。
多肽为异戊烯基转移酶(IPT)多肽。 增强的产量相关性状为一种或多种：提高的每株植
物的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子总数以及提高的收获指数。
[0054] 根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状，特别是提高早期萌发势以及改变开花时间，特别是缩短开花时间的方法，所述方法包括调节在植
物中编码STO多肽的核酸的表达。
物中编码STO多肽的核酸的表达。
[0055] 根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物的产量相关性状，特别是提高产量的方法，所述方法包括在植物中调节编码UGE多肽的核酸的表达。
[0056] 定义
[0057] 改良和/或增强和/或改良的和/或增强的植物产量相关性状的术语在本文中使用，包括改良和/或增强和/或改良的和/或增强的植物生长特征。
[0058] 多肽/蛋白质
[0059] 术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可相互交换地使用并且指由肽键连接起来的任意长度聚合物形式的氨基酸。
[0060] 多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0061] 术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相互交换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸
或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
[0062] 对照植物
[0063] 选择合适的对照植物是实验设计的例行部分并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。 对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的
品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。 失效合子是因分离而丢失转基因的个
体。 如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部
分。
品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。 失效合子是因分离而丢失转基因的个
体。 如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部
分。
[0064] 同源物
[0065] 蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与从中衍生它们的非修饰蛋
白质具有相似的生物学活性和功能活性。
白质具有相似的生物学活性和功能活性。
[0066] 缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
[0067] 插入指一个或多个氨基酸残基被导入蛋白质中的预定位点。 插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。 通常，在氨基酸序列内部
的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小约1至10个残基级别。 氨基端或羧基端融合
蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结
构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽
糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、 -表位、lacZ、
CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小约1至10个残基级别。 氨基端或羧基端融合
蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结
构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽
糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、 -表位、lacZ、
CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
[0068] 替换指以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替代蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是
单个残基的，不过根据给予多肽的功能性约束条件，可以是簇集的；插入通常是约1至
10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域
熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。
单个残基的，不过根据给予多肽的功能性约束条件，可以是簇集的；插入通常是约1至
10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域
熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。
[0069] 表1：保守性氨基酸替换的例子
[0070]残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
[0071] 氨基酸替换、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作轻易地进行。 用于操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插
入或缺失变体的方法是本领域熟知的。 例如，用于在DNA的预定位点处产生替换突
变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，
Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介
导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
入或缺失变体的方法是本领域熟知的。 例如，用于在DNA的预定位点处产生替换突
变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，
Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介
导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
[0072] 衍生物
[0073] “衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比较，它们包含非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天
然存在的氨基酸残基的添加。 蛋白质的“衍生物”也包括这样的肽、寡肽、多肽，其中
与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰
化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然存在的改变
的氨基酸残基。 与从中衍生出衍生物的氨基酸序列相比较，该衍生物可以也包含与所述
氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加物(例如报道分子或
其他配体)，如所结合旨在促进检测该衍生物的报道分子，和相对于天然存在的蛋白质的
氨基酸序列而言，包含非天然存在的氨基酸残基。 此外，“衍生物”也包括天然存在形
式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe，Appl.
Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的融合物。
然存在的氨基酸残基的添加。 蛋白质的“衍生物”也包括这样的肽、寡肽、多肽，其中
与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰
化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然存在的改变
的氨基酸残基。 与从中衍生出衍生物的氨基酸序列相比较，该衍生物可以也包含与所述
氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加物(例如报道分子或
其他配体)，如所结合旨在促进检测该衍生物的报道分子，和相对于天然存在的蛋白质的
氨基酸序列而言，包含非天然存在的氨基酸残基。 此外，“衍生物”也包括天然存在形
式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe，Appl.
Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的融合物。
[0074] 直向同源物/旁系同源物
[0075] 直向同源物和旁系同源物包括用来描述基因祖先关系的进化概念。 旁系同源物是相同物种内因祖先基因复制而起源的基因；直向同源物是来自不同生物的因物种形成
而起源的基因，并且也衍生于共同的祖先基因。
而起源的基因，并且也衍生于共同的祖先基因。
[0076] 结构域
[0077] 术语“结构域”指在进化相关性蛋白质的序列比对结果上的特定位置处保守的一组氨基酸。 尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高
度保守的氨基酸指示了很可能在蛋白质结构、稳定性或功能方面是必需的氨基酸。 结构
域因其在蛋白质同源物家族的比对序列中高保守程度而鉴定，故它们可以作为鉴定物用
来确定所讨论的任意多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
度保守的氨基酸指示了很可能在蛋白质结构、稳定性或功能方面是必需的氨基酸。 结构
域因其在蛋白质同源物家族的比对序列中高保守程度而鉴定，故它们可以作为鉴定物用
来确定所讨论的任意多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
[0078] 基序/共有序列/标签
[0079] 术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中短的保守区域。 基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可
以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
[0080] 杂交
[0081] 如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补核酸均处于溶液中。 杂交过程也
可以用固定至基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的互补核酸之一进
行。 杂交过程也可以用固定至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平
版印刷术固定至例如硅玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)的互补
核酸之一进行。 为使杂交发生，核酸分子通常被热变性或化学变性，以使双链解链成两
条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
可以用固定至基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的互补核酸之一进
行。 杂交过程也可以用固定至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平
版印刷术固定至例如硅玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)的互补
核酸之一进行。 为使杂交发生，核酸分子通常被热变性或化学变性，以使双链解链成两
条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
[0082] 术语“严格性”指杂交发生的条件。 杂交的严格性受诸条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。 通常，低严格条件选择为在定义的离子强度和pH
处，低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃。 中等严格条件是当所述温度低于Tm 20℃
时，并且高严格条件是当所述温度低于Tm 10℃时。高严格杂交条件一般用于分离与靶核
酸序列具有高序列相似性的杂交序列。 但是，核酸可以在序列上偏离且依旧编码基本上
相同的多肽，原因是遗传密码的简并性。 因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴
定此类核酸分子。
处，低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃。 中等严格条件是当所述温度低于Tm 20℃
时，并且高严格条件是当所述温度低于Tm 10℃时。高严格杂交条件一般用于分离与靶核
酸序列具有高序列相似性的杂交序列。 但是，核酸可以在序列上偏离且依旧编码基本上
相同的多肽，原因是遗传密码的简并性。 因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴
定此类核酸分子。
[0083] Tm是在定义的离子强度和pH处的下述温度，其中50％的靶序列在所述温度与完全匹配的探针杂交。 Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。 例如，较长的序
列在更高温度上特异性地杂交。 最大杂交速率在低于Tm约16℃直至32℃上获得。 杂
交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交体形
成；这种作用对于直到0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高的浓度而言，可以忽略这
种作用)。 甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数的甲酰
胺降低0.6至0.7℃，且添加50％甲酰胺允许在30至45℃杂交，尽管杂交速率将降低。
碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。 平均而言和对于大探针而言，Tm下降
约1℃/每％碱基错配。 根据杂交体的类型，Tm可以使用以下等式计算：
列在更高温度上特异性地杂交。 最大杂交速率在低于Tm约16℃直至32℃上获得。 杂
交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交体形
成；这种作用对于直到0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高的浓度而言，可以忽略这
种作用)。 甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数的甲酰
胺降低0.6至0.7℃，且添加50％甲酰胺允许在30至45℃杂交，尽管杂交速率将降低。
碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。 平均而言和对于大探针而言，Tm下降
约1℃/每％碱基错配。 根据杂交体的类型，Tm可以使用以下等式计算：
[0084] 1)DNA-DNA 杂 交 体 (Meinkoth 和 Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
[0085] Tm＝81.5℃+16.6×log10[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×Lc]-1-0.61×％甲酰胺
[0086] 2)DNA-RNA杂交体或RNA-RNA杂交体：
[0087] Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
[0088] 3)寡DNA杂交体或寡RNAd杂交体：
[0089] 对少于20个核苷酸而言：Tm＝2(ln)
[0090] 对20-35个核苷酸而言：Tm＝22+1.46(ln)
[0091] a或者用于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
[0092] b仅对于在30％-75％范围内的％GC是精确的。
[0093] cL＝双链体的碱基对长度。
[0094] dOligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
[0095] 可以使用许多已知技术中任意一种技术控制非特异性结合，例如将膜以含有蛋白质的溶液封闭、添加异源RNA、异源DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处
理。对于非同源性探针，可以通过变换以下条件之一：(i)渐进地降低复性温度(例如从
68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)进行一系列杂交。 技
术人员了解可以在杂交期间变更并且将维持或改变所述严格条件的多个参数。
理。对于非同源性探针，可以通过变换以下条件之一：(i)渐进地降低复性温度(例如从
68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)进行一系列杂交。 技
术人员了解可以在杂交期间变更并且将维持或改变所述严格条件的多个参数。
[0096] 除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。 为除去因非特异性杂交引起的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。 此类洗涤的关键因素包括最终洗涤
溶液的离子强度和温度：盐浓度越低且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。 洗涤条件
一般在杂交严格性处或低于所述杂交严格性而进行。 阳性杂交产生至少两倍于背景信号
的信号。通常，用于核酸杂交测定法或基因扩增检测方法的适宜严格条件如上所述。 也
可以选择严格性更高或更低的条件。 技术人员了解可以在洗涤期间变更并且将维持或改
变所述严格条件的多个参数。
溶液的离子强度和温度：盐浓度越低且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。 洗涤条件
一般在杂交严格性处或低于所述杂交严格性而进行。 阳性杂交产生至少两倍于背景信号
的信号。通常，用于核酸杂交测定法或基因扩增检测方法的适宜严格条件如上所述。 也
可以选择严格性更高或更低的条件。 技术人员了解可以在洗涤期间变更并且将维持或改
变所述严格条件的多个参数。
[0097] 例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中
洗涤。 用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的例子包括在50℃
于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂
交体的长度是杂交核酸的预期长度。 当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴
定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。 1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；
杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性
的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
洗涤。 用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的例子包括在50℃
于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂
交体的长度是杂交核酸的预期长度。 当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴
定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。 1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；
杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性
的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
[0098] 出于定义严格性的水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New
York或参考Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和年度更
新版)。
York或参考Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和年度更
新版)。
[0099] 剪接变体
[0100] 如本文中所用的术语“剪接变体”包括其中已经切除、替换、置换或添加所选内含子和/或外显子或其中已经缩短或加长内含子的核酸序列的变体。 此类变体将是其
中基本上保留蛋白质的生物学活性的一类变体；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能
性片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制备。 用于预测和分离此类
剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex，BMC Bioinformatics.2005；
6：25)。
中基本上保留蛋白质的生物学活性的一类变体；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能
性片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制备。 用于预测和分离此类
剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex，BMC Bioinformatics.2005；
6：25)。
[0101] 等位变体
[0102] 等位基因或等位变体是给定基因位于相同染色体位置处的备选形式。 等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小型插入/缺失多态性(INDEL)。 INDEL的大小通常小
于100bp。 SNP和INDEL形成大部分生物的天然存在多态性株系中的序列变体的最大集
合。
于100bp。 SNP和INDEL形成大部分生物的天然存在多态性株系中的序列变体的最大集
合。
[0103] 基因改组/定向进化
[0104] 基因改组或定向进化由反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体而组成(Castle等人(2004)Science
304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
[0105] 调节元件/调控序列/启动子
[0106] 术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”均在本文中可相互交换地使用并且在广泛含义上意指能够实现与它们相连接的序列表达的调节性核酸序列。 术语“启
动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而
指导有效连接的核酸转录的核酸调控序列。 前述术语包括从经典真核基因组基因(包括
对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)衍生的转录调节序列和
应答发育性刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的其它调节元件(即
上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在此情
况下它可以包括一个-35框序列和/或一个-10框转录调节序列。 术语“调节元件”也
包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的人工融合分子或衍生物。
动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而
指导有效连接的核酸转录的核酸调控序列。 前述术语包括从经典真核基因组基因(包括
对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)衍生的转录调节序列和
应答发育性刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的其它调节元件(即
上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在此情
况下它可以包括一个-35框序列和/或一个-10框转录调节序列。 术语“调节元件”也
包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的人工融合分子或衍生物。
[0107] “植物启动子”包含介导植物细胞中编码序列节段表达的调节元件。 因此，植物启动子不需要是植物来源的，而可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病
毒。 “植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用在本发明方法中待表达并在本文
中描述的核酸序列转化的植物。 这也适用于其他“植物”调节信号，如“植物”终止
子。 在本发明方法中有用的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸替换、
插入和/或缺失进行修饰，但不影响启动子、可读框(ORF)或3’调节区如终止子或远
离ORF存在的其他3’调节区的功能性或活性。 还有可能的是：所述启动子的活性因其
序列的修饰或被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替代而提高。 为了在
植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效地连接至或包含在正确的时间点并以所需空
间表达模式表达基因的合适启动子。
毒。 “植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用在本发明方法中待表达并在本文
中描述的核酸序列转化的植物。 这也适用于其他“植物”调节信号，如“植物”终止
子。 在本发明方法中有用的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸替换、
插入和/或缺失进行修饰，但不影响启动子、可读框(ORF)或3’调节区如终止子或远
离ORF存在的其他3’调节区的功能性或活性。 还有可能的是：所述启动子的活性因其
序列的修饰或被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替代而提高。 为了在
植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效地连接至或包含在正确的时间点并以所需空
间表达模式表达基因的合适启动子。
[0108] 鉴定功能性等价启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以例如通过将此启动子有效地与报道基因连接并分析该报道基因在植物多种组织中的表达水平和
模式进行分析。 熟知的合适报道基因包括例如β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。 启动
子活性通过测量β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或
表达模式随后可以与参考启动子(如在本发明方法中使用的一种启动子)的启动子强度和
/或表达模式比较。 备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如RNA印迹法及放射
自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods 6：
986-994)，通过量化mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基
因(如18S rRNA)的mRNA水平比较进行分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在
低水平表达的启动子。 “低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转
录物、至约1/500,0000转录物的水平上。 相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、
或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。 强启动子
的例子是CaMV 35S启动子。
模式进行分析。 熟知的合适报道基因包括例如β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。 启动
子活性通过测量β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或
表达模式随后可以与参考启动子(如在本发明方法中使用的一种启动子)的启动子强度和
/或表达模式比较。 备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如RNA印迹法及放射
自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods 6：
986-994)，通过量化mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基
因(如18S rRNA)的mRNA水平比较进行分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在
低水平表达的启动子。 “低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转
录物、至约1/500,0000转录物的水平上。 相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、
或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。 强启动子
的例子是CaMV 35S启动子。
[0109] 有效地连接
[0110] 如本文中所用的术语“有效地连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，从而该启动子序列能够起动该目的基因转录。
[0111] 组成型启动子
[0112] “组成型启动子”指在生长和发育的大部分期间而无需在全部期间和在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。下表2a给出组成型
启动子的例子。
启动子的例子。
[0113] 表2a：组成型启动子的例子
[0114]基因来源 参考文献
肌动蛋白 McElroy等人，Plant Cell，2：163-171，1990
HMGP WO 2004/070039
CAMV 35S Odell等人，Nature，313：810-812，1985
CaMV 19S Nilsson等人，Physiol.Plant.100：456-462，1997
de Pater等人，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992，
GOS2
WO 2004/065596
Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689，
遍在蛋白
1992
Buchholz等人，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，
稻亲环蛋白
1994
Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231：276-285，
玉米H3组蛋白
1992
苜蓿H3组蛋白 Wu等人Plant Mol.Biol.11：641-649，1988
肌动蛋白2 An等人，Plant J.10(1)；107-121，1996
34S FMV Sanger等人，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443
核酮糖二磷酸羧化酶-加 US 4,962,028
氧酶小亚基
Leisner(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(5)：
OCS
2553
SAD1 Jain等人，Crop Science，39(6)，1999：1696
SAD2 Jain等人，Crop Science，39(6)，1999：1696
Shaw等人(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：
nos
7831-7846
V-ATP酶 WO 01/14572
超级启动子 WO 95/14098
G框蛋白质 WO 94/12015
肌动蛋白 McElroy等人，Plant Cell，2：163-171，1990
HMGP WO 2004/070039
CAMV 35S Odell等人，Nature，313：810-812，1985
CaMV 19S Nilsson等人，Physiol.Plant.100：456-462，1997
de Pater等人，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992，
GOS2
WO 2004/065596
Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689，
遍在蛋白
1992
Buchholz等人，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，
稻亲环蛋白
1994
Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231：276-285，
玉米H3组蛋白
1992
苜蓿H3组蛋白 Wu等人Plant Mol.Biol.11：641-649，1988
肌动蛋白2 An等人，Plant J.10(1)；107-121，1996
34S FMV Sanger等人，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443
核酮糖二磷酸羧化酶-加 US 4,962,028
氧酶小亚基
Leisner(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(5)：
OCS
2553
SAD1 Jain等人，Crop Science，39(6)，1999：1696
SAD2 Jain等人，Crop Science，39(6)，1999：1696
Shaw等人(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：
nos
7831-7846
V-ATP酶 WO 01/14572
超级启动子 WO 95/14098
G框蛋白质 WO 94/12015
[0115]
[0116] 遍在启动子
[0117] 遍在启动子基本上在生物的全部组织或细胞中有活性。
[0118] 发育调节型启动子
[0119] 发育调节型启动子在某些发育阶段期间或在经历发育变化的植物的部分中有活性。
[0120] 诱导型启动子
[0121] 诱导型启动子在应答化学刺激(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有诱导型或提高的转录启动作用，
或可以是“胁迫诱导的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时被激活，或是“病原体诱导
的”，即当植物暴露于多种病原体时被激活。
或可以是“胁迫诱导的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时被激活，或是“病原体诱导
的”，即当植物暴露于多种病原体时被激活。
[0122] 器官特异性/组织特异性启动子
[0123] 器官特异性或组织特异性启动子是能够偏好性地在某些器官或组织如叶、根、种子组织等中启动转录的启动子。 例如，“根特异性启动子”是这样的启动子，该启动
子优势地在植物根中具有转录活性，基本上在植物的任何其他部分中无活性，尽管在该
植物其他这些部分中仍允许任意泄露表达。 能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本
文中称作“细胞特异性的”。
子优势地在植物根中具有转录活性，基本上在植物的任何其他部分中无活性，尽管在该
植物其他这些部分中仍允许任意泄露表达。 能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本
文中称作“细胞特异性的”。
[0124] 种子特异性启动子是能够优势地在种子组织中有转录活性的启动子，但实际上并非必需排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。 种子特异性启动
子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。 自59392：种子特异性启动子的例子在
Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol。 J.2，113-125，2004)中给出。
子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。 自59392：种子特异性启动子的例子在
Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol。 J.2，113-125，2004)中给出。
[0125] 来自59348：
[0126] 例如，种子特异性启动子可以驱动在一个或多个种子组织例如胚乳、糊粉、胚中的表达。 种子特异性启动子的例子示于下文表2b中。 种子特异性启动子的其他例子
在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，所述文献的公开内
容如完整所述那样通过引用方式并入本文。
在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，所述文献的公开内
容如完整所述那样通过引用方式并入本文。
[0127] 表2b：种子特异性启动子的例子
[0128]基因来源 参考文献
种子特异性基因 Simon等人，Plant Mol.Biol.5：191，1985；
Scofield等人，J.Biol.Chem.262：12202，1987.；
Baszczynski等人，Plant Mol.Biol.14：633，1990.
巴西坚果(Brazil Nut)白蛋 Pearson等人，Plant Mol.Biol.18：235-245，
白 1992.
豆球蛋白 Ellis等人，Plant Mol.Biol.10：203-214，1988.
Takaiwa等人，Mol.Gen.Genet.208：15-22，
谷蛋白(稻)
1986；
Takaiwa等人，FEBS Letts.221：43-47，1987.
玉米醇溶蛋白 Matzke等人Plant Mol Biol，14(3)：323-32 1990
NapA Stalberg等人，Planta 199：515-519，1996.
小麦LMW和HMW麦谷 Mol Gen Genet 216：81-90，1989；NAR 17：461-2，
蛋白-1 1989
小麦SPA Albani等人，Plant Cell，9：171-184，1997
小麦α、β、γ-麦醇溶蛋白 EMBO J.3：1409-15，1984
大麦Itr1启动子 Diaz等人(1995)Mol Gen Genet 248(5)：592-8
大麦B1、C、D大麦醇溶蛋 Theor Appl Gen 98：1253-62，1999；Plant J
白 4：343-55，1993；Mol Gen Genet 250：750-60，1996
Mena等人，The Plant Journal，116(1)：53-62，
大麦DOF
1998
blz2 EP99106056.7
Vicente-Carbajosa等人，Plant J.13：629-640，
合成的启动子
1998.
Wu等人，Plant Cen Physiology 39(8)885-889，
稻谷醇溶蛋白NRP33
1998
Wu等人，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，
稻α-球蛋白Glb-1
1998
Sato等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：
稻OSH1
8117-8122，1996
稻α-球蛋白REB/OHP-1 Nakase等人Plant Mol.Biol.33：513-522，1997
稻ADP-葡萄糖焦磷酸酶 Trans Res 6：157-68，1997
玉米ESR基因家族 Plant J 12：235-46，1997
高粱α-高粱醇溶蛋白 DeRose等人，Plant Mol.Biol 32：1029-35，1996
Postma-Haarsma等人，Plant Mol.Biol.
KNOX
39：257-71，1999
稻油质蛋白 Wu等人，J.Biochem.123：386，1998
Cummins等人，Plant Mol.Biol.19：873-876，
向日葵油质蛋白
1992
PRO0117，推定的稻40S
核糖体蛋白 WO 2004/070039
PRO0136，稻丙氨酸氨基转
移酶 未公开
PRO0147，酪氨酸抑制物 未公开
ITR1(大麦)
PRO0151，稻WSI18 WO 2004/070039
PRO0175，稻RAB21 WO 2004/070039
PRO00S WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
α-淀粉酶(Amy32b) Lanahan等人，Plant Cell 4：203-211，1992；
Skriver等人，Proc Natl Acad Sci USA
88：7266-7270，1991
组织蛋白酶β样基因 Cejudo等人，Plant Mol Biol 20：849-856，1992
大麦Ltp2 Kalla等人，Plant J.6：849-60，1994
Chi26 Leah等人，Plant J.4：579-89，1994
玉米B-Peru Selinger等人，Genetics 149；1125-38，1998
种子特异性基因 Simon等人，Plant Mol.Biol.5：191，1985；
Scofield等人，J.Biol.Chem.262：12202，1987.；
Baszczynski等人，Plant Mol.Biol.14：633，1990.
巴西坚果(Brazil Nut)白蛋 Pearson等人，Plant Mol.Biol.18：235-245，
白 1992.
豆球蛋白 Ellis等人，Plant Mol.Biol.10：203-214，1988.
Takaiwa等人，Mol.Gen.Genet.208：15-22，
谷蛋白(稻)
1986；
Takaiwa等人，FEBS Letts.221：43-47，1987.
玉米醇溶蛋白 Matzke等人Plant Mol Biol，14(3)：323-32 1990
NapA Stalberg等人，Planta 199：515-519，1996.
小麦LMW和HMW麦谷 Mol Gen Genet 216：81-90，1989；NAR 17：461-2，
蛋白-1 1989
小麦SPA Albani等人，Plant Cell，9：171-184，1997
小麦α、β、γ-麦醇溶蛋白 EMBO J.3：1409-15，1984
大麦Itr1启动子 Diaz等人(1995)Mol Gen Genet 248(5)：592-8
大麦B1、C、D大麦醇溶蛋 Theor Appl Gen 98：1253-62，1999；Plant J
白 4：343-55，1993；Mol Gen Genet 250：750-60，1996
Mena等人，The Plant Journal，116(1)：53-62，
大麦DOF
1998
blz2 EP99106056.7
Vicente-Carbajosa等人，Plant J.13：629-640，
合成的启动子
1998.
Wu等人，Plant Cen Physiology 39(8)885-889，
稻谷醇溶蛋白NRP33
1998
Wu等人，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，
稻α-球蛋白Glb-1
1998
Sato等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：
稻OSH1
8117-8122，1996
稻α-球蛋白REB/OHP-1 Nakase等人Plant Mol.Biol.33：513-522，1997
稻ADP-葡萄糖焦磷酸酶 Trans Res 6：157-68，1997
玉米ESR基因家族 Plant J 12：235-46，1997
高粱α-高粱醇溶蛋白 DeRose等人，Plant Mol.Biol 32：1029-35，1996
Postma-Haarsma等人，Plant Mol.Biol.
KNOX
39：257-71，1999
稻油质蛋白 Wu等人，J.Biochem.123：386，1998
Cummins等人，Plant Mol.Biol.19：873-876，
向日葵油质蛋白
1992
PRO0117，推定的稻40S
核糖体蛋白 WO 2004/070039
PRO0136，稻丙氨酸氨基转
移酶 未公开
PRO0147，酪氨酸抑制物 未公开
ITR1(大麦)
PRO0151，稻WSI18 WO 2004/070039
PRO0175，稻RAB21 WO 2004/070039
PRO00S WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
α-淀粉酶(Amy32b) Lanahan等人，Plant Cell 4：203-211，1992；
Skriver等人，Proc Natl Acad Sci USA
88：7266-7270，1991
组织蛋白酶β样基因 Cejudo等人，Plant Mol Biol 20：849-856，1992
大麦Ltp2 Kalla等人，Plant J.6：849-60，1994
Chi26 Leah等人，Plant J.4：579-89，1994
玉米B-Peru Selinger等人，Genetics 149；1125-38，1998
[0129]
[0130]
[0131] 如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是优势地在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在该植物其他这些部分中仍允
许任意泄露表达。 自59392：绿色组织特异性启动子的例子在Nomura等人，2000Plant
Mol Biol.44(1)：99-106；WO2004/070039中给出。
许任意泄露表达。 自59392：绿色组织特异性启动子的例子在Nomura等人，2000Plant
Mol Biol.44(1)：99-106；WO2004/070039中给出。
[0132] 组织特异性启动子的另一个例子是分生组织特异性启动子，其优势地在分生组织中具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在该植物其他这些部
分中仍允许任意泄露表达。
分中仍允许任意泄露表达。
[0133] 终止子
[0134] 术语“终止子”包括作为转录单元末端处DNA序列的调控序列，所述的DNA序列产生初级转录物的3’加工和多聚腺苷化及转录终止的信号。 所述终止子可以从天
然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以从例如胭脂碱合酶
或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较不优选地从任何其他真核基因衍生。
然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以从例如胭脂碱合酶
或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较不优选地从任何其他真核基因衍生。
[0135] 调节
[0136] 就表达或基因表达而言，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比较，表达水平因所述基因的表达而改变，优选地，表达水平可以提高或降低。
原始、未调节的表达可以是结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型的表达，随
后是翻译。 术语“调节活性”意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何改变，
这导致植物产量提高和/或生长增加。
原始、未调节的表达可以是结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型的表达，随
后是翻译。 术语“调节活性”意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何改变，
这导致植物产量提高和/或生长增加。
[0137] 表达
[0138] 术语“表达”或“基因表达”意指某个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。 术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或诸基因或基因构建体
转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，而所述RNA随后翻译或不翻译成蛋白质。
该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，而所述RNA随后翻译或不翻译成蛋白质。
该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
[0139] 增加的表达/过量表达
[0140] 如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平为额外的任何形式的表达。
[0141] 在本领域内充分记载了用于提高基因或基因产物表达的方法并且这些方法包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。 充当启动子或增强
子元件的分离核酸可以导入多核苷酸的非异源形式的适宜位置(一般在上游)中，从而上
调编码目的多肽的核酸表达。 例如，内源性启动子可以在体内通过突变、缺失和/或替
换进行改变(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动
子以相对于本发明基因的恰当方向及距离导入植物细胞，从而控制该基因的表达。
子元件的分离核酸可以导入多核苷酸的非异源形式的适宜位置(一般在上游)中，从而上
调编码目的多肽的核酸表达。 例如，内源性启动子可以在体内通过突变、缺失和/或替
换进行改变(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动
子以相对于本发明基因的恰当方向及距离导入植物细胞，从而控制该基因的表达。
[0142] 若需要多肽表达，通常希望的是在多核苷酸编码区的3’末端处包括多聚腺苷化区。 所述多聚腺苷化区可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。 待添
加的3’末端序列可以从例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或
较不优选地从任何其他真核基因衍生。
加的3’末端序列可以从例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或
较不优选地从任何其他真核基因衍生。
[0143] 也可以将内含子序列添加至5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 已经证实在植物和动物表达构建体的转录
单位中包含可剪接内含子提高了mRNA水平及蛋白质水平上的基因表达至多到1000
倍 (Buchman 和 Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis 等 (1987)Gens Dev 1：
1183-1200)。 此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5’末
端附近时最强烈。 玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本
领域已知的。 对于总体信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，
Springer，N.Y.(1994)。
单位中包含可剪接内含子提高了mRNA水平及蛋白质水平上的基因表达至多到1000
倍 (Buchman 和 Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis 等 (1987)Gens Dev 1：
1183-1200)。 此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5’末
端附近时最强烈。 玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本
领域已知的。 对于总体信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，
Springer，N.Y.(1994)。
[0144] 内源基因
[0145] 本文中对“内源的”基因的称谓不仅仅涉及如植物中以其天然形式(即没有人类任何干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式下的随后(再)导入植物(转基因)
的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以出
现转基因表达的大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。 所述的分离基因可以从生物
分离或可以是人造的，例如通过化学合成法人造的。
的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以出
现转基因表达的大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。 所述的分离基因可以从生物
分离或可以是人造的，例如通过化学合成法人造的。
[0146] 降低的表达
[0147] 本文中提及的“降低的表达”或“降低或基本消除表达”意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的下降。与对照植物相比较，所述降低或基
本上消除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、
85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多降低。
本上消除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、
85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多降低。
[0148] 为了最佳实施，用于在植物中降低内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列来转化单子叶植物，以及来自双子叶植物的核酸序列来转化双子
叶植物。优选地，来自任何给定植物物种的核酸序列被引入该相同物种。 例如，来自稻
的核酸序列被转化入稻植物。 但是，并非完全必要的是待引入的核酸序列来自的植物与
其将被引入的植物是同一物种。 只要内源靶基因和待被引入的核酸之间有基本同源性即
足够。
叶植物。优选地，来自任何给定植物物种的核酸序列被引入该相同物种。 例如，来自稻
的核酸序列被转化入稻植物。 但是，并非完全必要的是待引入的核酸序列来自的植物与
其将被引入的植物是同一物种。 只要内源靶基因和待被引入的核酸之间有基本同源性即
足够。
[0149] 来自59391：
[0150] 为了降低或基本消除植物中内源基因的表达，需要核酸序列的基本上连续的核苷酸的足够长度。 为了进行基因沉默，这个长度可以是短至20、19、18、17、16、15、
14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以长至完整基因(包括部分或完
整的5’和/或3’UTR)。 基本上连续的核苷酸片段可以从编码目的蛋白的核酸(靶
基因)或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸衍生。 优
选地，基本上连续的核苷酸的片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选
地，基本上连续的核苷酸片段以增加的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、
60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一
性。 编码(功能性)多肽的核酸序列不是用于降低或基本消除内源基因表达的本文中所
讨论多种方法的必要条件。
14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以长至完整基因(包括部分或完
整的5’和/或3’UTR)。 基本上连续的核苷酸片段可以从编码目的蛋白的核酸(靶
基因)或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸衍生。 优
选地，基本上连续的核苷酸的片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选
地，基本上连续的核苷酸片段以增加的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、
60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一
性。 编码(功能性)多肽的核酸序列不是用于降低或基本消除内源基因表达的本文中所
讨论多种方法的必要条件。
[0151] 表达的这种降低或基本消除可以使用常规工具和技术完成。 用于降低或基本消除内源基因表达的优选方法是在植物中导入并表达基因构建体，其中将核酸(在此情况
下，从目的基因或从能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的
任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)克隆至所述基因构建体，作为被间隔序列
(非编码性DNA)隔开的(部分或完全)反向重复序列。
下，从目的基因或从能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的
任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)克隆至所述基因构建体，作为被间隔序列
(非编码性DNA)隔开的(部分或完全)反向重复序列。
[0152] 在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下，所述部分是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段
基本上连续的核苷酸)的反向重复序列(其优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的
沉默作用降低或基本上消除内源基因的表达。 在包含调控序列的表达载体中克隆所述反
向重复序列。 非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内
含子、多接头等)位于形成所述反向重复序列的两个反向核酸之间。 在反向重复序列转
录后，形成具有(部分或完全)自我互补性结构的嵌合RNA。 这种双链RNA结构称作
发夹RNA(hpRNA)。 hpRNA由植物加工成siRNA，该siRNA掺入RNA诱导的沉默复
合体(RISC)。 该RISC进一步切开所述mRNA转录物，从而大幅降低待翻译成多肽的
mRNA转录物的数目。 对于其他一般细节，见例如Grierson等人(1998)WO 98/53083；
Waterhouse等人(1999)WO99/53050。
基本上连续的核苷酸)的反向重复序列(其优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的
沉默作用降低或基本上消除内源基因的表达。 在包含调控序列的表达载体中克隆所述反
向重复序列。 非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内
含子、多接头等)位于形成所述反向重复序列的两个反向核酸之间。 在反向重复序列转
录后，形成具有(部分或完全)自我互补性结构的嵌合RNA。 这种双链RNA结构称作
发夹RNA(hpRNA)。 hpRNA由植物加工成siRNA，该siRNA掺入RNA诱导的沉默复
合体(RISC)。 该RISC进一步切开所述mRNA转录物，从而大幅降低待翻译成多肽的
mRNA转录物的数目。 对于其他一般细节，见例如Grierson等人(1998)WO 98/53083；
Waterhouse等人(1999)WO99/53050。
[0153] 本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达所述核酸作为反向重复序列克隆到其中的基因构建体，不过可以使用几种熟知“基因沉默”方法的任何一种或多种方法
来实现相同的作用。
来实现相同的作用。
[0154] 用于降低内源基因表达的这样一种方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在这种情况下，沉默作用由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在
植物中触发。 这种dsRNA进一步由植物加工成约20个至约26个核苷酸，称作短干扰
RNA(siRNA)。 siRNA掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其中所述的RISC切割
内源性靶基因的mRNA转录物，从而大幅降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优
选地，所述双链RNA序列对应于靶基因。
植物中触发。 这种dsRNA进一步由植物加工成约20个至约26个核苷酸，称作短干扰
RNA(siRNA)。 siRNA掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其中所述的RISC切割
内源性靶基因的mRNA转录物，从而大幅降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优
选地，所述双链RNA序列对应于靶基因。
[0155] RNA沉默方法的另一个例子包括将核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段
基本上连续的核苷酸)以有义方向导入植物。 “有义方向”指与其mRNA转录物同源的
DNA序列。 因而，将所述核酸序列的至少一个拷贝导入植物。 这种额外的核酸序列会
降低内源基因表达，产生称为共抑制作用的现象。 当一种核酸序列的几个额外拷贝导入
植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与触发共抑制作用之间存在正相
关。
基本上连续的核苷酸)以有义方向导入植物。 “有义方向”指与其mRNA转录物同源的
DNA序列。 因而，将所述核酸序列的至少一个拷贝导入植物。 这种额外的核酸序列会
降低内源基因表达，产生称为共抑制作用的现象。 当一种核酸序列的几个额外拷贝导入
植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与触发共抑制作用之间存在正相
关。
[0156] RNA沉默方法的另一个例子包括使用反义核酸序列。 “反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA
转录物序列互补的核苷酸序列。所述反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。 此
互补性可以位于基因的“编码区”中和/或基因的“非编码区”中。 术语“编码区”
指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。 术语“非编码区”指被转录
但不被翻译成氨基酸的分布在编码区侧翼的5’和3’序列(也称作5’和3’非翻译
区)。
转录物序列互补的核苷酸序列。所述反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。 此
互补性可以位于基因的“编码区”中和/或基因的“非编码区”中。 术语“编码区”
指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。 术语“非编码区”指被转录
但不被翻译成氨基酸的分布在编码区侧翼的5’和3’序列(也称作5’和3’非翻译
区)。
[0157] 反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基对规则设计。 反义核酸序列可以与完整核酸序列(在此情况下是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同
源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)互补，不过也可以是仅与
所述核酸序列的一部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。 例如，所述反义
寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。 合适反义寡
核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15
或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以使用化学合成和酶连接
反应，利用本领域已知的方法构建。 例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可
以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中设计所述的修饰核苷酸
旨在提高分子的生物学稳定性或提高反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的
物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。 可以用来产生反
义核酸序列的修饰核苷酸的例子是本领域熟知的。 已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化
和“加帽”用类似物(如肌苷)替换一个或多个天然存在的核苷酸。 对核苷酸的其他修
饰是本领域熟知的。
源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)互补，不过也可以是仅与
所述核酸序列的一部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。 例如，所述反义
寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。 合适反义寡
核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15
或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以使用化学合成和酶连接
反应，利用本领域已知的方法构建。 例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可
以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中设计所述的修饰核苷酸
旨在提高分子的生物学稳定性或提高反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的
物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。 可以用来产生反
义核酸序列的修饰核苷酸的例子是本领域熟知的。 已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化
和“加帽”用类似物(如肌苷)替换一个或多个天然存在的核苷酸。 对核苷酸的其他修
饰是本领域熟知的。
[0158] 所述反义核酸序列可以使用表达载体以生物学方式产生，其中将一种核酸序列以反义方向亚克隆(即从所插入核酸转录出的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)至所述
表达载体。 优选地，植物中反义核酸序列的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中
所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
表达载体。 优选地，植物中反义核酸序列的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中
所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
[0159] 本发明方法中用于沉默作用的核酸分子(无论导入植物中或原位(insitu)产生)与mRNA转录物和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合，从而抑制蛋白质的表达，例
如通过抑制转录和/或翻译做到这一点。 杂交可以通过常规核苷酸互补性以形成稳定双
链体引起，或例如与DNA双链体结合的反义核酸序列的情形下，因双螺旋大沟内的特异
性相互作用引起。 反义核酸序列可以通过转化法或在特定组织部位处的直接注射法导入
植物。 或者，反义核酸序列可以受到修饰以靶向所选的细胞并且随后全身性施用例如，
对于全身性施用，可以修饰反义核酸序列，从而它们与表达在所选细胞表面上的受体或
抗原特异性地结合，例如通过将所述反义核酸序列连接至与细胞表面受体或抗原结合的
肽或抗体连接而做到这一点。 所述反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体递送至细
胞。
如通过抑制转录和/或翻译做到这一点。 杂交可以通过常规核苷酸互补性以形成稳定双
链体引起，或例如与DNA双链体结合的反义核酸序列的情形下，因双螺旋大沟内的特异
性相互作用引起。 反义核酸序列可以通过转化法或在特定组织部位处的直接注射法导入
植物。 或者，反义核酸序列可以受到修饰以靶向所选的细胞并且随后全身性施用例如，
对于全身性施用，可以修饰反义核酸序列，从而它们与表达在所选细胞表面上的受体或
抗原特异性地结合，例如通过将所述反义核酸序列连接至与细胞表面受体或抗原结合的
肽或抗体连接而做到这一点。 所述反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体递送至细
胞。
[0160] 根据又一个方面，反义核酸序列是α-端基异构核酸序列。 α端基异构核酸序列与互补RNA形成特定的双链杂交体，在所述双链杂交体中与常见的b-单元相反，所述
链彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。 反义核酸序列也可以包含
2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA
类似物(Inoue等(1987)FEBSLett.215，327-330)。
链彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。 反义核酸序列也可以包含
2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA
类似物(Inoue等(1987)FEBSLett.215，327-330)。
[0161] 内源基因表达的降低或基本上消除也可以使用核酶进行。 核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因
此，核酶(例如锤头状核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)
可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅降低待翻译成多肽的mRNA
转录物的数目。 可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号
4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。 或者，与核酸序列相对应的mRNA转录
物可以用来从RNA分子汇集物中选出具有特异核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和
Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。 核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已
知的(例如Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等
(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。
此，核酶(例如锤头状核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)
可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅降低待翻译成多肽的mRNA
转录物的数目。 可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号
4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。 或者，与核酸序列相对应的mRNA转录
物可以用来从RNA分子汇集物中选出具有特异核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和
Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。 核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已
知的(例如Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等
(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。
[0162] 基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO 98/36083)或
Baulcombe(WO 99/15682)及其他人描述的策略实现。
Baulcombe(WO 99/15682)及其他人描述的策略实现。
[0163] 内源基因中存在突变和/或在随后导入植物的分离的基因/核酸中存在突变时，基因沉默也可以发生。所述降低或基本上消除可以由无功能的多肽引起。 例如，多肽可
以与多种相互作用性蛋白质结合；一种或多种突变和/或截短因而可以产生仍能够结合
相互作用性蛋白质(如受体蛋白)但不能表现其正常功能的多肽(如信号配体)。
以与多种相互作用性蛋白质结合；一种或多种突变和/或截短因而可以产生仍能够结合
相互作用性蛋白质(如受体蛋白)但不能表现其正常功能的多肽(如信号配体)。
[0164] 基因沉默的又一种方法是靶向与基因的调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成可阻止靶细胞中基因转录的三重螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer
Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992；和Maher，
L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992；和Maher，
L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
[0165] 技术人员熟知其他方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制其在植物中的功能，或干扰其中涉及某多肽的信号传导途径。 尤其，可以考虑人造分子可用于抑制靶多
肽的生物学功能，或用于干扰其中涉及所述靶多肽的信号传导途径。
肽的生物学功能，或用于干扰其中涉及所述靶多肽的信号传导途径。
[0166] 或者，可以设立筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，其中所述的天然变体编码活性降低的多肽。 也可以使用此类天然变体，例如来开展同源重组。
[0167] 人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常长19-24个核苷酸的单链小RNA。 它们主要发挥调节基因表达和
/或mRNA翻译的功能。 大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列完全互补或接近完
全互补。 但是，存在具有多达5个错配的天然靶。 它们由Dicer家族的双链特异性RNA
酶从具有特征性折返结构的较长非编码性RNA加工而来加工后，它们通过与RNA诱导的
沉默复合体(RISC)的主要组分-Argonaute蛋白结合被掺入该复合体。miRNA充当RISC
的特异性组分，因为它们与胞浆内的靶核酸(大多是mRNA)发生碱基配对。 后续调节
事件包括靶mRNA切割和摧毁和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此往往反映为
靶基因的mRNA水平降低。
/或mRNA翻译的功能。 大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列完全互补或接近完
全互补。 但是，存在具有多达5个错配的天然靶。 它们由Dicer家族的双链特异性RNA
酶从具有特征性折返结构的较长非编码性RNA加工而来加工后，它们通过与RNA诱导的
沉默复合体(RISC)的主要组分-Argonaute蛋白结合被掺入该复合体。miRNA充当RISC
的特异性组分，因为它们与胞浆内的靶核酸(大多是mRNA)发生碱基配对。 后续调节
事件包括靶mRNA切割和摧毁和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此往往反映为
靶基因的mRNA水平降低。
[0168] 可以按照遗传工程方式专门设计通常长21个核苷酸的人工微RNA(amiRNA)以负向地调节单个或多个目的基因的基因表达。选择植物的微RNA靶的决定因素是本领域
熟知的。 已经定义了用于靶识别的经验参数和可以使用它们来辅助特定amiRNA的设计
(Schwab等，Dev.Cell 8，517-527，2005)。 用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工
具也是公众可获得的(Schwab等，2006Plant Cell.200618(5)：1121-33)。
熟知的。 已经定义了用于靶识别的经验参数和可以使用它们来辅助特定amiRNA的设计
(Schwab等，Dev.Cell 8，517-527，2005)。 用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工
具也是公众可获得的(Schwab等，2006Plant Cell.200618(5)：1121-33)。
[0169] 为了最佳性能，用于降低植物中内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子
叶植物。 优选地，来自任何给定植物物种的核酸序列导入相同物种。 例如，来自稻的
核酸序列转化至稻植物。 但是，并非绝对要求待导入的核酸序列源自与该核酸序列待导
入的植物相同的植物物种。 只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在实质的同源性即
可。
叶植物。 优选地，来自任何给定植物物种的核酸序列导入相同物种。 例如，来自稻的
核酸序列转化至稻植物。 但是，并非绝对要求待导入的核酸序列源自与该核酸序列待导
入的植物相同的植物物种。 只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在实质的同源性即
可。
[0170] 上文描述的是用于降低或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的例子。例如，本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于通过利用合适启动
子，实现降低完整植物中或其部分中内源基因的表达。
子，实现降低完整植物中或其部分中内源基因的表达。
[0171] 本领域的技术人员熟悉多种技术用于降低基因的表达。
[0172] 选择标记(基因)/报道基因
[0173] “选择标记”、“选择标记基因”或“报道基因”包括对细胞赋予表型的任何基因，其中所述″选择标记″、 ″选择标记基因″或“报道基因”在所述细胞中表
达旨在促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。 这些标记基因能
够借助一系列不同原理而鉴定核酸分子的成功转移。 合适的标记可以选自赋予抗生素抗
性或除草剂抗性、导入新代谢性状或允许目视选择的标记。 选择标记基因的例子包括赋
予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或
赋予针对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素
(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例
如提供 抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予针对例如咪唑啉酮、膦
丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一
碳源的manA，或利用木糖的木糖异构酶，或抗营养性标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。 目
视标记基因的表达导致颜色(例如β-葡糖醛酸酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底
物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP和其衍生
物)的形成。 这个名单仅代表少数的可能标记。 技术人员熟悉此类标记。 取决于生物
和选择方法，优选不同的标记。
达旨在促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。 这些标记基因能
够借助一系列不同原理而鉴定核酸分子的成功转移。 合适的标记可以选自赋予抗生素抗
性或除草剂抗性、导入新代谢性状或允许目视选择的标记。 选择标记基因的例子包括赋
予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或
赋予针对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素
(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例
如提供 抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予针对例如咪唑啉酮、膦
丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一
碳源的manA，或利用木糖的木糖异构酶，或抗营养性标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。 目
视标记基因的表达导致颜色(例如β-葡糖醛酸酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底
物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP和其衍生
物)的形成。 这个名单仅代表少数的可能标记。 技术人员熟悉此类标记。 取决于生物
和选择方法，优选不同的标记。
[0174] 已知当核酸稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅少数细胞摄取了外来DNA，并且根据需要，将其整合至细胞的基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技
术。 为鉴定并选择这些整合体，编码选择标记的基因(如上文所述的基因)通常连同目
的基因一起导入宿主细胞。 这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的
突变体中使用。 此外，编码选择标记的核酸分子可以在包含编码本发明多肽或在本发明
方法中所用多肽的序列的相同载体上，或在独立的载体上导入宿主细胞。 已经用所导入
核酸稳定转染的细胞可以通过选择作用鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其
他细胞死亡)。
术。 为鉴定并选择这些整合体，编码选择标记的基因(如上文所述的基因)通常连同目
的基因一起导入宿主细胞。 这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的
突变体中使用。 此外，编码选择标记的核酸分子可以在包含编码本发明多肽或在本发明
方法中所用多肽的序列的相同载体上，或在独立的载体上导入宿主细胞。 已经用所导入
核酸稳定转染的细胞可以通过选择作用鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其
他细胞死亡)。
[0175] 因为所述标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因一旦已经成功地导入，则在转基因宿主细胞中是不再需要或不想要的，故而，用于导入核酸的本发明方法
有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。 一种这样的方法称作共转化法。 共
转化法同时使用两种载体用于转化，一种载体携带本发明的核酸而第二种载体携带标记
基因。 大比例的转化体接受或在植物情况下包含(多达40％或更多的转化体)这两种载
体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧
翼存在T-DNA的序列，该序列通常代表表达盒。 标记基因随后可以通过开展杂交从转
化的植物中除去。 在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与目的核酸一起进行
转化(称作Ac/Ds技术)。 转化体可以与转座酶来源物杂交，或该转化体用导致转座酶
表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。 在一些情况下(大约10％)，一旦转化已经成功
发生，则转座子从宿主细胞的基因组中跳出并丢失。 在其他许多情况下，转座子跳到不
同位置。在这些情况下，必须通过开展杂交消除标记基因。 在微生物学中，开发了有可
能或促进检测这类事件的技术。 又一个有利的方法依赖于所谓重组系统；此方法的优势
在于可以用所述的重组系统实行杂交消除作用。最知名的该类型系统称作Cre/lox系统。
Cre1是除去位于loxP序列之间序列的重组酶。 若所述标记基因整合在loxP序列之间，
则一旦转化已经成功发生，它因重组酶表达而被除去。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/
FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan
等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。 有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整
合至植物基因组。 这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。
有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。 一种这样的方法称作共转化法。 共
转化法同时使用两种载体用于转化，一种载体携带本发明的核酸而第二种载体携带标记
基因。 大比例的转化体接受或在植物情况下包含(多达40％或更多的转化体)这两种载
体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧
翼存在T-DNA的序列，该序列通常代表表达盒。 标记基因随后可以通过开展杂交从转
化的植物中除去。 在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与目的核酸一起进行
转化(称作Ac/Ds技术)。 转化体可以与转座酶来源物杂交，或该转化体用导致转座酶
表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。 在一些情况下(大约10％)，一旦转化已经成功
发生，则转座子从宿主细胞的基因组中跳出并丢失。 在其他许多情况下，转座子跳到不
同位置。在这些情况下，必须通过开展杂交消除标记基因。 在微生物学中，开发了有可
能或促进检测这类事件的技术。 又一个有利的方法依赖于所谓重组系统；此方法的优势
在于可以用所述的重组系统实行杂交消除作用。最知名的该类型系统称作Cre/lox系统。
Cre1是除去位于loxP序列之间序列的重组酶。 若所述标记基因整合在loxP序列之间，
则一旦转化已经成功发生，它因重组酶表达而被除去。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/
FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan
等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。 有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整
合至植物基因组。 这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。
[0176] 转基因的/转基因/重组
[0177] 为本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”例如就核酸序列而言，意指包含所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体，或用本发明核酸序列、表达
盒或载体转化的生物，这些构建体均通过重组方法产生，其中
盒或载体转化的生物，这些构建体均通过重组方法产生，其中
[0178] (a)编码在本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或
[0179] (b)与本发明核酸序列有效连接的基因调控序列，例如启动子，或
[0180] (c)a)和b)
[0181] 不位于其天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，所述的修饰有可能采取例如替换、添加、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。 天然遗传环境理解为意指
原初植物中的天然基因组位点或染色体位点或存在于基因组文库中。 在基因组文库的情
况下，核酸序列的天然遗传环境优选地保留，至少部分保留。 该环境分布在所述核酸序
列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少
5000bp序列长度。 当天然存在的表达盒受非天然的合成( “人工”)方法(如诱变处
理)被修饰时，天然存在的表达盒-例如所述核酸序列的天然启动子与编码在本发明方法
中有用的多肽的相应核酸序列的天然存在组合，如上文所定义-变成转基因表达盒。 合
适方法例如在US 5,565,350或WO 00/15815中描述。
原初植物中的天然基因组位点或染色体位点或存在于基因组文库中。 在基因组文库的情
况下，核酸序列的天然遗传环境优选地保留，至少部分保留。 该环境分布在所述核酸序
列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少
5000bp序列长度。 当天然存在的表达盒受非天然的合成( “人工”)方法(如诱变处
理)被修饰时，天然存在的表达盒-例如所述核酸序列的天然启动子与编码在本发明方法
中有用的多肽的相应核酸序列的天然存在组合，如上文所定义-变成转基因表达盒。 合
适方法例如在US 5,565,350或WO 00/15815中描述。
[0182] 为本发明目的，如上所述，将转基因植物因此理解为意指在本发明方法中有用的核酸不处于所述植物基因组中所述核酸的天然基因座处，所述核酸有可能同源或异源
地表达。 但是，如所提及，转基因的还意指尽管本发明的或在本发明方法中有用的核
酸处于植物基因组中所述核酸的天然位置处，然而其序列相对于天然序列而言已经被修
饰，和/或所述天然序列的调节序列已经被修饰。 转基因的优选地理解为意指本发明核
酸在基因组的非天然基因座处表达，即，所述核酸的同源表达或优选异源表达发生。 优
选的转基因植物在本文中提及。
地表达。 但是，如所提及，转基因的还意指尽管本发明的或在本发明方法中有用的核
酸处于植物基因组中所述核酸的天然位置处，然而其序列相对于天然序列而言已经被修
饰，和/或所述天然序列的调节序列已经被修饰。 转基因的优选地理解为意指本发明核
酸在基因组的非天然基因座处表达，即，所述核酸的同源表达或优选异源表达发生。 优
选的转基因植物在本文中提及。
[0183] 转化
[0184] 如本文中提及的术语“导入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞，无论转化所用的方法是什么方法。 能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发
生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化并且完整植物可以从中再生。 所选的具
体组织根据可用于并且最适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统变化。 示例性
靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存分生组织(例
如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导性分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分
生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地导入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质
粒。备选地，它可以整合至宿主基因组。 所得的转化植物细胞随后可以用来按照本领域
技术人员已知的方式再生出转化植物。
生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化并且完整植物可以从中再生。 所选的具
体组织根据可用于并且最适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统变化。 示例性
靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存分生组织(例
如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导性分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分
生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地导入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质
粒。备选地，它可以整合至宿主基因组。 所得的转化植物细胞随后可以用来按照本领域
技术人员已知的方式再生出转化植物。
[0185] 外来基因转移至植物基因组的过程称作转化。 转化植物物种现在是极为常规的技术。 有利地，几种转化方法中的任何方法可以用来将目的基因导入合适的祖先细
胞。 描述用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的方法可以用于瞬时转化或稳定
转化。 转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、提高游离DNA摄入的化学品、DNA直接
注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。
转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，
72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito
R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，
(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击法(Klein TM等，
(1987)Nature 327：70)、(非整合性)病毒感染法等。 包括转基因作物植物在内的转基
因植物优选通过农杆菌介导的转化法产生。 有利的转化方法是植物内(in planta)转化
法。 为此目的，例如有可能将农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生
组织。 根据本发明，已经证明特别有利的是将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至
少作用于花原基。 随后继续培育该植物直至获得已处理植物的种子(Clough和Bent，
Plant J.(1998)16，735-743)。 用于农杆菌介导稻转化的方法包括用于稻转化的众知
方法，如在以下任意文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita
和 Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan 等 (Plant Mol Biol 22(3)：491-506，
1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容如充分所述那样通过引用的
方式并入本文。 在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：
745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容如
充分所述那样通过引用的方式并入本文。 所述方法还例如由B.Jenes等，Techniques
for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1 卷，Engineering and Utilization，编 者
S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)128-143及 在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.
Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)描述。 待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转
化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids
Res.12(1984)8711)。 通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，
例如作为模型使用的植物如拟南芥属植物(拟南芥在本发明范围不视为作物植物)，或
作物植物，例如烟草植物，所述方式例如是通过将擦伤的叶或切碎的叶浸泡在农杆菌溶
液中并随后将它们在合适培养基中培育。 借助根癌农杆菌转化植物例如由 和
Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors forGene
Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，编者
S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
胞。 描述用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的方法可以用于瞬时转化或稳定
转化。 转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、提高游离DNA摄入的化学品、DNA直接
注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。
转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，
72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito
R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，
(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击法(Klein TM等，
(1987)Nature 327：70)、(非整合性)病毒感染法等。 包括转基因作物植物在内的转基
因植物优选通过农杆菌介导的转化法产生。 有利的转化方法是植物内(in planta)转化
法。 为此目的，例如有可能将农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生
组织。 根据本发明，已经证明特别有利的是将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至
少作用于花原基。 随后继续培育该植物直至获得已处理植物的种子(Clough和Bent，
Plant J.(1998)16，735-743)。 用于农杆菌介导稻转化的方法包括用于稻转化的众知
方法，如在以下任意文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita
和 Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan 等 (Plant Mol Biol 22(3)：491-506，
1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容如充分所述那样通过引用的
方式并入本文。 在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：
745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容如
充分所述那样通过引用的方式并入本文。 所述方法还例如由B.Jenes等，Techniques
for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1 卷，Engineering and Utilization，编 者
S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)128-143及 在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.
Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)描述。 待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转
化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids
Res.12(1984)8711)。 通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，
例如作为模型使用的植物如拟南芥属植物(拟南芥在本发明范围不视为作物植物)，或
作物植物，例如烟草植物，所述方式例如是通过将擦伤的叶或切碎的叶浸泡在农杆菌溶
液中并随后将它们在合适培养基中培育。 借助根癌农杆菌转化植物例如由 和
Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors forGene
Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，编者
S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
[0186] 除了转化随后必需再生成完整植物的体细胞之外，还可转化植物分生组织的细胞，并且尤其是发育成配子的那些细胞。 在这种情况下，转化的配子遵循天然植物
发育过程，从而产生转基因植物。 因此，例如用农杆菌处理拟南芥属植物的种子并且
从正在发育的植物中获得种子，其中一定比例的所述植物被转化并且因此是转基因的
[Feldman，KA 和 MarksMD(1987)Mol Gen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992)，
在：编者CKoncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.WordScientific，
Singapore，第274-289页]。备选方法基于反复除去花序并将莲座丛中心内的切除部位与
转化的农杆菌温育，因而同样可以在较晚的时间点上获得转化的种子(Chang(1994)Plant
J.5：551-558；Katavic(1994)MolGen Genet，245：363-370)。 但是，特别有效的方法
是改良真空渗入法，如“花器浸蘸”法。 在拟南芥属植物真空渗入法的情况下，在减压
下用农杆菌悬液处理完整植物[Bechthold，N(1993)。 C R Acad Sci Paris Life Sci，316：
1194-1199]，而在”花器浸蘸法”的情况下，将正在发育的花组织与经表面活性剂处理的
农杆菌悬液短暂温育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)ThePlant J.16，735-743]。 在这两种
情况下均收获某个比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下
培育与非转基因种子区分。 此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中
母系地遗传，这降低或消除了经过花粉的转基因流动风险。 叶绿体基因组的转化一般通
过在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中已示意性展示的方法实现。
简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至同源于叶绿体基因组的侧翼序
列之间。这些同源侧翼序列指导进入原质体的位点特异性整合。 已经对许多不同植物物
种描述了质体转化并且Bock(2001)基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic
plastidsin basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：
425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progresstowards commercialization
of plastid transformation technology)，TrendsBiotechnol.21，20-28进行了综述。 其他生
物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式进行报道，其中所述的无标记质体转化
体可以通过瞬时共整合性标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，
225-229)。
发育过程，从而产生转基因植物。 因此，例如用农杆菌处理拟南芥属植物的种子并且
从正在发育的植物中获得种子，其中一定比例的所述植物被转化并且因此是转基因的
[Feldman，KA 和 MarksMD(1987)Mol Gen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992)，
在：编者CKoncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.WordScientific，
Singapore，第274-289页]。备选方法基于反复除去花序并将莲座丛中心内的切除部位与
转化的农杆菌温育，因而同样可以在较晚的时间点上获得转化的种子(Chang(1994)Plant
J.5：551-558；Katavic(1994)MolGen Genet，245：363-370)。 但是，特别有效的方法
是改良真空渗入法，如“花器浸蘸”法。 在拟南芥属植物真空渗入法的情况下，在减压
下用农杆菌悬液处理完整植物[Bechthold，N(1993)。 C R Acad Sci Paris Life Sci，316：
1194-1199]，而在”花器浸蘸法”的情况下，将正在发育的花组织与经表面活性剂处理的
农杆菌悬液短暂温育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)ThePlant J.16，735-743]。 在这两种
情况下均收获某个比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下
培育与非转基因种子区分。 此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中
母系地遗传，这降低或消除了经过花粉的转基因流动风险。 叶绿体基因组的转化一般通
过在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中已示意性展示的方法实现。
简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至同源于叶绿体基因组的侧翼序
列之间。这些同源侧翼序列指导进入原质体的位点特异性整合。 已经对许多不同植物物
种描述了质体转化并且Bock(2001)基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic
plastidsin basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：
425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progresstowards commercialization
of plastid transformation technology)，TrendsBiotechnol.21，20-28进行了综述。 其他生
物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式进行报道，其中所述的无标记质体转化
体可以通过瞬时共整合性标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，
225-229)。
[0187] T-DNA活化标签技术(T-DNA activation tagging)
[0188] T-DNA活化标签技术(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及以启动子指导靶向的基因表达的方式在目的基因的基因组区域内或基因的编码区上游或下游10kb处插
入通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA。 一般，靶向基因的天然
启动子对该靶向基因表达的调节被破坏，并且所述基因处于新导入的启动子控制下。 该
启动子一般嵌入T-DNA中。 这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如借助农杆菌感
染，并且导致在插入的T-DNA附近的基因表达受到调节。所得的转基因植物因在导入的
启动子附近的基因表达受到调节而显示显性表型。
入通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA。 一般，靶向基因的天然
启动子对该靶向基因表达的调节被破坏，并且所述基因处于新导入的启动子控制下。 该
启动子一般嵌入T-DNA中。 这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如借助农杆菌感
染，并且导致在插入的T-DNA附近的基因表达受到调节。所得的转基因植物因在导入的
启动子附近的基因表达受到调节而显示显性表型。
[0189] TILLING
[0190] 术语“TILLING”是“基因组中定向诱导的局部损伤法”的缩写并且指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有改良表达和/或活性的蛋白
质。 TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。 这些突变变体可以表现在强度或
在位置或在时间方面改良的表达(例如若所述突变影响启动子)。 这些突变变体可以显
示比其天然形式基因所表现活性更高的活性。 TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法
组合。 在TILLING中一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在
Methodsin Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编辑，World
Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville
CR编辑，Arabidopsis.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第
137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods
onMolecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的
DNA制备和汇集；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和复性以使得异双链体形成；
(e)DHPLC，其中异双链体在汇集物中的存在作为色谱图中一个额外的峰被检测到；(f)
鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物的测序。 用于TILLING的方法是本领域熟知的
(McCallum等，(2000)NatBiotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet
5(2)：145-50)。
质。 TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。 这些突变变体可以表现在强度或
在位置或在时间方面改良的表达(例如若所述突变影响启动子)。 这些突变变体可以显
示比其天然形式基因所表现活性更高的活性。 TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法
组合。 在TILLING中一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在
Methodsin Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编辑，World
Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville
CR编辑，Arabidopsis.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第
137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods
onMolecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的
DNA制备和汇集；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和复性以使得异双链体形成；
(e)DHPLC，其中异双链体在汇集物中的存在作为色谱图中一个额外的峰被检测到；(f)
鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物的测序。 用于TILLING的方法是本领域熟知的
(McCallum等，(2000)NatBiotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet
5(2)：145-50)。
[0191] 同源重组
[0192] 同源重组允许在基因组中定义的所选位置处导入选择的核酸。 同源重组是在生物科学中例行用于低等生物如酵母或小立碗藓属(Physcomitrella)苔藓的标准技术。 已
经对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)和作物植物例如稻(Terada
等 (2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida 和 Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：
132-8)描述了用于植物中开展同源重组的方法，并且存在与靶生物无关而通常适用的方
法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
经对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)和作物植物例如稻(Terada
等 (2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida 和 Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：
132-8)描述了用于植物中开展同源重组的方法，并且存在与靶生物无关而通常适用的方
法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
[0193] 产量
[0194] 术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与特定作物、与面积并与时间段有关。 单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接有助于对产量，或
实际产量是对于某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的
产量)除以种植的平方米数而确定。 术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物量
(根和/或枝条生物量)、涉及繁殖器官和/或涉及繁殖体(如种子)。
实际产量是对于某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的
产量)除以种植的平方米数而确定。 术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物量
(根和/或枝条生物量)、涉及繁殖器官和/或涉及繁殖体(如种子)。
[0195] 早期萌发势
[0196] “早期萌发势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期期间，并且可以因植物适应性提高引起，其中所述的植物适应性提高原因在于例如该植物更好
地适应环境(即优化能量来源的用途和枝条与根之间的分配)。 具有早期萌发势的植
物也显示幼苗存活提高和作物建立更佳，这往往产生高度均一的田块(作物以均一方式
生长，即大多数植物在基本上相同的时间达到各个发育期)和往往形成更好及更高的产
量。 因而，早期萌发势可以通过测量多种因子如千粒重(Thousand Kernel Weight)、萌发
百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝条生物量和许多其他因素
等确定。
地适应环境(即优化能量来源的用途和枝条与根之间的分配)。 具有早期萌发势的植
物也显示幼苗存活提高和作物建立更佳，这往往产生高度均一的田块(作物以均一方式
生长，即大多数植物在基本上相同的时间达到各个发育期)和往往形成更好及更高的产
量。 因而，早期萌发势可以通过测量多种因子如千粒重(Thousand Kernel Weight)、萌发
百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝条生物量和许多其他因素
等确定。
[0197] 提高/改善/增强
[0198] 术语“提高”、“改善”或“增强”是相互可交换的并且在应用含义上应当意指与如本文中定义的对照植物相比较，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或
10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生
长。
10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生
长。
[0199] 种子产量
[0200] 提高的种子产量自身可以表现为以下一个或多个指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子基础和/或每株植物和/或每平方米；b)提高的每株植
物花数目；c)提高的(充实)种子数；d)提高的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种
子总数之间的比率)；e)提高的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物
量的比率；和f)提高的千粒重(TKW)，这从计数的饱满种子数及其总重量中外推出来。
提高的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量引起，并且也可以因胚和/或胚乳大
小的增加引起。
物花数目；c)提高的(充实)种子数；d)提高的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种
子总数之间的比率)；e)提高的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物
量的比率；和f)提高的千粒重(TKW)，这从计数的饱满种子数及其总重量中外推出来。
提高的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量引起，并且也可以因胚和/或胚乳大
小的增加引起。
[0201] 种子产量的提高也可以表现为种子大小和/或种子体积的增长。 此外，种子产量的提高自身也可以表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的提
高。 提高的产量也可以产生改良的构造，或可以因改良的构造而出现。
高。 提高的产量也可以产生改良的构造，或可以因改良的构造而出现。
[0202] 绿度指数
[0203] 从植物的数字图像计算如本文中所用的“绿度指数”。 对属于图像上植物目标的每个像素计算绿色值与红色值的比率(在编码颜色的RGB模式中)。 绿度指数表述为
绿色/红色比超过给定阈值的像素百分数。 在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和
在营养可用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。 相反，
在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。
绿色/红色比超过给定阈值的像素百分数。 在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和
在营养可用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。 相反，
在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。
[0204] 植物
[0205] 本文中所用的术语“植物”包括完整植物、植物的祖先及子代和包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织、器官在内的植物部分，其中每种前述对象包含
目的基因/核酸。 术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组
织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种前述对象包含目的基因/核酸。
目的基因/核酸。 术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组
织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种前述对象包含目的基因/核酸。
[0206] 在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树
或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物
种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物
种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属
物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番
荔枝属物种(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachis spp.)、木
波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)
(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦
原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、
箣竹属(Bambusasp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜
菜(Betavulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜
青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turniprape)])、
Cadaba farinosa、 茶 (Camellia sinensis)、 美 人 蕉 (Canna indica)、 大 麻 (Cannabis
sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假
虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Caryaspp.)、红花(Carthamus tinctorius)、
栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟
属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰
子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲
梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物
种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种
(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜、山马
蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、
柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油
棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、埃塞俄
比亚画眉草(Eragrostistef)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、
桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、
水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficuscarica)、
金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆
属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Sojahispida)或大豆(Soja max))、
陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus
annuus))、长管萱草(Hemerocallisfulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum
spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans
spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、
亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱
角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzulasylvatica、番茄属
物 种(Lycopersicon spp.)(例 如 番 茄(Lycopersiconesculentum)、 番 茄(Lycopersicon
lycopersicum)、番茄(Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果
属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、
芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜
蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Menthaspp.)、芒
(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属物
种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物
种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopusspp.)、稻属物种(Oryza spp.)(例如稻、
阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋
果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨
属物种(Perseaspp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属
物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦
苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子
(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poaspp.)、杨属物种(Populus
spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium
spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝
卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖
麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳
属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种
(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanumspp.)(例如马铃薯(Solanum
tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜
属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸
豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅
状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普
通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、
Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小
麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越
桔属物种(Vacciniumspp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇
(Violaodorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种
(Ziziphus spp.)及其他。
或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物
种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物
种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属
物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番
荔枝属物种(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachis spp.)、木
波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)
(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦
原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、
箣竹属(Bambusasp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜
菜(Betavulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜
青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turniprape)])、
Cadaba farinosa、 茶 (Camellia sinensis)、 美 人 蕉 (Canna indica)、 大 麻 (Cannabis
sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假
虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Caryaspp.)、红花(Carthamus tinctorius)、
栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟
属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰
子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲
梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物
种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种
(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜、山马
蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、
柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油
棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、埃塞俄
比亚画眉草(Eragrostistef)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、
桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、
水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficuscarica)、
金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆
属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Sojahispida)或大豆(Soja max))、
陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus
annuus))、长管萱草(Hemerocallisfulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum
spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans
spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、
亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱
角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzulasylvatica、番茄属
物 种(Lycopersicon spp.)(例 如 番 茄(Lycopersiconesculentum)、 番 茄(Lycopersicon
lycopersicum)、番茄(Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果
属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、
芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜
蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Menthaspp.)、芒
(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属物
种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物
种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopusspp.)、稻属物种(Oryza spp.)(例如稻、
阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋
果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨
属物种(Perseaspp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属
物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦
苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子
(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poaspp.)、杨属物种(Populus
spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium
spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝
卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖
麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳
属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种
(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanumspp.)(例如马铃薯(Solanum
tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜
属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸
豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅
状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普
通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、
Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小
麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越
桔属物种(Vacciniumspp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇
(Violaodorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种
(Ziziphus spp.)及其他。
[0207] 发明详述：
[0208] 出人意料地，现在已经发现：调节植物中编码bHLH6样多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。 根据第一实施方案，本发明提供了用
于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码bHLH6样多肽
的核酸表达。
于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码bHLH6样多肽
的核酸表达。
[0209] 用于调节(优选提高)编码bHLH6样多肽的核酸表达的优选方法是在植物中导入并表达编码bHLH6样多肽的核酸。
[0210] 在一个实施方案中，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任意称谓意指如本文中定义的bHLH6样多肽。在同一实施方案中，下文对“在本发明方法中有用的核
酸”的任意称谓意指能够编码这种bHLH6样多肽的核酸。在一个实施方案中，待导入植
物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核
酸，下文也称作“bHLH6样核酸”或“bHLH6样基因”。
酸”的任意称谓意指能够编码这种bHLH6样多肽的核酸。在一个实施方案中，待导入植
物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核
酸，下文也称作“bHLH6样核酸”或“bHLH6样基因”。
[0211] 如本文中定义的“bHLH6样多肽”指下述的任意多肽，其包含有后附HLH结构域(HMMPFam PF00010、ProfileScan PS50888、SMARTSM00353)的碱性结构域，从而
形成碱性螺旋-环-螺旋结构域(InterproIPR001092)。 优选地，所述bHLH6样多肽包含
至少1个、优选2个、更优选3个或多个以下基序：
形成碱性螺旋-环-螺旋结构域(InterproIPR001092)。 优选地，所述bHLH6样多肽包含
至少1个、优选2个、更优选3个或多个以下基序：
[0212] 基序1(SEQ ID NO：3)：L(G/E/T)WX(D/E)(G/S)X(Y/F)(K/N)G(E/D)
[0213] 其中第4位X可以是任何氨基酸，优选转角样氨基酸(turnlike aminoacid)，更优选G、R、K、T和S之一；并且其中第7位X可以是任何氨基酸，优选疏水或极性氨基
酸，更优选Y、F、N和H之一。
酸，更优选Y、F、N和H之一。
[0214] 基序2(SEQ ID NO：4)：
[0215] G(V/I)(V/I/L)E(V/L/I)(G/A)(S/V/T/A)(T/L/S)(E/D/S)
[0216] 基序3(SEQ ID NO：5)：(D/E)K(A/V/I)S(L/I/V)L(G/D/E/A)
[0217] 基序4(SEQ ID NO：6)：(T/N/S)LQ(Q/H)RLQ
[0218] 基序5(SEQ ID NO：7)：
[0219] (K/F)(I/F/V)(I/L/V/M/S)G(W/L/R/N/E)(E/D)AM(I/V)(G/R)(V/I)(Q/N/E/Y)
[0220] 基序6(SEQ ID NO：8)：
[0221] (H/Y)(A/S)(S/N)(V/C/M/L/T)(S/Q)(V/C/S)(V/MF)(K/N/S)(D/C/E)(L/Q/F/M)(M/R/L)(I/F/L)(Q/D/H)(Q/D/V)
[0222] 备选地，bHLH6样蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：2所表示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、
35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、
47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，条件是该同源蛋白包含上文所列出
的保守基序。 使用全局比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的
Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数，确定整体序列同一性。 与整体序列同一
性相比较，当仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常将更高。 序列保守性
在bHLH结构域区域中高得多(见实施例3中的表B2和图2)。因此，bHLH结构域是定
义bHLH6样蛋白组的良好标准。 优选地，bHLH6样多肽包含基序7(SEQ ID NO：9)的
序列：PKKRGRKPANGREEPLNHVEAERQRREKLNQRFYALRAVVPNVSKMDKASLLG
DAIAYINELKSKVVKTE，或以增加的优选顺序与SEQ IDNO：9具有至少80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。如由SMART确定的HLH结
构域覆盖SEQ ID NO：2中的第454至503位残基并且被包含在基序7中。
35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、
47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，条件是该同源蛋白包含上文所列出
的保守基序。 使用全局比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的
Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数，确定整体序列同一性。 与整体序列同一
性相比较，当仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常将更高。 序列保守性
在bHLH结构域区域中高得多(见实施例3中的表B2和图2)。因此，bHLH结构域是定
义bHLH6样蛋白组的良好标准。 优选地，bHLH6样多肽包含基序7(SEQ ID NO：9)的
序列：PKKRGRKPANGREEPLNHVEAERQRREKLNQRFYALRAVVPNVSKMDKASLLG
DAIAYINELKSKVVKTE，或以增加的优选顺序与SEQ IDNO：9具有至少80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。如由SMART确定的HLH结
构域覆盖SEQ ID NO：2中的第454至503位残基并且被包含在基序7中。
[0223] 优选地，当多肽序列在构建进化系统树例如Li等人(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列)中聚类，
而不与任何其他组聚类。
而不与任何其他组聚类。
[0224] 优选地，编码bHLH6样多肽的基因组DNA序列不包含内含子。
[0225] 术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文中的“定义”部分定义。 存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
95，5857-5864；Letunic等 人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder
等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分
子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
95，5857-5864；Letunic等 人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder
等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分
子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
[0226] 用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。 GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT：使用蛋白质序列
或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。 如本领域技术人员显而易见，可以进
行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的
替代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸
或氨基酸序列范围或选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。 对于局部比
对，所述Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol
147(1)；195-7)。
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT：使用蛋白质序列
或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。 如本领域技术人员显而易见，可以进
行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的
替代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸
或氨基酸序列范围或选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。 对于局部比
对，所述Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol
147(1)；195-7)。
[0227] 另外，bHLH6样多肽(至少以它们的天然形式)一般具有DNA结合活性。 用于测定DNA结合活性的工具和技术在本领域是熟知的。 另外，如本发明中所示的，当
bHLH6样蛋白(如SEQ ID NO：2)在稻中过量表达时，产生具有增强的产量相关性状、
尤其出苗萌发势和/或每株圆锥花序增加的花数的植物。 其他生物测定在Dombrecht等
人(Plant Cell 19，2225-2245，2007)。 在实施例部分提供其他细节。
bHLH6样蛋白(如SEQ ID NO：2)在稻中过量表达时，产生具有增强的产量相关性状、
尤其出苗萌发势和/或每株圆锥花序增加的花数的植物。 其他生物测定在Dombrecht等
人(Plant Cell 19，2225-2245，2007)。 在实施例部分提供其他细节。
[0228] 本发明通过用SEQ ID NO：1所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：2的多肽序列。 但是，本发明的实施不限于这些序列；本发
明的方法可以有利地使用任意编码bHLH6样的核酸或如本文中定义的bHLH6样多肽实
施。
明的方法可以有利地使用任意编码bHLH6样的核酸或如本文中定义的bHLH6样多肽实
施。
[0229] 编码bHLH6样多肽的核酸的例子在本文实施例1的表A1中给出。此类核酸用于实施本发明的方法中。在实施例1的表A1中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：2所表
示的bHLH6样多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁
系同源物”如本文中定义。 其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast
搜索轻易地鉴定。 通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列
(例如使用实施例1的表A1中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的
NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使
用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默
认值)。 可以任选地筛选BLAST结果。 筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来
自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生
(在查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的情况下，第二BLAST因而将针对拟南
芥(Arabidopsis thaliana)序列进行)。 随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。 若
来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同
源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST
中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并
且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
示的bHLH6样多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁
系同源物”如本文中定义。 其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast
搜索轻易地鉴定。 通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列
(例如使用实施例1的表A1中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的
NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使
用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默
认值)。 可以任选地筛选BLAST结果。 筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来
自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生
(在查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的情况下，第二BLAST因而将针对拟南
芥(Arabidopsis thaliana)序列进行)。 随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。 若
来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同
源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST
中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并
且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
[0230] 高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。 E-值的计算是本领域熟知的。 除了E-值外，比较过程
也通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长
度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，
随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系同源物。
也通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长
度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，
随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系同源物。
[0231] 核酸变体也可以用于实施本发明的方法中。 此类变体的例子包括编码在实施例1的表A1中所给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍
生物”如本文中定义。 还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码在实施例1的表A1
中所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。 用于本发明
方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功
能活性。
生物”如本文中定义。 还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码在实施例1的表A1
中所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。 用于本发明
方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功
能活性。
[0232] 在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码bHLH6样多肽的核酸的部分、与编码bHLH6样多肽的核酸杂交的核酸、编码bHLH6样多肽的核酸的剪接变体、编
码bHLH6样多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码bHLH6样多肽的核酸的变
体。 术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中
所述。
码bHLH6样多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码bHLH6样多肽的核酸的变
体。 术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中
所述。
[0233] 编码bHLH6样多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括
在植物中导入并表达实施例1的表A1中给出的任一核酸序列的一部分或编码实施例1的
表A1中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
在植物中导入并表达实施例1的表A1中给出的任一核酸序列的一部分或编码实施例1的
表A1中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
[0234] 核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。 所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合
有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对于该
蛋白质部分所预测的多肽更大。
有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对于该
蛋白质部分所预测的多肽更大。
[0235] 在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的bHLH6样多肽，并且具有如实施例1的表A1中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。 优选地，此部分是在实
施例1的表A1中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例1的表A1中所给出的任
一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。 优选地，该部分的长度是至
少 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、
1800、1900、2000、2100、2200个连续核苷酸，所述连续核苷酸为实施例1的表A1中
给出的任一核酸序列或为编码在实施例1的表A1中所给出的任一氨基酸序列的直向同源
物或旁系同源物的核酸。 最优选地，该部分是SEQ IDNO：1的核酸的一部分。 优选
地，该部分编码氨基酸序列的片段，其中所述的氨基酸序列在构建进化系统树例如Li等
人(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所
表示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他组聚类。
施例1的表A1中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例1的表A1中所给出的任
一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。 优选地，该部分的长度是至
少 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、
1800、1900、2000、2100、2200个连续核苷酸，所述连续核苷酸为实施例1的表A1中
给出的任一核酸序列或为编码在实施例1的表A1中所给出的任一氨基酸序列的直向同源
物或旁系同源物的核酸。 最优选地，该部分是SEQ IDNO：1的核酸的一部分。 优选
地，该部分编码氨基酸序列的片段，其中所述的氨基酸序列在构建进化系统树例如Li等
人(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所
表示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他组聚类。
[0236] 在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如本文中定义的bHLH6样多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核
酸。
酸。
[0237] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与实施例1的表A1中给出的任一核酸杂交的核酸，或包括在植物中导入并表
达这样的核酸，其中所述核酸能够与编码在实施例1的表A1中给出的任意核酸序列的直
向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
达这样的核酸，其中所述核酸能够与编码在实施例1的表A1中给出的任意核酸序列的直
向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
[0238] 在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的bHLH6样多肽，其具有如实施例1的表A1中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能
够与实施例1的表A1中给出的任一核酸或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的
一部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与核酸杂交，其中所述的核酸编码在实施
例1的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序
列能够与如SEQ ID NO：1所表示的核酸或与其一部分杂交。
够与实施例1的表A1中给出的任一核酸或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的
一部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与核酸杂交，其中所述的核酸编码在实施
例1的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序
列能够与如SEQ ID NO：1所表示的核酸或与其一部分杂交。
[0239] 优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列是全长的且在构建进化系统树例如Li等人(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用
时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他
组聚类。
时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他
组聚类。
[0240] 在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的bHLH6样多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
[0241] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A1中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码实施例1的表A1中所
给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
[0242] 优选的剪接变体是由SEQ ID NO：1所表示的核酸的剪接变体，或是编码SEQID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。 优选地，由该剪接变体编码
的氨基酸序列在构建进化系统树例如Li等人(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用
时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他
组聚类。
的氨基酸序列在构建进化系统树例如Li等人(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用
时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他
组聚类。
[0243] 在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义bHLH6样多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。
[0244] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A1中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中导入并表达编码
在实施例1的表A1中所给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核
酸的等位变体。
在实施例1的表A1中所给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核
酸的等位变体。
[0245] 由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽具有如SEQ ID NO：2的bHLH6样多肽和实施例1的表A1中所述任意氨基酸基本上相同的生物学活性。 等位变体存在于
自然界中，并且在本发明的方法中包括这些天然等位基因的用途。 优选地，所述等位变
体是SEQ ID NO：1的等位变体或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核
酸的等位变体。 优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列在构建进化系统树例如Li等人
(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所表
示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他组聚类。
自然界中，并且在本发明的方法中包括这些天然等位基因的用途。 优选地，所述等位变
体是SEQ ID NO：1的等位变体或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核
酸的等位变体。 优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列在构建进化系统树例如Li等人
(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用时，在亚组N(其包含由SEQ ID NO：2所表
示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他组聚类。
[0246] 基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的bHLH6样多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文中定义。 优化bHLH蛋白质的例子由Pattanaik等人
(BBA1759，308-318，2006)提供。 该方法可以用于选择优化的bHLH6样蛋白质用于增
强植物中的产量相关性状。
(BBA1759，308-318，2006)提供。 该方法可以用于选择优化的bHLH6样蛋白质用于增
强植物中的产量相关性状。
[0247] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达在实施例1的表A1中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中导入并表达核
酸的变体，所述的核酸编码在实施例1的表A1中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、
旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
酸的变体，所述的核酸编码在实施例1的表A1中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、
旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
[0248] 优选地，由通过基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列在构建进化系统树例如Li等人(2006)中的图6所描述的进化系统树中使用时，在亚组N(其包含由SEQ
ID NO：2所表示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他组聚类。
ID NO：2所表示的氨基酸序列)中聚类，而不与任何其他组聚类。
[0249] 另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。 几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编辑)。
[0250] 编码bHLH6样多肽的核酸可以衍生自任何天然来源或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。 优选地，编
码bHLH6样多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自双子叶植物，更优选地来自十字花
科(Brassicaceae)，最优选地该核酸来自拟南芥。
码bHLH6样多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自双子叶植物，更优选地来自十字花
科(Brassicaceae)，最优选地该核酸来自拟南芥。
[0251] 本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。 尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的产量、尤其提高的种子产量的植物。 术
语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0252] 本文中对增强的产量相关性状的称谓意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获的)部分和/或(可收获的)地下部分。尤
其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量
而言，具有提高的种子产量的植物。 应当注意增强的产量相关性状不包括对渗透胁迫增
加的抗性，增加的氧化胁迫抗性或增加的对昆虫的抗性。
其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量
而言，具有提高的种子产量的植物。 应当注意增强的产量相关性状不包括对渗透胁迫增
加的抗性，增加的氧化胁迫抗性或增加的对昆虫的抗性。
[0253] 以谷物为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物穗数的提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/直
径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻为
例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每平方米植物数、每株植物
的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述为饱满种
子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提
高、千粒重提高及其他。
径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻为
例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每平方米植物数、每株植物
的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述为饱满种
子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提
高、千粒重提高及其他。
[0254] 本发明提供了用于相对于对照植物提高植物的产量、尤其种子产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的bHLH6样多肽的核酸表达。
[0255] 由于本发明的转基因植物具有提高的产量，故相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其生活周期的至少部分期间)表现提高的生长
速率。
速率。
[0256] 提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整个植物。具有提到的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。 植物的生活周
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每平方米一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即
在一年中)提高)。 生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛
的地理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(旱季)或在收获时期(晚
季)的不利环境条件决定。 这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通
过从生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大
小所花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每平方米一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即
在一年中)提高)。 生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛
的地理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(旱季)或在收获时期(晚
季)的不利环境条件决定。 这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通
过从生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大
小所花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
[0257] 根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的生长速率的植物。 因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，所
述方法包括在植物中调节编码如本文中定义的bHLH6样多肽的核酸表达。
述方法包括在植物中调节编码如本文中定义的bHLH6样多肽的核酸表达。
[0258] 与对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，产量和/或生长速率的提高均出现。 植物一般通过生长得更慢而应答于胁迫暴
露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一方面，轻度胁迫在本文中定
义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不
能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫
植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于
14％、13％、12％、11％或10％或更低。 由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的
进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对
于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环
境)胁迫。 非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁
迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、
氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。 生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、
线虫和昆虫引起的那些胁迫。
露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一方面，轻度胁迫在本文中定
义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不
能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫
植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于
14％、13％、12％、11％或10％或更低。 由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的
进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对
于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环
境)胁迫。 非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁
迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、
氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。 生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、
线虫和昆虫引起的那些胁迫。
[0259] 具体而言，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件开展以产生相对于对照植物具有提高的产量的植物。 如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，
非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分
子变化。 干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导
生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁
迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为
渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱
胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常
激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼
容性溶质和生长停滞。 如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些
环境条件。 本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分
子变化。 干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导
生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁
迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为
渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱
胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常
激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼
容性溶质和生长停滞。 如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些
环境条件。 本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
[0260] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物提高的产量。 因此，根据本发明，提供了用于在非胁
迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括调节植物中
编码bHLH6样多肽的核酸表达。
迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括调节植物中
编码bHLH6样多肽的核酸表达。
[0261] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在营养缺乏条件下、尤其在缺氮条件下培育的植物提高的产量。 因此，根据本发明，提供了用于在营
养缺乏条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括调节植物中编码bHLH6样多
肽的核酸表达。 营养缺乏可以因营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、
镁、锰、铁和硼等缺少所致。
养缺乏条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括调节植物中编码bHLH6样多
肽的核酸表达。 营养缺乏可以因营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、
镁、锰、铁和硼等缺少所致。
[0262] 本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物或其部分包含编码如上文定义的bHLH6样多肽的核酸转基因。
[0263] 本发明也提供了基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码bHLH6样多肽的核酸。 所述基因构建体可以插入适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目的
基因的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本
发明方法中的用途。
基因的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本
发明方法中的用途。
[0264] 更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
[0265] (a)编码如上文定义的bHLH6样多肽的核酸；
[0266] (b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0267] (c)转录终止序列。
[0268] 优选地，编码bHLH6样多肽的核酸如上文定义。 术语“调控序列”和“终止序列”如本文中的定义。
[0269] 用包含任意上述核酸的载体转化植物。 技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。 该目的序列有效地
与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
[0270] 有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来驱动所述核酸序列的表达。植物来源的组成型启动子是在所述方法中特别有用的。 优选地，该组成型
启动子也是遍在启动子。 对于多种启动子类型的定义，见本文中的“定义”部分。 优
选地，植物组成型启动子是中等强度的启动子并且比CaMV 35S启动子强度要低。
启动子也是遍在启动子。 对于多种启动子类型的定义，见本文中的“定义”部分。 优
选地，植物组成型启动子是中等强度的启动子并且比CaMV 35S启动子强度要低。
[0271] 应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：1表示的编码bHLH6样多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码bHLH6样多肽的核酸在受组成型启动子驱动时的表达。
[0272] 组成型启动子优选地是GOS2启动子，优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：12相似的核酸序列表示，最优选地该组
成型启动子如SEQ ID NO：12所表示。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定
义”部分中的表2a。
成型启动子如SEQ ID NO：12所表示。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定
义”部分中的表2a。
[0273] 任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。 优选地，该构建体包含表达盒，所述表达盒与SEQ ID NO：56基本相似或相同，包含GOS2启动
子，以及编码所述bHLH6样多肽的核酸。
子，以及编码所述bHLH6样多肽的核酸。
[0274] 额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。 本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以
添加至5’非翻译区(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。(除
启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控
序列可以是蛋白质/或RNA稳定元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻
易获得。
添加至5’非翻译区(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。(除
启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控
序列可以是蛋白质/或RNA稳定元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻
易获得。
[0275] 本发明的基因构建体还可以包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。 一个例子是当需要基因构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
[0276] 为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报道基因)。因此，所述基因构建体可以任选地
包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再需要
所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本领域
已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再需要
所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本领域
已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
[0277] 本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中导入并表达编码如上文所定义的
bHLH6样多肽的任意核酸。
bHLH6样多肽的任意核酸。
[0278] 更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增加的增强产量相关性状、尤其提高的出苗萌发势和/或种子产量，其中所述方法包括：
[0279] (i)在植物或植物细胞中导入并表达编码bHLH6样多肽的核酸；和
[0280] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
[0281] (i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的bHLH6样多肽的任意核酸。
[0282] 所述核酸可以直接导入植物细胞或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。 根据本发明的优选特征，该核酸优选地通过转化作用导入植物。 术
语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0283] 遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的全部方法再生。 合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或 和Willmitzer的出版物中找到。
[0284] 通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
[0285] 在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析对目的基因的存在性、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，新导入的DNA的
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
[0286] 产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
[0287] 本发明明确地扩展至由本文中所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。 本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
[0288] 本发明也包括含有编码如本文以上所定义bHLH6样多肽的分离核酸的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。 对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或
构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植
物。
构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植
物。
[0289] 本发明的方法有利地适用于任意植物。 在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。 作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、油菜、亚麻、棉
花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包括
甘蔗。更优选地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、
谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、
黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。 作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、油菜、亚麻、棉
花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包括
甘蔗。更优选地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、
谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、
黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
[0290] 本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。 本发明进一步涉及了衍生自、优选直接衍生自此种植物的可
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
[0291] 根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。 用于增加核酸或基因或基因产物表达的方法是本领域中充分经文献报道的并且在定义部分中提供了例子。
[0292] 如上所述，用于调节编码bHLH6样多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码bHLH6样多肽的核酸；但是，实施本方法的效果，即增强产量相关性
状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内的其他熟知
技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内的其他熟知
技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
[0293] 本发明也包括编码如本文中所述bHLH6样多肽的核酸的用途，和这些bHLH6样多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。
[0294] 编码本文中所述bHLH6样多肽的核酸或bHLH6样多肽自身可以用于育种程序中，在所述育种程序中鉴定到可以遗传地与编码bHLH6样多肽的基因连锁的DNA标记。
所述核酸/基因或bHLH6样多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记
随后可以在育种程序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关
性状的植物。
所述核酸/基因或bHLH6样多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记
随后可以在育种程序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关
性状的植物。
[0295] 编码bHLH6样多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而导入等位变
异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随
后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致产量提高的
序列的优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长
性能而实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴定到优异
等位变体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随
后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致产量提高的
序列的优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长
性能而实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴定到优异
等位变体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
[0296] 编码bHLH6样多肽的核酸也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其一部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。 此类信息可以用于植物育种
中，以开发具有所希望表型的品系。编码bHLH6样多肽的核酸的这种用途仅需要具有至
少15个核苷酸长度的核酸序列。 编码bHLH6样多肽的核酸可以用作限制性片段长度多
态性(RFLP)标记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch
EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码bHLH6样
多肽的核酸探测。 所得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人
(1987)Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸可以用来探测
含有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组
个体代表具有定义的遗传杂交的亲代和子代。DNA多态性的分离是明显的并用来计算编
码bHLH6样多肽的核酸在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)
Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
中，以开发具有所希望表型的品系。编码bHLH6样多肽的核酸的这种用途仅需要具有至
少15个核苷酸长度的核酸序列。 编码bHLH6样多肽的核酸可以用作限制性片段长度多
态性(RFLP)标记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch
EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码bHLH6样
多肽的核酸探测。 所得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人
(1987)Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸可以用来探测
含有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组
个体代表具有定义的遗传杂交的亲代和子代。DNA多态性的分离是明显的并用来计算编
码bHLH6样多肽的核酸在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)
Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
[0297] 在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。 许多出版物描述了使用以上概述的方法
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
[0298] 所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996， 第
319-346页及其中引用的参考文献)。
319-346页及其中引用的参考文献)。
[0299] 在另一个实施方案中，所述核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。 尽管当前的FISH作图法支持使用大的
克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的
改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的
改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
[0300] 用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。 方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、
PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、等
位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用
的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图的方
法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序列差
异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、等
位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用
的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图的方
法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序列差
异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
[0301] 如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状的植物。 这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
[0302] 在一个实施方案中，本发明涉及总结如下的主题：
[0303] 条目1：在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码bHLH6样多肽的核酸的表达，其中所述bHLH6样多肽包含HLH结构域。
[0304] 条目2：根据条目1的方法，其中所述bHLH6-样多肽包含一个或多个下述基序：
[0305] 基序1(SEQ ID NO：3)，
[0306] 基序2(SEQ ID NO：4)，
[0307] 基序3：(SEQ ID NO：5)
[0308] 基序7(SEQ ID NO：9)或与SEQ ID NO：9具有至少80％序列同一性的序列。
[0309] 条目3：根据条目1或2的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达编码bHLH6样多肽的核酸来实现。
[0310] 条目4：根据任何前述条目的方法，其中所述编码bHLH6样多肽的核酸编码表A1中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
[0311] 条目5：根据任何前述条目的方法，其中所述核酸序列编码表A1中所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0312] 条目6：根据任何前述条目的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的产量、优选提高的出苗萌发势和/或提高的种子产量。
[0313] 条目7：根据条目1至6任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
[0314] 条目8：根据条目3至7中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
[0315] 条目9：根据任何前述条目的方法，其中所述编码bHLH6样多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae)，更优选来自拟
南芥属(Arabidopsis)，最优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
南芥属(Arabidopsis)，最优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0316] 条目10：植物或其部分，其包括种子，通过根据任何前述条目的方法可获得，其中所述植物或其部分包含编码bHLH6样多肽的重组核酸。
[0317] 条目11：构建体，其包含
[0318] (a)编码在条目1或2中定义的bHLH6样多肽的核酸；
[0319] (b)一个或多个调控序列，其能够驱动(a)的核酸序列的表达；以及任选地
[0320] (c)转录终止序列。
[0321] 条目12：根据条目11的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
[0322] 条目13：根据条目11或12的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的出苗萌发势和/或提高的种子产量的植物。
[0323] 条目14：用根据条目10或11的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0324] 条目15：用于产生转基因植物的方法，所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的生物量和/或提高的种子产量，所述方法包括：
[0325] (i)在植物中导入和表达编码如条目1或2中所定义的bHLH6样多肽的核酸；和
[0326] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
[0327] 条目16：相对于对照植物具有提高的产量、特别是提高的生物量和/或提高的种子产量的转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物获得
自编码如条目1或2所定义的bHLH6样多肽的核酸的调节的表达。
自编码如条目1或2所定义的bHLH6样多肽的核酸的调节的表达。
[0328] 条目17：根据条目10、14或16的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子
(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦(emmer)、斯佩尔特小麦
(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和
燕麦。
(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦(emmer)、斯佩尔特小麦
(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和
燕麦。
[0329] 条目18：根据条目17的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
[0330] 条目19：来自根据条目17的植物和/或来自根据条目19的植物可收获部分的产品。
[0331] 条目20：编码bHLH6样多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高产量，特别是提高种子产量和/或枝条生物量中的用途。
[0332] 在本发明的另一个实施方案中，现在发现在植物中调节编码GRP多肽的核酸序列的表达提供了具有相对于对照植物增强的产量相关性状的植物，其中所述GRP多肽是
RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽。 根据第一个实施方案，本发明提供了在植物中
相对于对照植物增强产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节编码GRP多肽的
核酸序列的表达，其中所述GRP多肽是RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/
FtsJ多肽)。
RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽。 根据第一个实施方案，本发明提供了在植物中
相对于对照植物增强产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节编码GRP多肽的
核酸序列的表达，其中所述GRP多肽是RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/
FtsJ多肽)。
[0333] 用于调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列表达的优选的方法是通过在植物中导入和表达编码GRP多肽的核酸序列。
[0334] 在一个实施方案中，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任意称谓意指如本文中定义的GRP多肽。在同一实施方案中，下文对“在本发明方法中有用的核酸”
的任意称谓意指能够编码这种GRP多肽的核酸序列。 在一个实施方案中，待导入植物
(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸序列是编码现在将描述的蛋白质类型的任意
核酸序列，下文也称作“GRP核酸”或“GRP基因”。
的任意称谓意指能够编码这种GRP多肽的核酸序列。 在一个实施方案中，待导入植物
(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸序列是编码现在将描述的蛋白质类型的任意
核酸序列，下文也称作“GRP核酸”或“GRP基因”。
[0335] 在一个实施方案中，本文定义的“GRP多肽”是指由SEQ ID NO：58、由SEQID NO：60所表示的蛋白质，以及其同源物(直向同源物和旁系同源物)。 实施例1的
表A2在本文中显示了此类直向同源物和旁系同源物。
表A2在本文中显示了此类直向同源物和旁系同源物。
[0336] 优选地，SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60的同源物具有核糖体RNA甲基转移酶RrmJ/FtsJ结构域(InterPro进入(entry)IPR002877和IPR015507；Pfam进入PF01728；
PANTHER进入PTHR10920)。
PANTHER进入PTHR10920)。
[0337] 可选地或另外地，本文定义的“GRP多肽”涉及任何多肽，所述多肽与SEQ IDNO：58或SEQ ID NO：60所表示的GRP多肽或者与本文实施例1的表A2中所给出的任
何多肽序列以优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％、98％、99％或更多的多肽序列同一性。
何多肽序列以优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％、98％、99％或更多的多肽序列同一性。
[0338] 在一个实施方案中，本发明的方法使用部分GRP多肽，其中GRP多肽是RrmJ/FtsJ多肽。 可以通过存在数个熟知的特征(见上)之一或多个来鉴定GRP多肽。 鉴定
GRP多肽时，本领域的技术人员可以容易地使用常规技术衍生可以用于实施本发明方法
的相应的编码部分GRP的核酸序列。
GRP多肽时，本领域的技术人员可以容易地使用常规技术衍生可以用于实施本发明方法
的相应的编码部分GRP的核酸序列。
[0339] 术语“结构域”和“基序”在本文中的“定义”部分定义。 存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
[0340] 用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。 GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸序列
或多肽序列范围或在选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸序列
或多肽序列范围或在选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
[0341] 此外，GRP多肽，在涉及到SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60以及其同源物时，通常具有在核糖体的氨酰(A)1-位点中的第U2552位处甲基化23S核糖体RNA的能
力，这仅在当23S rRNA存在于50S核糖体亚基中时。 用于测定rRNA甲基转移酶活性
的工具和技术是本领域熟知的，例如在Hager等人(2004)J Bacteriol 186(19)：6634-6642
中。
力，这仅在当23S rRNA存在于50S核糖体亚基中时。 用于测定rRNA甲基转移酶活性
的工具和技术是本领域熟知的，例如在Hager等人(2004)J Bacteriol 186(19)：6634-6642
中。
[0342] 本发明通过用SEQ ID NO：57所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：58的多肽序列。但是，本发明的实施不限于这些序列；本
发明的方法可以有利地使用任意编码GRP的核酸序列或如本文中定义的GRP多肽实施。
发明的方法可以有利地使用任意编码GRP的核酸序列或如本文中定义的GRP多肽实施。
[0343] 编码GRP多肽的核酸的例子在本领域已知的数据库中发现。 此类核酸用于实施本发明的方法中。 直向同源物和旁系同源物(术语“直向同源物”和“旁系同源
物”如本文中定义)可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。 通常，这包括第
一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用SEQ ID NO：58或SEQ
ID NO：60)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。 当从核
苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质
序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。 可以任选地筛选BLAST
结果。 筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜
索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：57、
SEQ IDNO：58、SEQ IDNO：59或SEQ ID NO：60的情况下，第二BLAST因而将针对
烟草(Nicotiana tabacum)序列进行)。 随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。 若
来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同
源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST
中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并
且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
物”如本文中定义)可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。 通常，这包括第
一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用SEQ ID NO：58或SEQ
ID NO：60)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。 当从核
苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质
序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。 可以任选地筛选BLAST
结果。 筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜
索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：57、
SEQ IDNO：58、SEQ IDNO：59或SEQ ID NO：60的情况下，第二BLAST因而将针对
烟草(Nicotiana tabacum)序列进行)。 随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。 若
来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同
源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST
中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并
且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
[0344] 高阶位命中是具有低E-值的那些命中。 E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。 E-值的计算是本领域熟知的。 除了E-值外，比较
过程也通过同一性百分数评分。 同一性百分数指两个所比较的核酸序列(或多肽)序列
之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。 在大型家族的情况下，可以使
用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系
同源物。
过程也通过同一性百分数评分。 同一性百分数指两个所比较的核酸序列(或多肽)序列
之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。 在大型家族的情况下，可以使
用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系
同源物。
[0345] 编码SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60的同源物和衍生物的核酸变体也可以用于实施本发明的方法中，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。 还用于本发明
方法中的是这样的核酸，其编码SEQ ID NO：58或SEQ IDNO：60的直向同源物或旁系
同源物的同源物和衍生物。 用于本发明方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋
白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。
方法中的是这样的核酸，其编码SEQ ID NO：58或SEQ IDNO：60的直向同源物或旁系
同源物的同源物和衍生物。 用于本发明方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋
白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。
[0346] 在实施本发明方法中有用的其他核酸序列变体包括编码GRP多肽的核酸的部分、与编码GRP多肽的核酸杂交的核酸、编码GRP多肽的核酸的剪接变体、编码GRP多
肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码GRP多肽的核酸的变体。术语“杂交序
列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中所述。
肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码GRP多肽的核酸的变体。术语“杂交序
列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中所述。
[0347] 编码GRP多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植
物中导入并表达SEQ ID NO：57的一部分或SEQID：59的一部分或编码SEQ ID NO：60
的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的一部分。
物中导入并表达SEQ ID NO：57的一部分或SEQID：59的一部分或编码SEQ ID NO：60
的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的一部分。
[0348] 核酸序列的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。 所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生
组合有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对
于该蛋白质部分所预测的多肽更大。
组合有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对
于该蛋白质部分所预测的多肽更大。
[0349] 在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的GRP多肽，并且具有如SEQ IDNO：58或SEQ ID NO：60中所给出多肽序列基本上相同的生物学活性。 优选地，此部
分是在SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59中给出的核酸的一部分，或是编码在SEQ ID
NO：58或SEQ ID NO：60中所给出的多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列
的一部分。优选地，该部分的长度是至少400、450、500、550、600、650、700、750个
连续核苷酸，所述连续核苷酸属于SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59，或属于编码SEQ
ID NO：58或SEQ ID NO：60的直向同源物或旁系同源物的核酸序列。最优选地，该部
分是SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59的核酸序列的一部分。
分是在SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59中给出的核酸的一部分，或是编码在SEQ ID
NO：58或SEQ ID NO：60中所给出的多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列
的一部分。优选地，该部分的长度是至少400、450、500、550、600、650、700、750个
连续核苷酸，所述连续核苷酸属于SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59，或属于编码SEQ
ID NO：58或SEQ ID NO：60的直向同源物或旁系同源物的核酸序列。最优选地，该部
分是SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59的核酸序列的一部分。
[0350] 在本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列或与如本文中定义的部分杂交
的核酸序列。
的核酸序列。
[0351] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与SEQ ID NO：57或与SEQ ID NO：59杂交的核酸序列，或包括在植物中导
入并表达能够与编码SEQ ID NO：58或SEQ IDNO：60的直向同源物、旁系同源物或同
源物的核酸序列杂交的核酸序列。
入并表达能够与编码SEQ ID NO：58或SEQ IDNO：60的直向同源物、旁系同源物或同
源物的核酸序列杂交的核酸序列。
[0352] 在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的GRP多肽，具有如SEQIDNO：58中所给出多肽序列基本上相同的生物学活性。 优选地，该杂交序列能够与SEQ
ID NO：57或SEQ ID NO：59或与任何这些序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定
义，或所述杂交序列能够与编码SEQID NO：58或SEQ ID NO：60的直向同源物或旁系
同源物的核酸序列杂交。
ID NO：57或SEQ ID NO：59或与任何这些序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定
义，或所述杂交序列能够与编码SEQID NO：58或SEQ ID NO：60的直向同源物或旁系
同源物的核酸序列杂交。
[0353] 在本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是编码如上文所定义的GRP多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
[0354] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59的剪接变体或编码SEQID NO：58或SEQ ID
NO：60的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接变体。
NO：60的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接变体。
[0355] 在实施本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是编码如上文所定义GRP多肽的核酸序列的等位变体，等位变体如本文中定义。
[0356] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59的等位变体，或包括在植物中导入并表达核酸
序列的等位变体，其中所述核酸序列编码由SEQ IDNO：58或SEQ ID NO：60表示的多
肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
序列的等位变体，其中所述核酸序列编码由SEQ IDNO：58或SEQ ID NO：60表示的多
肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
[0357] 本发明方法中有用的等位变体具有与SEQ ID NO：58或SEQ IDNO：60的GRP多肽基本上相同的生物学活性。 等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括
这些天然等位基因的用途。 基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的GRP
多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
这些天然等位基因的用途。 基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的GRP
多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
[0358] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59的变体，或包括在植物中导入并表达编码SEQ
ID NO：58或SEQ ID NO：60的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，
其中所述变体核酸序列通过基因改组获得。
ID NO：58或SEQ ID NO：60的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，
其中所述变体核酸序列通过基因改组获得。
[0359] 另外，核酸序列变体也可以通过位点定向诱变获得。 几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编
辑)。
辑)。
[0360] 编码GRP多肽的核酸可以衍生自任何天然来源或人工来源。 该核酸序列可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。 优选地，编
码GRP多肽的核酸序列来自植物。 在SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59的情况下，编
码GRP多肽的核酸序列优选地来自双子叶植物，更优选地来自茄科(Solanaceae)，该核
酸序列最优选地来自烟草(Nicotiana tabacum)。
码GRP多肽的核酸序列来自植物。 在SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59的情况下，编
码GRP多肽的核酸序列优选地来自双子叶植物，更优选地来自茄科(Solanaceae)，该核
酸序列最优选地来自烟草(Nicotiana tabacum)。
[0361] 本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。 尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的早期萌发势和提高的产量、尤其提高的
生物量和提高的种子产量的植物。 术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部
分中更详细地描述。
生物量和提高的种子产量的植物。 术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部
分中更详细地描述。
[0362] 本文中对增强的产量相关性状的称谓意指早期萌发势和/或植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获的)部分和/或(可收获
的)地下部分。 尤其，此类可收获部分是生物量和/或种子，并且本发明方法的实施产
生了相对于对照植物的早期萌发势、生物量或种子产量而言，具有提高的早期萌发势、
生物量或种子产量的植物。
的)地下部分。 尤其，此类可收获部分是生物量和/或种子，并且本发明方法的实施产
生了相对于对照植物的早期萌发势、生物量或种子产量而言，具有提高的早期萌发势、
生物量或种子产量的植物。
[0363] 以谷物为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每公顷或英亩已建立的植物数目增加、每株植物穗数的提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
[0364] 本发明提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状、尤其生物量和/或种子产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列
表达，优选地增加该核酸表达。
表达，优选地增加该核酸表达。
[0365] 由于本发明的转基因植物具有增强的产量相关性状，故相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其生活周期的至少部分期间)表现提
高的生长速率。
高的生长速率。
[0366] 提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整个植物。具有提到的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。 植物的生活周
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在
一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地
理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)
的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通过从
生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所
花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在
一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地
理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)
的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通过从
生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所
花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
[0367] 根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的生长速率的植物。 因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，所
述方法包括在植物中调节、优选地提高编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列表达。
述方法包括在植物中调节、优选地提高编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列表达。
[0368] 与对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，出现产量相关性状的增强(产量和/或生长速率的提高)。植物一般通过生长得
更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一方面，
轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全
停止生长，但同时不能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发
明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或
15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施
肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由轻度胁
迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。 轻度胁迫是植物所暴露的常见生物
胁迫和/或非生物(环境)胁迫。 非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁
迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。 非生物胁迫可以是因水胁迫(尤
其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体
如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。 本文中使用的术语“非胁迫”条件是那些
环境条件，其允许植物的最佳生长。 本领域的技术人员已知给定的地点的正常土壤条件
和气候条件。
更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一方面，
轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全
停止生长，但同时不能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发
明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或
15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施
肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由轻度胁
迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。 轻度胁迫是植物所暴露的常见生物
胁迫和/或非生物(环境)胁迫。 非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁
迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。 非生物胁迫可以是因水胁迫(尤
其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体
如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。 本文中使用的术语“非胁迫”条件是那些
环境条件，其允许植物的最佳生长。 本领域的技术人员已知给定的地点的正常土壤条件
和气候条件。
[0369] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物增强的产量相关性状。 因此，根据本发明，提供了用
于在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方
法包括在植物中调节，优选增加编码GRP多肽的核酸序列的表达。
于在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方
法包括在植物中调节，优选增加编码GRP多肽的核酸序列的表达。
[0370] 根据本发明方法的实施产生在非生物胁迫条件下生长的植物，其相对于在可比较胁迫条件下生长的对照植物而言具有增强的产量相关性状，优选增强的种子产量相关
性状。 如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地
影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。 干旱、盐度、极端温
度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。 Rabbani
等人(PlantPhysiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的
“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和
离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋
白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细
胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。 由于多样的
环境胁迫激活相似的途径，本发明干旱胁迫的例子不应当被视为限于干旱胁迫，而更应
当被视为指示了下述的视窗：上述定义的GRP多肽一般在非生物胁迫中相对于在可比较
胁迫条件中生长的对照植物增强产量相关性状，优选增强种子产量相关性状中的参与。
性状。 如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地
影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。 干旱、盐度、极端温
度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。 Rabbani
等人(PlantPhysiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的
“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和
离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋
白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细
胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。 由于多样的
环境胁迫激活相似的途径，本发明干旱胁迫的例子不应当被视为限于干旱胁迫，而更应
当被视为指示了下述的视窗：上述定义的GRP多肽一般在非生物胁迫中相对于在可比较
胁迫条件中生长的对照植物增强产量相关性状，优选增强种子产量相关性状中的参与。
[0371] 如本文中定义的术语“非生物胁迫”意指以下任意一项或多项：水胁迫(因干旱或过量的水所致)、缺氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(因热、寒冷或冰冻温度所致)、化
学毒性胁迫和氧化胁迫。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自
水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，所述水胁迫是干旱胁迫。术语“盐胁
迫”不限于常见盐(NaCl)，不过可以是由NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等中一种或
多种盐引起的任意胁迫。
学毒性胁迫和氧化胁迫。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自
水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，所述水胁迫是干旱胁迫。术语“盐胁
迫”不限于常见盐(NaCl)，不过可以是由NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等中一种或
多种盐引起的任意胁迫。
[0372] 相对于在可比较胁迫条件下培育的对照植物，本发明方法的实施产生这样的植物，所述植物在非生物胁迫条件下具有增强的产量相关性状、优选增强的种子产量相关
性状。 因此，根据本发明，提供了用于在非生物胁迫条件下培育的植物中增强产量相关
性状、优选增强种子产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码GRP多肽的核
酸序列表达。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自以下一个或
多个胁迫：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
性状。 因此，根据本发明，提供了用于在非生物胁迫条件下培育的植物中增强产量相关
性状、优选增强种子产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码GRP多肽的核
酸序列表达。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自以下一个或
多个胁迫：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
[0373] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在营养缺乏条件下、尤其在缺氮条件下培育的植物增强的产量相关性状。 因此，根据本发明，提供了
用于在营养缺乏条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法包括调节，优
选增加植物中编码GRP多肽的核酸序列的表达。 营养缺乏可以因营养物如氮、磷酸盐和
其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等缺少所致。
用于在营养缺乏条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法包括调节，优
选增加植物中编码GRP多肽的核酸序列的表达。 营养缺乏可以因营养物如氮、磷酸盐和
其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等缺少所致。
[0374] 本发明包括通过本发明方法可获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞。所述植物、其部分或植物细胞包含编码如上文定义的GRP多肽的核酸转基因。
[0375] 本发明也提供了基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码GRP多肽的核酸。 所述基因构建体可以插入适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目的基因
的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明
方法中的用途。
的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明
方法中的用途。
[0376] 更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
[0377] (a)编码如上文定义的GRP多肽的核酸序列；
[0378] (b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0379] (c)转录终止序列。
[0380] 优选地，编码GRP多肽的核酸序列如上文定义。 术语“调控序列”和“终止序列”如本文中的定义。
[0381] 用包含任意上述核酸的载体转化植物。 技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。 该目的序列有效地
与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
[0382] 有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或人工的，可以用来驱动所述核酸序列的表达。种子特异性启动子是在本发明方法中特别有用的。 对于多种启动子类型的
定义，见本文中的“定义”部分。
定义，见本文中的“定义”部分。
[0383] 应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：59表示的编码GRP多肽的核酸序列，本发明的应用也不限于编码GRP多肽的核酸序列在受种子特异性
启动子驱动时的表达。
启动子驱动时的表达。
[0384] 种子特异性启动子优选地是油质蛋白启动子，优选地是来自稻的油质蛋白启动子。还优选地，所述油质蛋白启动子由基本上与SEQ ID NO：91相似的核酸序列表示，
最优选地该油质蛋白启动子如SEQ ID NO：91所表示。对于种子特异性启动子的其他例
子，见本文中的“定义”部分的表2b。
最优选地该油质蛋白启动子如SEQ ID NO：91所表示。对于种子特异性启动子的其他例
子，见本文中的“定义”部分的表2b。
[0385] 任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。 额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。 本领域技术人员将知道可能适用于实施本发
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
[0386] 本发明的基因构建体还可以包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。 一个例子是当需要基因构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
[0387] 为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报道基因)。因此，所述基因构建体可以任选地
包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再需要
所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本领域
已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再需要
所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本领域
已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
[0388] 本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中导入并表达编码如上文所定义的
GRP多肽的任意核酸序列。
GRP多肽的任意核酸序列。
[0389] 更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强产量相关性状，其中所述方法包括：
[0390] (i)在植物、植物部分或植物细胞中导入并表达编码GRP多肽的核酸序列；和
[0391] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物、植物部分或植物细胞。
[0392] (i)的核酸序列可以是能够编码如本文中定义的GRP多肽的任意核酸。
[0393] 所述核酸序列可以直接导入植物细胞或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸序列优选地通过转化作用导入植
物。 术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
物。 术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0394] 遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的全部方法再生。 合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或 和Willmitzer的出版物中找到。
[0395] 通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
[0396] 在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析对目的基因的存在性、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，新导入的DNA的
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
[0397] 产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
[0398] 本发明明确地扩展至由本文中所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。 本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
[0399] 本发明也包括含有编码如本文以上所定义GRP多肽的分离核酸序列的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。 对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或
构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植
物。
构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植
物。
[0400] 本发明的方法有利地适用于任意植物。 在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。 作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃
薯和烟草。 还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包括甘蔗。 更优选
地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、
黑小麦、高粱和燕麦。
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。 作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃
薯和烟草。 还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包括甘蔗。 更优选
地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、
黑小麦、高粱和燕麦。
[0401] 本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。 本发明进一步涉及了衍生自、优选直接衍生自此种植物的可
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
[0402] 根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。 用于增加核酸或基因或基因产物表达的方法是本领域中充分经文献报道的并且在定义部分中提供了例子。
[0403] 如上所述，用于调节(优选地增加)编码GRP多肽的核酸序列表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码GRP多肽的核酸序列；但是，实施本方法的效果，即增
强产量相关性状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在
内的其他熟知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
强产量相关性状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在
内的其他熟知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
[0404] 本发明也包括编码如本文中所述GRP多肽的核酸的用途，和这些GRP多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。
[0405] 编码本文中所述GRP多肽的核酸或GRP多肽自身可以用于育种程序中，在所述育种程序中鉴定到可以遗传地与编码GRP多肽的基因连锁的DNA标记。 所述核酸/基
因或GRP多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程
序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
因或GRP多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程
序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
[0406] 编码GRP多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。 此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而导入等位变异；备
选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随后进行
等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致增强产量相关性状
的序列的优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生
长性能而实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴定到优
异等位变体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随后进行
等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致增强产量相关性状
的序列的优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生
长性能而实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴定到优
异等位变体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
[0407] 编码GRP多肽的核酸也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其一部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。 此类信息可以用于植物育种中，
以开发具有所希望表型的品系。编码GRP多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核
苷酸长度的核酸序列。 编码GRP多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标
记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis
T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码GRP的核酸探测。所得的条
带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：174-181)
进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制性核酸
内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的遗传杂
交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编码GRP多肽的核酸序列
在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：
314-331)。
以开发具有所希望表型的品系。编码GRP多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核
苷酸长度的核酸序列。 编码GRP多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标
记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis
T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码GRP的核酸探测。所得的条
带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：174-181)
进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制性核酸
内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的遗传杂
交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编码GRP多肽的核酸序列
在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：
314-331)。
[0408] 在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。 许多出版物描述了使用以上概述的方法
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
[0409] 所述核酸序列探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第
319-346页及其中引用的参考文献)。
319-346页及其中引用的参考文献)。
[0410] 在另一个实施方案中，所述核酸序列探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。 尽管当前的FISH作图法支持使用大
的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度
的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度
的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
[0411] 用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸而实施。 方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：
95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、
等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应
(Sokolov(1990)NucleicAcid sequence Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)
Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acidsequence Res.17：
6795-6807)。 对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或在引
物延伸反应中使用的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于
PCR遗传作图的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代
之间的DNA序列差异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、
等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应
(Sokolov(1990)NucleicAcid sequence Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)
Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acidsequence Res.17：
6795-6807)。 对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或在引
物延伸反应中使用的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于
PCR遗传作图的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代
之间的DNA序列差异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
[0412] 如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状的植物。 这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
[0413] 在本说明书中使用的术语“表A2”是为了指定表A2a和表A2b的内容。 本说明书中使用的术语“表A2a”是为了指定表A2a中的内容。 本说明书中使用的术语“表
A2b”是为了指定表A2b中的内容。 在一个优选的实施方案中，术语“表A2”意思是
表A2b。
A2b”是为了指定表A2b中的内容。 在一个优选的实施方案中，术语“表A2”意思是
表A2b。
[0414] 在一个实施方案中，本发明涉及总结如下的主题：
[0415] 条目21：在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码GRP的核酸序列的表达以及任选地选择具有增强的产量相关性状的植物，其中
所述GRP是RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/FtsJ多肽)。
所述GRP是RrmJ/FtsJ核糖体RNA甲基转移酶多肽(RrmJ/FtsJ多肽)。
[0416] 条目22：根据条目21的方法，其中所述GRP多肽包含核糖体RNA甲基转移酶RrmJ/FtsJ结构域(InterPro进入IPR002877和IPR015507；Pfam进入PF01728；PANTHER
进入PTHR10920)。
进入PTHR10920)。
[0417] 条目23：根据条目21或22的方法，其中所述GRP多肽与SEQ IDNO：58或SEQ ID NO：60所表示的GRP多肽或者与实施例1的表A2中所给出的任何多肽序列以
优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、98％、99％或更多的多肽序列同一性。
优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、98％、99％或更多的多肽序列同一性。
[0418] 条目24：根据条目21至23的任一项的方法，其中所述编码GRP多肽的核酸序列由下述表示：表A2中所给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其部分，或能够与实施例1
的表A2中给出的任一核酸序列SEQ ID NO杂交的序列。
的表A2中给出的任一核酸序列SEQ ID NO杂交的序列。
[0419] 条目25：根据任一前述条目的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达编码所述GRP多肽的核酸序列来实现。
[0420] 条目26：根据任一前述条目的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率以及提高的收获指
数。
数。
[0421] 条目27.根据任一前述条目的方法，其中所述调节的表达是增加的表达。
[0422] 条目28：根据任一前述条目的方法，其中所述核酸序列与种子特异性启动子，优选与油质蛋白启动子，最优选与来自稻的油质蛋白启动子有效连接。
[0423] 条目29：根据任一前述条目的方法，其中所述编码GRP多肽的核酸序列是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自茄科(Solanaceae)，更优选来自烟草
(Nicotiana tabacum)。
(Nicotiana tabacum)。
[0424] 条目30：包含选自以下的核酸序列的分离的核酸序列：
[0425] a)编码如SEQ ID NO：97、99、101和/或103和/或表A2b中所示的多肽的分离的核酸分子；
[0426] b)如SEQ ID NO：96、98、100和/或102和/或表A2b所示的分离的核酸分子；
[0427] c)分离的核酸分子，其作为遗传密码子简并性的结果，可以来自如表A2中所示的多肽序列并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
[0428] d)分离的核酸分子，其与多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性并且赋予相对于对
照植物增强的产量相关性状，所述多核苷酸包含表A2中所示的核酸分子；
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性并且赋予相对于对
照植物增强的产量相关性状，所述多核苷酸包含表A2中所示的核酸分子；
[0429] e)编码多肽并且赋予了相对于对照植物增强的产量相关性状的分离的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％、31％、
32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性；
32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性；
[0430] f)分离的核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
[0431] g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含图5中所示的共有序列或一个或多个多肽基序，并且所述分离的核酸分子优选地具有下述核酸分子所代表的活性，所述
核酸分子包含表A2中所示的多核苷酸；
核酸分子包含表A2中所示的多核苷酸；
[0432] h)编码多肽并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的分离的核酸分子，所述多肽具有如表A2中所示的蛋白质所代表的活性；
[0433] 以及
[0434] i)通过在严格杂交条件下用探针或用其片段筛选适当的核酸文库可获得的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)的核酸分子的互补序列，所述可获得的核酸分子具有与
(a)至(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt并且编码具有活性的多肽，所述活性由包含表A2中所示的多肽的
蛋白质所代表；
(a)至(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt并且编码具有活性的多肽，所述活性由包含表A2中所示的多肽的
蛋白质所代表；
[0435] 其中根据(a)至(i)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上不同于表A2a中所示的序列并且优选地编码下述蛋白质，所述蛋白质至少在一个或多个氨基酸上不同于表
A2a中所示的蛋白质序列。
A2a中所示的蛋白质序列。
[0436] 条目31：通过根据任一前述条目的方法可获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞，其中所述植物、其部分或植物细胞包含(优选根据条目30)编码GRP多肽的
核酸转基因。
核酸转基因。
[0437] 条目32：构建体，其包含
[0438] (i)编码如条目21至24所定义的GRP多肽或由条目30的核酸分子所编码的多肽的核酸序列；
[0439] (ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的调控序列；以及任选地
[0440] (iii)转录终止序列。
[0441] 条目33：根据条目32的构建体，其中所述调控序列之一是种子特异性启动子，优选油质蛋白启动子，最优选来自稻的油质蛋白启动子。
[0442] 条目34：根据条目32或33的任一项的构建体或根据条目30的核酸在制备下述植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，特别是提高
的种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率以及提高的收获指数。
的种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率以及提高的收获指数。
[0443] 条目35：用根据条目32或33的任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0444] 条目36：用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有相对于对照植物增强的产量相关性状，所述方法包括：
[0445] (i)在植物、植物部分或植物细胞中导入和表达核酸序列，所述核酸序列编码如条目21至24所定义的GRP多肽或者由条目30的核酸分子所编码的多肽；以及
[0446] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物、植物部分或植物细胞。
[0447] 条目37：相对于对照植物具有增强的产量相关性状、特别是提高的种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率以及提高的收获指数的转基因植物或来自所述转
基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物从下述产生：编码如条目21至24中所定义
的GRP多肽的核酸序列的增加的表达，或者条目30的核酸分子所编码的多肽的增加的表
达。
基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物从下述产生：编码如条目21至24中所定义
的GRP多肽的核酸序列的增加的表达，或者条目30的核酸分子所编码的多肽的增加的表
达。
[0448] 条目38：根据条目31、35或37的转基因植物，或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸
麦、黑小麦、高粱和燕麦。
麦、黑小麦、高粱和燕麦。
[0449] 条目39：根据条目38的包含编码GRP多肽的核酸序列的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为种子。
[0450] 条目40：来自根据条目38的植物和/或来自根据条目39的植物的可收获部分的产品。
[0451] 条目41：编码GRP多肽的核酸序列在植物中相对于对照植物增强产量相关性状、特别是在增加特别是提高种子产量、提高饱满种子数、提高种子饱满率、以及提高
收获指数中的用途。
收获指数中的用途。
[0452] 根据本发明的另一个实施方案，还提供了包含选自以下的多肽序列的分离的多肽：
[0453] (i)由条目30所表示的任一核酸所编码的氨基酸序列；
[0454] (ii)与(i)的氨基酸序列以优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的
氨基酸序列；
氨基酸序列；
[0455] (iii)上文(i)或(ii)中所给出的任何氨基酸序列的衍生物。
[0456] 在本发明的另一个实施方案中，现在发现在植物中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达提供了具有相对于对照植物增强的产量相关性状(优选增强的种子
产量相关性状)的植物，其中所述GRP多肽是碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽。
根据第一个实施方案，本发明提供了在植物中相对于对照植物增强产量相关性状(优选
增强的种子产量相关性状)的方法，所述方法包括在植物中调节(优选增加)编码GRP
多肽的核酸序列的表达，其中所述GRP多肽是碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽。
产量相关性状)的植物，其中所述GRP多肽是碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽。
根据第一个实施方案，本发明提供了在植物中相对于对照植物增强产量相关性状(优选
增强的种子产量相关性状)的方法，所述方法包括在植物中调节(优选增加)编码GRP
多肽的核酸序列的表达，其中所述GRP多肽是碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽。
[0457] 用于调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列表达的优选的方法是通过在植物中导入和表达编码GRP多肽的核酸序列。
[0458] 下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任意称谓意指如本文中定义的GRP多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸序列”的任意称谓意指能够编码这种GRP多
肽的核酸序列。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸序列是编码现在
将描述的蛋白质类型的任意核酸序列，下文也称作“GRP核酸序列”或“GRP基因”。
肽的核酸序列。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸序列是编码现在
将描述的蛋白质类型的任意核酸序列，下文也称作“GRP核酸序列”或“GRP基因”。
[0459] 在本发明的一个实施方案中，本文定义的“GRP多肽”是指由SEQ IDNO：105所表示的蛋白质，以及其直向同源物、旁系同源物和同源物。实施例1的表A3在本文中
显示了此类直向同源物和旁系同源物。
显示了此类直向同源物和旁系同源物。
[0460] 优选地，SEQ ID NO：105的直向同源物、旁系同源物和同源物具有碱性-螺旋-环-螺旋二聚化区域(其具有InterPro进入IPR001092)和螺旋-环-螺旋DNA-结
合(其具有InterPro进入IPR011598)。
合(其具有InterPro进入IPR011598)。
[0461] 可选地或另外地，本文定义的“GRP多肽”涉及任何多肽，所述多肽与SEQID NO：105所表示的GRP多肽或者与本文实施例1的表A3中所给出的任何多肽序列以
优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性。
优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性。
[0462] 术语“结构域”和“基序”在本文中的“定义”部分定义。 存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
[0463] 用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。 GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸序列
或多肽序列范围或在选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸序列
或多肽序列范围或在选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
[0464] 此外，GRP多肽，在涉及SEQ ID NO：105以及其直向同源物、旁系同源物和同源物时，一般具有结合DNA(至少以其天然形式)的能力，而并非必须地具有转录调节活
性以及与其它蛋白质相互作用的能力。 因此，具有降低的转录调节活性、无转录调节活
性、具有降低的蛋白质-蛋白质相互作用能力或无蛋白质-蛋白质相互作用能力的GRP多
肽可以等价地被用于本发明的方法。 DNA结合活性和蛋白质-蛋白质相互作用可以使用
本领域熟知的技术(例如在Current Protocols in Molecular Biology，第1和2卷，Ausubel
等人(1994)，Current Protocols中)轻易地在体外或体内测定。 为了测定GRP多肽的
DNA结合活性，可用几种测定法，如DNA结合凝胶迁移率测定法(或凝胶阻滞测定法；
Korfhage等人(1994)Plant C 6：695-708)、体外DNA结合作用测定法(Schindler等人
(1993)Plant J 4(1)：137-150)或GRP多肽在酵母、动物和植物细胞中的转录激活作用。
GRP多肽通常与被称为E-框，CANNTG的共有序列结合。规范的E-框是CACGTG(回
文)，但是一些bHLH4转录因子结合不同的序列，所述不同序列通常与E-框类似。 可
以使用使用随机寡核苷酸选择技术(Viola和Gonzalez(2007年5月26)Biochemistry)确定
特定的DNA结合序列。
性以及与其它蛋白质相互作用的能力。 因此，具有降低的转录调节活性、无转录调节活
性、具有降低的蛋白质-蛋白质相互作用能力或无蛋白质-蛋白质相互作用能力的GRP多
肽可以等价地被用于本发明的方法。 DNA结合活性和蛋白质-蛋白质相互作用可以使用
本领域熟知的技术(例如在Current Protocols in Molecular Biology，第1和2卷，Ausubel
等人(1994)，Current Protocols中)轻易地在体外或体内测定。 为了测定GRP多肽的
DNA结合活性，可用几种测定法，如DNA结合凝胶迁移率测定法(或凝胶阻滞测定法；
Korfhage等人(1994)Plant C 6：695-708)、体外DNA结合作用测定法(Schindler等人
(1993)Plant J 4(1)：137-150)或GRP多肽在酵母、动物和植物细胞中的转录激活作用。
GRP多肽通常与被称为E-框，CANNTG的共有序列结合。规范的E-框是CACGTG(回
文)，但是一些bHLH4转录因子结合不同的序列，所述不同序列通常与E-框类似。 可
以使用使用随机寡核苷酸选择技术(Viola和Gonzalez(2007年5月26)Biochemistry)确定
特定的DNA结合序列。
[0465] 本发明通过用SEQ ID NO：104所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：105的多肽序列。 但是，本发明的实施不限于这些序列；
本发明的方法可以有利地使用任意编码GRP的核酸序列或如本文中定义的GRP多肽实
施。
本发明的方法可以有利地使用任意编码GRP的核酸序列或如本文中定义的GRP多肽实
施。
[0466] 编码GRP多肽的核酸序列的例子在本领域已知的数据库中发现。 此类核酸序列用于实施本发明的方法中。 直向同源物和旁系同源物(术语“直向同源物”和“旁系同
源物”如本文中定义)可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。 通常，这包括第
一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用SEQ ID NO：105)针对
任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。 当从核苷酸序列开始时，
一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用
BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。 可以任选地筛选BLAST结果。 筛选结果或
非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，
其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105
的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。 随后比较第一BLAST和第二
BLAST的结果。 若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物
种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序
列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴
定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
源物”如本文中定义)可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。 通常，这包括第
一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用SEQ ID NO：105)针对
任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。 当从核苷酸序列开始时，
一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用
BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。 可以任选地筛选BLAST结果。 筛选结果或
非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，
其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105
的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。 随后比较第一BLAST和第二
BLAST的结果。 若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物
种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序
列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴
定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
[0467] 高阶位命中是具有低E-值的那些命中。 E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。 E-值的计算是本领域熟知的。 除了E-值外，比较
过程也通过同一性百分数评分。 同一性百分数指两个所比较的核酸序列(或多肽)序列
之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。 在大型家族的情况下，可以使
用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系
同源物。
过程也通过同一性百分数评分。 同一性百分数指两个所比较的核酸序列(或多肽)序列
之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。 在大型家族的情况下，可以使
用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系
同源物。
[0468] 编码SEQ ID NO：105的同源物和衍生物的核酸序列变体也可以用于实施本发明的方法中，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。 还用于本发明方法中的是这
样的核酸序列，其编码SEQ ID NO：105的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。
用于本发明方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物
学活性和功能活性。
样的核酸序列，其编码SEQ ID NO：105的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。
用于本发明方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物
学活性和功能活性。
[0469] 在实施本发明方法中有用的其他核酸序列变体包括编码GRP多肽的核酸序列的部分、与编码GRP多肽的核酸序列杂交的核酸序列、编码GRP多肽的核酸序列的剪接变
体、编码GRP多肽的核酸序列的等位变体和通过基因改组获得的编码GRP多肽的核酸序
列的变体。 术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如
本文中所述。
体、编码GRP多肽的核酸序列的等位变体和通过基因改组获得的编码GRP多肽的核酸序
列的变体。 术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如
本文中所述。
[0470] 编码GRP多肽的核酸序列不需要是全长核酸序列，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状(优选增
强的种子产量相关性状)的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：104的一部分或
编码SEQ ID NO：105的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的一部分。
强的种子产量相关性状)的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：104的一部分或
编码SEQ ID NO：105的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的一部分。
[0471] 核酸序列的一部分可以例如通过对所述核酸序列产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在
产生组合有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以
比对于该蛋白质部分所预测的多肽更大。
产生组合有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以
比对于该蛋白质部分所预测的多肽更大。
[0472] 在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的GRP多肽，并且具有如SEQID NO：105中所给出多肽序列基本上相同的生物学活性。 优选地，此部分是在SEQ
ID NO：104中给出的核酸序列的一部分，或是编码在SEQ ID NO：105中所给出的多
肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的一部分。 优选地，该部分的长度是至少
500、600、700、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、
1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750或更多个连续核苷酸，所述
连续核苷酸属于SEQ ID NO：104，或属于编码SEQ ID NO：105的直向同源物或旁系同
源物的核酸序列。 最优选地，该部分是SEQ ID NO：104的核酸序列的一部分。
ID NO：104中给出的核酸序列的一部分，或是编码在SEQ ID NO：105中所给出的多
肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的一部分。 优选地，该部分的长度是至少
500、600、700、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、
1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750或更多个连续核苷酸，所述
连续核苷酸属于SEQ ID NO：104，或属于编码SEQ ID NO：105的直向同源物或旁系同
源物的核酸序列。 最优选地，该部分是SEQ ID NO：104的核酸序列的一部分。
[0473] 在本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列或与如本文中定义的部分杂交
的核酸序列。
的核酸序列。
[0474] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的方法，包括在植物中导入并表达能够与SEQ ID NO：104杂交的核酸序列，或包
括在植物中导入并表达能够与编码SEQ ID NO：105的直向同源物、旁系同源物或同源物
的核酸序列杂交的核酸序列。
括在植物中导入并表达能够与编码SEQ ID NO：105的直向同源物、旁系同源物或同源物
的核酸序列杂交的核酸序列。
[0475] 在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的GRP多肽，具有如SEQ IDNO：105中所给出多肽序列基本上相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与SEQ
ID NO：104或与该序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或所述杂交序列能够
与编码SEQ ID NO：105的直向同源物或旁系同源物的核酸序列或其部分杂交。
ID NO：104或与该序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或所述杂交序列能够
与编码SEQ ID NO：105的直向同源物或旁系同源物的核酸序列或其部分杂交。
[0476] 在本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是编码如上文所定义的GRP多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
[0477] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状(优选增强种子产量相关性状)的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：104的剪接变体或编码SEQ ID NO：
105的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接变体。
105的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接变体。
[0478] 在实施本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是编码如上文所定义GRP多肽的核酸序列的等位变体，等位变体如本文中定义。
[0479] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状(优选增强种子产量相关性状)的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：104的等位变体，或包括在植物中导
入并表达核酸序列的等位变体，其中所述核酸序列编码由SEQ ID NO：105表示的多肽序
列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
入并表达核酸序列的等位变体，其中所述核酸序列编码由SEQ ID NO：105表示的多肽序
列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
[0480] 本发明方法中有用的等位变体具有与SEQ ID NO：105的GRP多肽基本上相同的生物学活性。 等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括这些天然等位基
因的用途。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的GRP多肽的核酸序列
的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
因的用途。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的GRP多肽的核酸序列
的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
[0481] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状(优选增强种子产量相关性状)的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：104的变体核酸序列，或包括在植物
中导入并表达编码SEQ ID NO：105的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变
体，其中所述变体核酸序列通过基因改组获得。
中导入并表达编码SEQ ID NO：105的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变
体，其中所述变体核酸序列通过基因改组获得。
[0482] 另外，核酸序列变体也可以通过位点定向诱变获得。 几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编
辑)。
辑)。
[0483] 编码GRP多肽的核酸序列可以衍生自任何天然来源或人工来源。 该核酸序列可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。 优选
地，编码GRP多肽的核酸序列来自植物。在SEQ IDNO：104的情况下，编码GRP多肽
的核酸序列优选地来自双子叶植物，更优选地来自十字花科(Brassicaceae)，该核酸序列
最优选地来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
地，编码GRP多肽的核酸序列来自植物。在SEQ IDNO：104的情况下，编码GRP多肽
的核酸序列优选地来自双子叶植物，更优选地来自十字花科(Brassicaceae)，该核酸序列
最优选地来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0484] 本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状(特别是增强的种子产量相关性状)的植物。 术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描
述。
述。
[0485] 本文中对增强的产量相关性状的称谓意指早期萌发势和/或植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获的)部分和/或(可收获
的)地下部分。 尤其，此类可收获部分是生物量和/或种子，并且本发明方法的实施产
生了相对于对照植物的早期萌发势、生物量或种子产量而言，具有提高的早期萌发势、
生物量或种子产量的植物。
的)地下部分。 尤其，此类可收获部分是生物量和/或种子，并且本发明方法的实施产
生了相对于对照植物的早期萌发势、生物量或种子产量而言，具有提高的早期萌发势、
生物量或种子产量的植物。
[0486] 以谷物为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每公顷或英亩已建立的植物数目增加、每株植物穗数的提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
[0487] 本发明提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状、尤其生物量和/或种子产量的方法，所述方法包括调节(优选增加)植物中编码如本文中定义的GRP多
肽的核酸序列表达。
肽的核酸序列表达。
[0488] 由于本发明的转基因植物具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)，故相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其
生活周期的至少部分期间)表现提高的生长速率。
生活周期的至少部分期间)表现提高的生长速率。
[0489] 提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整个植物。具有提到的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。 植物的生活周
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在
一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地
理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)
的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通过从
生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所
花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在
一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地
理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)
的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通过从
生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所
花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
[0490] 根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的生长速率的植物。 因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，所
述方法包括在植物中调节(优选地提高)编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列表达。
述方法包括在植物中调节(优选地提高)编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列表达。
[0491] 与对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，出现产量相关性状的增强(种子产量和/或生长速率的提高)。 植物一般通过
生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一
方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植
物完全停止生长，但同时不能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫
在本发明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、
20％或15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌
溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由
轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。 轻度胁迫是植物所暴露的常
见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、
盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。 非生物胁迫可以是因水胁迫
(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病
原体如细菌、病毒、线虫、真菌和昆虫引起的那些胁迫。 本文中使用的术语“非胁迫”
条件是那些环境条件，其允许植物的最佳生长。 本领域的技术人员已知给定的地点的正
常土壤条件和气候条件。
生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一
方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植
物完全停止生长，但同时不能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫
在本发明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、
20％或15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌
溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由
轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。 轻度胁迫是植物所暴露的常
见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、
盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。 非生物胁迫可以是因水胁迫
(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病
原体如细菌、病毒、线虫、真菌和昆虫引起的那些胁迫。 本文中使用的术语“非胁迫”
条件是那些环境条件，其允许植物的最佳生长。 本领域的技术人员已知给定的地点的正
常土壤条件和气候条件。
[0492] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下培育的植物具有增强的产量相关性状，优选增强的种子产量相关
性状。 因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下培育的植物
中增强产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的方法，所述方法包括在植物中调
节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达。
性状。 因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下培育的植物
中增强产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的方法，所述方法包括在植物中调
节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达。
[0493] 根据本发明方法的实施产生在非生物胁迫条件下生长的植物，其相对于在可比较胁迫条件下生长的对照植物而言具有增强的产量相关性状，优选增强的种子产量相关
性状。 如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地
影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。 干旱、盐度、极端温
度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。 Rabbani
等人(PlantPhysiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的
“交互作用”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态
和离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性
蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和
细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。 由于多样
的环境胁迫激活相似的途径，相对于在可比较非生物胁迫条件下培育的对照植物而言，
在一种类型的非生物胁迫生长条件下具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相
关性状)的植物不应当被视为限于非生物胁迫生长条件的该类型，而更应当视为指示了
如上文所定义的GRP多肽一般在非生物胁迫生长条件中增强产量相关性状中的参与。
性状。 如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地
影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。 干旱、盐度、极端温
度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。 Rabbani
等人(PlantPhysiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的
“交互作用”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态
和离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性
蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和
细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。 由于多样
的环境胁迫激活相似的途径，相对于在可比较非生物胁迫条件下培育的对照植物而言，
在一种类型的非生物胁迫生长条件下具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相
关性状)的植物不应当被视为限于非生物胁迫生长条件的该类型，而更应当视为指示了
如上文所定义的GRP多肽一般在非生物胁迫生长条件中增强产量相关性状中的参与。
[0494] 如本文中定义的术语“非生物胁迫”意指以下任意一项或多项：水胁迫(因干旱或过量的水所致)、缺氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(因热、寒冷或冰冻温度所致)、化
学毒性胁迫和氧化胁迫。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自
水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，所述水胁迫是干旱胁迫。术语“盐胁
迫”不限于常见盐(NaCl)，不过可以是由NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等中一种或
多种盐引起的任意胁迫。
学毒性胁迫和氧化胁迫。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自
水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，所述水胁迫是干旱胁迫。术语“盐胁
迫”不限于常见盐(NaCl)，不过可以是由NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等中一种或
多种盐引起的任意胁迫。
[0495] 相对于在可比较胁迫条件下培育的对照植物，本发明方法的实施产生这样的植物，所述植物在非生物胁迫生长条件下具有增强的产量相关性状、优选增强的种子产量
相关性状。 因此，根据本发明，提供了用于在非生物胁迫生长条件下培育的植物中增强
产量相关性状、优选增强种子产量相关性状的方法，所述方法包括调节(优选增加)植
物中编码GRP多肽的核酸序列表达。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁
迫，其选自以下一个或多个胁迫：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
相关性状。 因此，根据本发明，提供了用于在非生物胁迫生长条件下培育的植物中增强
产量相关性状、优选增强种子产量相关性状的方法，所述方法包括调节(优选增加)植
物中编码GRP多肽的核酸序列表达。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁
迫，其选自以下一个或多个胁迫：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
[0496] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在降低的营养物有效性条件下、尤其在降低的氮有效性条件下培育的植物增强的产量相关性状，特别
是增强种子产量相关性状。 因此，根据本发明，提供了用于在降低的营养物有效性条件
下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法包括调节(优选增加)植物中编码
GRP多肽的核酸序列的表达。 降低的营养物有效性可以包含营养物如氮、磷酸盐和其他
含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等的降低的有效性。
是增强种子产量相关性状。 因此，根据本发明，提供了用于在降低的营养物有效性条件
下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法包括调节(优选增加)植物中编码
GRP多肽的核酸序列的表达。 降低的营养物有效性可以包含营养物如氮、磷酸盐和其他
含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等的降低的有效性。
[0497] 本发明包括通过本发明方法可获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞。所述植物、其部分或植物细胞包含编码如上文定义的GRP多肽(优选地碱性-螺旋-环-螺
旋4(bHLH4)多肽)的核酸转基因。
旋4(bHLH4)多肽)的核酸转基因。
[0498] 本发明也提供了基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码GRP多肽的核酸序列。 所述基因构建体可以插入适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目的
基因的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本
发明方法中的用途。
基因的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本
发明方法中的用途。
[0499] 更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
[0500] (a)编码如上文定义的GRP多肽(优选碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽)的核酸序列；
[0501] (b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0502] (c)转录终止序列。
[0503] 优选地，编码GRP多肽的核酸序列如上文定义。 术语“调控序列”和“终止序列”如本文中的定义。
[0504] 用包含任意上述核酸序列的载体转化植物。 技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。 该目的序列有
效地与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
效地与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
[0505] 有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或人工的，可以用来驱动所述核酸序列的表达。 组成型启动子是在本发明方法中特别有用的。 对于多种启动子类型的定
义，见本文中的“定义”部分。
义，见本文中的“定义”部分。
[0506] 应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：104表示的编码GRP多肽的核酸序列，本发明的应用也不限于编码GRP多肽的核酸序列在受组成型启动子驱动时的表
达。
达。
[0507] 组成型启动子优选地是高速泳动族B(HMGB)启动子，优选地是来自稻的HMGB启动子。 还优选地，所述HMGB启动子由基本上与SEQ IDNO：106相似的核酸
序列表示，最优选地该HMGB启动子如SEQ ID NO：106所表示。 对于组成型启动子的
其他例子，见本文中的“定义”部分的表2。
序列表示，最优选地该HMGB启动子如SEQ ID NO：106所表示。 对于组成型启动子的
其他例子，见本文中的“定义”部分的表2。
[0508] 任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。 额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。 本领域技术人员将知道可能适用于实施本发
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
[0509] 本发明的基因构建体还可以包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。 一个例子是当需要基因构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
[0510] 为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报道基因)。因此，所述基因构建体可以任
选地包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再
需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本
领域已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
选地包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再
需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本
领域已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
[0511] 本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)，其中所述方法包括在植物中
导入并表达编码如上文所定义的GRP多肽的核酸序列。
导入并表达编码如上文所定义的GRP多肽的核酸序列。
[0512] 更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强产量相关性状，优选增强的种子产量相关性状，其中所述方法包括：
[0513] (i)在植物、植物部分或植物细胞中导入并表达编码GRP多肽的核酸序列；和
[0514] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物、植物部分或植物细胞。
[0515] (i)的核酸序列可以是能够编码如本文中定义的GRP多肽(在一个实施方案中所述多肽具有碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽的活性)的任意核酸序列。
[0516] 所述核酸序列可以直接导入植物细胞或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸序列优选地通过转化作用导入植
物。 术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
物。 术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0517] 遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的全部方法再生。 合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或 和Willmitzer的出版物中找到。
[0518] 通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
[0519] 在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析对目的基因的存在性、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，新导入的DNA的
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
[0520] 产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
[0521] 本发明明确地扩展至由本文中所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。 本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
[0522] 本发明也包括含有编码如本文以上所定义GRP多肽的分离核酸序列的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。 对于本发明方法中所用核酸转基因或载体、表
达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的
全部植物。
达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的
全部植物。
[0523] 本发明的方法有利地适用于任意植物。 在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。 作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃
薯和烟草。 还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包括甘蔗。 更优选
地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、
黑小麦、高粱和燕麦。
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。 作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃
薯和烟草。 还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包括甘蔗。 更优选
地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、
黑小麦、高粱和燕麦。
[0524] 本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。 本发明进一步涉及了衍生自、优选直接衍生自此种植物的可
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
[0525] 根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。 用于增加核酸序列或基因或基因产物表达的方法是本领域中充分经文献报道的并且在定义部分中提供了例子。
[0526] 如上所述，用于调节(优选地增加)编码GRP多肽的核酸序列表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码GRP多肽的核酸序列；但是，实施本方法的效果，即增
强产量相关性状，优选增强种子产量相关性状也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签
法、TILLING、同源重组在内的其他熟知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的
描述。
强产量相关性状，优选增强种子产量相关性状也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签
法、TILLING、同源重组在内的其他熟知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的
描述。
[0527] 本发明也包括编码如本文中所述GRP多肽的核酸序列的用途，和这些GRP多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状，优选种子产量相关性状。
[0528] 编码本文中所述GRP多肽的核酸序列或GRP多肽自身可以用于育种程序中，在所述育种程序中鉴定到可以遗传地与编码GRP多肽的基因连锁的DNA标记。 所述基因
/核酸序列或GRP多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记随后可以
在育种程序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状(优
选增强的种子产量相关性状)的植物。
/核酸序列或GRP多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记随后可以
在育种程序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状(优
选增强的种子产量相关性状)的植物。
[0529] 编码GRP多肽的核酸序列/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而导入等位变
异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随
后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致增强产量相
关性状(优选增强的种子产量相关性状)的序列的优异等位变体。 选择一般通过监测含
有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施。 生长性能可以在温室或在田间
监测。其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一种植物杂交。 这可能
用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随
后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致增强产量相
关性状(优选增强的种子产量相关性状)的序列的优异等位变体。 选择一般通过监测含
有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施。 生长性能可以在温室或在田间
监测。其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一种植物杂交。 这可能
用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
[0530] 编码GRP多肽的核酸序列也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其一部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。 此类信息可以用于植物育种
中，以开发具有所希望表型的品系。编码GRP多肽的核酸序列的这种用途仅需要具有至
少15个核苷酸长度的核酸序列。 编码GRP多肽的核酸序列可以用作限制性片段长度多
态性(RFLP)标记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch
EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码GRP的核酸
序列探测。 所得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)
Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸序列可以用来探测含
有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个
体代表具有定义的遗传杂交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编
码GRP多肽的核酸序列在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)
Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
中，以开发具有所希望表型的品系。编码GRP多肽的核酸序列的这种用途仅需要具有至
少15个核苷酸长度的核酸序列。 编码GRP多肽的核酸序列可以用作限制性片段长度多
态性(RFLP)标记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch
EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码GRP的核酸
序列探测。 所得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)
Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸序列可以用来探测含
有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个
体代表具有定义的遗传杂交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编
码GRP多肽的核酸序列在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)
Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
[0531] 在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。 许多出版物描述了使用以上概述的方法
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
[0532] 所述核酸序列探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第
319-346页及其中引用的参考文献)。
319-346页及其中引用的参考文献)。
[0533] 在另一个实施方案中，所述核酸序列探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。 尽管当前的FISH作图法支持使用大
的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度
的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度
的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
[0534] 用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。 方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：
95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、
等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)NucleicAcid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中
使用的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图
的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序
列差异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、
等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)NucleicAcid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中
使用的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图
的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序
列差异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
[0535] 如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的植物。 这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增
强性状、针对其他非生物胁迫和生物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化
学特征和/或生理学特征的性状。
强性状、针对其他非生物胁迫和生物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化
学特征和/或生理学特征的性状。
[0536] 在本说明书中使用的术语“表A3”是为了指定表A3a和表A3b的内容。 本说明书中使用的术语“表A3a”是为了指定表A3a中的内容。 本说明书中使用的术语“表
A3b”是为了指定表A3b中的内容。 在一个优选的实施方案中，术语“表A3”意思是
表A3b。
A3b”是为了指定表A3b中的内容。 在一个优选的实施方案中，术语“表A3”意思是
表A3b。
[0537] 在一个实施方案中，本发明涉及总结如下的主题：
[0538] 条目42：在植物中相对于对照植物增强产量相关性状，优选增强种子产量相关性状的方法，其包括在植物中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达以及任选
地选择具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的植物，其中所述GRP
多肽是如SEQ ID NO：2所表示的碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽或者表A3中所
给出的任何多肽或其直向同源物、旁系同源物或同源物。
地选择具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的植物，其中所述GRP
多肽是如SEQ ID NO：2所表示的碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽或者表A3中所
给出的任何多肽或其直向同源物、旁系同源物或同源物。
[0539] 条目43：根据条目42的方法，其中所述如SEQ ID NO：105所示的GRP多肽以及其直向同源物、旁系同源物或同源物具有碱性-螺旋-环-螺旋二聚化区域(具有
InterPro进入IPR001092)和螺旋-环-螺旋DNA结合(具有InterPro进入IPR011598)。
InterPro进入IPR001092)和螺旋-环-螺旋DNA结合(具有InterPro进入IPR011598)。
[0540] 条目44：根据条目42或43的方法，其中所述GRP多肽与SEQ IDNO：105所表示的GRP多肽或者与实施例1的表A3中所给出的任何多肽序列以优选增加的顺序具有
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或
更多的氨基酸序列同一性。
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或
更多的氨基酸序列同一性。
[0541] 条目45：根据任一前述条目42至44的方法，其中所述编码GRP多肽的核酸序列由下述表示：SEQ ID NO：104的核酸序列或其部分，或能够与SEQ ID NO：104的核
酸序列或其部分杂交的序列，或者能够与实施例1的表A3中给出的任一核酸序列SEQ ID
NO杂交的序列。
酸序列或其部分杂交的序列，或者能够与实施例1的表A3中给出的任一核酸序列SEQ ID
NO杂交的序列。
[0542] 条目46：根据任一前述条目42至45的方法，其中所述调节(优选增加)的表达通过在植物中导入和表达编码所述GRP多肽的核酸序列来实现。
[0543] 条目47：根据任一前述条目42至46的方法，其中所述增强的产量相关性状包括以下一种或多种：相对于对照植物提高的早期萌发势、提高的绿度指数、提高的每株
植物的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率以及提高的收获指数。
植物的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率以及提高的收获指数。
[0544] 条目48：根据任一前述条目42至47的方法，其中所述调节的表达是增加的表达。
[0545] 条目49：根据任一前述条目42至48的方法，其中所述核酸序列与组成型启动子，优选与高速泳动族B(high mobility group B)(HMGB)启动子，最优选与来自稻的
HMGB启动子有效连接。
HMGB启动子有效连接。
[0546] 条目50：根据任一前述条目42至49的方法，其中所述编码GRP多肽的核酸序列是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae)，更优选
来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0547] 条目51：通过根据任一前述条目42至45的方法可获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞，其中所述植物、其部分或植物细胞包含编码GRP多肽的核酸转基因。
[0548] 条目52：包含选自以下的核酸序列的分离的核酸序列：
[0549] a)编码如SEQ ID NO：122、124、126、128和/或130和/或表A3b中所示的多肽的分离的核酸分子；
[0550] b)如SEQ ID NO：121、123、125、127和/或129和/或表A3b所示的分离的核酸分子；
[0551] c)分离的核酸分子，其作为遗传密码子简并性的结果，可以来自如表A3中所示的多肽序列并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
[0552] d)分离的核酸分子，其与多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并且赋予相对于对照
植物增强的产量相关性状，所述多核苷酸包含表A3中所示的核酸分子；
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并且赋予相对于对照
植物增强的产量相关性状，所述多核苷酸包含表A3中所示的核酸分子；
[0553] e)编码多肽并且赋予了相对于对照植物增强的产量相关性状的分离的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％、31％、
32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；
32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；
[0554] f)分离的核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
[0555] g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含图10中所示的共有序列或一个或多个多肽基序，并且所述分离的核酸分子优选地具有下述核酸分子所代表的活性，所述
核酸分子包含表A3中所示的多核苷酸；
核酸分子包含表A3中所示的多核苷酸；
[0556] h)编码多肽并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的分离的核酸分子，所述多肽具有如表A3中所示的蛋白质所代表的活性；
[0557] 以及
[0558] i)通过在严格杂交条件下用探针或用其片段筛选适当的核酸文库可获得的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)的核酸分子的互补序列，所述可获得的核酸分子具有与
(a)至(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt并且编码具有活性的多肽，所述活性由包含表A3中所示的多肽的
蛋白质所代表；
(a)至(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt并且编码具有活性的多肽，所述活性由包含表A3中所示的多肽的
蛋白质所代表；
[0559] 其中根据(a)至(i)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上不同于表A3a中所示的序列并且优选地编码下述蛋白质，所述蛋白质至少在一个或多个氨基酸上不同于表
A3a中所示的蛋白质序列。
A3a中所示的蛋白质序列。
[0560] 条目53：构建体，其包含
[0561] (a)如条目42至44或52所定义的编码GRP多肽的核酸序列；一个或多个能够驱动(a)的核酸序列表达的调控序列；以及任选地
[0562] (b)转录终止序列。
[0563] 条目54：根据条目53的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选HMGB启动子，最优选来自稻的HMGB启动子。
[0564] 条目55：根据条目53至54的任一项的构建体在制备下述植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，特别是提高的早期萌发势、提
高的绿度指数、提高的每株植物的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率
以及提高的收获指数。
高的绿度指数、提高的每株植物的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子饱满率
以及提高的收获指数。
[0565] 条目56：用根据条目53至54的任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0566] 条目57：用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有相对于对照植物增强的产量相关性状，所述方法包括：
[0567] (i)在植物、植物部分或植物细胞中导入和表达如条目42至44和52所定义的编码GRP多肽的核酸序列；以及
[0568] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物、植物部分或植物细胞。
[0569] 条目58：相对于对照植物具有增强的产量相关性状、特别是提高的早期萌发势、提高的绿度指数、提高的每株植物的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子
饱满率以及提高的收获指数的转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所
述转基因植物从下述产生：如条目42至44和52中所定义的编码GRP多肽的核酸序列的
增加的表达。
饱满率以及提高的收获指数的转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所
述转基因植物从下述产生：如条目42至44和52中所定义的编码GRP多肽的核酸序列的
增加的表达。
[0570] 条目59：根据条目51、56和58的转基因植物，或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸
麦、黑小麦、高粱和燕麦。
麦、黑小麦、高粱和燕麦。
[0571] 条目60：根据条目59的包含编码GRP多肽的核酸序列的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为种子。
[0572] 条目61：来自根据条目59的植物和/或来自根据条目60的植物的可收获部分的产品。
[0573] 条目62：编码GRP多肽的核酸序列在植物中相对于对照植物增强产量相关性状、特别是提高早期萌发势、提高绿度指数、提高每株植物的总种子产量、提高饱满种
子数、提高种子饱满率以及提高收获指数中的用途。
子数、提高种子饱满率以及提高收获指数中的用途。
[0574] 根据本发明的另一个实施方案，还提供了包含选自以下的多肽序列的分离的多肽：
[0575] (i)由条目52所表示的任一核酸所编码的氨基酸序列；
[0576] (ii)与(i)的氨基酸序列以优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的
氨基酸序列；
氨基酸序列；
[0577] (iii)上文(i)或(ii)中所给出的任何氨基酸序列的衍生物。
[0578] 在本发明的一个实施方案中，现在发现在植物中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达提供了具有相对于对照植物增强的产量相关性状的植物，其中所述
GRP多肽是异戊烯基转移酶(isopentenyl transferase(IPT))多肽。 根据第一个实施方案，
本发明提供了在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，所述方法包括在植物
中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达，其中所述GRP多肽是异戊烯基转
移酶(IPT)多肽。
GRP多肽是异戊烯基转移酶(isopentenyl transferase(IPT))多肽。 根据第一个实施方案，
本发明提供了在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，所述方法包括在植物
中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达，其中所述GRP多肽是异戊烯基转
移酶(IPT)多肽。
[0579] 用于调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列表达的优选的方法是通过在植物中导入和表达编码GRP多肽的核酸序列。
[0580] 下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任意称谓意指如本文中定义的GRP多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸序列”的任意称谓意指能够编码这种GRP多
肽的核酸序列。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸序列是编码现在
将描述的蛋白质类型的任意核酸序列，下文也称作“GRP核酸序列”或“GRP基因”。
肽的核酸序列。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸序列是编码现在
将描述的蛋白质类型的任意核酸序列，下文也称作“GRP核酸序列”或“GRP基因”。
[0581] 本文定义的“GRP多肽”是指由SEQ ID NO：132所表示的多肽，以及其直向同源物、旁系同源物和同源物，或者本文实施例1的表A4中给出的任何多肽序列。
[0582] 优选地，SEQ ID NO：132的直向同源物、旁系同源物和同源物属于具有InterPro进入IPR002627和IPR011593的tRNA异戊烯基转移酶家族。
[0583] 可选地或另外地，本文定义的“GRP多肽”涉及任何多肽，所述多肽与SEQID NO：132所表示的GRP多肽或者与本文实施例1的表A4中所给出的任何多肽序列以
优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性。
优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性。
[0584] 术语“结构域”和“基序”在本文中的“定义”部分定义。 存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
[0585] 用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。 GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸序列
或多肽序列范围或在选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸序列
或多肽序列范围或在选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
[0586] 细胞分裂素是植物中细胞分裂和分化的重要调节子，是携带可以被羟基化的异戊烯基侧链的腺嘌呤衍生物。植物具有两类作用于腺嘌呤部分的异戊烯基转移酶(IPT)：
ATP/ADP异戊烯基转移酶(在拟南芥中，AtIPT1，3，4-8)和tRNA IPT(在拟南芥中
AtIPT2和9；Miyawaki等人(2006)ProcNatl Acad Sci U S A.103(44)：16598-16603)。如
上所述，通过ATP/ADPIPT的ATP和ADP的异戊烯基化(isopentenylation)是iP-和tZ-型
细胞分裂素的生物合成中的关键步骤。 GRP多肽，在涉及SEQ ID NO：2以及其直向同
源物、旁系同源物和同源物时，通常负责iP-和tZ-型细胞分裂素的生物合成中的ATP
和ADP的异戊烯基化。 测量此类酶活性是本领域中熟知的(例如Miyawaki等人，见上
文)。
ATP/ADP异戊烯基转移酶(在拟南芥中，AtIPT1，3，4-8)和tRNA IPT(在拟南芥中
AtIPT2和9；Miyawaki等人(2006)ProcNatl Acad Sci U S A.103(44)：16598-16603)。如
上所述，通过ATP/ADPIPT的ATP和ADP的异戊烯基化(isopentenylation)是iP-和tZ-型
细胞分裂素的生物合成中的关键步骤。 GRP多肽，在涉及SEQ ID NO：2以及其直向同
源物、旁系同源物和同源物时，通常负责iP-和tZ-型细胞分裂素的生物合成中的ATP
和ADP的异戊烯基化。 测量此类酶活性是本领域中熟知的(例如Miyawaki等人，见上
文)。
[0587] 本发明通过用SEQ ID NO：131所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：132的多肽序列。 但是，本发明的实施不限于这些序列；
本发明的方法可以有利地使用任意编码GRP的核酸序列或如本文中定义的GRP多肽实
施。
本发明的方法可以有利地使用任意编码GRP的核酸序列或如本文中定义的GRP多肽实
施。
[0588] 编码GRP多肽的核酸序列的例子在本领域已知的数据库中发现。 此类核酸序列用于实施本发明的方法中。 直向同源物和旁系同源物(术语“直向同源物”和“旁系同
源物”如本文中定义)可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。 通常，这包括第
一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用SEQ ID NO：132)针对
任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。 当从核苷酸序列开始时，
一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用
BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。 可以任选地筛选BLAST结果。 筛选结果或
非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，
其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：132
的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。 随后比较第一BLAST和第二
BLAST的结果。 若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物
种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序
列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴
定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
源物”如本文中定义)可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。 通常，这包括第
一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用SEQ ID NO：132)针对
任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。 当从核苷酸序列开始时，
一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用
BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。 可以任选地筛选BLAST结果。 筛选结果或
非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，
其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：132
的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。 随后比较第一BLAST和第二
BLAST的结果。 若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物
种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序
列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴
定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
[0589] 高阶位命中是具有低E-值的那些命中。 E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。 E-值的计算是本领域熟知的。 除了E-值外，比较
过程也通过同一性百分数评分。 同一性百分数指两个所比较的核酸序列(或多肽)序列
之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。 在大型家族的情况下，可以使
用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系
同源物。
过程也通过同一性百分数评分。 同一性百分数指两个所比较的核酸序列(或多肽)序列
之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。 在大型家族的情况下，可以使
用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系
同源物。
[0590] 编码SEQ ID NO：132的同源物和衍生物的核酸序列变体也可以用于实施本发明的方法中，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。 还用于本发明方法中的是这
样的核酸序列，其编码SEQ ID NO：132或实施例1的表A4中所给出的任何多肽序列的
直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。 用于本发明方法中的同源物和衍生物与衍
生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。
样的核酸序列，其编码SEQ ID NO：132或实施例1的表A4中所给出的任何多肽序列的
直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。 用于本发明方法中的同源物和衍生物与衍
生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。
[0591] 在实施本发明方法中有用的其他核酸序列变体包括编码GRP多肽的核酸序列的部分、与编码GRP多肽的核酸序列杂交的核酸序列、编码GRP多肽的核酸序列的剪接变
体、编码GRP多肽的核酸序列的等位变体和通过基因改组获得的编码GRP多肽的核酸序
列的变体。 术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如
本文中所述。
体、编码GRP多肽的核酸序列的等位变体和通过基因改组获得的编码GRP多肽的核酸序
列的变体。 术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如
本文中所述。
[0592] 编码GRP多肽的核酸序列不需要是全长核酸序列，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，
包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：131的一部分或编码SEQ ID NO：132的直向同源
物、旁系同源物或同源物的核酸序列的一部分。
包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：131的一部分或编码SEQ ID NO：132的直向同源
物、旁系同源物或同源物的核酸序列的一部分。
[0593] 核酸序列的一部分可以例如通过对所述核酸序列产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在
产生组合有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以
比对于该多肽部分所预测的多肽更大。
产生组合有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以
比对于该多肽部分所预测的多肽更大。
[0594] 在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的GRP多肽，并且具有如SEQ IDNO：132中所给出多肽序列或如实施例1的表A4中所给出的任何多肽序列的基本上相同
的生物学活性。优选地，此部分是在SEQ IDNO：131中给出的核酸序列的一部分，或是
编码在SEQ ID NO：132中所给出的多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的一
部分。优选地，该部分的长度是至少300、400、500、600、700、800、850、900、950、
1000、1050或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸属于SEQ ID NO：131，或属于编码
SEQ ID NO：132的直向同源物或旁系同源物的核酸序列。 最优选地，该部分是SEQ ID
NO：131的核酸序列的一部分。
的生物学活性。优选地，此部分是在SEQ IDNO：131中给出的核酸序列的一部分，或是
编码在SEQ ID NO：132中所给出的多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的一
部分。优选地，该部分的长度是至少300、400、500、600、700、800、850、900、950、
1000、1050或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸属于SEQ ID NO：131，或属于编码
SEQ ID NO：132的直向同源物或旁系同源物的核酸序列。 最优选地，该部分是SEQ ID
NO：131的核酸序列的一部分。
[0595] 在本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列或与如本文中定义的部分杂交
的核酸序列。
的核酸序列。
[0596] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与SEQ ID NO：131杂交的核酸序列，或包括在植物中导入并表达能够与编码
SEQ ID NO：132或实施例1的表A中所给出的任何多肽序列的直向同源物、旁系同源物
或同源物的核酸序列杂交的核酸序列。
SEQ ID NO：132或实施例1的表A中所给出的任何多肽序列的直向同源物、旁系同源物
或同源物的核酸序列杂交的核酸序列。
[0597] 在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的GRP多肽，具有如SEQ IDNO：132中所给出多肽序列基本上相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与SEQ
ID NO：131或与该序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或所述杂交序列能够
与编码SEQ ID NO：132的直向同源物或旁系同源物的核酸序列或与其部分或与实施例1
的表A中所给出的任何多肽序列杂交。
ID NO：131或与该序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或所述杂交序列能够
与编码SEQ ID NO：132的直向同源物或旁系同源物的核酸序列或与其部分或与实施例1
的表A中所给出的任何多肽序列杂交。
[0598] 在本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是编码如上文所定义的GRP多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
[0599] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：131的剪接变体或编码SEQ ID NO：132的直向同源物、旁系同源物
或同源物的核酸序列的剪接变体。
或同源物的核酸序列的剪接变体。
[0600] 在实施本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是编码如上文所定义GRP多肽的核酸序列的等位变体，等位变体如本文中定义。
[0601] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：131的等位变体，或包括在植物中导入并表达核酸序列的等位变体，
其中所述核酸序列编码由SEQ ID NO：132表示的多肽序列的直向同源物、旁系同源物或
同源物。
其中所述核酸序列编码由SEQ ID NO：132表示的多肽序列的直向同源物、旁系同源物或
同源物。
[0602] 本发明方法中有用的等位变体具有与SEQ ID NO：132的GRP多肽基本上相同的生物学活性。 等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括这些天然等位基
因的用途。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的GRP多肽的核酸序列
的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
因的用途。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的GRP多肽的核酸序列
的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
[0603] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达SEQ ID NO：131的变体核酸序列，或包括在植物中导入并表达编码SEQ ID NO：
132的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，其中所述变体核酸序列通过
基因改组获得。
132的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，其中所述变体核酸序列通过
基因改组获得。
[0604] 另外，核酸序列变体也可以通过位点定向诱变获得。 几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编
辑)。
辑)。
[0605] 编码GRP多肽的核酸序列可以衍生自任何天然来源或人工来源。 该核酸序列可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。 优选
地，编码GRP多肽的核酸序列来自植物。在SEQ IDNO：131的情况下，编码GRP多肽
的核酸序列优选地来自双子叶植物，更优选地来自十字花科(Brassicaceae)，该核酸序列
最优选地来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
地，编码GRP多肽的核酸序列来自植物。在SEQ IDNO：131的情况下，编码GRP多肽
的核酸序列优选地来自双子叶植物，更优选地来自十字花科(Brassicaceae)，该核酸序列
最优选地来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0606] 本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的植物。 术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0607] 本文中对增强的产量相关性状的称谓意指早期萌发势和/或植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获的)部分和/或(可收获
的)地下部分。 尤其，此类可收获部分是生物量和/或种子，并且本发明方法的实施产
生了相对于对照植物的早期萌发势、生物量或种子产量而言，具有提高的早期萌发势、
生物量或种子产量的植物。
的)地下部分。 尤其，此类可收获部分是生物量和/或种子，并且本发明方法的实施产
生了相对于对照植物的早期萌发势、生物量或种子产量而言，具有提高的早期萌发势、
生物量或种子产量的植物。
[0608] 以谷物为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每公顷或英亩已建立的植物数目增加、每株植物穗数的提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
[0609] 本发明提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状、尤其生物量和/或种子产量的方法，所述方法包括调节(优选增加)植物中编码如本文中定义的GRP多
肽的核酸序列表达。
肽的核酸序列表达。
[0610] 由于本发明的转基因植物具有增强的产量相关性状，故相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其生活周期的至少部分期间)表现提
高的生长速率。
高的生长速率。
[0611] 提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整个植物。具有提到的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。 植物的生活周
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在
一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地
理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)
的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通过从
生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所
花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在
一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地
理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)
的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通过从
生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所
花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
[0612] 根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的生长速率的植物。 因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，所
述方法包括在植物中调节(优选地提高)编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列表达。
述方法包括在植物中调节(优选地提高)编码如本文中定义的GRP多肽的核酸序列表达。
[0613] 与对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，出现产量相关性状的增强(种子产量和/或生长速率的提高)。 植物一般通过
生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一
方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植
物完全停止生长，但同时不能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫
在本发明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、
20％或15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌
溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由
轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。 轻度胁迫是植物所暴露的常
见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、
盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。 非生物胁迫可以是因水胁迫
(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病
原体如细菌、病毒、线虫、真菌和昆虫引起的那些胁迫。 本文中使用的术语“非胁迫”
条件是那些环境条件，其允许植物的最佳生长。 本领域的技术人员已知给定的地点的正
常土壤条件和气候条件。
生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一
方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植
物完全停止生长，但同时不能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫
在本发明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、
20％或15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌
溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由
轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。 轻度胁迫是植物所暴露的常
见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、
盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。 非生物胁迫可以是因水胁迫
(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病
原体如细菌、病毒、线虫、真菌和昆虫引起的那些胁迫。 本文中使用的术语“非胁迫”
条件是那些环境条件，其允许植物的最佳生长。 本领域的技术人员已知给定的地点的正
常土壤条件和气候条件。
[0614] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下培育的植物具有增强的产量相关性状。 因此，根据本发明，提供
了用于在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所
述方法包括在植物中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达。
了用于在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所
述方法包括在植物中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达。
[0615] 根据本发明方法的实施产生在非生物胁迫条件下生长的植物，其相对于在可比较胁迫条件下生长的对照植物而言具有增强的产量相关性状。 如Wang等人
(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产
量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。 干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已
知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。 Rabbani等人(Plant
Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作
用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布
的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构
蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，
如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。 由于多样的环境胁迫
激活相似的途径，相对于在可比较非生物胁迫条件下培育的对照植物而言，在一种类型
的非生物胁迫生长条件下具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的植
物不应当被视为限于非生物胁迫生长条件的该类型，而更应当视为指示了如上文所定义
的GRP多肽一般在非生物胁迫生长条件中增强产量相关性状中的参与。
(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产
量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。 干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已
知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。 Rabbani等人(Plant
Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作
用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布
的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构
蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，
如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。 由于多样的环境胁迫
激活相似的途径，相对于在可比较非生物胁迫条件下培育的对照植物而言，在一种类型
的非生物胁迫生长条件下具有增强的产量相关性状(优选增强的种子产量相关性状)的植
物不应当被视为限于非生物胁迫生长条件的该类型，而更应当视为指示了如上文所定义
的GRP多肽一般在非生物胁迫生长条件中增强产量相关性状中的参与。
[0616] 如本文中定义的术语“非生物胁迫”意指以下任意一项或多项：水胁迫(因干旱或过量的水所致)、缺氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(因热、寒冷或冰冻温度所致)、化
学毒性胁迫和氧化胁迫。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自
水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，所述水胁迫是干旱胁迫。术语“盐胁
迫”不限于常见盐(NaCl)，不过可以是由NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等中一种或
多种盐引起的任意胁迫。
学毒性胁迫和氧化胁迫。 根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自
水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，所述水胁迫是干旱胁迫。术语“盐胁
迫”不限于常见盐(NaCl)，不过可以是由NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等中一种或
多种盐引起的任意胁迫。
[0617] 相对于在可比较胁迫条件下培育的对照植物，本发明方法的实施产生这样的植物，所述植物在非生物胁迫生长条件下具有增强的产量相关性状。 因此，根据本发明，
提供了用于在非生物胁迫生长条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法
包括调节(优选增加)植物中编码GRP多肽的核酸序列表达。 根据本发明的一个方面，
所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自以下一个或多个胁迫：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫
和离子胁迫。
提供了用于在非生物胁迫生长条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法
包括调节(优选增加)植物中编码GRP多肽的核酸序列表达。 根据本发明的一个方面，
所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自以下一个或多个胁迫：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫
和离子胁迫。
[0618] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在降低的营养物有效性条件下、尤其在降低的氮有效性条件下培育的植物增强的产量相关性状。 因
此，根据本发明，提供了用于在降低的营养物有效性条件下培育的植物中增强产量相关
性状的方法，所述方法包括调节(优选增加)植物中编码GRP多肽的核酸序列的表达。降
低的营养物有效性可以包含营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、
锰、铁和硼等的降低的有效性。
此，根据本发明，提供了用于在降低的营养物有效性条件下培育的植物中增强产量相关
性状的方法，所述方法包括调节(优选增加)植物中编码GRP多肽的核酸序列的表达。降
低的营养物有效性可以包含营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、
锰、铁和硼等的降低的有效性。
[0619] 本发明包括通过本发明方法可获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞。所述植物、其部分或植物细胞包含编码如上文定义的GRP多肽(优选地异戊烯基转移酶
(IPT)多肽)的核酸转基因。
(IPT)多肽)的核酸转基因。
[0620] 本发明也提供了基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码GRP多肽的核酸序列。 所述基因构建体可以插入适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目的
基因的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本
发明方法中的用途。
基因的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本
发明方法中的用途。
[0621] 更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
[0622] (i)编码如上文定义的GRP多肽(优选异戊烯基转移酶(IPT)多肽)的核酸序列；
[0623] (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0624] (iii)转录终止序列。
[0625] 优选地，编码GRP多肽的核酸序列如上文定义。 术语“调控序列”和“终止序列”如本文中的定义。
[0626] 用包含任意上述核酸序列的载体转化植物。 技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。 该目的序列有
效地与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
效地与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
[0627] 有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或人工的，可以用来驱动所述核酸序列的表达。种子特异性启动子是在本发明方法中特别有用的。 对于多种启动子类型的
定义，见本文中的“定义”部分。
定义，见本文中的“定义”部分。
[0628] 应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：131表示的编码GRP多肽的核酸序列，本发明的应用也不限于编码GRP多肽的核酸序列在受种子特异性启动子驱动时的
表达。
表达。
[0629] 种子特异性启动子优选地是谷醇溶蛋白(prolamin)启动子，优选地是来自稻的谷醇溶蛋白启动子。 还优选地，所述谷醇溶蛋白启动子由基本上与SEQ ID NO：133相
似的核酸序列表示，最优选地该谷醇溶蛋白启动子如SEQ ID NO：133所表示。 对于种
子特异性启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分的表2。
似的核酸序列表示，最优选地该谷醇溶蛋白启动子如SEQ ID NO：133所表示。 对于种
子特异性启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分的表2。
[0630] 任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。 额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。 本领域技术人员将知道可能适用于实施本发
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
[0631] 本发明的基因构建体还可以包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。 一个例子是当需要基因构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
[0632] 为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报道基因)。因此，所述基因构建体可以任
选地包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再
需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本
领域已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
选地包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再
需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本
领域已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
[0633] 本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中导入并表达编码如上文所定义的
GRP多肽(优选异戊烯基转移酶(IPT)多肽)的核酸序列。
GRP多肽(优选异戊烯基转移酶(IPT)多肽)的核酸序列。
[0634] 更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强产量相关性状，其中所述方法包括：
[0635] (i)在植物、植物部分或植物细胞中导入并表达编码GRP多肽的核酸序列；和
[0636] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物、植物部分或植物细胞。
[0637] (i)的核酸序列可以是能够编码如本文中定义的GRP多肽的任意核酸序列。
[0638] 所述核酸序列可以直接导入植物细胞或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸序列优选地通过转化作用导入植
物。 术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
物。 术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0639] 遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的全部方法再生。 合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或 和Willmitzer的出版物中找到。
[0640] 通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
[0641] 在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析对目的基因的存在性、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，新导入的DNA的
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
[0642] 产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
[0643] 本发明明确地扩展至由本文中所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。 本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
[0644] 本发明也包括含有编码如本文以上所定义GRP多肽的分离核酸序列的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。 对于本发明方法中所用核酸转基因或载体、表
达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的
全部植物。
达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的
全部植物。
[0645] 本发明的方法有利地适用于任意植物。 在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。 作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃
薯和烟草。 还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包括甘蔗。 更优选
地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、
黑小麦、高粱和燕麦。
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。 作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃
薯和烟草。 还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包括甘蔗。 更优选
地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、
黑小麦、高粱和燕麦。
[0646] 本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。 本发明进一步涉及了衍生自、优选直接衍生自此种植物的可
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
[0647] 根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。 用于增加核酸序列或基因或基因产物表达的方法是本领域中充分经文献报道的并且在定义部分中提供了例子。
[0648] 如上所述，用于调节(优选地增加)编码GRP多肽的核酸序列表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码GRP多肽的核酸序列；但是，实施本方法的效果，即增
强产量相关性状也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内
的其他熟知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
强产量相关性状也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内
的其他熟知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
[0649] 本发明也包括编码如本文中所述GRP多肽的核酸序列的用途，和这些GRP多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。
[0650] 编码本文中所述GRP多肽的核酸序列或GRP多肽自身可以用于育种程序中，在所述育种程序中鉴定到可以遗传地与编码GRP多肽的基因连锁的DNA标记。所述基因/
核酸序列或GRP多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育
种程序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
核酸序列或GRP多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育
种程序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
[0651] 编码GRP多肽的核酸序列/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而导入等位变
异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随
后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致增强产量相
关性状的序列的优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植
物的生长性能而实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴
定到优异等位变体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组
合。
异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随
后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致增强产量相
关性状的序列的优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植
物的生长性能而实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴
定到优异等位变体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组
合。
[0652] 编码GRP多肽的核酸序列也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其一部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。 此类信息可以用于植物育种
中，以开发具有所希望表型的品系。编码GRP多肽的核酸序列的这种用途仅需要具有至
少15个核苷酸长度的核酸序列。 编码GRP多肽的核酸序列可以用作限制性片段长度多
态性(RFLP)标记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch
EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码GRP的核酸
序列探测。 所得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)
Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸序列可以用来探测含
有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个
体代表具有定义的遗传杂交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编
码GRP多肽的核酸序列在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)
Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
中，以开发具有所希望表型的品系。编码GRP多肽的核酸序列的这种用途仅需要具有至
少15个核苷酸长度的核酸序列。 编码GRP多肽的核酸序列可以用作限制性片段长度多
态性(RFLP)标记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch
EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码GRP的核酸
序列探测。 所得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)
Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸序列可以用来探测含
有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个
体代表具有定义的遗传杂交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编
码GRP多肽的核酸序列在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)
Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
[0653] 在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。 许多出版物描述了使用以上概述的方法
学或其变例对特定eDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
学或其变例对特定eDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
[0654] 所述核酸序列探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第
319-346页及其中引用的参考文献)。
319-346页及其中引用的参考文献)。
[0655] 在另一个实施方案中，所述核酸序列探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。 尽管当前的FISH作图法支持使用大
的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度
的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度
的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
[0656] 用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。 方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：
95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、
等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)NucleicAcid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中
使用的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图
的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序
列差异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、
等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)NucleicAcid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中
使用的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图
的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序
列差异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
[0657] 如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状的植物。 这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
[0658] 在一个实施方案中，本发明涉及总结如下的主题：
[0659] 条目63：在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括在植物中调节(优选增加)编码GRP多肽的核酸序列的表达以及任选地选择具有增强的产量相关
性状的植物，其中所述GRP多肽是如SEQ IDNO：132所表示的异戊烯基转移酶(IPT)多
肽或其直向同源物、旁系同源物或同源物。
性状的植物，其中所述GRP多肽是如SEQ IDNO：132所表示的异戊烯基转移酶(IPT)多
肽或其直向同源物、旁系同源物或同源物。
[0660] 条目64：根据条目63的方法，其中所述如SEQ ID NO：132所示的GRP多肽以及其直向同源物、旁系同源物或同源物属于具有InterPro进入IPR002627和IPR011593
的tRNA异戊烯基转移酶家族或者包含根据如图13中所示的共有序列的结构域或基序。
的tRNA异戊烯基转移酶家族或者包含根据如图13中所示的共有序列的结构域或基序。
[0661] 条目65：根据条目63或64的方法，其中所述GRP多肽与SEQ IDNO：132所表示的GRP多肽或者与实施例1的表A4中所给出的任何多肽序列以优选增加的顺序具有
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或
更多的氨基酸序列同一性。
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或
更多的氨基酸序列同一性。
[0662] 条目66：根据任一前述条目63至65的方法，其中所述编码GRP多肽的核酸序列由下述表示：SEQ ID NO：131的核酸序列或其部分，或能够与SEQ ID NO：131的核
酸序列或其部分杂交的序列，或者能够与实施例1的表A4中给出的任一核酸序列SEQ ID
NO杂交的序列。
酸序列或其部分杂交的序列，或者能够与实施例1的表A4中给出的任一核酸序列SEQ ID
NO杂交的序列。
[0663] 条目67：根据任一前述条目63至66的方法，其中所述调节(优选增加)的表达通过在植物中导入和表达编码所述GRP多肽的核酸序列来实现。
[0664] 条目68：根据任一前述条目63至67的方法，其中所述增强的产量相关性状包括以下一种或多种：相对于对照植物提高的每株植物的总种子产量、提高的饱满种子
数、提高的种子总数以及提高的收获指数。
数、提高的种子总数以及提高的收获指数。
[0665] 条目69：根据任一前述条目63至68的方法，其中所述调节的表达是增加的表达。
[0666] 条目70：根据任一前述条目63至69的方法，其中所述核酸序列与种子特异性启动子，优选与谷醇溶蛋白启动子，最优选与来自稻的谷醇溶蛋白启动子有效连接。
[0667] 条目71：根据任一前述条目63至70的方法，其中所述编码GRP多肽的核酸序列是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae)，更优选
来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0668] 条目72：通过根据任一前述条目63至71的方法可获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞，其中所述植物、其部分或植物细胞包含编码GRP多肽的核酸转基因。
[0669] 条目73：构建体，其包含
[0670] (a)编码如条目63至65所定义的GRP多肽的核酸序列；
[0671] (b)一个或多个能够驱动(a)的核酸序列表达的调控序列；以及任选地
[0672] (c)转录终止序列。
[0673] 条目74：根据条目73的构建体，其中所述调控序列之一是种子特异性启动子，优选谷醇溶蛋白启动子，最优选来自稻的谷醇溶蛋白启动子。
[0674] 条目75：根据条目73至75的任一项的构建体在制备下述植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，特别是提高的每株植物的总种
子产量、提高的饱满种子数、提高的种子总数以及提高的收获指数。
子产量、提高的饱满种子数、提高的种子总数以及提高的收获指数。
[0675] 条目76：用根据条目74至75的任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0676] 条目77：用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有相对于对照植物增强的产量相关性状，所述方法包括：
[0677] (i)在植物、植物部分或植物细胞中导入和表达核酸序列，所述核酸序列编码如条目63至65所定义的GRP多肽；以及
[0678] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物、植物部分或植物细胞。
[0679] 条目78：相对于对照植物具有增强的产量相关性状、特别是提高的每株植物的总种子产量、提高的饱满种子数、提高的种子总数以及提高的收获指数的转基因植物或
来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物从下述产生：编码如条目63至
65中所定义的GRP多肽的核酸序列的增加的表达。
来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物从下述产生：编码如条目63至
65中所定义的GRP多肽的核酸序列的增加的表达。
[0680] 条目79：根据条目72、76或78的转基因植物，或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸
麦、黑小麦、高粱和燕麦。
麦、黑小麦、高粱和燕麦。
[0681] 条目80：根据条目79的包含编码GRP多肽的核酸序列的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为种子。
[0682] 条目81：来自根据条目79的植物和/或来自根据条目80的植物的可收获部分的产品。
[0683] 条目81：编码GRP多肽的核酸序列在植物中相对于对照植物增强产量相关性状、特别是提高每株植物的总种子产量、提高饱满种子数、提高种子总数以及提高收获
指数中的用途。
指数中的用途。
[0684] 在本发明的一个实施方案中，现在已经发现：调节植物中编码STO多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。 根据第一实施方案，本
发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码
STO多肽的核酸表达。
发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码
STO多肽的核酸表达。
[0685] 用于调节(优选提高)编码STO多肽的核酸表达的优选方法是在植物中导入并表达编码STO多肽的核酸。
[0686] 对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任意称谓意指如本文中定义的STO多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任意称谓意指能够编码这种STO多肽的核
酸。 待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白
质类型的任意核酸，下文也称作“STO核酸”或“STO基因”。
酸。 待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白
质类型的任意核酸，下文也称作“STO核酸”或“STO基因”。
[0687] 本文定义的“STO多肽”涉及包含至少一个B框结构域的任何多肽。 B框结构域是在多种来源的蛋白质中保守的氨基酸结构域，所述来源包括原核和真核生物。 B框
结构域约40个氨基酸长，在关键位置包含保守的半胱氨酸残基和/或组氨酸残基，从而
所述结构域被分成与锌离子配位中所涉及的锌指类似的三级结构。 NMR分析显示B框
结构包含两个β链、两个螺旋转角和三个延伸的环区域(不同于任何其它锌结合基序)
(Borden等人1995EMBO J.1995年12月1日；14(23)：5947-56)。
结构域约40个氨基酸长，在关键位置包含保守的半胱氨酸残基和/或组氨酸残基，从而
所述结构域被分成与锌离子配位中所涉及的锌指类似的三级结构。 NMR分析显示B框
结构包含两个β链、两个螺旋转角和三个延伸的环区域(不同于任何其它锌结合基序)
(Borden等人1995EMBO J.1995年12月1日；14(23)：5947-56)。
[0688] 包含B框结构域的蛋白质可以在特定的数据库例如Pfam和Interpro中找到。 在Interpro数据库的release15.1中的B框的结构域的登录号是IPR000315，在Pfam版本21.0
中是PF00643。
中是PF00643。
[0689] 基于在不同蛋白质中发现的B框结构域的序列比较，可能定义代表了B框结构域的共有序列。 例如Reymond等人(EMBO J.2001年5月1日；20(9)：2140-51)能
够将共有序列定义至在人的TRIM蛋白质中存在的两个B框结构域，如对于B框1，由
CXX(C/D)X(7-12)CXXCXXXXCXX(C/H)X(3-4)HX(4-9)H所代表，对于B框2，由
CXXHX(7-9)CXX(C/D/E/H)XXXXCXXCX(3-6)H(X-4)(H/C)所代表。 在植物来源
的许多STO蛋白质的B框结构域中发现的共有序列由SEQ ID NO：221(CX2CX16CX2C)
所表示。 所有B框结构域的标签特征是存在至少4个氨基酸残基，通常半胱氨酸和/或
组氨酸残基具有推定的结合锌离子的能力。
够将共有序列定义至在人的TRIM蛋白质中存在的两个B框结构域，如对于B框1，由
CXX(C/D)X(7-12)CXXCXXXXCXX(C/H)X(3-4)HX(4-9)H所代表，对于B框2，由
CXXHX(7-9)CXX(C/D/E/H)XXXXCXXCX(3-6)H(X-4)(H/C)所代表。 在植物来源
的许多STO蛋白质的B框结构域中发现的共有序列由SEQ ID NO：221(CX2CX16CX2C)
所表示。 所有B框结构域的标签特征是存在至少4个氨基酸残基，通常半胱氨酸和/或
组氨酸残基具有推定的结合锌离子的能力。
[0690] 优选的用于本发明方法中的STO多肽包含至少一个，更优选两个B框结构域，所述结构域具有如CX2CX16CX2C(SEQ ID NO：221)所示的共有序列。
[0691] 在SEQ ID NO：169中发现的B框结构域如SEQ ID NO：219和SEQ IDNO：220所表示。 更优选的用于本发明方法中的STO多肽包含至少一个，更优选两个B框结
构域，所述结构域与SEQ ID NO：219或SEQ ID NO：220具有至少50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。
构域，所述结构域与SEQ ID NO：219或SEQ ID NO：220具有至少50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。
[0692] 可选地，STO多肽中的B框结构域可以通过实施与包含B框结构域的已知多肽的序列比较并且建立在B框结构域区域中的相似性来鉴定。 可以使用本领域熟知的任何
方法例如Blast算法来比对序列。与给定的序列发生比对的概率被作为鉴定类似多肽的基
础。 通常用来表示此类概率的参数被称为e值。 E值是S分数可靠性的量度。 S分数是
查询与所显示序列的相似性的量度。e值描述了预期给定S分数随机发生有多经常。e值
界点(cut-off)可以高至1.0。 来自使用STO多肽作为查询序列的BLAST搜索输出的可
-5 -10 -15 -20 -25 -50 -75 -100
信的e-值的典型阈值可以低于1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、
-200 -300 -400 -500 -600 -700 -800
1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 和1.e 。 优选的用于本发明方法中的STO
多肽包含至少一个，更优选两个B框结构域，所述结构域具有下述序列，所述序列以优
-5 -5 -10 -15 -20 -25 -50 -75 -100
选增加的顺序具有低于e (＝10 )、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、
-200 -300 -400 -500 -600 -700 -800
1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 和1.e 的e值(在与SEQ ID NO：219或
SEQ ID NO：220或在已知STO多肽中发现的任何B框结构域(如表A中所列出的那些)
的比对中)。
方法例如Blast算法来比对序列。与给定的序列发生比对的概率被作为鉴定类似多肽的基
础。 通常用来表示此类概率的参数被称为e值。 E值是S分数可靠性的量度。 S分数是
查询与所显示序列的相似性的量度。e值描述了预期给定S分数随机发生有多经常。e值
界点(cut-off)可以高至1.0。 来自使用STO多肽作为查询序列的BLAST搜索输出的可
-5 -10 -15 -20 -25 -50 -75 -100
信的e-值的典型阈值可以低于1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、
-200 -300 -400 -500 -600 -700 -800
1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 和1.e 。 优选的用于本发明方法中的STO
多肽包含至少一个，更优选两个B框结构域，所述结构域具有下述序列，所述序列以优
-5 -5 -10 -15 -20 -25 -50 -75 -100
选增加的顺序具有低于e (＝10 )、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、
-200 -300 -400 -500 -600 -700 -800
1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 、1.e 和1.e 的e值(在与SEQ ID NO：219或
SEQ ID NO：220或在已知STO多肽中发现的任何B框结构域(如表A中所列出的那些)
的比对中)。
[0693] 优选地，用于本发明方法中的STO多肽序列，当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，与包含如SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列(图中
OS04g0540200)的STO多肽的组聚类，而不与任何其他组聚类。
OS04g0540200)的STO多肽的组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0694] 可选地或额外地，本文定义的“STO多肽”涉及任何多肽，所述多肽以优选增加的顺序与如SEQ ID NO：169或由SEQ ID NO：171表示的STO多肽或者与本文实施
例1的表A5中所给出的任何多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多的多肽序列同一性。
例1的表A5中所给出的任何多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多的多肽序列同一性。
[0695] 术语“结构域”和“基序”在本文中的“定义”部分定义。 存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
[0696] 用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。 GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸或氨
基酸序列范围或选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸或氨
基酸序列范围或选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
[0697] 另外，STO多肽(至少以它们的天然形式)一般在转基因植物(优选稻)中表达时，在组成型启动子的调控下，产生对开花时间的调节，通常缩短开花时间。 用于产生
转基因植物以及测量开花时间的工具和技术是本领域熟知的。 其它细节提供在实施例部
分中。
转基因植物以及测量开花时间的工具和技术是本领域熟知的。 其它细节提供在实施例部
分中。
[0698] 本发明通过用SEQ ID NO：168所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：169的多肽序列。 但是，本发明的实施不限于这些序列；
本发明的方法可以有利地使用任意编码STO的核酸或如本文中定义的STO多肽实施。
本发明的方法可以有利地使用任意编码STO的核酸或如本文中定义的STO多肽实施。
[0699] 编码STO多肽的核酸的例子在本文实施例1的表A5中给出。此类核酸用于实施本发明的方法中。在实施例1的表A5中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：169所表示
的STO多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源
物”如本文中定义。 其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻
易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使
用实施例1的表A5中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数
据库进行BLAST。 当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准
默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。
可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序
列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序
列是SEQ ID NO：168或SEQ ID NO：169的情况下，第二BLAST因而将针对稻序列进
行)。 随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。 若来自第一blast的高阶位命中是
源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理
想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生
查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生
属于最高命中当中的该查询序列。
的STO多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源
物”如本文中定义。 其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻
易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使
用实施例1的表A5中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数
据库进行BLAST。 当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准
默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。
可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序
列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序
列是SEQ ID NO：168或SEQ ID NO：169的情况下，第二BLAST因而将针对稻序列进
行)。 随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。 若来自第一blast的高阶位命中是
源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理
想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生
查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生
属于最高命中当中的该查询序列。
[0700] 优选的同源物
[0701] 高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。 E-值的计算是本领域熟知的。 除了E-值外，比较过程
也通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长
度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，
随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系同源物。
也通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长
度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，
随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系同源物。
[0702] 核酸变体也可以用于实施本发明的方法中。 此类变体的例子包括编码在实施例1的表A5中所给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍
生物”如本文中定义。 还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码在实施例1的表A5
中所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。 用于本发明
方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功
能活性。
生物”如本文中定义。 还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码在实施例1的表A5
中所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。 用于本发明
方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功
能活性。
[0703] 在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码STO多肽的核酸的部分、与编码STO多肽的核酸杂交的核酸、编码STO多肽的核酸的剪接变体、编码STO多肽的核
酸的等位变体和通过基因改组获得的编码STO多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、
“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中所述。
酸的等位变体和通过基因改组获得的编码STO多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、
“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中所述。
[0704] 编码STO多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植
物中导入并表达实施例1的表A5中给出的任一核酸序列的一部分或编码实施例1的表A5
中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
物中导入并表达实施例1的表A5中给出的任一核酸序列的一部分或编码实施例1的表A5
中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
[0705] 核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。 所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合
有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对于该
蛋白质部分所预测的多肽更大。
有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对于该
蛋白质部分所预测的多肽更大。
[0706] 在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的STO多肽，并且具有如实施例1的表A5中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。 优选地，此部分是在实施例1
的表A中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例1的表A5中所给出的任一氨基酸
序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。 优选地，该部分的长度是至少100、
200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核
苷酸，所述连续核苷酸为实施例1的表A5中给出的任一核酸序列或为编码在实施例1的
表A5中所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。 最优选地，该部
分是SEQ ID NO：168的核酸的一部分。 优选地，该部分编码氨基酸序列，其中所述的
氨基酸序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，优选地，用于本
发明方法中的STO多肽序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，
与包含如SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO多肽的组聚
类，而不与任何其他组聚类。
的表A中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例1的表A5中所给出的任一氨基酸
序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。 优选地，该部分的长度是至少100、
200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核
苷酸，所述连续核苷酸为实施例1的表A5中给出的任一核酸序列或为编码在实施例1的
表A5中所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。 最优选地，该部
分是SEQ ID NO：168的核酸的一部分。 优选地，该部分编码氨基酸序列，其中所述的
氨基酸序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，优选地，用于本
发明方法中的STO多肽序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，
与包含如SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO多肽的组聚
类，而不与任何其他组聚类。
[0707] 在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如本文中定义的STO多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。
[0708] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与实施例1的表A5中给出的任一核酸杂交的核酸，或包括在植物中导入并表
达这样的核酸，其中所述核酸能够与编码在实施例1的表A5中给出的任意核酸序列的直
向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
达这样的核酸，其中所述核酸能够与编码在实施例1的表A5中给出的任意核酸序列的直
向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
[0709] 在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的STO多肽，其具有如实施例1的表A5中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。 优选地，该杂交序列能够
与实施例1的表A5中给出的任一核酸或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的一
部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与核酸杂交，其中所述的核酸编码在实施例1
的表A5中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能
够与如SEQ ID NO：168所表示的核酸或与其一部分杂交。
与实施例1的表A5中给出的任一核酸或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的一
部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与核酸杂交，其中所述的核酸编码在实施例1
的表A5中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能
够与如SEQ ID NO：168所表示的核酸或与其一部分杂交。
[0710] 优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列是全长的且当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，与包含如SEQ ID
NO：169所示的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO多肽的组聚类，而不与任何其
他组聚类。
NO：169所示的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO多肽的组聚类，而不与任何其
他组聚类。
[0711] 在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的STO多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
[0712] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A5中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码实施例1的表A5中所
给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
[0713] 优选的剪接变体是由SEQ ID NO：168所表示的核酸的剪接变体，或是编码SEQID NO：169的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由该剪接变体编码
的氨基酸序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，与包含如SEQ
ID NO：169所示的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO多肽的组聚类，而不与任何
其他组聚类。
的氨基酸序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，与包含如SEQ
ID NO：169所示的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO多肽的组聚类，而不与任何
其他组聚类。
[0714] 在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义STO多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。
[0715] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A5中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中导入并表达编码
在实施例1的表A5中所给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核
酸的等位变体。
在实施例1的表A5中所给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核
酸的等位变体。
[0716] 本发明方法中有用的等位变体具有如SEQ ID NO：169的STO多肽和实施例1的表A中所述任意氨基酸基本上相同的生物学活性。 等位变体存在于自然界中，并且在本
发明的方法中包括这些天然等位基因的用途。优选地，所述等位变体是SEQ ID NO：168
的等位变体或编码SEQ ID NO：169的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。 优
选地，由该等位变体编码的氨基酸序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化
系统树时，与包含如SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO
多肽的组聚类，而不与任何其他组聚类。
发明的方法中包括这些天然等位基因的用途。优选地，所述等位变体是SEQ ID NO：168
的等位变体或编码SEQ ID NO：169的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。 优
选地，由该等位变体编码的氨基酸序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化
系统树时，与包含如SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO
多肽的组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0717] 基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的STO多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
[0718] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达在实施例1的表A5中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中导入并表达核
酸的变体，所述的核酸编码在实施例1的表A5中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、
旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
酸的变体，所述的核酸编码在实施例1的表A5中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、
旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
[0719] 优选地，由通过基因改组直接或间接获得的变体核酸所编码的氨基酸序列当用于构建进化系统树例如图16中所描述的进化系统树时，与包含如SEQ ID NO：169所示
的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO多肽的组聚类，而不与任何其他组聚类。
的氨基酸序列(图中OS04g0540200)的STO多肽的组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0720] 另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。 几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编辑)。
[0721] 编码STO多肽的核酸可以衍生自任何天然来源或人工来源。 该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。 优选地，
编码STO多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自单子叶植物，更优选地来自禾本科
(Poaceae)，最优选地该核酸来自稻(Oryzasativa)。
编码STO多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自单子叶植物，更优选地来自禾本科
(Poaceae)，最优选地该核酸来自稻(Oryzasativa)。
[0722] 本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。 尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的产量、尤其提高的种子产量的植物。 术
语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0723] 此处中对增强的产量相关性状的称谓意思是相对于对照植物早期(幼苗)萌发势提高和改变的开花时间(更特别地更短的开花时间)。优选地，开花时间缩短了至少1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24或25天，或者缩短了与相对于对照植物相比的时间的至少5％、10％、15％、
20％或25％。
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24或25天，或者缩短了与相对于对照植物相比的时间的至少5％、10％、15％、
20％或25％。
[0724] 以谷物为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每公顷或英亩已建立的植物数目增加、每株植物穗数的提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
[0725] 本发明提供了用于相对于对照植物提高早期(幼苗)萌发势和改变开花时间(特别是缩短植物的开花时间)的方法，所述方法包括调节(优选增加)植物中编码如本文中
定义的STO多肽的核酸表达。
定义的STO多肽的核酸表达。
[0726] 由于本发明的转基因植物具有提高的产量，故相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其生活周期的至少部分期间)表现提高的生长
速率。
速率。
[0727] 提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整个植物。具有提到的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。 植物的生活周
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的或提高的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允
许植物较晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间
获得)。若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并
收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类
似地，若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并
收获谷物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些
作物植物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获
周期可以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次
数(即在一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更
广泛的地理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期
(晚季)的不利环境条件决定。 这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可
以通过从生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植
物大小所花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的或提高的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允
许植物较晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间
获得)。若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并
收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类
似地，若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并
收获谷物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些
作物植物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获
周期可以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次
数(即在一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更
广泛的地理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期
(晚季)的不利环境条件决定。 这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可
以通过从生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植
物大小所花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
[0728] 根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的生长速率的植物。 因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，所
述方法包括在植物中调节(优选增加)编码如本文中定义的STO多肽的核酸表达。
述方法包括在植物中调节(优选增加)编码如本文中定义的STO多肽的核酸表达。
[0729] 与对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，产量和/或生长速率的提高均出现。 植物一般通过生长得更慢而应答于胁迫暴
露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一方面，轻度胁迫在本文中定
义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不
能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫
植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于
14％、13％、12％、11％或10％或更低。 由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的
进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对
于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环
境)胁迫。 非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁
迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、
氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。 生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和
昆虫引起的那些胁迫。
露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一方面，轻度胁迫在本文中定
义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不
能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫
植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于
14％、13％、12％、11％或10％或更低。 由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的
进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对
于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环
境)胁迫。 非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁
迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、
氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。 生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和
昆虫引起的那些胁迫。
[0730] 具体而言，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件开展以产生相对于对照植物具有提高的产量的植物。 如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，
非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分
子变化。 干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导
生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁
迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为
渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱
胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常
激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼
容性溶质和生长停滞。 如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些
环境条件。 本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分
子变化。 干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导
生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁
迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为
渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱
胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常
激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼
容性溶质和生长停滞。 如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些
环境条件。 本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
[0731] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物提高的产量。 因此，根据本发明，提供了用于在非胁
迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中
编码STO多肽的核酸表达。
迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中
编码STO多肽的核酸表达。
[0732] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在营养缺乏条件下、尤其在缺氮条件下培育的植物提高的产量。 因此，根据本发明，提供了用于在营
养缺乏条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中编码STO多肽的
核酸表达。 营养缺乏可以因营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、
锰、铁和硼等缺少所致。
养缺乏条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中编码STO多肽的
核酸表达。 营养缺乏可以因营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、
锰、铁和硼等缺少所致。
[0733] 本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物或其部分包含编码如上文定义的STO多肽的核酸转基因。
[0734] 本发明也提供了基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码STO多肽的核酸。 所述基因构建体可以插入适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目的基因
的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明
方法中的用途。
的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明
方法中的用途。
[0735] 更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
[0736] (a)编码如上文定义的STO多肽的核酸；
[0737] (b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0738] (c)转录终止序列。
[0739] 优选地，编码STO多肽的核酸如上文定义。 术语“调控序列”和“终止序列”如本文中的定义。
[0740] 用包含任意上述核酸的载体转化植物。 技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。 该目的序列有效地
与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
[0741] 有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来驱动所述核酸序列的表达。组成型启动子是方法中特别有用的。多种启动子类型的定义参见本文“定
义”部分。
义”部分。
[0742] 应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：168表示的编码STO多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码STO多肽的核酸在受组成型启动子驱动时的表达。
[0743] 组成型启动子优选地是GOS2启动子，优选地是来自稻的GOS2启动子。 还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：218相似的核酸序列表示，最优选地该
组成型启动子如SEQ ID NO：218所表示。 对于组成型启动子的其他例子，见本文中的
“定义”部分中的表2。
组成型启动子如SEQ ID NO：218所表示。 对于组成型启动子的其他例子，见本文中的
“定义”部分中的表2。
[0744] 任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。 额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。 本领域技术人员将知道可能适用于实施本发
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
[0745] 本发明的基因构建体还可以包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。 一个例子是当需要基因构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
[0746] 为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报道基因)。因此，所述基因构建体可以任选地
包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再需要
所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本领域
已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再需要
所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本领域
已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
[0747] 本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中导入并表达编码如上文所定义的
STO多肽的任意核酸。
STO多肽的任意核酸。
[0748] 更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增加的增强产量相关性状、尤其提高的(早期)幼苗萌发势和/或改变的开花时间(更特别
地植物的更短的开花时间)，其中所述方法包括：
地植物的更短的开花时间)，其中所述方法包括：
[0749] (i)在植物或植物细胞中导入并表达编码STO多肽的核酸；和
[0750] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
[0751] (i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的STO多肽的任意核酸。
[0752] 所述核酸可以直接导入植物细胞或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。 根据本发明的优选特征，该核酸优选地通过转化作用导入植物。 术
语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0753] 遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的全部方法再生。 合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或 和Willmitzer的出版物中找到。
[0754] 通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
[0755] 在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析对目的基因的存在性、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，新导入的DNA的
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
[0756] 产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
[0757] 本发明明确地扩展至由本文中所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。 本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
[0758] 本发明也包括含有编码如本文以上所定义STO多肽的分离核酸的宿主细胞。 本发明的优选宿主细胞是植物细胞。 对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体
或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植物。
或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植物。
[0759] 本发明的方法有利地适用于任意植物。 在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、油菜(rapeseed)、
棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包
括甘蔗。 更优选地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大
麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、和燕麦。
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、油菜(rapeseed)、
棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包
括甘蔗。 更优选地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大
麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、和燕麦。
[0760] 本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。 本发明进一步涉及了衍生自、优选直接衍生自此种植物的可
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
[0761] 根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。 用于增加核酸或基因或基因产物表达的方法是本领域中充分经文献报道的并且在定义部分中提供了例子。
[0762] 如上所述，用于调节(优选增加)编码STO多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码STO多肽的核酸；但是，实施本方法的效果，即增强产量相关
性状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内的其他熟
知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
性状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内的其他熟
知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
[0763] 本发明也包括编码如本文中所述STO多肽的核酸的用途，和这些STO多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。
[0764] 编码本文中所述STO多肽的核酸或STO多肽自身可以用于育种程序中，在所述育种程序中鉴定到可以遗传地与编码STO多肽的基因连锁的DNA标记。 所述核酸/基
因或STO多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程
序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
因或STO多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程
序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
[0765] 编码STO多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。 此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而导入等位变异；备
选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随后进行
等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致产量提高的序列的
优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而
实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变
体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随后进行
等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致产量提高的序列的
优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而
实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变
体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
[0766] 编码STO多肽的核酸也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其一部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。 此类信息可以用于植物育种中，
以开发具有所希望表型的品系。编码STO多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核
苷酸长度的核酸序列。 编码STO多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标
记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis
T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码STO多肽的核酸探测。 所
得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：
174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制
性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的
遗传杂交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编码STO多肽的核酸
在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：
314-331)。
以开发具有所希望表型的品系。编码STO多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核
苷酸长度的核酸序列。 编码STO多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标
记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis
T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码STO多肽的核酸探测。 所
得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：
174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制
性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的
遗传杂交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编码STO多肽的核酸
在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：
314-331)。
[0767] 在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。 许多出版物描述了使用以上概述的方法
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
[0768] 所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996， 第
319-346页及其中引用的参考文献)。
319-346页及其中引用的参考文献)。
[0769] 在另一个实施方案中，所述核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。 尽管当前的FISH作图法支持使用大的
克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的
改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的
改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
[0770] 用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。 方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、
PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、等
位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用
的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图的方
法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序列差
异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、等
位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用
的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图的方
法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序列差
异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
[0771] 如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状的植物。 这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
[0772] 在本说明书中使用的术语“表A5”是为了指定表A5a和表A5b的内容。 本说明书中使用的术语“表A5a”是为了指定表A5a中的内容。 本说明书中使用的术语“表
A5b”是为了指定表A5b中的内容。 在一个优选的实施方案中，术语“表A5”意思是
表A5b。
A5b”是为了指定表A5b中的内容。 在一个优选的实施方案中，术语“表A5”意思是
表A5b。
[0773] 在一个实施方案中，本发明涉及总结如下的主题：
[0774] 条目82：在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码STO多肽的核酸的表达，其中所述STO多肽包含B框结构域。
[0775] 条目83：根据条目82的方法，其中所述B框结构域包含如SEQ IDNO：221所表示的共有序列。
[0776] 条目84：根据条目82或83的方法，其中所述STO多肽包含B框结构域，所述结构域与SEQ ID NO：219或SEQ ID NO：220具有至少50％、55％、60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。
70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。
[0777] 条目85：根据条目82至84的任一项的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达编码STO多肽的核酸来实现。
[0778] 条目86：根据条目82至85的任一项的方法，其中所述编码STO多肽的核酸编码表A5中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的一部分或者是能够与此类核酸杂交的核
酸。
酸。
[0779] 条目87：根据条目82至86的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A5中所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0780] 条目88：根据条目82至87的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的幼苗萌发势和/或改变的开花时间，优选更短的开花时间。
[0781] 条目89：根据条目82至88任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
[0782] 条目90：根据条目85至89中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
[0783] 条目91：根据条目82至90中任一项的方法，其中所述编码STO多肽的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，进一步优选来自禾本科(Poaceae)，更优选来自稻属
(Oryza)，最优选来自稻(Oryza sativa)。
(Oryza)，最优选来自稻(Oryza sativa)。
[0784] 条目92：植物或其部分(包括种子)，通过根据任何前述条目的方法可获得，其中所述植物或其部分包含编码STO多肽的重组核酸。
[0785] 条目93：包含选自以下的核酸序列的分离的核酸序列：
[0786] a)编码如SEQ ID NO：223和/或表A5b中所示的多肽的分离的核酸分子；
[0787] b)如SEQ ID NO：222和/或表A5b所示的分离的核酸分子；
[0788] c)分离的核酸分子，其作为遗传密码子简并性的结果，可以来自如表A5中所示的多肽序列并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
[0789] d)分离的核酸分子，其与多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并且赋予相对于对照
植物增强的产量相关性状，所述多核苷酸包含表A5中所示的核酸分子；
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并且赋予相对于对照
植物增强的产量相关性状，所述多核苷酸包含表A5中所示的核酸分子；
[0790] e)编码多肽并且赋予了相对于对照植物增强的产量相关性状的分离的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％、31％、
32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；
32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；
[0791] f)分离的核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
[0792] g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含图15中所示的共有序列或一个或多个多肽基序，并且所述分离的核酸分子优选地具有下述核酸分子所代表的活性，所述
核酸分子包含表A5中所示的多核苷酸；
核酸分子包含表A5中所示的多核苷酸；
[0793] h)编码多肽并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的分离的核酸分子，所述多肽具有如表A5中所示的蛋白质所代表的活性；
[0794] 以及
[0795] i)通过在严格杂交条件下用探针或用其片段筛选适当的核酸文库可获得的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)的核酸分子的互补序列，所述可获得的核酸分子具有与
(a)至(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt并且编码具有活性的多肽，所述活性由包含表A5中所示的多肽的
蛋白质所代表；
(a)至(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt并且编码具有活性的多肽，所述活性由包含表A5中所示的多肽的
蛋白质所代表；
[0796] 其中根据(a)至(i)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上不同于表A5a中所示的序列并且优选地编码下述蛋白质，所述蛋白质至少在一个或多个氨基酸上不同于表
A5a中所示的蛋白质序列。
A5a中所示的蛋白质序列。
[0797] 条目94：构建体，其包含
[0798] (a)在条目82至84和93的任一项中定义的编码STO多肽的核酸；
[0799] (b)一个或多个调控序列，其能够驱动(a)的核酸序列的表达，以及任选地
[0800] (c)转录终止序列。
[0801] 条目95：根据条目94的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
[0802] 条目96：根据条目94至95的任一项的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选提高的幼苗萌发势和/或改变的开
花时间(特别是更短的开花时间)的植物。
花时间(特别是更短的开花时间)的植物。
[0803] 条目97：用根据条目94至95的任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0804] 条目98：用于产生转基因植物的方法，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选提高的幼苗萌发势和/或改变的开花时间(特别是更短的开花时间)，
所述方法包括：
所述方法包括：
[0805] (i)在植物中导入和表达如条目82至84和93中任一项中所定义的编码STO多肽的核酸；和
[0806] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
[0807] 条目99：相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选提高的幼苗萌发势和/或改变的开花时间(特别是更短的开花时间)的转基因植物或来自所述转基因植物的
转基因植物细胞，所述转基因植物获得自如条目82至84和93的任一项中所定义的编码
STO多肽的核酸的增加的表达。
转基因植物细胞，所述转基因植物获得自如条目82至84和93的任一项中所定义的编码
STO多肽的核酸的增加的表达。
[0808] 条目100：根据条目92、97或99的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸
麦、黑小麦、高粱和燕麦。
麦、黑小麦、高粱和燕麦。
[0809] 条目101：根据条目100的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
[0810] 条目102：来自根据条目100的植物和/或来自根据条目101的植物可收获部分的产品。
[0811] 条目103：编码STO多肽的核酸在相对于对照植物提高幼苗萌发势和/或改变开花时间，特别是缩短开花时间中的用途。
[0812] 根据本发明的另一个实施方案，还提供了包含选自以下的多肽序列的分离的多肽：
[0813] (i)由条目93所表示的任一核酸所编码的氨基酸序列；
[0814] (ii)与(i)的氨基酸序列以优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的
氨基酸序列；
氨基酸序列；
[0815] (iii)上文(i)或(ii)中所给出的任何氨基酸序列的衍生物。
[0816] 在本发明的另一个实施方案中，现在已经发现：调节植物中编码UGE多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。 根据第一实施方案，本
发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码
UGE多肽的核酸表达。
发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码
UGE多肽的核酸表达。
[0817] 用于调节(优选增加)编码UGE多肽的核酸表达的优选方法是在植物中导入并表达编码UGE多肽的核酸。
[0818] 对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任意称谓意指UGE多肽。 下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任意称谓意指能够编码这种UGE多肽的核酸。 待导入植
物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核
酸，下文也称作“UGE核酸”或“UGE基因”。已经在以前描述了UGE多肽和UGE核
酸 (Maxwell 和 Robichon-Szulmajster(1960)；J.Biol.Chem.235(1960)308-312；Wilson，
D.B.和Hogness，D.S.(1964).J.Biol.Chem.2392469-2481；综述见FreyFASEB J.1996Mar；
10(4)：461-70；Thoden等人(1997)Biochemistry36：6294-6304；Dormann和Benning
1998；Shaw等人2003.Mol.Biochem.Parasitol.126，173-180；Barber等人2006)。
物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核
酸，下文也称作“UGE核酸”或“UGE基因”。已经在以前描述了UGE多肽和UGE核
酸 (Maxwell 和 Robichon-Szulmajster(1960)；J.Biol.Chem.235(1960)308-312；Wilson，
D.B.和Hogness，D.S.(1964).J.Biol.Chem.2392469-2481；综述见FreyFASEB J.1996Mar；
10(4)：461-70；Thoden等人(1997)Biochemistry36：6294-6304；Dormann和Benning
1998；Shaw等人2003.Mol.Biochem.Parasitol.126，173-180；Barber等人2006)。
[0819] “UGE多肽”包含差向异构酶结构域并且通常具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性。 差向异构酶结构域涉及不同长度的序列，平均在大约200个氨基酸长，在差向
异构酶中保守(InterPro参考IPR005886；Pfam参考：PF01370)。
异构酶中保守(InterPro参考IPR005886；Pfam参考：PF01370)。
[0820] UGE多肽可以通过搜索专门化数据库例如Pfam来发现(Finn等人Nucleic AcidsResearch(2006)Database Issue 34：D247-D251)。 Pfam编纂了覆盖许多常见蛋白质结
构域和家族的多重序列比对和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合和并且通过英国
Sanger研究所可使用。 Pfam数据库中所认为的可信任匹配是评分高于收集临界阈值的
那些序列。 差向异构酶结构域的收集临界阈值在Pfam HMM_fs方法中是-46.3并且在
PfamHMM_ls方法中是16.7。 但是，包含真实差向异构酶结构域的潜在匹配依旧可以低
于该收集界点。 优选地，在本发明方法中有用的UGE多肽是在其序列中具有超出Pfam
蛋白质结构域家族PF01370(已知为差向异构酶或NAD依赖性差向异构酶/脱水酶家族结
构域)的收集临界值的一个或多个结构域的蛋白质。
构域和家族的多重序列比对和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合和并且通过英国
Sanger研究所可使用。 Pfam数据库中所认为的可信任匹配是评分高于收集临界阈值的
那些序列。 差向异构酶结构域的收集临界阈值在Pfam HMM_fs方法中是-46.3并且在
PfamHMM_ls方法中是16.7。 但是，包含真实差向异构酶结构域的潜在匹配依旧可以低
于该收集界点。 优选地，在本发明方法中有用的UGE多肽是在其序列中具有超出Pfam
蛋白质结构域家族PF01370(已知为差向异构酶或NAD依赖性差向异构酶/脱水酶家族结
构域)的收集临界值的一个或多个结构域的蛋白质。
[0821] 可选地，多肽中的差向异构酶结构域可以通过实施与包含差向异构酶结构域的已知多肽的序列比较并且建立在差向异构酶结构域区域中的相似性来鉴定。 可以使用本
领域熟知的任何方法例如Blast算法来比对序列。与给定的序列发生比对的概率被作为鉴
定类似多肽的基础。 通常用来表示此类概率的参数被称为e值。 E值是S分数可靠性的
量度。S分数是查询与所显示序列的相似性的量度。e值描述了预期给定S分数随机发生
有多经常。 e值界点(cut-off)可以高至1.0。 来自使用差向异构酶多肽作为查询序列的
BLAST搜索输出的可信的e-值的典型阈值低于e-5(＝10-5)、1.e-10、1.e-15、1.e-20、
1.e-25、1.e-50、1.e-75、1.e-100、1.e-200、1.e-300、1.e-400、1.e-500、1.e-600、
1.e-700和1.e-800。 优选的用于本发明方法中的UGE多肽包含下述序列，所述序列
以优选增加的顺序具有低于e-5(＝10-5)、1.e-10、1.e-15、1.e-20、1.e-25、1.e-50、
1.e-75、1.e-100、1.e-200、1.e-300、1.e-400、1.e-500、1.e-600、1.e-700和1.e-800的e
值(在与已知UGE多肽中发现的差向异构酶结构域(如SEQ ID NO：225)的比对中)。
领域熟知的任何方法例如Blast算法来比对序列。与给定的序列发生比对的概率被作为鉴
定类似多肽的基础。 通常用来表示此类概率的参数被称为e值。 E值是S分数可靠性的
量度。S分数是查询与所显示序列的相似性的量度。e值描述了预期给定S分数随机发生
有多经常。 e值界点(cut-off)可以高至1.0。 来自使用差向异构酶多肽作为查询序列的
BLAST搜索输出的可信的e-值的典型阈值低于e-5(＝10-5)、1.e-10、1.e-15、1.e-20、
1.e-25、1.e-50、1.e-75、1.e-100、1.e-200、1.e-300、1.e-400、1.e-500、1.e-600、
1.e-700和1.e-800。 优选的用于本发明方法中的UGE多肽包含下述序列，所述序列
以优选增加的顺序具有低于e-5(＝10-5)、1.e-10、1.e-15、1.e-20、1.e-25、1.e-50、
1.e-75、1.e-100、1.e-200、1.e-300、1.e-400、1.e-500、1.e-600、1.e-700和1.e-800的e
值(在与已知UGE多肽中发现的差向异构酶结构域(如SEQ ID NO：225)的比对中)。
[0822] 优选的用于本发明方法中的UGE多肽涉及包含差向异构酶结构域的多肽，此类结构域与SEQ ID NO：275(在SEQ ID NO：225中所包含的代表差向异构酶结构域的序
列)以优选增加的顺序具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更多的
序列同一性。
列)以优选增加的顺序具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更多的
序列同一性。
[0823] 用于本发明方法中的UGE多肽的例子在表A6中给出。 在代表性UGE蛋白质(如SEQ ID NO：225所示)中的差向异构酶结构域的氨基酸坐标在表C中给出。在SEQ
ID NO：225中包含的差向异构酶结构域的序列在SEQID NO：275中给出。
ID NO：225中包含的差向异构酶结构域的序列在SEQID NO：275中给出。
[0824] 优选的用于本发明方法中的UGE多肽是下述那些，所述多肽与表A6中所给出的任何多肽以优选增加的顺序具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
98％或更多的序列同一性。
98％或更多的序列同一性。
[0825] UGE多肽通常包含与其酶促活性相关的保守基序，例如i)参与UGE蛋白质与辅因子NAD+结合的基序8，如GXXGXXG(SEQ ID NO：276)所示，以及ii)位于活性位
点的基序9，如YGRT/S(SEQ ID NO：277)所示，其中所述G可以被任何其它非极性氨
基酸所取代，R可以被任何其它极性氨基酸所取代。
点的基序9，如YGRT/S(SEQ ID NO：277)所示，其中所述G可以被任何其它非极性氨
基酸所取代，R可以被任何其它极性氨基酸所取代。
[0826] 除了差向异构酶结构域外，UGE多肽还可以包含一个或多个下列保守基序：i)如SEQ ID NO：278所示的基序10，其包含NAD+结合基序；ii)如SEQ ID NO：279所
示的基序11以及iii)如SEQ ID NO：280所示的基序12。 图19显示了保守基序基序8
至基序12，以及它们在如SEQ ID NO：225中所示的UGE多肽序列中的相对位置。
示的基序11以及iii)如SEQ ID NO：280所示的基序12。 图19显示了保守基序基序8
至基序12，以及它们在如SEQ ID NO：225中所示的UGE多肽序列中的相对位置。
[0827] 因此，用于本发明方法中的优选的UGE多肽除了包含差向异构酶结构域以外，还包含任何一个或多个下列保守基序：
[0828] (i)基序8，其如SEQ ID NO：276所示；
[0829] (ii)基序9，其如SEQ ID NO：277所示，其中G可以被任何其它非极性氨基酸所取代，R可以被任何其它极性氨基酸所取代；
[0830] (iii)基序10，其如SEQ ID NO：278所示，其中允许1、2、3或4个错配；
[0831] (iv)基序11，其如SEQ ID NO：279所示，
[0832] (v)基序12，其如SEQ ID NO：280所示，其中允许1、2、3或4个错配。
[0833] 在表3中给出了20个关键氨基酸的极性。最常见的包含在多肽中的氨基酸是α氨基酸，其具有连接在相同碳(α碳)上的胺和羧基，所述氨基酸分子通常包含与α碳
相连的侧链。 表3显示了基于侧链的物理和生物化学性质的氨基酸的分类。
相连的侧链。 表3显示了基于侧链的物理和生物化学性质的氨基酸的分类。
[0834] 表3：根据侧链性质的氨基酸的分类
[0835]氨基酸 3-字母 1-字母 侧链极性 侧链酸性或碱性 亲水性指数
精氨酸 Arg R 极性 碱性 -4.5
天冬酰胺 Asn N 极性 中性 -3.5
天冬氨酸 Asp D 极性 酸性 -3.5
半胱氨酸 Cys C 极性 中性 2.5
谷氨酸 Glu E 极性 酸性 -3.5
谷氨酰胺 Gln Q 极性 中性 -3.5
组氨酸 His H 极性 碱性 -3.2
赖氨酸 Lys K 极性 碱性 -3.9
丝氨酸 Ser S 极性 中性 -0.8
苏氨酸 Thr T 极性 中性 -0.7
酪氨酸 Tyr Y 极性 中性 -1.3
丙氨酸 Ala A 非极性 中性 1.8
甘氨酸 Gly G 非极性 中性 -0.4
异亮氨酸 Ile I 非极性 中性 4.5
亮氨酸 Leu L 非极性 中性 3.8
甲硫氨酸 Met M 非极性 中性 1.9
苯丙氨酸 Phe F 非极性 中性 2.8
脯氨酸 Pro P 非极性 中性 -1.6
色氨酸 Trp W 非极性 中性 -0.9
氨基酸 3-字母 1-字母 侧链极性 侧链酸性或碱性 亲水性指数
缬氨酸 Val V 非极性 中性 4.2
精氨酸 Arg R 极性 碱性 -4.5
天冬酰胺 Asn N 极性 中性 -3.5
天冬氨酸 Asp D 极性 酸性 -3.5
半胱氨酸 Cys C 极性 中性 2.5
谷氨酸 Glu E 极性 酸性 -3.5
谷氨酰胺 Gln Q 极性 中性 -3.5
组氨酸 His H 极性 碱性 -3.2
赖氨酸 Lys K 极性 碱性 -3.9
丝氨酸 Ser S 极性 中性 -0.8
苏氨酸 Thr T 极性 中性 -0.7
酪氨酸 Tyr Y 极性 中性 -1.3
丙氨酸 Ala A 非极性 中性 1.8
甘氨酸 Gly G 非极性 中性 -0.4
异亮氨酸 Ile I 非极性 中性 4.5
亮氨酸 Leu L 非极性 中性 3.8
甲硫氨酸 Met M 非极性 中性 1.9
苯丙氨酸 Phe F 非极性 中性 2.8
脯氨酸 Pro P 非极性 中性 -1.6
色氨酸 Trp W 非极性 中性 -0.9
氨基酸 3-字母 1-字母 侧链极性 侧链酸性或碱性 亲水性指数
缬氨酸 Val V 非极性 中性 4.2
[0836]
[0837] 包含一个或多个保守基序基序8至基序12的UGE多肽的例子在实施例1中给出。 图20显示了保守基序在那些UGE多肽中的位置。
[0838] 额外地，UGE多肽可以包含在细胞中蛋白质的亚细胞定位中有功能的信号多肽。 例如，SEQ ID NO：225包含位于氨基酸13和37之间的推定的分泌途径信号肽，
其具有在氨基酸36和37之间的推定的切割位点。
其具有在氨基酸36和37之间的推定的切割位点。
[0839] UGE多肽可以进一步在细胞中被修饰，例如通过切割信号肽以产生所谓的成熟UGE多肽。 优选的用于本发明方法中的UGE多肽的衍生物是从移除信号传导肽所得来
的，对应于成熟UGE多肽。
的，对应于成熟UGE多肽。
[0840] 优选地，多肽序列当用于构建进化系统树，例如图21中所描述的进化系统树时，与包含SEQ ID NO：225(Os_UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当
在树，例如Rosti等人2007(The Plant Cell 19：1565-1579)的图1中的树中时，与包含
AtUGE2的组聚类。
在树，例如Rosti等人2007(The Plant Cell 19：1565-1579)的图1中的树中时，与包含
AtUGE2的组聚类。
[0841] 术语“结构域”和“基序”在本文中的“定义”部分定义。 存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，
(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子
序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax
forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).( 在 )
ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，
Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.
Res.32：D134-D137，(2004)) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1)：
276-280(2002))。 一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服
务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋
白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis)，
Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列
比对进行鉴定。
[0842] 用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。 GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸或氨
基酸序列范围或选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即
覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)
计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。 用于开展BLAST分
析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。 同源物可以使用例如
ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地
鉴定。 相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定
(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序
列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/
identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行
少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。 此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替
代，也可以使用特定结构域。 利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸或氨
基酸序列范围或选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。
[0843] 另外，UGE多肽(至少以它们天然的形式)通常具有UDP-葡萄糖4-差向异构酶或UDP-半乳糖4-差向异构酶活性。 此外，用于本发明方法中的UGE多肽还可以
是酶促失活的。 用于测量UDP_葡萄糖4-差向异构酶和UDP-半乳糖4-差向异构酶活
性的工具和技术是本领域熟知的。 对于反应性质或活性以及UGE多肽的例子的其它细
节是本领域熟知的，并且可以在专门化数据库例如BRENDA(The Comprehensive Enzyme
InformationSystem)中发现，所述数据库BRENDA由University of Cologne(德国)开发
和维护。 体内测定包括在携带编码UGE多肽的基因中的突变的微生物中的缺陷型UDP
葡萄糖4-差向异构酶活性的补偿，所述微生物例如携带编码GAL10蛋白质的基因中的
缺陷的酿酒酵母(Scharomyces cerevisiae)菌株(Dormann和Benning.1996.Arch Biochem
Biophys.327(1)：27-34)。 纯化UGE多肽和体外测量差向异构酶活性的方法也被描述
(Barber2006)。
是酶促失活的。 用于测量UDP_葡萄糖4-差向异构酶和UDP-半乳糖4-差向异构酶活
性的工具和技术是本领域熟知的。 对于反应性质或活性以及UGE多肽的例子的其它细
节是本领域熟知的，并且可以在专门化数据库例如BRENDA(The Comprehensive Enzyme
InformationSystem)中发现，所述数据库BRENDA由University of Cologne(德国)开发
和维护。 体内测定包括在携带编码UGE多肽的基因中的突变的微生物中的缺陷型UDP
葡萄糖4-差向异构酶活性的补偿，所述微生物例如携带编码GAL10蛋白质的基因中的
缺陷的酿酒酵母(Scharomyces cerevisiae)菌株(Dormann和Benning.1996.Arch Biochem
Biophys.327(1)：27-34)。 纯化UGE多肽和体外测量差向异构酶活性的方法也被描述
(Barber2006)。
[0844] 本发明通过用SEQ ID NO：224所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：225的多肽序列。 但是，本发明的实施不限于这些序列；
本发明的方法可以有利地使用任意编码UGE的核酸或如本文中定义的UGE多肽实施。
本发明的方法可以有利地使用任意编码UGE的核酸或如本文中定义的UGE多肽实施。
[0845] 编码UGE多肽的核酸的例子在本文实施例1的表A6中给出。 此类核酸用于实施本发明的方法中。在实施例1的表A6中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：225所表
示的UGE多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同
源物”如本文中定义。 其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索
轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如
使用实施例1的表A6中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数
据库进行BLAST。 当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准
默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。
可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序
列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序
列是SEQ ID NO：224或SEQ ID NO：225的情况下，第二BLAST因而将针对稻序列进
行)。 随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。 若来自第一blast的高阶位命中是
源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理
想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生
查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生
属于最高命中当中的该查询序列。
示的UGE多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同
源物”如本文中定义。 其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索
轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如
使用实施例1的表A6中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数
据库进行BLAST。 当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准
默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。
可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序
列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序
列是SEQ ID NO：224或SEQ ID NO：225的情况下，第二BLAST因而将针对稻序列进
行)。 随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。 若来自第一blast的高阶位命中是
源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理
想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生
查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生
属于最高命中当中的该查询序列。
[0846] 高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。 E-值的计算是本领域熟知的。 除了E-值外，比较过程
也通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长
度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，
随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系同源物。
也通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长
度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，
随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系同源物。
[0847] 核酸变体也可以用于实施本发明的方法中。 此类变体的例子包括编码在实施例1的表A6中所给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍
生物”如本文中定义。 还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码在实施例1的表A6
中所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。 用于本发明
方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功
能活性。
生物”如本文中定义。 还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码在实施例1的表A6
中所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。 用于本发明
方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功
能活性。
[0848] 在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码UGE多肽的核酸的部分、与编码UGE多肽的核酸杂交的核酸、编码UGE多肽的核酸的剪接变体、编码UGE多肽
的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码UGE多肽的核酸的变体。 术语“杂交序
列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中所述。
的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码UGE多肽的核酸的变体。 术语“杂交序
列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中所述。
[0849] 编码UGE多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植
物中导入并表达实施例1的表A6中给出的任一核酸序列的一部分或编码实施例1的表A6
中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
物中导入并表达实施例1的表A6中给出的任一核酸序列的一部分或编码实施例1的表A6
中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
[0850] 核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。 所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合
有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对于该
蛋白质部分所预测的多肽更大。
有几种活性的蛋白质。 与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对于该
蛋白质部分所预测的多肽更大。
[0851] 在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的UGE多肽，并且具有如实施例1的表A6中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。 优选地，此部分是在实施例1
的表A中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例1的表A6中所给出的任一氨基酸
序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。 优选地，该部分的长度是至少250、
500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核苷酸，所述连续
核苷酸为实施例1的表A6中给出的任一核酸序列或为编码在实施例1的表A6中所给出的
任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。 最优选地，该部分是SEQ ID NO：
224的核酸的一部分。 优选地，该部分编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列当用于
构建进化系统树，例如图21中所描述的进化系统树时，与包含SEQ ID NO：225(Os_
UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当在树，例如Rosti等人2007(The
Plant Cell19：1565-1579)的图1中的树中时，与包含AtUGE2的组聚类。
的表A中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例1的表A6中所给出的任一氨基酸
序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。 优选地，该部分的长度是至少250、
500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核苷酸，所述连续
核苷酸为实施例1的表A6中给出的任一核酸序列或为编码在实施例1的表A6中所给出的
任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。 最优选地，该部分是SEQ ID NO：
224的核酸的一部分。 优选地，该部分编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列当用于
构建进化系统树，例如图21中所描述的进化系统树时，与包含SEQ ID NO：225(Os_
UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当在树，例如Rosti等人2007(The
Plant Cell19：1565-1579)的图1中的树中时，与包含AtUGE2的组聚类。
[0852] 在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如本文中定义的UGE多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。
[0853] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与实施例1的表A6中给出的任一核酸杂交的核酸，或包括在植物中导入并表
达这样的核酸，其中所述核酸能够与编码在实施例1的表A6中给出的任意核酸序列的直
向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
达这样的核酸，其中所述核酸能够与编码在实施例1的表A6中给出的任意核酸序列的直
向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
[0854] 在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的UGE多肽，其具有如实施例1的表A6中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。 优选地，该杂交序列能够
与实施例1的表A6中给出的任一核酸或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的一
部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与核酸杂交，其中所述的核酸编码在实施例1
的表A6中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能
够与如SEQ ID NO：224所表示的核酸或与其一部分杂交。
与实施例1的表A6中给出的任一核酸或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的一
部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与核酸杂交，其中所述的核酸编码在实施例1
的表A6中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能
够与如SEQ ID NO：224所表示的核酸或与其一部分杂交。
[0855] 优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列当用于构建进化系统树，例如图21中所描述的进化系统树时，与包含SEQ ID NO：
225(Os_UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当用于构建进化系统树，
例如Rosti等人2007(The Plant Cell 19：1565-1579)的图1中的进化系统树时，与包含
AtUGE2的组聚类。
225(Os_UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当用于构建进化系统树，
例如Rosti等人2007(The Plant Cell 19：1565-1579)的图1中的进化系统树时，与包含
AtUGE2的组聚类。
[0856] 在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的UGE多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
[0857] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A6中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码实施例1的表A6中所
给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
[0858] 优选的剪接变体是由SEQ ID NO：224所表示的核酸的剪接变体，或是编码SEQID NO：225的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由该剪接变体编码
的氨基酸序列当用于构建进化系统树，例如图21中所描述的进化系统树时，与包含SEQ
ID NO：225(Os_UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当用于构建进化系统
树，例如Rosti等人2007(The Plant Cell 19：1565-1579)的图1中的进化系统树时，与包
含AtUGE2的组聚类。
的氨基酸序列当用于构建进化系统树，例如图21中所描述的进化系统树时，与包含SEQ
ID NO：225(Os_UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当用于构建进化系统
树，例如Rosti等人2007(The Plant Cell 19：1565-1579)的图1中的进化系统树时，与包
含AtUGE2的组聚类。
[0859] 在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义UGE多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。
[0860] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A6中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中导入并表达编码
在实施例1的表A6中所给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核
酸的等位变体。
在实施例1的表A6中所给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核
酸的等位变体。
[0861] 本发明方法中有用的等位变体具有如SEQ ID NO：225的UGE多肽和实施例1的表A6中所述任意氨基酸基本上相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在
本发明的方法中包括这些天然等位基因的用途。 优选地，所述等位变体是SEQ ID NO：
224的等位变体或编码SEQ IDNO：225的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。
优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列当用于构建进化系统树，例如图21中所描述的
进化系统树时，与包含SEQ ID NO：225(Os_UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者
可选地，当用于构建进化系统树，例如Rosti等人2007(The Plant Cell19：1565-1579)的
图1中的进化系统树时，与包含AtUGE2的组聚类。
本发明的方法中包括这些天然等位基因的用途。 优选地，所述等位变体是SEQ ID NO：
224的等位变体或编码SEQ IDNO：225的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。
优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列当用于构建进化系统树，例如图21中所描述的
进化系统树时，与包含SEQ ID NO：225(Os_UGE2)所示的氨基酸序列的组聚类，或者
可选地，当用于构建进化系统树，例如Rosti等人2007(The Plant Cell19：1565-1579)的
图1中的进化系统树时，与包含AtUGE2的组聚类。
[0862] 基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的UGE多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
[0863] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达在实施例1的表A6中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中导入并表达核
酸的变体，所述的核酸编码在实施例1的表A6中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、
旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
酸的变体，所述的核酸编码在实施例1的表A6中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、
旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
[0864] 优选地，由通过基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列当用于构建进化系统树，例如图21中所描述的进化系统树时，与包含SEQ IDNO：225(Os_UGE2)所示
的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当用于构建进化系统树，例如Rosti等人2007(The
Plant Cell 19：1565-1579)的图1中的进化系统树时，与包含AtUGE2的组聚类。
的氨基酸序列的组聚类，或者可选地，当用于构建进化系统树，例如Rosti等人2007(The
Plant Cell 19：1565-1579)的图1中的进化系统树时，与包含AtUGE2的组聚类。
[0865] 另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。 几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编辑)。
[0866] 编码UGE多肽的核酸可以衍生自任何天然来源或人工来源。 该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。 优选地，
编码UGE多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自单子叶植物，更优选地来自禾本科
(Poaceae)，最优选地该核酸来自稻(Oryzasativa)。
编码UGE多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自单子叶植物，更优选地来自禾本科
(Poaceae)，最优选地该核酸来自稻(Oryzasativa)。
[0867] 本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。 尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的产量、尤其提高的种子产量的植物。 术
语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0868] 此处中对增强的产量相关性状的称谓意思是植物的一个或多个部分的生物量(重量)的提高，所述部分包括地上(可收获)部分和/或地下的(可收获)部分。 特别
地，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量
具有提高的种子产量的植物。
地，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量
具有提高的种子产量的植物。
[0869] 以谷物为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每公顷或英亩已建立的植物数目增加、每株植物穗数的提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。 以稻
为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每
株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述
为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以
100)提高、千粒重提高及其他。
[0870] 本发明提供了用于相对于对照植物提高植物的产量，尤其是种子产量的方法，所述方法包括调节(优选增加)植物中编码如本文中定义的UGE多肽的核酸表达。
[0871] 由于本发明的转基因植物具有提高的产量，故相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其生活周期的至少部分期间)表现提高的生长
速率。
速率。
[0872] 提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整个植物。具有提到的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。 植物的生活周
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在
一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地
理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)
的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通过从
生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所
花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶
段所需要的时间。 这个生活周期可以受以下因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度
指数、开花时间和种子成熟速度。 生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶
段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。 提高的生长速率在植物生活周期的早期期
间可以反映增强的萌发势。 生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较
晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。
若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻
植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，
若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷
物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植
物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。 改变植物的收获周期可
以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在
一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地
理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)
的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。 生长速率可以通过从
生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所
花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
[0873] 根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的生长速率的植物。 因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，所
述方法包括在植物中调节(优选增加)编码如本文中定义的UGE多肽的核酸表达。
述方法包括在植物中调节(优选增加)编码如本文中定义的UGE多肽的核酸表达。
[0874] 与对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，产量和/或生长速率的提高均出现。 植物一般通过生长得更慢而应答于胁迫暴
露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一方面，轻度胁迫在本文中定
义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不
能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫
植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于
14％、13％、12％、11％或10％或更低。 由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的
进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对
于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环
境)胁迫。 非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁
迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、
氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。 生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和
昆虫引起的那些胁迫。
露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。 另一方面，轻度胁迫在本文中定
义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不
能恢复生长。 与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫
植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于
14％、13％、12％、11％或10％或更低。 由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的
进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。 因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对
于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环
境)胁迫。 非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁
迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、
氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。 生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和
昆虫引起的那些胁迫。
[0875] 具体而言，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件开展以产生相对于对照植物具有提高的产量的植物。 如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，
非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分
子变化。 干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导
生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁
迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为
渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱
胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常
激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼
容性溶质和生长停滞。 如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些
环境条件。 本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分
子变化。 干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导
生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁
迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为
渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。 经常伴随高温或低温、盐度或干旱
胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常
激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼
容性溶质和生长停滞。 如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些
环境条件。 本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
[0876] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物提高的产量。 因此，根据本发明，提供了用于在非胁
迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中
编码UGE多肽的核酸表达。
迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中
编码UGE多肽的核酸表达。
[0877] 相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在营养缺乏条件下、尤其在缺氮条件下培育的植物提高的产量。 因此，根据本发明，提供了用于在营
养缺乏条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中编码UGE多肽的
核酸表达。 营养缺乏可以因营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、
锰、铁和硼等缺少所致。
养缺乏条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中编码UGE多肽的
核酸表达。 营养缺乏可以因营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、
锰、铁和硼等缺少所致。
[0878] 本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物或其部分包含编码如上文定义的UGE多肽的核酸转基因。
[0879] 本发明也提供了基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码UGE多肽的核酸。 所述基因构建体可以插入适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目的基因
的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明
方法中的用途。
的载体，所述载体可以是市售的。 本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明
方法中的用途。
[0880] 更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
[0881] (a)编码如上文定义的UGE多肽的核酸；
[0882] (b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0883] (c)转录终止序列。
[0884] 优选地，编码UGE多肽的核酸如上文定义。术语“调控序列”和“终止序列”如本文中的定义。
[0885] 用包含任意上述核酸的载体转化植物。 技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。 该目的序列有效地
与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
[0886] 有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来驱动所述核酸序列的表达。组成型启动子是方法中特别有用的。多种启动子类型的定义参见本文“定
义”部分。
义”部分。
[0887] 应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：1表示的编码UGE多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码UGE多肽的核酸在受组成型启动子驱动时或在受根特异性启
动子驱动时的表达。
动子驱动时的表达。
[0888] 组成型启动子优选地是GOS2启动子，优选地是来自稻的GOS2启动子。 还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：270相似的核酸序列表示，最优选地该
组成型启动子如SEQ ID NO：270所表示。 对于组成型启动子的其他例子，见本文中的
“定义”部分中的表2。
组成型启动子如SEQ ID NO：270所表示。 对于组成型启动子的其他例子，见本文中的
“定义”部分中的表2。
[0889] 任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。 额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。 本领域技术人员将知道可能适用于实施本发
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
明的终止子和增强子序列。 如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区
(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。 (除启动子、增强子、
沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质
/或RNA稳定元件。 此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
[0890] 本发明的基因构建体还可以包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。 一个例子是当需要基因构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
[0891] 为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报道基因)。因此，所述基因构建体可以任选地
包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再需要
所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本领域
已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
包含选择标记基因。 选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。 一旦不再需要
所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。 用于移出标记的技术是本领域
已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
[0892] 本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中导入并表达编码如上文所定义的
UGE多肽的任意核酸。
UGE多肽的任意核酸。
[0893] 更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增加的增强产量相关性状、尤其提高的(种子)产量，其中所述方法包括：
[0894] (i)在植物或植物细胞中导入并表达编码UGE多肽的核酸；和
[0895] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
[0896] (i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的UGE多肽的任意核酸。
[0897] 所述核酸可以直接导入植物细胞或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。 根据本发明的优选特征，该核酸优选地通过转化作用导入植物。 术
语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0898] 遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的全部方法再生。 合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或 和Willmitzer的出版物中找到。
[0899] 通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
植物。 为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而
转化植物可以与非转化植物区分。 例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初
始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。 另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用
合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。 备选地，对所述转
化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
[0900] 在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析对目的基因的存在性、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，新导入的DNA的
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技
术均是本领域普通技术人员熟知的。
[0901] 产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种
形式。 例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转
化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转
化接穗嫁接的转化根状茎)。
[0902] 本发明明确地扩展至由本文中所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。 本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明
方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
[0903] 本发明也包括含有编码如本文以上所定义UGE多肽的分离核酸的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。 对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体
或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植物。
或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植物。
[0904] 本发明的方法有利地适用于任意植物。 在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、油菜(rapeseed)、
棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包
括甘蔗。 更优选地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大
麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、和燕麦。
观赏植物、粮食作物、树或灌木。 根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植
物。作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、油菜(rapeseed)、
棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，所述植物是单子叶植物。 单子叶植物的例子包
括甘蔗。 更优选地，所述植物是谷物植物。 谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大
麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、和燕麦。
[0905] 本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。 本发明进一步涉及了衍生自、优选直接衍生自此种植物的可
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
[0906] 根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。 用于增加核酸或基因或基因产物表达的方法是本领域中充分经文献报道的并且在定义部分中提供了例子。
[0907] 如上所述，用于调节(优选增加)编码UGE多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码UGE多肽的核酸；但是，实施本方法的效果，即增强产量相关
性状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内的其他熟
知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
性状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内的其他熟
知技术实现。 在定义部分中提供了对这些技术的描述。
[0908] 本发明也包括编码如本文中所述UGE多肽的核酸的用途，和这些UGE多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。
[0909] 编码本文中所述UGE多肽的核酸或UGE多肽自身可以用于育种程序中，在所述育种程序中鉴定到可以遗传地与编码UGE多肽的基因连锁的DNA标记。 所述核酸/基
因或UGE多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程
序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
因或UGE多肽自身可以用来定义分子标记。 这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程
序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
[0910] 编码UGE多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。 此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而导入等位变异；备
选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随后进行
等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致产量提高的序列的
优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而
实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变
体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。 随后进行
等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致产量提高的序列的
优异等位变体。 选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而
实施。生长性能可以在温室或在田间监测。 其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变
体的植物与另一种植物杂交。 这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
[0911] 编码UGE多肽的核酸也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其一部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。 此类信息可以用于植物育种中，
以开发具有所希望表型的品系。编码UGE多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核
苷酸长度的核酸序列。编码UGE多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标
记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis
T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码UGE多肽的核酸探测。 所
得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：
174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制
性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的
遗传杂交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编码UGE多肽的核酸
在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：
314-331)。
以开发具有所希望表型的品系。编码UGE多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核
苷酸长度的核酸序列。编码UGE多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标
记。 限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis
T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码UGE多肽的核酸探测。 所
得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：
174-181)进行遗传分析以构建遗传图。 此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制
性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的
遗传杂交的亲代和子代。 DNA多态性的分离是明显的并用来计算编码UGE多肽的核酸
在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：
314-331)。
[0912] 在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。 许多出版物描述了使用以上概述的方法
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。 例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻
近纯合系和其他个体群体可以用于作图。 此类方法学是本领域技术人员熟知的。
[0913] 所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996， 第
319-346页及其中引用的参考文献)。
319-346页及其中引用的参考文献)。
[0914] 在另一个实施方案中，所述核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。 尽管当前的FISH作图法支持使用大的
克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的
改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的
改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
[0915] 用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。 方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、
PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、等
位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用
的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图的方
法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序列差
异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、等
位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反
应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.
Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。
对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用
的引物对。 此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。 在使用基于PCR遗传作图的方
法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序列差
异。 但是，这通常对作图法而言不是必需的。
[0916] 如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状的植物。 这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
[0917] 在本说明书中使用的术语“表A6”是为了指定表A6a和表A6b的内容。 本说明书中使用的术语“表A6a”是为了指定表A6a中的内容。 本说明书中使用的术语“表
A6b”是为了指定表A6b中的内容。 在一个优选的实施方案中，术语“表A6”意思是
表A6b。
A6b”是为了指定表A6b中的内容。 在一个优选的实施方案中，术语“表A6”意思是
表A6b。
[0918] 在一个实施方案中，本发明涉及总结如下的主题：
[0919] 条目104：在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码UGE多肽的核酸的表达。
[0920] 条目105：根据条目104的方法，其中所述UGE多肽包含差向异构酶结构域，所述结构域与SEQ ID NO：275以优选增加的顺序具有至少70％、75％、80％、85％、
90％、95％、97％或更多的序列同一性。
90％、95％、97％或更多的序列同一性。
[0921] 条目106：根据条目104或105的方法，其中所述UGE多肽包含下述基序中的一个或多个：
[0922] 基序8，其如SEQ ID NO：276所示；
[0923] 基序9，其如SEQ ID NO：277所示，其中G可以被任何其它非极性氨基酸所取代，R可以被任何其它极性氨基酸所取代；
[0924] 基序10，其如SEQ ID NO：278所示，其中允许1、2、3或4个错配；
[0925] 基序11，其如SEQ ID NO：279所示，
[0926] 基序12，其如SEQ ID NO：280所示，其中允许1、2、3或4个错配。
[0927] 条目107：根据条目104至106的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达编码UGE多肽的核酸来实现。
[0928] 条目108：根据条目104至107的任一项的方法，其中所述编码UGE多肽的核酸编码表A6中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的一部分或者是能够与此类核酸杂交的
核酸。
核酸。
[0929] 条目109：根据条目104至108的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A6中所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0930] 条目110：根据条目104至109的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的产量，优选提高的种子产量。
[0931] 条目111：根据条目104至110任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
[0932] 条目112：根据条目104至111任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫条件下获得。
[0933] 条目113：根据条目104至112中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
[0934] 条目114：根据条目104至113中任一项的方法，其中所述编码UGE多肽的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，进一步优选来自禾本科(Poaceae)，更优选来自
稻属(Oryza)，最优选来自稻(Oryza sativa)。
稻属(Oryza)，最优选来自稻(Oryza sativa)。
[0935] 条目115：植物或其部分(包括种子)，通过根据条目104至114的任何一项的方法可获得，其中所述植物或其部分包含编码UGE多肽的重组核酸。
[0936] 条目116：包含选自以下的核酸序列的分离的核酸序列：
[0937] a) 编 码 如 SEQ ID NO：282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318和/或320和/或表A6b中所示
的多肽的分离的核酸分子；
的多肽的分离的核酸分子；
[0938] b) 如 SEQ ID NO：281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317和/或319和/或表A6b所示的分离的
核酸分子；
核酸分子；
[0939] c)分离的核酸分子，其作为遗传密码子简并性的结果，可以来自如表A6中所示的多肽序列并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
[0940] d)分离的核酸分子，其与多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并且赋予相对于对照
植物增强的产量相关性状，所述多核苷酸包含表A6中所示的核酸分子；
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并且赋予相对于对照
植物增强的产量相关性状，所述多核苷酸包含表A6中所示的核酸分子；
[0941] e)编码多肽并且赋予了相对于对照植物增强的产量相关性状的分离的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％、31％、
32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；
32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；
[0942] f)分离的核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
[0943] g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含图20中所示的共有序列或一个或多个多肽基序，并且所述分离的核酸分子优选地具有下述核酸分子所代表的活性，所述
核酸分子包含表A6中所示的多核苷酸；
核酸分子包含表A6中所示的多核苷酸；
[0944] h)编码多肽并且赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的分离的核酸分子，所述多肽具有如表A6中所示的蛋白质所代表的活性；
[0945] 以及
[0946] i)通过在严格杂交条件下用探针或用其片段筛选适当的核酸文库可获得的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)的核酸分子的互补序列，所述可获得的核酸分子具有与
(a)至(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt并且编码具有活性的多肽，所述活性由包含表A6中所示的多肽的
蛋白质所代表；
(a)至(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt并且编码具有活性的多肽，所述活性由包含表A6中所示的多肽的
蛋白质所代表；
[0947] 其中根据(a)至(i)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上不同于表A6a中所示的序列并且优选地编码下述蛋白质，所述蛋白质至少在一个或多个氨基酸上不同于表
A6a中所示的蛋白质序列。
A6a中所示的蛋白质序列。
[0948] 条目117：构建体，其包含
[0949] (a)在条目104至106或116中定义的编码UGE多肽的核酸；
[0950] (b)一个或多个调控序列，其能够驱动(a)的核酸序列的表达；以及任选地
[0951] (c)转录终止序列。
[0952] 条目118：根据条目117的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
[0953] 条目119：根据条目117至118的任一项的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选提高的产量，更优选提高的种子
产量的植物。
产量的植物。
[0954] 条目120：用根据条目117或118的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0955] 条目121：用于产生转基因植物的方法，所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的种子产量，所述方法包括：
[0956] (i)在植物中导入和表达如条目104至106或116中所定义的编码UGE多肽的核酸；和
[0957] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
[0958] 条目122：相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的种子产量的转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物获得自如条目104至106
或116中所定义的编码UGE多肽的核酸的增加的表达。
或116中所定义的编码UGE多肽的核酸的增加的表达。
[0959] 条目123：根据条目115、120或122的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷
子、裸麦、黑小麦、高粱和燕麦。
子、裸麦、黑小麦、高粱和燕麦。
[0960] 条目124：根据条目123的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
[0961] 条目125：来自根据条目123的植物和/或来自根据条目124的植物可收获部分的产品。
[0962] 条目126：编码UGE多肽的核酸相对于对照植物增强产量相关性状，优选提高产量，更优选提高种子产量的用途。
[0963] 根据本发明的另一个实施方案，还提供了包含选自以下的多肽序列的分离的多肽：
[0964] (i)由条目116所表示的任一核酸所编码的氨基酸序列；
[0965] (ii)与(i)的氨基酸序列以优选增加的顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的
氨基酸序列；
氨基酸序列；
[0967] 本发明现在将参考下列图进行描述，其中
[0968] 图1表示SEQ ID NO：2的结构域结构，其具有由下划线和其编号表示的保守基序。 通过SMART确定的HLH结构域以黑体下划线显示。
[0969] 图2表示一些bHLH6样蛋白质的多重比对。 点表示保守的残基，冒号表示高度保守的残基，星号代表优选保守的残基。 最高程度的序列保守性在bHLH结构域的区域
中和蛋白质序列的更多的N末端部分中发现。
中和蛋白质序列的更多的N末端部分中发现。
[0970] 图3表示二元载体，其用于在稻中编码bHLH6样的核酸在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的增加的表达。
[0971] 图4详细描述了用于实施本发明方法的序列的例子。
[0972] 图5表示来自表A2的RrmJ/FtsJ多肽的CLUSTAL W(1；83)的多重序列比对。
[0973] 图6表示二元载体，其用于在稻中编码GRP的核酸序列在稻油质蛋白启动子(pOleo::GRP)的控制下的增加的表达(其中所述GRP多肽为RrmJ/FtsJ多肽)。
[0974] 图7详细描述了用于实施本发明方法的序列的例子。
[0975] 图8表示二元载体，其用于在稻中编码GRP的核酸序列在稻HMGB启动子(pHMGB::GRP)的控制下的增加的表达(其中所述GRP多肽是碱性-螺旋-环-螺旋
4(bHLH4)多肽)。
4(bHLH4)多肽)。
[0976] 图9详细描述了用于实施本发明方法的序列的例子。
[0977] 图10表示了GRP多肽的多重序列比对(其中所述GRP多肽是碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽)。 给出了代表性的bHLH4多肽的共有序列、结构域和基序。 在共
有序列中，提供了高度保守的氨基酸；其间的空的空白空间代表任何氨基酸。
有序列中，提供了高度保守的氨基酸；其间的空的空白空间代表任何氨基酸。
[0978] 图11表示二元载体，其用于在稻中编码GRP的核酸序列在稻谷醇溶蛋白启动子(pProl::GRP)的控制下的增加的表达(其中所述GRP多肽是异戊烯基转移酶(IPT)多
肽)。
肽)。
[0979] 图12详细描述了用于实施本发明方法的序列的例子。
[0980] 图13表示了GRP多肽的多重序列比对(其中所述GRP多肽是异戊烯基转移酶(IPT)多肽)。 给出了代表性的IPT多肽的共有序列、结构域和基序。 在共有序列中，
提供了高度保守的氨基酸；其间的空的空白空间代表任何氨基酸。
提供了高度保守的氨基酸；其间的空的空白空间代表任何氨基酸。
[0981] 图14表示了SEQ ID NO：169的氨基酸序列和结构域结构。SEQ IDNO：169中的两个保守B框结构域如点线所指示(B框结构域1)和如实线(B框结构域2)所指示。
每个B框结构域中的4个半胱氨酸残基(具有推定的结合锌离子的潜力)用框标示。
每个B框结构域中的4个半胱氨酸残基(具有推定的结合锌离子的潜力)用框标示。
[0982] 图15表示了STO多肽的多重序列比对。 指示了对应于在图14中所描述的那些的保守氨基酸残基和结构域的位置。 给出了代表性的STO多肽的共有序列。 在共有序
列中，提供了高度保守的氨基酸；其间的空的空白空间代表任何氨基酸。
列中，提供了高度保守的氨基酸；其间的空的空白空间代表任何氨基酸。
[0983] 图16显示了STO多肽的进化系统树。 在进化系统树中，通过Os04g0540200代表SEQ ID NO：169。
[0984] 图17表示了二元载体，其用于在稻中在稻GOS2启动子(pGOS2)的控制下的编码STO的核酸的增加的表达。
[0985] 图18详细描述了用于实施本发明方法的序列的例子。
[0986] 图19显示了SEQ ID NO：225的氨基酸序列，其中指示了相关功能性结构域和保守基序。 指示了差向异构酶结构域(框中的区域)、基序8(黑体大写字母，以间断的
线标示下划线)、基序9(黑体小写字母)、基序10(黑体大写字母)、基序11(以点标示
下划线的大写字母)和基序12(以实线标示下划线的大写字母)。
线标示下划线)、基序9(黑体小写字母)、基序10(黑体大写字母)、基序11(以点标示
下划线的大写字母)和基序12(以实线标示下划线的大写字母)。
[0987] 图20显示了表A6的UGE多肽的多重蛋白质比对。 给出了共有序列。 指示了保守结构域以及基序的部分。
[0988] 图21显示了表A6的UGE多肽的进化系统树。
[0989] 图22表示了二元载体，其用于在稻中在稻GOS2启动子(pGOS2)的控制下的编码UGE的核酸的增加的表达。
[0990] 图23详细描述了用于实施本发明方法的序列的例子。实施例
[0991] 本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是示意性的。 以下实施例不意图完全限定或限制本发明的范围。
[0992] DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第 3版Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New
York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第
1卷和第2卷中描述的标准方案进行。 用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS
科学出版有限责任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版
社(Blackwell Scientific Publications(英国))出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology
Labfax(1993)中描述。
York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第
1卷和第2卷中描述的标准方案进行。 用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS
科学出版有限责任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版
社(Blackwell Scientific Publications(英国))出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology
Labfax(1993)中描述。
[0993] 实施例1：鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列
[0994] 用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生
物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法
中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。 使用该程序通过将核酸序
列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似
性区域。 由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和
过滤程序以忽略低复杂性序列启动。 这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概
率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越
低，命中的显著性越高)。 除了E-值外，比较过程也可以通过同一性百分数评分。 同
一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨
基酸)的数目。 在一些情况下，可以调整默认参数以修改搜索的严格性。 例如，可以提
高E-值以显示更少的严格匹配。 以这种方式，可以鉴定几乎完美的短匹配。
物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法
中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。 使用该程序通过将核酸序
列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似
性区域。 由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和
过滤程序以忽略低复杂性序列启动。 这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概
率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越
低，命中的显著性越高)。 除了E-值外，比较过程也可以通过同一性百分数评分。 同
一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨
基酸)的数目。 在一些情况下，可以调整默认参数以修改搜索的严格性。 例如，可以提
高E-值以显示更少的严格匹配。 以这种方式，可以鉴定几乎完美的短匹配。
[0995] 表A提供与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
[0996] 表A1：bHLH6样多肽的例子
[0997]植物来源 核酸 蛋白质
SEQ ID NO： SEQ ID NO：
拟南芥 1 2
菜豆(Phaseolus vulgaris) 13 14
黄长春花(Catharanthus roseus) 15 16
马铃薯(Solanum tuberosum) 17 18
豌豆(Pisum sativum) 19 20
甘蓝(Brassica oleracea) 21 22
稻(Oryza sativa) 23 24
藏边大黄(Rheum australe) 25 26
玉米 27 28
展叶剑叶藓(Physcomitrella 29 30
patens)
番茄(Lycopersicon esculentum) 31 32
Populus trichocarpa 33 34
普通小麦(Triticum aestivum) 35 36
杨属物种(Populus sp) 37 38
葡萄(Vitis vinifera) 39 40
稻 41
SEQ ID NO： SEQ ID NO：
拟南芥 1 2
菜豆(Phaseolus vulgaris) 13 14
黄长春花(Catharanthus roseus) 15 16
马铃薯(Solanum tuberosum) 17 18
豌豆(Pisum sativum) 19 20
甘蓝(Brassica oleracea) 21 22
稻(Oryza sativa) 23 24
藏边大黄(Rheum australe) 25 26
玉米 27 28
展叶剑叶藓(Physcomitrella 29 30
patens)
番茄(Lycopersicon esculentum) 31 32
Populus trichocarpa 33 34
普通小麦(Triticum aestivum) 35 36
杨属物种(Populus sp) 37 38
葡萄(Vitis vinifera) 39 40
稻 41
[0998] 表2a：GRP多肽的例子，其中所述GRP多肽是RrmJ/FtsJ多肽：
[0999]名称 来源生物 SEQ SEQ 状 公共数据库登
ID ID 态 录号
NO NO
核酸 多肽
序列 序列
Nicta_RrmJ/FtsJ 烟草(Nicotiana 57 58 部
部分 tabacum) 分
Nicta_RrmJ/FtsJ 烟草 59 60 全 EB446219，
长 EB448450.1
Arath_RrmJ/FtsJ 拟南芥 61 62 全 AY087952.1
长
Lyces_RrmJ/FtsJ 番茄 63 64 全 BT013964
长
Medtr_RrmJ/FtsJ 蒺藜苜蓿 65 66 全 AC149135.2
(Medicago 长
truncatula)
Orysa_RrmJ/FtsJ 稻 67 68 全 AK103054
长
Osta_RrmJ/FtsJ Ostreococcus 69 70 全 XM_001418019
lucimarinus 长
CCE9901
Poptr_RrmJ/FtsJ Populus 71 72 全 CX183550.1的
tremuloides 长 重叠群
DT504907.1
Sacof_RrmJ/FtsJ 甘蔗(Saccharum 73 74 全 CA279558.1的
officinarum) 长 重叠群
CF576902.1
Triae_RrmJ/FtsJ 普通小麦 75 76 全 DR740715
长
Apime_RrmJ/FtsJ 蜜蜂(Apis 77 78 全 XM_392223
mellifera) 长
Caeel_RrmJ/FtsJ 漂亮新小杆线虫 79 80 全 NM_065442
(Caenorhabditis 长
elegans)
Danre_RrmJ/FtsJ 鲐(Danio rerio) 81 82 全 BC085449
长
Homsa_RrmJ/FtsJ 人(Homo 83 84 全 AK024023
sapiens) 长
Horvu_FtsJ 大麦(Hordeum 92 93 全
vulgare) 长
Sorbi_FtsJ 两色蜀黍 94 95 全
(Sorghum 长
bicolor)
ID ID 态 录号
NO NO
核酸 多肽
序列 序列
Nicta_RrmJ/FtsJ 烟草(Nicotiana 57 58 部
部分 tabacum) 分
Nicta_RrmJ/FtsJ 烟草 59 60 全 EB446219，
长 EB448450.1
Arath_RrmJ/FtsJ 拟南芥 61 62 全 AY087952.1
长
Lyces_RrmJ/FtsJ 番茄 63 64 全 BT013964
长
Medtr_RrmJ/FtsJ 蒺藜苜蓿 65 66 全 AC149135.2
(Medicago 长
truncatula)
Orysa_RrmJ/FtsJ 稻 67 68 全 AK103054
长
Osta_RrmJ/FtsJ Ostreococcus 69 70 全 XM_001418019
lucimarinus 长
CCE9901
Poptr_RrmJ/FtsJ Populus 71 72 全 CX183550.1的
tremuloides 长 重叠群
DT504907.1
Sacof_RrmJ/FtsJ 甘蔗(Saccharum 73 74 全 CA279558.1的
officinarum) 长 重叠群
CF576902.1
Triae_RrmJ/FtsJ 普通小麦 75 76 全 DR740715
长
Apime_RrmJ/FtsJ 蜜蜂(Apis 77 78 全 XM_392223
mellifera) 长
Caeel_RrmJ/FtsJ 漂亮新小杆线虫 79 80 全 NM_065442
(Caenorhabditis 长
elegans)
Danre_RrmJ/FtsJ 鲐(Danio rerio) 81 82 全 BC085449
长
Homsa_RrmJ/FtsJ 人(Homo 83 84 全 AK024023
sapiens) 长
Horvu_FtsJ 大麦(Hordeum 92 93 全
vulgare) 长
Sorbi_FtsJ 两色蜀黍 94 95 全
(Sorghum 长
bicolor)
[1000]
[1001] 表A2b：GRP多肽的例子，其中所述GRP多肽是RrmJ/FtsJ多肽：
[1002]名称 来源生物 SEQ ID NO SEQ ID NO 状态
核酸序列 多肽序列
Brana_FtsJ 欧洲油菜 96 97 全长
(Brassica
napus)
Glyma_FtsJ 大豆(Glycine 98 99 全长
max)
Zeama_FtsJ 玉米 100 101 全长
Tager_FtsJ_ 万寿菊(Tagetes 部分
部分 erecta)
核酸序列 多肽序列
Brana_FtsJ 欧洲油菜 96 97 全长
(Brassica
napus)
Glyma_FtsJ 大豆(Glycine 98 99 全长
max)
Zeama_FtsJ 玉米 100 101 全长
Tager_FtsJ_ 万寿菊(Tagetes 部分
部分 erecta)
[1003] 表A3a：GRP多肽的例子，其中所述GRP多肽是bHLH4多肽：
[1004]名称 来源生物 SEQ ID SEQ ID 公共数据库登
NO核酸 NO多肽 录号
序列 序列
Arath_bHLH4 拟南芥 104 105
Arath_bHLH4 拟南芥 109 110
II
Brana_bHLH4 欧洲油菜 111 112
II
Lotja_bHLH4 Lotus 113 114
japonicus
Lyces_bHLH4 番茄 115 116
Vitvi_bHLH4 葡萄 117 118 重叠群样
VV78X118066.5
AM475703.2
Zeama_bHLH4 玉米 119 120 AF061107和
EE190449的全
长核酸序列重
叠群
NO核酸 NO多肽 录号
序列 序列
Arath_bHLH4 拟南芥 104 105
Arath_bHLH4 拟南芥 109 110
II
Brana_bHLH4 欧洲油菜 111 112
II
Lotja_bHLH4 Lotus 113 114
japonicus
Lyces_bHLH4 番茄 115 116
Vitvi_bHLH4 葡萄 117 118 重叠群样
VV78X118066.5
AM475703.2
Zeama_bHLH4 玉米 119 120 AF061107和
EE190449的全
长核酸序列重
叠群
[1005]
[1006] 表A3b：GRP多肽的例子，其中所述GRP多肽是bHLH4多肽：
[1007]名称 来源生物 SEQ ID SEQ ID 公共数据库登
NO核酸 NO多肽 录号
序列 序列
Brana_bHLH4 欧洲油菜 121 122
Glyma_ 大豆 123 124
bHLH4
Glyma_ 大豆 125 126
bHLH4II
Horvu_ 大麦 127 128
bHLH4
Zeama_bHLH4 玉米 129 130
II
NO核酸 NO多肽 录号
序列 序列
Brana_bHLH4 欧洲油菜 121 122
Glyma_ 大豆 123 124
bHLH4
Glyma_ 大豆 125 126
bHLH4II
Horvu_ 大麦 127 128
bHLH4
Zeama_bHLH4 玉米 129 130
II
[1008] 表A4：GRP多肽的例子，其中所述GRP多肽是IPT多肽：
[1009]
[1010]
[1011] 表A5a：STO核酸和多肽的例子：
[1012]名称 植物来源 核酸SEQ 蛋白质
ID NO： SEQ ID
NO：
Os04g0540200 cds3887 稻 168 169
Os01g0202500 稻 170 171
Os02g0606200 稻 172 173
Os02g0646200 稻 174 175
Os04g049300 稻 176 177
Os05g0204600 稻 178 179
Os06g0152200 稻 180 181
Os06g071300 稻 182 183
Os09g0527900 稻 184 185
Os12g0209200 稻 186 187
SO_STO 甘蔗 188 189
AT1G06040_剪接变体1 拟南芥 190 191
AT1G06040_剪接变体2 拟南芥 192 193
AT1G75540 拟南芥 194 195
AT1G78600 拟南芥 196 197
名称 植物来源 核酸SEQ 蛋白质
ID NO： SEQ ID
NO：
AT2G31380 拟南芥 198 199
AT4G10240 拟南芥 200 201
AT4G39070 拟南芥 202 203
Mt_ABO84497 蒺藜苜蓿 204 205
LE_gi|45544865 番茄 206 207
(Lycopersicul esculentum)
ST_gi|76160970 马铃薯 208 209
PP_STO样 populus trichoparcca 210 211
VV_CAN72879 葡萄 212 213
GM_gi|78173056 大豆 214 215
ID NO： SEQ ID
NO：
Os04g0540200 cds3887 稻 168 169
Os01g0202500 稻 170 171
Os02g0606200 稻 172 173
Os02g0646200 稻 174 175
Os04g049300 稻 176 177
Os05g0204600 稻 178 179
Os06g0152200 稻 180 181
Os06g071300 稻 182 183
Os09g0527900 稻 184 185
Os12g0209200 稻 186 187
SO_STO 甘蔗 188 189
AT1G06040_剪接变体1 拟南芥 190 191
AT1G06040_剪接变体2 拟南芥 192 193
AT1G75540 拟南芥 194 195
AT1G78600 拟南芥 196 197
名称 植物来源 核酸SEQ 蛋白质
ID NO： SEQ ID
NO：
AT2G31380 拟南芥 198 199
AT4G10240 拟南芥 200 201
AT4G39070 拟南芥 202 203
Mt_ABO84497 蒺藜苜蓿 204 205
LE_gi|45544865 番茄 206 207
(Lycopersicul esculentum)
ST_gi|76160970 马铃薯 208 209
PP_STO样 populus trichoparcca 210 211
VV_CAN72879 葡萄 212 213
GM_gi|78173056 大豆 214 215
[1013]
[1014] 表A5b：STO核酸和多肽的序列：
[1015]名称 植物来源 核酸SEQ 蛋白质
ID NO： SEQ ID
NO：
Zeama_STO 玉米 222 223
ID NO： SEQ ID
NO：
Zeama_STO 玉米 222 223
[1016] 表A6：UGE核酸和多肽的例子：
[1017]名称 来源生物 核酸SEQ ID 蛋白质SEQ
NO： ID NO：
OS_UGE2 稻 224 225
Os04g0618200 稻 226 227
Os05g0595100 稻 228 229
Os07g0139400 稻 230 231
Os08g0374800 稻 232 233
Os09g0323000 稻 234 235
Os09g0504000 稻 236 237
Os09g0526700 稻 238 239
AT1G12780_UGE1 拟南芥 240 241
AT1G63180_UGE3 拟南芥 242 243
AT1G64440_UGE4 拟南芥 244 245
名称 来源生物 核酸SEQ ID 蛋白质SEQ
NO： ID NO：
AT4G10960_UGE5 拟南芥 246 247
AT4G23920_UGE2 拟南芥 248 249
Pt_lcl|scaff_XVI.140 Populus trichocarpa 250 251
Pt_lcl|scaff_XI.1329 Populus trichocarpa 252 253
Pt_lcl|scaff_VI.203 Populus trichocarpa 254 255
Pt_lcl|scaff_III.961 Populus trichocarpa 256 257
Pt_lcl|scaff_III.1133 Populus trichocarpa 258 259
Pt_lcl|scaff_I.773 Populus trichocarpa 260 261
Pt_lcl|scaff_I.2996 Populus trichocarpa 262 263
Pt_lcl|scaff_5422 Populus trichocarpa 264 265
Ot08g015500 Ostreococcus tauri 266 267
SC_GAL10_P04397 Ostreococcus tauri 268 269
Ec_GALE_AAO37702 大肠杆菌 270 271
(Escherichia coli)
NO： ID NO：
OS_UGE2 稻 224 225
Os04g0618200 稻 226 227
Os05g0595100 稻 228 229
Os07g0139400 稻 230 231
Os08g0374800 稻 232 233
Os09g0323000 稻 234 235
Os09g0504000 稻 236 237
Os09g0526700 稻 238 239
AT1G12780_UGE1 拟南芥 240 241
AT1G63180_UGE3 拟南芥 242 243
AT1G64440_UGE4 拟南芥 244 245
名称 来源生物 核酸SEQ ID 蛋白质SEQ
NO： ID NO：
AT4G10960_UGE5 拟南芥 246 247
AT4G23920_UGE2 拟南芥 248 249
Pt_lcl|scaff_XVI.140 Populus trichocarpa 250 251
Pt_lcl|scaff_XI.1329 Populus trichocarpa 252 253
Pt_lcl|scaff_VI.203 Populus trichocarpa 254 255
Pt_lcl|scaff_III.961 Populus trichocarpa 256 257
Pt_lcl|scaff_III.1133 Populus trichocarpa 258 259
Pt_lcl|scaff_I.773 Populus trichocarpa 260 261
Pt_lcl|scaff_I.2996 Populus trichocarpa 262 263
Pt_lcl|scaff_5422 Populus trichocarpa 264 265
Ot08g015500 Ostreococcus tauri 266 267
SC_GAL10_P04397 Ostreococcus tauri 268 269
Ec_GALE_AAO37702 大肠杆菌 270 271
(Escherichia coli)
[1018]
[1019] 表A6b：UGE核酸和多肽的例子：
[1020]名称 来源生物 核酸SEQ ID 蛋白质SEQ
NO： ID NO：
Brana_UGE I 欧洲油菜 281 282
Brana_UGE II 欧洲油菜 283 284
Zeama_UGE I 玉米 285 286
Zeama_UGE II 玉米 287 288
Zeama_UGE III 玉米 289 290
Zeama_UGE IV 玉米 291 292
Zeama_UGE V 玉米 293 294
Zeama_UGE VI 玉米 295 296
Zeama_UGE VII 玉米 297 298
Zeama_UGE VIII 玉米 299 300
Orysa_UGE 稻 301 302
Glyma_UGE I 大豆 303 304
Glyma_UGE II 大豆 305 306
Glyma_UGE III 大豆 307 308
Glyma_UGE IV 大豆 309 310
Glyma_UGE V 大豆 311 312
名称 来源生物 核酸SEQ ID 蛋白质SEQ
NO： ID NO：
Helan_UGE 向日葵(Helianthus 313 314
annuus)
Zeama_UGE IX 玉米 315 316
Zeama_UGE X 玉米 317 318
Glyma_UGE VI 大豆 319 320
NO： ID NO：
Brana_UGE I 欧洲油菜 281 282
Brana_UGE II 欧洲油菜 283 284
Zeama_UGE I 玉米 285 286
Zeama_UGE II 玉米 287 288
Zeama_UGE III 玉米 289 290
Zeama_UGE IV 玉米 291 292
Zeama_UGE V 玉米 293 294
Zeama_UGE VI 玉米 295 296
Zeama_UGE VII 玉米 297 298
Zeama_UGE VIII 玉米 299 300
Orysa_UGE 稻 301 302
Glyma_UGE I 大豆 303 304
Glyma_UGE II 大豆 305 306
Glyma_UGE III 大豆 307 308
Glyma_UGE IV 大豆 309 310
Glyma_UGE V 大豆 311 312
名称 来源生物 核酸SEQ ID 蛋白质SEQ
NO： ID NO：
Helan_UGE 向日葵(Helianthus 313 314
annuus)
Zeama_UGE IX 玉米 315 316
Zeama_UGE X 玉米 317 318
Glyma_UGE VI 大豆 319 320
[1021]
[1022] 此外，在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(ThiInstitutefor Genomic Research，TIGR)暂时汇编并且公共公开。 可以使用真核生物基因直向同源
物(Eukaryotic Gene Orthologs，EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索
或者通过使用BLAST算法以目的核酸或多肽序列进行。 一些列出的序列是部分的；优
选全长序列或功能性等价的片段用于本发明的方法。 当仅部分序列从数据库中可得时，
可以通过本领域的技术人员使用标准克隆技术来获得全长基因序列。
物(Eukaryotic Gene Orthologs，EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索
或者通过使用BLAST算法以目的核酸或多肽序列进行。 一些列出的序列是部分的；优
选全长序列或功能性等价的片段用于本发明的方法。 当仅部分序列从数据库中可得时，
可以通过本领域的技术人员使用标准克隆技术来获得全长基因序列。
[1023] 实施例2：本发明多肽序列的比对
[1024] 多肽序列的比对使用来自Vector NTI(Invitrogen)的Alignment X程序进行，其中所述Alignment X程序基于受欢迎的累进比对Clustal W算法(Thompson等人
(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003)，Nucleic Acids Res 31：
3497-3500)。 空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分0.1并且所选的权重矩阵是
Blosum 62(若比对多肽)。 进行少许手工编辑以优化该比对。
(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003)，Nucleic Acids Res 31：
3497-3500)。 空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分0.1并且所选的权重矩阵是
Blosum 62(若比对多肽)。 进行少许手工编辑以优化该比对。
[1025] bHLH6样多肽序列的比对
[1026] 诸bHLH6样多肽之间的序列保守性基本上在所述多肽的氨基端结构域和羧基端bHLH结构域内，中心部分通常在序列长度和组成方面更为多变。 所述bHLH6样多肽在
图2中比对。
图2中比对。
[1027] RrmJ/FtsJ多肽序列的比对
[1028] 在图5中显示了来自表A2的RrmJ/FtsJ多肽的CLUSTAL W(1；83)多重序列比对。
[1029] 给出了在每个位置处包含高度保守的代表性氨基酸的bHLH4多肽的共有序列；在共有序列中的给定氨基酸之间的空白代表任何氨基酸。
[1030] bHLH4多肽在图10中比对。
[1031] 基本上沿着bHLH结构域发现了bHLH4多肽之间的序列保守性。共有序列代表bHLH4多肽中的高度保守的氨基酸残基；共有序列中的空白代表高度可变的区域。
[1032] IPT多肽序列的比对
[1033] 给出了在每个位置处包含高度保守的代表性氨基酸的IPT多肽的共有序列；在共有序列中的给定氨基酸之间的空白代表任何氨基酸。
[1034] IPT多肽在图13中比对。
[1035] 共有序列代表IPT多肽中的高度保守的氨基酸残基；共有序列中的空白代表高度可变的区域。
[1036] 使用邻接聚类算法(如Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供)构建GRP多肽的进化系统树。
[1037] STO多肽中的序列保守性基本上在包含两个B框结构域的氨基端区域中。 两个B框结构域通过可变长度(通常在2至20个氨基酸之间)的接头区域分隔开。
[1038] 使用邻接聚类算法(如Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供)构建STO多肽的进化系统树(图16)。
[1039] 给出了在每个位置处包含高度保守的代表性氨基酸的UGE多肽的共有序列；在共有序列中的给定氨基酸之间的空白代表任何氨基酸。
[1040] UGE多肽在图20中比对。
[1041] UGE多肽之间的序列保守性在位于差向异构酶结构域的氨基端处的区域中更高。 其中在共有序列中存在给定的定义的氨基酸的区域代表具有高相似性的区域；共有
序列中的空白代表高度可变区域。
序列中的空白代表高度可变区域。
[1042] 使用邻接聚类算法(如Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供)构建UGE多肽的进化系统树(图21)。
[1043] 实施例3：在实施本发明方法中有用的多肽序列之间的总体同一性百分数的计算
[1044] 使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同
一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein
or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维
护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。
MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比
对。 该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执
行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后
将结果置于距离矩阵内。 在分割线下半部分显示序列相似性，和在对角分割线的上半部
分显示序列同一性。
一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein
or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维
护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。
MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比
对。 该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执
行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后
将结果置于距离矩阵内。 在分割线下半部分显示序列相似性，和在对角分割线的上半部
分显示序列同一性。
[1045] 比较中使用的参数是：
[1046] 评分矩阵：Blosum62
[1047] 第一空位：12
[1048] 延伸空位：2
[1049] 表B1中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线上方以黑体给出同一性百分数而在对角线下方(正常面)给出相似性百分数。
[1050] 在实施本发明方法中有用的bHLH6样多肽之间的同一性百分数可以低至与SEQID NO：2(AAL55713)相比30％的氨基酸同一性。 但是，当比对在bHLH结构域范围
内进行时，序列同一性可以在不同的bHLH6样蛋白质之间高得多。 在表B2中，列出
了与SEQ ID NO：9(包含bHLH6样多肽序列的bHLH结构域)比对的序列之间的总体
相似性和同一性的值。 序列同一性是大约80％或更高。 使用的肽序列是SEQ ID NO：
42，NP_001065478；SEQ ID NO：43，EAY79619；SEQ ID NO：44，AAD15818；
SEQ ID NO：45，AAB00686；SEQ ID NO：46，ABD59338；SEQ ID NO：47，
Pt29.195#1；SEQ ID NO：48，CAF74710；SEQ ID NO：49，AAF04917；SEQID NO：
50，AAQ14332；SEQ ID NO：51，AAY90122；SEQ ID NO：52，AAL55713；SEQ ID
NO：53，ABD65632；SEQ ID NO：54，ABK94979；SEQID NO：55，EDQ81347。
内进行时，序列同一性可以在不同的bHLH6样蛋白质之间高得多。 在表B2中，列出
了与SEQ ID NO：9(包含bHLH6样多肽序列的bHLH结构域)比对的序列之间的总体
相似性和同一性的值。 序列同一性是大约80％或更高。 使用的肽序列是SEQ ID NO：
42，NP_001065478；SEQ ID NO：43，EAY79619；SEQ ID NO：44，AAD15818；
SEQ ID NO：45，AAB00686；SEQ ID NO：46，ABD59338；SEQ ID NO：47，
Pt29.195#1；SEQ ID NO：48，CAF74710；SEQ ID NO：49，AAF04917；SEQID NO：
50，AAQ14332；SEQ ID NO：51，AAY90122；SEQ ID NO：52，AAL55713；SEQ ID
NO：53，ABD65632；SEQ ID NO：54，ABK94979；SEQID NO：55，EDQ81347。
[1051] 表B1：在多肽序列的全长范围内的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
[1052]6. 4. 5. 4. 5. 5. 7. 2. 3. 2. 0. 4. 2.
4 2 7 0 5 0 9 9 9 8 3 7 0 2
1 6 5 6 5 6 2 4 4 4 4 4 3 3
5. 7. 6. 2. 0. 7. 8. 2. 9. 9. 1. 3.
3 0 1 0 3 0 0 9 2 9 7 1 7
1 3 3 3 3 3 2 2 3 2 2 3 2
9. 5. 3. 6. 0. 2. 0. 5. 7. 9. 5. 1.
2 1 9 9 3 0 3 7 3 8 7 8 8
1 3 2 2 3 3 2 2 3 2 2 2 4
8. 5. 2. 8. 2. 2. 2. 0. 2. 3. 7. 6.
1 7 5 6 5 9 4 4 0 9 5 2 5
1 4 4 4 4 4 2 4 4 7 7 4 4
7. 7. 6. 6. 5. 4. 4. 8. 7. 3. 8. 6.
0 3 1 3 2 5 4 2 6 4 3 2 4
1 4 4 4 4 4 2 4 3 9 8 4 4
0. 8. 8. 2. 7. 3. 1. 3. 8. 6. 9. 9.
8 5 7 7 9 3 5 9 4 7 2 5
9 4 4 4 4 4 2 4 3 9 8 4 4
4. 8. 4. 6. 4. 8. 1. 5. 6. 1. 2. 2.
8 3 5 7 6 7 1 3 2 4 2 3
8 4 4 4 4 4 2 4 5 5 5 5 5
1. 6. 1. 3. 9. 0. 2. 4. 9. 1. 6. 7.
9 6 2 6 2 6 4 1 7 2 2 6
7 4 4 5 4 5 2 5 6 5 6 4 4
2. 9. 8. 7. 3. 7. 3. 9. 3. 1. 8. 4.
8 7 8 4 7 0 4 0 2 1 5 1
6 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3
3. 1. 0. 0. 9. 6. 1. 5. 4. 7. 9. 7.
8 5 4 2 0 7 9 5 1 5 4 8
5 5 5 6 5 4 6 5 6 6 6 4 4
6. 1. 5. 8. 4. 6. 8. 8. 7. 0. 6. 6.
6 0 3 6 2 9 6 0 8 9 2 0
4 5 5 5 6 3 5 6 6 5 5 5 5
1. 1. 2. 4. 1. 1. 2. 8. 8. 4. 2. 1.
9 4 7 8 5 8 0 4 9 3 5 7
3 5 5 6 7 3 6 6 6 5 6 4 4
5. 7. 3. 8. 4. 1. 8. 5. 2. 4. 4. 4.
6 7 8 8 4 2 1 3 1 2 5 9
2 6 6 6 6 3 6 6 6 6 6 4 4
1. 1. 7. 2. 9. 6. 8. 8. 0. 3. 6. 3.
9 1 0 0 4 3 6 3 2 2 8 0
1 7 7 7 7 3 6 6 6 6 6 4 5
8
68600BAA. 83395DBA. 23341QAA. 31755LAA. 01747FAC. 71940FAA. 22109YAA. 23656DBA. 74560100PN. 91697YAE.0 81851DAA.1 97949KBA.2 74318QDE.3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1
8.
8
4
9.
7
4
8.
1
6
5.
1
6
7.
3
6
2.
6
6
0.
4
6
9.
6
3
4.
3
7
6.
1
7
5.
4
7
6.
2
7
8.
6
7
1
#
5
9
1.
9
2t
P.
4
1
4 2 7 0 5 0 9 9 9 8 3 7 0 2
1 6 5 6 5 6 2 4 4 4 4 4 3 3
5. 7. 6. 2. 0. 7. 8. 2. 9. 9. 1. 3.
3 0 1 0 3 0 0 9 2 9 7 1 7
1 3 3 3 3 3 2 2 3 2 2 3 2
9. 5. 3. 6. 0. 2. 0. 5. 7. 9. 5. 1.
2 1 9 9 3 0 3 7 3 8 7 8 8
1 3 2 2 3 3 2 2 3 2 2 2 4
8. 5. 2. 8. 2. 2. 2. 0. 2. 3. 7. 6.
1 7 5 6 5 9 4 4 0 9 5 2 5
1 4 4 4 4 4 2 4 4 7 7 4 4
7. 7. 6. 6. 5. 4. 4. 8. 7. 3. 8. 6.
0 3 1 3 2 5 4 2 6 4 3 2 4
1 4 4 4 4 4 2 4 3 9 8 4 4
0. 8. 8. 2. 7. 3. 1. 3. 8. 6. 9. 9.
8 5 7 7 9 3 5 9 4 7 2 5
9 4 4 4 4 4 2 4 3 9 8 4 4
4. 8. 4. 6. 4. 8. 1. 5. 6. 1. 2. 2.
8 3 5 7 6 7 1 3 2 4 2 3
8 4 4 4 4 4 2 4 5 5 5 5 5
1. 6. 1. 3. 9. 0. 2. 4. 9. 1. 6. 7.
9 6 2 6 2 6 4 1 7 2 2 6
7 4 4 5 4 5 2 5 6 5 6 4 4
2. 9. 8. 7. 3. 7. 3. 9. 3. 1. 8. 4.
8 7 8 4 7 0 4 0 2 1 5 1
6 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3
3. 1. 0. 0. 9. 6. 1. 5. 4. 7. 9. 7.
8 5 4 2 0 7 9 5 1 5 4 8
5 5 5 6 5 4 6 5 6 6 6 4 4
6. 1. 5. 8. 4. 6. 8. 8. 7. 0. 6. 6.
6 0 3 6 2 9 6 0 8 9 2 0
4 5 5 5 6 3 5 6 6 5 5 5 5
1. 1. 2. 4. 1. 1. 2. 8. 8. 4. 2. 1.
9 4 7 8 5 8 0 4 9 3 5 7
3 5 5 6 7 3 6 6 6 5 6 4 4
5. 7. 3. 8. 4. 1. 8. 5. 2. 4. 4. 4.
6 7 8 8 4 2 1 3 1 2 5 9
2 6 6 6 6 3 6 6 6 6 6 4 4
1. 1. 7. 2. 9. 6. 8. 8. 0. 3. 6. 3.
9 1 0 0 4 3 6 3 2 2 8 0
1 7 7 7 7 3 6 6 6 6 6 4 5
8
68600BAA. 83395DBA. 23341QAA. 31755LAA. 01747FAC. 71940FAA. 22109YAA. 23656DBA. 74560100PN. 91697YAE.0 81851DAA.1 97949KBA.2 74318QDE.3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1
8.
8
4
9.
7
4
8.
1
6
5.
1
6
7.
3
6
2.
6
6
0.
4
6
9.
6
3
4.
3
7
6.
1
7
5.
4
7
6.
2
7
8.
6
7
1
#
5
9
1.
9
2t
P.
4
1
[1053] 表B2：在对应于基序7的肽序列范围内的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
[1054]9. 3. 3. 3. 9. 7. 7. 7. 9. 7. 3. 1. 4.
4 2 4 4 4 2 5 5 5 2 5 4 7 1
1 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 7
4. 0. 0. 0. 3. 4. 1. 0. 1. 4. 6. 0.
3 1 0 0 0 4 1 7 0 7 1 8 0
1 8 8 8 8 8 8 7 8 7 8 7 8
0. 4. 4. 4. 4. 3. 9. 3. 3. 7. 9. 0.
2 0 1 1 1 1 4 2 4 4 5 2 0
1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
0. 4. 4. 4. 9. 3. 4. 1. 3. 3. 1. 0.
1 0 1 1 1 2 4 1 7 4 4 7 0
1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
4. 9. 9. 9. 9. 7. 9. 1. 3. 1. 1. 6.
0 1 2 2 2 2 5 2 7 4 7 7 8
1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
0. 0. 0. 0. 4. 9. 0. 1. 6. 6. 1. 6.
0 0 0 0 1 2 0 7 8 8 7 8
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
9. 9. 9. 9. 3. 7. 9. 0.0 6. 6. 1. 6.
2 2 2 2 4 5 2 0 8 8 7 8
8 9 9 9 9 9 9 9 1 9 9 9 8
1. 9. 9. 3. 0. 9. 6. 6. 1. 6. 1. 1.
7 2 2 4 0 2 8 8 7 8 7 7
7 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
0. 3. 3. 3. 3. 7. 7. 7. 7. 1. 7. 6.
0 4 4 4 4 5 5 5 5 7 5 8
6 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
0. 9. 9. 9. 3. 3. 3. 3. 3. 7. 7. 9.
0 2 2 2 4 4 4 4 4 5 5 2
5 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
6. 6. 6. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 1. 3. 6.
8 8 8 5 5 5 5 5 5 7 4 8
4 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
6. 0.0 0.0 7. 7. 7. 3. 3. 3. 7. 3. 6.
8 0 0 5 5 5 4 4 4 5 4 8
3 8 1 1 9 9 9 9 9 9 9 9 8
6. 0.0 0.0 7. 7. 7. 3. 3. 3. 7. 3. 6.
8 0 0 5 5 5 4 4 4 5 4 8
2 8 1 1 9 9 9 9 9 9 9 9 8
3. 3. 3. 7. 3. 7. 1. 1. 1. 7. 1. 0.
4 4 4 5 4 5 7 7 7 5 7 0
1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
8
7
31755LAA. 4560100_PN. 91697YAE. 81851DAA. 68600BAA. 83395DBA. 1#591.92tP. 01747FAC. 71940FAA. 23341QAA.0 22109YAA.1 23656DBA.2 97949KBA.3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1
1.
7
8
7.
5
9
9.
2
9
9.
2
9
9.
2
9
9.
2
9
3.
4
9
9.
2
9
4.
1
9
4.
1
9
4.
1
9
4.
1
9
4.
1
9
7
4
3
1
8
Q
D
E.
4
1
4 2 4 4 4 2 5 5 5 2 5 4 7 1
1 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 7
4. 0. 0. 0. 3. 4. 1. 0. 1. 4. 6. 0.
3 1 0 0 0 4 1 7 0 7 1 8 0
1 8 8 8 8 8 8 7 8 7 8 7 8
0. 4. 4. 4. 4. 3. 9. 3. 3. 7. 9. 0.
2 0 1 1 1 1 4 2 4 4 5 2 0
1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
0. 4. 4. 4. 9. 3. 4. 1. 3. 3. 1. 0.
1 0 1 1 1 2 4 1 7 4 4 7 0
1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
4. 9. 9. 9. 9. 7. 9. 1. 3. 1. 1. 6.
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1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
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9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
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1. 9. 9. 3. 0. 9. 6. 6. 1. 6. 1. 1.
7 2 2 4 0 2 8 8 7 8 7 7
7 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
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5 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
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8 8 8 5 5 5 5 5 5 7 4 8
4 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8
6. 0.0 0.0 7. 7. 7. 3. 3. 3. 7. 3. 6.
8 0 0 5 5 5 4 4 4 5 4 8
3 8 1 1 9 9 9 9 9 9 9 9 8
6. 0.0 0.0 7. 7. 7. 3. 3. 3. 7. 3. 6.
8 0 0 5 5 5 4 4 4 5 4 8
2 8 1 1 9 9 9 9 9 9 9 9 8
3. 3. 3. 7. 3. 7. 1. 1. 1. 7. 1. 0.
4 4 4 5 4 5 7 7 7 5 7 0
1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
8
7
31755LAA. 4560100_PN. 91697YAE. 81851DAA. 68600BAA. 83395DBA. 1#591.92tP. 01747FAC. 71940FAA. 23341QAA.0 22109YAA.1 23656DBA.2 97949KBA.3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1
1.
7
8
7.
5
9
9.
2
9
9.
2
9
9.
2
9
9.
2
9
3.
4
9
9.
2
9
4.
1
9
4.
1
9
4.
1
9
4.
1
9
4.
1
9
7
4
3
1
8
Q
D
E.
4
1
[1055] 在实施本发明方法中有用的STO多肽序列之间的同一性百分数可以低至与SEQID NO：2(Os04g0540200)相比15％氨基酸同一性。
[1056] 表B3：在稻STO蛋白质中的多肽序列的全长范围内的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
[1057]2. 9. 6. 3. 7. 4. 9. 1.
0 7 0 9 3 1 9 8 9 5
1 3 3 2 3 3 2 2 2 2
9. 6. 3. 7. 6. 1. 4. 4.
8 7 6 5 5 7 1 1 8
9 2 1 2 2 2 1 2 2 3
3. 6. 8. 1. 6. 2. 8. 5. 6.
9 8 1 1 4 6 8 2 8
8 3 2 3 4 3 2 2 3 3
2. 1. 6. 1. 4. 9. 4. 3. 1.
9 9 9 9 0 7 1 0 6
7 2 3 2 2 3 3 4 3 3
1. 4. 2. 2. 7. 1.
8 0 6 7 8 4 7 5 4
6 2 5 2 2 2 5 3 2 3
8. 5. 2. 5. 3. 5. 6. 6.
3 6 1 0 6 0 5 1 3
5 3 2 6 3 3 4 4 4 4
1. 4. 3. 9. 2. 9. 3. 6.
3 7 0 3 6 9 1 5 4
4 6 2 3 4 3 3 5 3 4
3. 1. 8. 6. 2. 5. 8. 3. 4.
2 7 5 1 6 2 3 4 2
3 3 2 4 7 3 4 4 3 4
4. 4. 8. 5. 4. 8. 5. 8.
9 8 9 7 3 4 9 7 7
2 2 3 3 3 6 5 3 2 3
5. 1. 7. 2. 2. 3. 2. 8.
9 9 1 8 6 0 2 9 6
1 3 4 7 4 3 4 5 3 4
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
2 5 2 2 0 6 2 0 9 9
0 2 6 6 3 4 2 3 7 0
4 0 0 4 9 0 5 1 2 2
5 2 6 6 4 2 1 7 5 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 g
g g g g g g g g g 2
40sO. 10sO. 20sO. 20sO. 40sO. 50sO. 60sO. 60sO. 90sO. 1sO.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
0 7 0 9 3 1 9 8 9 5
1 3 3 2 3 3 2 2 2 2
9. 6. 3. 7. 6. 1. 4. 4.
8 7 6 5 5 7 1 1 8
9 2 1 2 2 2 1 2 2 3
3. 6. 8. 1. 6. 2. 8. 5. 6.
9 8 1 1 4 6 8 2 8
8 3 2 3 4 3 2 2 3 3
2. 1. 6. 1. 4. 9. 4. 3. 1.
9 9 9 9 0 7 1 0 6
7 2 3 2 2 3 3 4 3 3
1. 4. 2. 2. 7. 1.
8 0 6 7 8 4 7 5 4
6 2 5 2 2 2 5 3 2 3
8. 5. 2. 5. 3. 5. 6. 6.
3 6 1 0 6 0 5 1 3
5 3 2 6 3 3 4 4 4 4
1. 4. 3. 9. 2. 9. 3. 6.
3 7 0 3 6 9 1 5 4
4 6 2 3 4 3 3 5 3 4
3. 1. 8. 6. 2. 5. 8. 3. 4.
2 7 5 1 6 2 3 4 2
3 3 2 4 7 3 4 4 3 4
4. 4. 8. 5. 4. 8. 5. 8.
9 8 9 7 3 4 9 7 7
2 2 3 3 3 6 5 3 2 3
5. 1. 7. 2. 2. 3. 2. 8.
9 9 1 8 6 0 2 9 6
1 3 4 7 4 3 4 5 3 4
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
2 5 2 2 0 6 2 0 9 9
0 2 6 6 3 4 2 3 7 0
4 0 0 4 9 0 5 1 2 2
5 2 6 6 4 2 1 7 5 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 g
g g g g g g g g g 2
40sO. 10sO. 20sO. 20sO. 40sO. 50sO. 60sO. 60sO. 90sO. 1sO.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
[1058] 表B4：在SEQ ID NO：2的直向同源物序列中的多肽序列的全长范围内的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
[1059]1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1.AT1G06040_剪接变体1 68.5 29.5 32 69.2 29.1 31.5 31.6 58.9 59.7 32.3 30 62.5
2.AT1G06040_剪接变体2 69 26.2 30.1 47.4 38.3 30.6 32.9 49.4 49.8 30 39.3 48.6
3.AT1G75540 43.2 35.6 29.5 28.4 23.4 35.6 32.3 30.5 30.2 51.5 25.5 29
4.AT1G78600 48.2 40.1 45.9 32.1 28.2 29.7 28.9 32.1 32.1 30.9 30.5 30.6
5.AT2G31380 82.7 60.9 40.5 44.5 29.5 34.6 32.6 58.2 58.2 32.2 29.6 58.3
6.AT4G10240 41.9 57.6 32.9 36.5 42 30 31 31.4 29.3 23.8 39.9 30.3
7.AT4G39070 50.4 43 47.7 43.5 48.3 40.9 46.8 30 30.4 38.7 29.6 30.9
8.MS_ABO84497 49.2 49.1 46.5 41.8 49.2 44.6 60.7 32.6 30.8 37.5 35.1 30.6
9.LE_AAS67368 69.4 57.1 41.4 45.2 70.6 45.9 47.1 51.9 98.3 33.4 33.2 65.8
10.ST_ABA40448.1 69.8 57.1 40.8 45.5 71 45.1 47.1 48.5 99.1 33.1 32.8 66.7
11.PP_STO 43.5 37.1 65.3 43.5 42.6 33.9 50.3 53.2 46.1 46.1 27.3 30.8
12.VV-CAN72879.1 45.6 53.2 35.6 45.2 49.2 54.6 44.2 47.3 49.8 48.9 37.1 30.9
13.GM_ABB29467 74.6 57.1 40.2 44.1 73.5 43.7 45 50 76.5 76.5 42.3 45.4
1.AT1G06040_剪接变体1 68.5 29.5 32 69.2 29.1 31.5 31.6 58.9 59.7 32.3 30 62.5
2.AT1G06040_剪接变体2 69 26.2 30.1 47.4 38.3 30.6 32.9 49.4 49.8 30 39.3 48.6
3.AT1G75540 43.2 35.6 29.5 28.4 23.4 35.6 32.3 30.5 30.2 51.5 25.5 29
4.AT1G78600 48.2 40.1 45.9 32.1 28.2 29.7 28.9 32.1 32.1 30.9 30.5 30.6
5.AT2G31380 82.7 60.9 40.5 44.5 29.5 34.6 32.6 58.2 58.2 32.2 29.6 58.3
6.AT4G10240 41.9 57.6 32.9 36.5 42 30 31 31.4 29.3 23.8 39.9 30.3
7.AT4G39070 50.4 43 47.7 43.5 48.3 40.9 46.8 30 30.4 38.7 29.6 30.9
8.MS_ABO84497 49.2 49.1 46.5 41.8 49.2 44.6 60.7 32.6 30.8 37.5 35.1 30.6
9.LE_AAS67368 69.4 57.1 41.4 45.2 70.6 45.9 47.1 51.9 98.3 33.4 33.2 65.8
10.ST_ABA40448.1 69.8 57.1 40.8 45.5 71 45.1 47.1 48.5 99.1 33.1 32.8 66.7
11.PP_STO 43.5 37.1 65.3 43.5 42.6 33.9 50.3 53.2 46.1 46.1 27.3 30.8
12.VV-CAN72879.1 45.6 53.2 35.6 45.2 49.2 54.6 44.2 47.3 49.8 48.9 37.1 30.9
13.GM_ABB29467 74.6 57.1 40.2 44.1 73.5 43.7 45 50 76.5 76.5 42.3 45.4
[1060] 在实施本发明方法中有用的UGE多肽序列之间的同一性百分数可以低至与SEQID NO：222相比15％氨基酸同一性。
[1061] 表B5：在代表稻中UGE同种型的多肽序列的全长范围内的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
[1062]UGE蛋白质名称 1 2 3 4 5 6 7 8
1.Os04g0618200 36.7 74.3 35.9 37 21.4 36.5 36.7
2.Os05g0595100 51.7 36.2 65.8 72.2 21.1 58.6 99.7
3.Os07g0139400 81.7 50.6 34.7 34.8 21.5 33.7 36
4.Os08g0374800 51 75.7 50.6 74.4 21.7 53.4 65.8
5.Os09g0323000 51.9 82.4 49.6 82.1 22.6 56.3 72.8
6.Os09g0504000 36.7 33.1 38.8 34.5 35.7 21.4 21.6
7.Os09g0526700 51.4 74 48.2 67.6 72.9 34.5 58.6
8.OS_UGE2 51.7 100 50.6 75.5 82.9 33.5 73.5
1.Os04g0618200 36.7 74.3 35.9 37 21.4 36.5 36.7
2.Os05g0595100 51.7 36.2 65.8 72.2 21.1 58.6 99.7
3.Os07g0139400 81.7 50.6 34.7 34.8 21.5 33.7 36
4.Os08g0374800 51 75.7 50.6 74.4 21.7 53.4 65.8
5.Os09g0323000 51.9 82.4 49.6 82.1 22.6 56.3 72.8
6.Os09g0504000 36.7 33.1 38.8 34.5 35.7 21.4 21.6
7.Os09g0526700 51.4 74 48.2 67.6 72.9 34.5 58.6
8.OS_UGE2 51.7 100 50.6 75.5 82.9 33.5 73.5
[1063] 表B6：在代表来自不同生物的UGE同种型的多肽序列的全长范围内的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
[1064]UGE蛋白质名称 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1.AT1G12780_UGE 90.6 63.3 64.6 64.3 33.9 33.1 32.9 43.6 65.8 54.3 33.1 33.5 24.5 59.6 47.7 65.1
2.AT1G63180_UGE 95.4 62.1 63.8 63.5 32.7 31.8 32.1 42.7 65.5 53.7 32 33.1 24 60.1 49.1 65.4
3.AT1G64440_UGE 78.3 77.5 79.2 79.4 37.6 34.6 34.2 32.3 79.6 64.6 34.4 33.9 26.9 59.9 49.3 74.9
4.AT4G10960_UGE 81.5 80.1 88 88.3 37.4 34.9 34.6 31 81.2 64.6 34.7 35.9 28.3 64.2 50.3 76.4
5.AT4G23920_UGE 80.1 77.8 88 92.9 37.1 35.3 34.8 31.3 83.1 65.9 35.3 35.6 28.5 62.4 50.4 75.8
6.Pt_lcl|scaff_XVI.140 53.2 51.3 55 54.5 54 75.3 82.7 21.1 36.8 32.9 73.2 22.5 19.6 36.1 35.2 36.1
7.Pt_lcl|scaff_XI.1329 49.4 47.5 51.1 49.2 49.2 81.5 76.2 18.9 34.7 31 94.5 21.1 19.9 33.3 33.1 34.3
8.Pt_lcI|scaff_VI.203 49.5 48 50 50.2 48.8 87.6 85.9 20.4 34.9 32.2 75.5 22 19.4 34.2 33 34.3
9.Pt_lcl|scaff_III.961 47.9 46.4 42 41.9 42.6 33.3 30.9 31.7 33.1 29.9 19.6 18.2 15.2 30 25.4 31.8
10.Pt_lcl|scaff_III.1133 79.8 78.3 88.2 90.3 90.3 52.9 48.7 47.8 43.4 73.1 34.4 34.7 27.2 62.5 50 78.2
11.Pt_lcl|scaff_I.773 69.2 68.7 76.1 76.1 77.4 49.2 44.1 45.9 41.9 80.5 30.8 28.6 23.7 52 41.8 62.5
12.Pt_lcl|scaff_I.2996 49.4 47.5 50.8 49.4 48.9 80.6 97.1 85.1 30.9 48.2 44.1 20.8 19.4 33.3 32.4 34
13.Pt_lcl|scaff_5422 45 44.5 45.8 48.1 47.3 39.3 38.4 39.5 25 46.4 40.1 38.2 32.5 35.5 32.9 35
14.Ot08g015500 34.9 34.5 35.5 37.1 36.8 28.9 29.8 29.8 20 36.3 32.2 29.8 45.8 26.2 24.5 26.9
15.SC_GAL10_P04397 77.8 76.4 73.6 75.6 75.3 52.1 47 47.3 40.9 73.9 65.1 47.2 48.7 34.6 47.3 61.7
16. 67.5 67.8 65.5 66.7 67.4 51.1 46.5 46.1 39.5 67.5 61.9 46.3 44.5 34.2 63.6 50
Ec_GALE_AAO37702
17.OS_UGE2 80.2 79.9 83.9 87.3 86.7 55.6 50.6 50.2 42.1 87.6 74.3 50.4 45 37.5 73.2 67.8[1065] 也可以针对本发明的其它多肽(或其部分)产生特定结构域的局部比对的
MATGAT表，或者特定结构域之间的％同一性/相似性的数据。
1.AT1G12780_UGE 90.6 63.3 64.6 64.3 33.9 33.1 32.9 43.6 65.8 54.3 33.1 33.5 24.5 59.6 47.7 65.1
2.AT1G63180_UGE 95.4 62.1 63.8 63.5 32.7 31.8 32.1 42.7 65.5 53.7 32 33.1 24 60.1 49.1 65.4
3.AT1G64440_UGE 78.3 77.5 79.2 79.4 37.6 34.6 34.2 32.3 79.6 64.6 34.4 33.9 26.9 59.9 49.3 74.9
4.AT4G10960_UGE 81.5 80.1 88 88.3 37.4 34.9 34.6 31 81.2 64.6 34.7 35.9 28.3 64.2 50.3 76.4
5.AT4G23920_UGE 80.1 77.8 88 92.9 37.1 35.3 34.8 31.3 83.1 65.9 35.3 35.6 28.5 62.4 50.4 75.8
6.Pt_lcl|scaff_XVI.140 53.2 51.3 55 54.5 54 75.3 82.7 21.1 36.8 32.9 73.2 22.5 19.6 36.1 35.2 36.1
7.Pt_lcl|scaff_XI.1329 49.4 47.5 51.1 49.2 49.2 81.5 76.2 18.9 34.7 31 94.5 21.1 19.9 33.3 33.1 34.3
8.Pt_lcI|scaff_VI.203 49.5 48 50 50.2 48.8 87.6 85.9 20.4 34.9 32.2 75.5 22 19.4 34.2 33 34.3
9.Pt_lcl|scaff_III.961 47.9 46.4 42 41.9 42.6 33.3 30.9 31.7 33.1 29.9 19.6 18.2 15.2 30 25.4 31.8
10.Pt_lcl|scaff_III.1133 79.8 78.3 88.2 90.3 90.3 52.9 48.7 47.8 43.4 73.1 34.4 34.7 27.2 62.5 50 78.2
11.Pt_lcl|scaff_I.773 69.2 68.7 76.1 76.1 77.4 49.2 44.1 45.9 41.9 80.5 30.8 28.6 23.7 52 41.8 62.5
12.Pt_lcl|scaff_I.2996 49.4 47.5 50.8 49.4 48.9 80.6 97.1 85.1 30.9 48.2 44.1 20.8 19.4 33.3 32.4 34
13.Pt_lcl|scaff_5422 45 44.5 45.8 48.1 47.3 39.3 38.4 39.5 25 46.4 40.1 38.2 32.5 35.5 32.9 35
14.Ot08g015500 34.9 34.5 35.5 37.1 36.8 28.9 29.8 29.8 20 36.3 32.2 29.8 45.8 26.2 24.5 26.9
15.SC_GAL10_P04397 77.8 76.4 73.6 75.6 75.3 52.1 47 47.3 40.9 73.9 65.1 47.2 48.7 34.6 47.3 61.7
16. 67.5 67.8 65.5 66.7 67.4 51.1 46.5 46.1 39.5 67.5 61.9 46.3 44.5 34.2 63.6 50
Ec_GALE_AAO37702
17.OS_UGE2 80.2 79.9 83.9 87.3 86.7 55.6 50.6 50.2 42.1 87.6 74.3 50.4 45 37.5 73.2 67.8[1065] 也可以针对本发明的其它多肽(或其部分)产生特定结构域的局部比对的
MATGAT表，或者特定结构域之间的％同一性/相似性的数据。
[1066] 实施例4：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的结构域
[1067] 蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(Integrated Resousce of ProteinFamilies，Domains and Sites)(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标
识数据库的集成界面。 InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法
学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识。 合作数
据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和
TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科
夫模型(HMM)的庞大集合。 Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。 Interpro由英国
欧洲生物信息学研究所维护。
识数据库的集成界面。 InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法
学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识。 合作数
据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和
TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科
夫模型(HMM)的庞大集合。 Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。 Interpro由英国
欧洲生物信息学研究所维护。
[1068] 在表C1中呈现如SEQ ID NO：2所代表的多肽序列的InterPro扫描结果。 检测的结构域归类于Interpro家族IPR001092(碱性螺旋-环-螺旋二聚化区域bHLH)和
IPR001092(碱性螺旋-环-螺旋二聚化区域bHLH)。 表C1：如SEQ ID NO：2所显示
的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)
IPR001092(碱性螺旋-环-螺旋二聚化区域bHLH)。 表C1：如SEQ ID NO：2所显示
的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)
[1069]数据库 登录号 登录名称 SEQ ID NO 2上的氨基酸坐
标
HMMPfam PF00010 HLH 449-498
ProfileScan PS50888 HLH 438-498
超家族 SSF47459 HLH碱性 451-522
标
HMMPfam PF00010 HLH 449-498
ProfileScan PS50888 HLH 438-498
超家族 SSF47459 HLH碱性 451-522
[1070] 代表GRP(RrmJ/FtsJ多肽)的蛋白质序列被用作为查询序列以搜索InterPro数据库。 在实施本发明方法中有用的GRP多肽具有核糖体RNA甲基转移酶RrmJ/FtsJ
结构域(InterPro进入IPR002877和IPR015507；Pfam进入PF01728；PANTHER进入
PTHR10920)。
结构域(InterPro进入IPR002877和IPR015507；Pfam进入PF01728；PANTHER进入
PTHR10920)。
[1071] GRP多肽(bHLH4多肽)序列被用作为查询序列以搜索InterPro数据库。 在实施本发明方法中有用的GRP多肽匹配两个InterPro进入：(i)IPR001092碱性螺旋-环-螺
旋二聚化区域bHLH和(ii)IPR011598螺旋-环-螺旋DNA-结合。
旋二聚化区域bHLH和(ii)IPR011598螺旋-环-螺旋DNA-结合。
[1072] 表C2：
[1073]InterPro登录号 完整的(Integrated) 完整的数据库登录 完整的数据库登录名称
数据库名称 号
IPR001092 Pfam PF00010 HLH
碱性螺旋-环-螺旋二
聚化区域bHLH
“ SMART SM00353 HLH
“ Prosite PS50888 HLH
IPR011598 SSF47459 HLH碱性
螺旋-环-螺旋DNA-
结合
未整合的 Panther PTHR12565
(unintegrated)
Panther PTHR12565 SF7
数据库名称 号
IPR001092 Pfam PF00010 HLH
碱性螺旋-环-螺旋二
聚化区域bHLH
“ SMART SM00353 HLH
“ Prosite PS50888 HLH
IPR011598 SSF47459 HLH碱性
螺旋-环-螺旋DNA-
结合
未整合的 Panther PTHR12565
(unintegrated)
Panther PTHR12565 SF7
[1074] GRP多肽(IPT多肽)序列被用作为查询序列以搜索InterPro数据库。 在实施本发明方法中有用的GRP多肽匹配InterPro进入：(i)IPR002627；和(ii)IPR011593，如下
表中所显示的：
表中所显示的：
[1075] 表C3：
[1076]InterPro登录号 完整的数据库名 完整的数据库登 完整的数据库登录名称
称 录号
IPR002627 ProDom PD004674 Q6GHD2_STAAR_Q6GHD2
家族tRNA异戊
烯基转移酶
Panther PTHR11088 TRNAδ(2)-异戊烯焦磷酸转
移酶相关(TRNA
DELTA(2)-ISOPENTENYLP
YROPHOSPHATE
TRANSFERASE-RELATED
)
Pfam PF01715 IPPT
IPR011593 ProDom PD005388 Q9CA35_ARATH_Q9CA35
结构域异戊烯基
转移酶样
未IPR整合的 Panther PTHR11088：SF2 细胞分裂素合酶
(integrated) 0 (CYTOKININ
SYNTHASE)
称 录号
IPR002627 ProDom PD004674 Q6GHD2_STAAR_Q6GHD2
家族tRNA异戊
烯基转移酶
Panther PTHR11088 TRNAδ(2)-异戊烯焦磷酸转
移酶相关(TRNA
DELTA(2)-ISOPENTENYLP
YROPHOSPHATE
TRANSFERASE-RELATED
)
Pfam PF01715 IPPT
IPR011593 ProDom PD005388 Q9CA35_ARATH_Q9CA35
结构域异戊烯基
转移酶样
未IPR整合的 Panther PTHR11088：SF2 细胞分裂素合酶
(integrated) 0 (CYTOKININ
SYNTHASE)
[1077] 表C4中显示了如SEQ ID NO：166所示的多肽序列的InterPro扫描的结果。
[1078] 表C4：如SEQ ID NO：166所示的多肽序列的InterPro扫描的结果(主要登录号)。
[1079]Interpro 登录号 登录号 名称 B-框1结构 E-值 B-框2结构 E-值
命中 登录号 域的氨基酸 域的氨基酸
坐标 坐标
IPR000315 PFAM PF00643 zf-B_box [1-47] 1.20E-10 [58-105] 8.00E-12
SMART SM00336 BBOX [1-47] 3.00E-11 [58-105] 4.80E-13
PROFILE PS50119 ZF_BBOX [1-47] 9.84 [58-105] 10.04
命中 登录号 域的氨基酸 域的氨基酸
坐标 坐标
IPR000315 PFAM PF00643 zf-B_box [1-47] 1.20E-10 [58-105] 8.00E-12
SMART SM00336 BBOX [1-47] 3.00E-11 [58-105] 4.80E-13
PROFILE PS50119 ZF_BBOX [1-47] 9.84 [58-105] 10.04
[1080]
[1081] 表C5：用于在pfam中针对B框结构域建立HMM的参数
[1082]
[1083] 表C6中显示了如SEQ ID NO：222所示的多肽序列的InterPro扫描的结果。
[1084] 表C6：如SEQ ID NO：222所示的多肽序列的InterPro扫描的结果(主要登录号)
[1085]数据库 登录号 登录名称 SEQ ID NO 2上的 e-值
氨基酸坐标
INTERPRO IPR001509 NAD-依赖性差向异构酶/脱水酶 [9-273] 4.20E-74
PFAM PF01370 差向异构酶 [9-273] 4.20E-74
氨基酸坐标
INTERPRO IPR001509 NAD-依赖性差向异构酶/脱水酶 [9-273] 4.20E-74
PFAM PF01370 差向异构酶 [9-273] 4.20E-74
[1086] 实施例5：在实施本发明方法中有用的多肽序列的拓扑结构预测
[1087] TargetP 1.1预测真核生物蛋白的亚细胞定位。 基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指
派。 作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。 但
是，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)
可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的
预测。 TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
派。 作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。 但
是，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)
可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的
预测。 TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
[1088] 对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
[1089] 可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、界点集合(无、预定义的界点集合或用户指定的界点集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
[1090] 在表D中呈现如SEQ ID NO：2所表示的多肽序列的TargetP 1.1分析的结果。选择“植物”生物组别，未定义界点，并且对转运肽的预测长度提出要求。 如SEQ ID
NO：2所代表的多肽序列的亚细胞定位可以是细胞质或细胞核，没有预测到转运肽。
NO：2所代表的多肽序列的亚细胞定位可以是细胞质或细胞核，没有预测到转运肽。
[1091] 表D1：如SEQ ID NO：2所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析结果
[1092]长度(AA) 623
叶绿体转运肽 0.155
线粒体转运肽 0.143
分泌途径信号肽 0.099
其他亚细胞靶向 0.816
预测的位置 /
可靠性级别 2
预测的转运肽长度 /
叶绿体转运肽 0.155
线粒体转运肽 0.143
分泌途径信号肽 0.099
其他亚细胞靶向 0.816
预测的位置 /
可靠性级别 2
预测的转运肽长度 /
[1093] 当用PredictNLS算法分析时，预测SEQ ID NO：2的核定位具有98％的概率。
[1094]
[1095] 许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
[1096] ·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
[1097] ·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的ProteinProwler亚细胞定位预测者1.2版；
[1098] ·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
[1099] ·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
[1100] 代表GRP的蛋白质序列用作为查询TargetP 1.1。 选择“植物”生物组别，未定义临界值，并且对转运肽的预测长度提出要求。。
[1101] 在表D中呈现如SEQ ID NO：225所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析的结果。选择“植物”生物组别，未定义临界值，并且对转运肽的预测长度提出要求。如SEQ ID
NO：225所代表的多肽序列可以通过分泌途径被送至其最终的亚细胞定位。
NO：225所代表的多肽序列可以通过分泌途径被送至其最终的亚细胞定位。
[1102] 表D2：如SEQ ID NO：222所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析结果
[1103]长度(AA) 354
叶绿体转运肽 /
线粒体转运肽 0.218
分泌途径信号肽 0.451
其他亚细胞靶向 0.268
预测的位置 S＊
可靠性级别 5
预测的转运肽长度 /
叶绿体转运肽 /
线粒体转运肽 0.218
分泌途径信号肽 0.451
其他亚细胞靶向 0.268
预测的位置 S＊
可靠性级别 5
预测的转运肽长度 /
[1104] ＊S：分泌途径
[1105] 实施例6：bHLH6样多肽的功能测定法
[1106] 在Dombrecht等人(2007)中提供AtbHLH6的DNA结合测定法。 简而言之，从基因组DNA扩增出包括密码子285至623的AtbHLH6编码序列的1000-bp片段并克隆到
经NheI-BamHI消化的pTacLCELD6·His载体(Xue，Plant J.41，638-649，2005)。 所
得构建体编码AtbHLH6的最后338个氨基酸(包括bHLH区)，与报道蛋白CelD和6xHis
标签的可读框符合。 通过DNA测序验证正确的扩增和克隆。
经NheI-BamHI消化的pTacLCELD6·His载体(Xue，Plant J.41，638-649，2005)。 所
得构建体编码AtbHLH6的最后338个氨基酸(包括bHLH区)，与报道蛋白CelD和6xHis
标签的可读框符合。 通过DNA测序验证正确的扩增和克隆。
[1107] 根据Xue(2005)确定MYC2DNA结合基序的共有序列和这些位点的相对结合亲和力，其中DNA-结合蛋白(DBP)与6·His标记的纤维素酶D(CELD)的融合物充当用
于从生物素化的随机序列寡核苷酸汇集物中选择结合位点时亲和纯化DBP-DNA复合物
的工具并充当用于测量DNA-结合活性的报道分子。 为了使用纤维素纸作为亲和基质选
择结合位点，将DBP-CELD与40μl含有1mM EDTA，0.25μg/μl聚d(AC-TG)、1mg/
mlBSA和10％甘油的(上述)结合/洗涤缓冲液中的20ng生物素标记的Bio-RS-Oligo在
室温孵育1小时。适宜量的用于结合位点选择的粗制DBP-CELD是实现20-30％相对纤维
素结合效率(洗涤后结合于纤维素的纤维素活性百分数)的DBP-CELD。将DBP-CELD/
2
Bio-RS-Oligo混合物转移至含有Whatman 1滤纸(4mm)的96孔微量滴定平板孔内，其
中所述的滤纸用10μl封闭溶液[含有0.5μg/μl聚d(AC-TG)和10％甘油的结合/洗
涤缓冲液]预先浸透。 在0℃孵育1小时同时轻柔振摇温育后，该纤维素纸用含有1mM
EDTA和0.1mg/ml BSA的结合/洗涤缓冲液洗涤6次。 彻底洗涤在靶位点选择中的使用
基于观察到在固体基质上固定的DBP-寡核苷酸复合物的稳定性相当高。携带靶结合位点
的DBP-CELD在40℃用40μl纤维素酶洗脱缓冲液[10mM HEPES，pH7，50mM KCl，
0.2mM EDTA，4mM纤维二糖，0.05mg/ml BSA和10μg/ml有义序列-特异性引物SP-S]
洗脱15分钟。 洗脱物用于所选择寡核苷酸的PCR扩增。 未经纯化的PCR产物(0.1μl)
用于下一轮位点选择。
于从生物素化的随机序列寡核苷酸汇集物中选择结合位点时亲和纯化DBP-DNA复合物
的工具并充当用于测量DNA-结合活性的报道分子。 为了使用纤维素纸作为亲和基质选
择结合位点，将DBP-CELD与40μl含有1mM EDTA，0.25μg/μl聚d(AC-TG)、1mg/
mlBSA和10％甘油的(上述)结合/洗涤缓冲液中的20ng生物素标记的Bio-RS-Oligo在
室温孵育1小时。适宜量的用于结合位点选择的粗制DBP-CELD是实现20-30％相对纤维
素结合效率(洗涤后结合于纤维素的纤维素活性百分数)的DBP-CELD。将DBP-CELD/
2
Bio-RS-Oligo混合物转移至含有Whatman 1滤纸(4mm)的96孔微量滴定平板孔内，其
中所述的滤纸用10μl封闭溶液[含有0.5μg/μl聚d(AC-TG)和10％甘油的结合/洗
涤缓冲液]预先浸透。 在0℃孵育1小时同时轻柔振摇温育后，该纤维素纸用含有1mM
EDTA和0.1mg/ml BSA的结合/洗涤缓冲液洗涤6次。 彻底洗涤在靶位点选择中的使用
基于观察到在固体基质上固定的DBP-寡核苷酸复合物的稳定性相当高。携带靶结合位点
的DBP-CELD在40℃用40μl纤维素酶洗脱缓冲液[10mM HEPES，pH7，50mM KCl，
0.2mM EDTA，4mM纤维二糖，0.05mg/ml BSA和10μg/ml有义序列-特异性引物SP-S]
洗脱15分钟。 洗脱物用于所选择寡核苷酸的PCR扩增。 未经纯化的PCR产物(0.1μl)
用于下一轮位点选择。
[1108] 备选地，6·His标记的DBP-CELD(10-25μg粗制蛋白)在室温于含有10mM咪唑和350μg Ni-NTA磁性琼脂糖珠(Qiagen)的60μl PNT缓冲液(50mM磷酸钠，pH8.0，
300mM NaCl和0.05％吐温20)中孵育45-60分钟，同时在微量管混和仪(日本东京Tomy
Seiko Co.)中轻柔振荡。 通过将所述管置于12管磁体(Qiagen)中，在管的侧边收集所述
Ni-NTA磁珠。 未结合的蛋白质通过用含有20mM咪唑的150-200μl PNT洗涤3次并用
含有2mM MgCl2、1mg/ml BSA和10％甘油的60μl结合/洗涤缓冲液洗涤1次除去。
洗过的珠子悬浮在含有2mM MgCl2，0.25μg/μl聚d(AC-TG)，1mg/ml BSA，0.0025％
Nonidet P-40，10％甘油和生物素标记的寡核苷酸(50ng Bio-RS-Oligo或从先前选择的寡
核苷酸中扩增的1μl PCR产物)的40μl结合/洗涤缓冲液中。 悬浮液在室温孵育1.5
小时，同时在微量管混和仪中轻柔振荡。用含有2mMMgCl2、0.1mg/ml BSA和0.0025％
Nonidet P-40的150-200μl结合/洗涤缓冲液洗涤4次(每次洗涤3-4分钟)后，携带靶
位点结合的BDP-CELD的珠子重悬于8μl含有5μg/ml有义序列特异性引物(SP-S)的
5mM Tris-Cl(pH8.0)/0.5mM EDTA中，并且悬浮液转移至一只清洁管内并用于所选择寡
核苷酸的PCR扩增。 未经纯化的PCR产物(1μl)用于下一轮位点选择。
300mM NaCl和0.05％吐温20)中孵育45-60分钟，同时在微量管混和仪(日本东京Tomy
Seiko Co.)中轻柔振荡。 通过将所述管置于12管磁体(Qiagen)中，在管的侧边收集所述
Ni-NTA磁珠。 未结合的蛋白质通过用含有20mM咪唑的150-200μl PNT洗涤3次并用
含有2mM MgCl2、1mg/ml BSA和10％甘油的60μl结合/洗涤缓冲液洗涤1次除去。
洗过的珠子悬浮在含有2mM MgCl2，0.25μg/μl聚d(AC-TG)，1mg/ml BSA，0.0025％
Nonidet P-40，10％甘油和生物素标记的寡核苷酸(50ng Bio-RS-Oligo或从先前选择的寡
核苷酸中扩增的1μl PCR产物)的40μl结合/洗涤缓冲液中。 悬浮液在室温孵育1.5
小时，同时在微量管混和仪中轻柔振荡。用含有2mMMgCl2、0.1mg/ml BSA和0.0025％
Nonidet P-40的150-200μl结合/洗涤缓冲液洗涤4次(每次洗涤3-4分钟)后，携带靶
位点结合的BDP-CELD的珠子重悬于8μl含有5μg/ml有义序列特异性引物(SP-S)的
5mM Tris-Cl(pH8.0)/0.5mM EDTA中，并且悬浮液转移至一只清洁管内并用于所选择寡
核苷酸的PCR扩增。 未经纯化的PCR产物(1μl)用于下一轮位点选择。
[1109] 对于EMSA测定法，利用高严格结合缓冲液(50mM磷酸钠，pH8.0，1MNaCl，10％甘油，1％吐温20和10mM咪唑)，使用Ni-NTA磁性琼脂糖珠纯化6·His标记的
DBP-CELD蛋白，并且该方法的其余部分按照制造商的说明书进行。 在3’末端以洋地
黄毒甙标记的双链合成性寡核苷酸(30-45fmol)与纯化的DBP(30-75ng)在15μl结合缓
冲液[25mM HEPES/KOH，pH 7.0，50mM KCl，0.5mM DTT，2mM MgCl2，0.2μg/μl
聚d(AC-TG)，0.3mg/mlBSA和10％甘油]中孵育。 在室温孵育30分钟后，DBP/DNA
复合物在含有5mM乙酸钠，0.5mM EDTA和5％甘油的40-mM Tris乙酸盐缓冲液(pH
7.5)中的6％聚丙烯酰胺凝胶上与游离探针分开。 电泳后，将凝胶中的DBP/DNA复合
物和游离探针转移至Hybond Np膜。 碱性磷酸酶缀和的抗洋地黄毒甙抗体和化学发光底
物CDP-Star(Roche Diagnostics)用于根据制造商的说明书检测洋地黄毒甙。
DBP-CELD蛋白，并且该方法的其余部分按照制造商的说明书进行。 在3’末端以洋地
黄毒甙标记的双链合成性寡核苷酸(30-45fmol)与纯化的DBP(30-75ng)在15μl结合缓
冲液[25mM HEPES/KOH，pH 7.0，50mM KCl，0.5mM DTT，2mM MgCl2，0.2μg/μl
聚d(AC-TG)，0.3mg/mlBSA和10％甘油]中孵育。 在室温孵育30分钟后，DBP/DNA
复合物在含有5mM乙酸钠，0.5mM EDTA和5％甘油的40-mM Tris乙酸盐缓冲液(pH
7.5)中的6％聚丙烯酰胺凝胶上与游离探针分开。 电泳后，将凝胶中的DBP/DNA复合
物和游离探针转移至Hybond Np膜。 碱性磷酸酶缀和的抗洋地黄毒甙抗体和化学发光底
物CDP-Star(Roche Diagnostics)用于根据制造商的说明书检测洋地黄毒甙。
[1110] 其他细节在Xue(2005)中提供。
[1111] 实施例7：在本发明方法中所用的核酸序列的克隆
[1112] 本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。 使用Hifi Taq DNA聚
合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。 所用的引物是
prm06515(SEQ ID NO：10；有义，起始密码子为粗体字)：
合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。 所用的引物是
prm06515(SEQ ID NO：10；有义，起始密码子为粗体字)：
[1113] 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaaca actgattaccggctacaa-3’，
[1114] 和prm06516(SEQ ID NO：11；反义，互补)：
[1115] 5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacacccttttaaccgattttt-3’，
[1116] 其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。 也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语
学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”pbHLH6样。 质
粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”pbHLH6样。 质
粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[1117] 包含SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已
经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。
用于根特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：12)位于该Gateway盒上游。
经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。
用于根特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：12)位于该Gateway盒上游。
[1118] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::bHLH6样(图3)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
[1119] 实施例8：植物转化
[1120] 稻转化
[1121] 使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。 将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
[1122] 将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。 农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。 随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
[1123] 对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养箱转移至温室。 在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
[1124] 玉米转化
[1125] 玉米(Zea mays)的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方法进行。 在玉米中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1126] 小麦转化
[1127] 小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。 栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化中。 不成熟的胚与
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1128] 大豆转化
[1129] 根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。 几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。 栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1130] 油菜/卡诺拉油菜转化
[1131] 使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。 商业品种Westar(Agriculture
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。 当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，
含有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将
生根的枝条(shoot)移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。 当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，
含有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将
生根的枝条(shoot)移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1132] 苜蓿转化
[1133] 使 用 (McKersie 等，1999Plant Physiol 119：839-847)的 方 法 转 化 苜 蓿((Medicago sativa))的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再
生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品
种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品
种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1134] 棉花转化
[1135] 使用根癌农杆菌根据US5,159,135中描述的方法转化棉花。 将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中在20分钟的期间内表面灭菌，并且在具500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水
中洗涤。 然后将种子转移至具有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中用于萌发。 将4-6日
龄的幼苗的下胚轴移出，切割成0.5cm的片，放置在0.8％的琼脂上。 使用农杆菌悬浮
液(大约108个细胞每ml，自用目的基因和适当的选择标记转化的过夜培养物中稀释)
用于接种下胚轴外植体。 在室温和光照下3天后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l
Gelrite)，其具有Murashige和Skoog盐(具有B5维生素(Gamborg等人，Exp.CellRes.50：
151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l 6-糠胺嘌呤和750μg/mlMgCL2)，并且具
有50-100μg/ml的头孢噻肟和400-500μg/ml的羧苄西林以杀死剩余的细菌。 在两个
或三个月后(每4至6周继代培养)分离单个细胞系，然后将它们进一步培养在选择培养
基上用于组织扩增(30℃，16小时光照期)。 然后将转化的组织再培养在非选择性培养
基中，经过2至3个月以产生体细胞胚。 至少4mm长的健康样子的胚被转移至具有SH
培养基的试管中，所述培养基在细的蛭石(vermiculite)中，补充有0.1mg/l的吲哚乙酸、
6糠胺嘌呤和赤霉酸。 将胚培养在30℃，光周期为16小时，并且将第2或3叶阶段的小
植株转移到具有蛭石和营养物的花盆中。 将植物硬化并且随后移到温室中用于进一步培
养。
中洗涤。 然后将种子转移至具有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中用于萌发。 将4-6日
龄的幼苗的下胚轴移出，切割成0.5cm的片，放置在0.8％的琼脂上。 使用农杆菌悬浮
液(大约108个细胞每ml，自用目的基因和适当的选择标记转化的过夜培养物中稀释)
用于接种下胚轴外植体。 在室温和光照下3天后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l
Gelrite)，其具有Murashige和Skoog盐(具有B5维生素(Gamborg等人，Exp.CellRes.50：
151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l 6-糠胺嘌呤和750μg/mlMgCL2)，并且具
有50-100μg/ml的头孢噻肟和400-500μg/ml的羧苄西林以杀死剩余的细菌。 在两个
或三个月后(每4至6周继代培养)分离单个细胞系，然后将它们进一步培养在选择培养
基上用于组织扩增(30℃，16小时光照期)。 然后将转化的组织再培养在非选择性培养
基中，经过2至3个月以产生体细胞胚。 至少4mm长的健康样子的胚被转移至具有SH
培养基的试管中，所述培养基在细的蛭石(vermiculite)中，补充有0.1mg/l的吲哚乙酸、
6糠胺嘌呤和赤霉酸。 将胚培养在30℃，光周期为16小时，并且将第2或3叶阶段的小
植株转移到具有蛭石和营养物的花盆中。 将植物硬化并且随后移到温室中用于进一步培
养。
[1136] 实施例9：表型评价方法
[1137] 9.1评价建立
[1138] 产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。 留下下述6个事件，其中所述事件的T1子代对所述转基因的存在
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
[1139] 4个T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，不过每个事件采用更多个体。植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，
从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1140] 干旱筛选
[1141] 来自T2种子的植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。 将湿度探针插入随机选择的花钵内，以监
测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌
溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培育(植物成熟、
种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件下生长详述那样
记录生长和产量参数。
测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌
溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培育(植物成熟、
种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件下生长详述那样
记录生长和产量参数。
[1142] 氮使用效率筛选
[1143] 源自T2种子的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。从移植至成熟期间用氮(N)浓度降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液浇灌所述花
钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。 如对
正常条件下的生长详述那样记录生长和产量参数。
钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。 如对
正常条件下的生长详述那样记录生长和产量参数。
[1144] 盐胁迫筛选
[1145] 植物在由椰子纤维和argex(3∶1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养溶液。在这两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养
溶液，直至收获植物。 随后测量种子相关参数。
溶液，直至收获植物。 随后测量种子相关参数。
[1146] 9.2统计分析：F-检验
[1147] 使用两因素ANOVA(变量分析)作为整体评价植物表型特征的统计模型。 对于用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。 实施F检验以
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
[1148] 因为实施了具有重叠事件的两个实验，故而进行联合分析。 这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且若是一致的，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
[1149] 9.3测量的参数
[1150] 生物量相关的参数测量
[1151] 植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1152] 植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素总数而确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。 早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分的面积。
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。 早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分的面积。
[1153] 早期萌发势通过计数来自植物部分的区别于背景的像素总数确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且转化成通过校正以平方mm表述的物理
表面值。 下述结果针对萌发后3周的植物。
表面值。 下述结果针对萌发后3周的植物。
[1154] 种子相关的参数测量
[1155] 将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。充实粒使用吹
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。每圆锥花序
的花数从总种子数和第一圆锥花序数计算，并且是植物上每圆锥花序的小花的平均数的
评估。
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。每圆锥花序
的花数从总种子数和第一圆锥花序数计算，并且是植物上每圆锥花序的小花的平均数的
评估。
[1156] 实施例10：转基因植物表型评价的结果
[1157] 在正常生长条件下培育的表达SEQ ID NO：2的bHLH6样蛋白质的转基因稻植物相比于对照植物，显示出出苗萌发势和种子产量的提高(如每圆锥花序的花数所显示
的，见下表)。 这些提高在用T1和T2世代植物的2个实验中测量，并且是统计学显著
的。
的，见下表)。 这些提高在用T1和T2世代植物的2个实验中测量，并且是统计学显著
的。
[1158]T1世代 T2世代
参数 ％提高 ％提高
出苗萌发势 11.9 2.8
每圆锥花序的花数 7.4 6.2
参数 ％提高 ％提高
出苗萌发势 11.9 2.8
每圆锥花序的花数 7.4 6.2
[1159] 此外，对于种子总重量、饱满种子数和收获指数，在T1和T2世代中观察到正向作用。
[1160] 实施例11：在本发明方法中有用的核酸序列的克隆
[1161] SEQ ID NO：57的克隆(编码RrmJ/FtsJ甲基转移酶)
[1162] 鉴定和选择在同步烟草BY2细胞培养物(烟草淡黄色-2栽培品种(Nicotianatabacum L.cv.Bright Yellow-2)上进行的cDNA-AFLP实验，以及受细胞周期调节的BY2表
达序列标签用于进一步克隆。使用所述表达序列标签来筛选烟草cDNA文库(在Gateway
相容载体中；Invitrogen Paisley，UK)以分离全长目的cDNA，即编码SEQ ID NO：57所
示的RrmJ/FtsJ甲基转移酶核酸序列的cDNA。
达序列标签用于进一步克隆。使用所述表达序列标签来筛选烟草cDNA文库(在Gateway
相容载体中；Invitrogen Paisley，UK)以分离全长目的cDNA，即编码SEQ ID NO：57所
示的RrmJ/FtsJ甲基转移酶核酸序列的cDNA。
[1163] 包含SEQ ID NO：57的分离的质粒随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与
已经克隆在进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。
用于种子特异性表达的稻油质蛋白启动子(SEQ ID NO：91)位于该Gateway盒上游。
已经克隆在进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。
用于种子特异性表达的稻油质蛋白启动子(SEQ ID NO：91)位于该Gateway盒上游。
[1164] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pOleo::GRP(图6)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
[1165] 实施例12：植物转化
[1166] 稻转化
[1167] 使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。 将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
[1168] 将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。 农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。 随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
[1169] 对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养箱转移至温室。 在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
[1170] 实施例13：表型评价方法
[1171] 13.1评价建立
[1172] 产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。 留下下述6个事件，其中所述事件的T1子代对所述转基因的存在
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
[1173] 4个T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，不过每个事件采用更多个体。
[1174] 植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1175] 干旱筛选
[1176] 来自T2种子的植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。 将湿度探针插入随机选择的花钵内，以监
测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌
溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培育(植物成熟、
种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件生长下详述那样
记录生长和产量参数。
测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌
溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培育(植物成熟、
种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件生长下详述那样
记录生长和产量参数。
[1177] 氮使用效率筛选
[1178] 源自T2种子的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。从移植至成熟期间用氮(N)浓度降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液浇灌所述花
钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。 如对
正常条件生长下详述那样记录生长和产量参数。
钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。 如对
正常条件生长下详述那样记录生长和产量参数。
[1179] 13.2统计分析：F-检验
[1180] 使用两因素ANOVA(变量分析)作为整体评价植物表型特征的统计模型。 对于用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。 实施F检验以
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
[1181] 因为实施了具有重叠事件的两个实验，故而进行联合分析。 这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且若是一致的，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
[1182] 13.3测量的参数
[1183] 生物量相关的参数测量
[1184] 植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素总数而确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。
[1185] 种子相关的参数测量
[1186] 将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。充实粒使用吹
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
[1187] 实施例14：转基因植物表型评价的结果
[1188] 在油质蛋白启动子的控制下表达如SEQ ID NO：57所表示的GRP核酸序列的转基因稻植物显示对于种子总重量、饱满种子数、饱满率和收获指数超过5％的提高。
[1189]在T1世代中2个事件 在T2世代中2个事件
的平均％提高 的平均％提高
每株植物的总种子产量 48％ 46％
饱满种子总数 46％ 44％
饱满率 39％ 45％
收获指数 40％ 40％
的平均％提高 的平均％提高
每株植物的总种子产量 48％ 46％
饱满种子总数 46％ 44％
饱满率 39％ 45％
收获指数 40％ 40％
[1190] 实施例15：其他作物转化
[1191] 玉米转化
[1192] 玉米(Zea mays)的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方法进行。 在玉米中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1193] 小麦转化
[1194] 小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。 栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化中。 不成熟的胚与
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1195] 大豆转化
[1196] 根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。 几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。 栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1197] 油菜/卡诺拉油菜转化
[1198] 使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。 商业品种Westar(Agriculture
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，含
有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将生
根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA
插入物的植物产生T1种子。
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，含
有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将生
根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA
插入物的植物产生T1种子。
[1199] 苜蓿转化
[1200] 使用(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(Medicagosativa)的再生性克隆。 苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植
物。 已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品种
Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
物。 已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品种
Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1201] 棉花转化
[1202] 使用根癌农杆菌，在下胚轴外植体上进行棉花(Gossypium hirsutum L.)转化。商业品种如Coker 130或Coker 312(SeedCo，Lubbock，TX)是用于转化的标准品种，不过
其他品种也可以使用。将种子进行表面消毒并在黑暗中萌发。 从萌发的幼苗切下下胚轴
外植体成约1-1.5厘米长度。该下胚轴外植体浸没在含有所述表达载体的根癌农杆菌接种
物中5分钟，随后在MS+1.8mg/l KNO3+2％葡萄糖上在24℃于黑暗中共培育约48小时。
所述外植体转移至含有适宜细菌选择标记和植物选择标记的相同培养基(更换数次)，直
至看到生胚性愈伤组织。将所述愈伤组织分开继代培养直至体细胞胚出现。 从所述体细
胞胚衍生的小植物在生根培养基上成熟直至根发育。 将生根的枝条移植至温室中的盆栽
土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种
子。
其他品种也可以使用。将种子进行表面消毒并在黑暗中萌发。 从萌发的幼苗切下下胚轴
外植体成约1-1.5厘米长度。该下胚轴外植体浸没在含有所述表达载体的根癌农杆菌接种
物中5分钟，随后在MS+1.8mg/l KNO3+2％葡萄糖上在24℃于黑暗中共培育约48小时。
所述外植体转移至含有适宜细菌选择标记和植物选择标记的相同培养基(更换数次)，直
至看到生胚性愈伤组织。将所述愈伤组织分开继代培养直至体细胞胚出现。 从所述体细
胞胚衍生的小植物在生根培养基上成熟直至根发育。 将生根的枝条移植至温室中的盆栽
土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种
子。
[1203] 实施例16：在本发明方法中所用的核酸序列的克隆
[1204] 克隆SEQ ID NO：104(编码GRP，其中所述GRP多肽是碱性-螺旋-环-螺旋4(bHLH4)多肽)
[1205] 本发明方法中所用的核酸序列SEQ ID NO：104通过PCR，使用定制的拟南芥混合组织cDNA文库(在pCMV Sport 6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩
增。 使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板
进行PCR。 所用的引物是prm06763(SEQID NO：107；有义)：
增。 使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板
进行PCR。 所用的引物是prm06763(SEQID NO：107；有义)：
[1206] 5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggctccgacgaatgtt 3’
[1207] 和prm06764(SEQ ID NO：108；反义，互补)：
[1208] 5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggttgctgacttcaattcatggac 3’
[1209] 其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。 也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语
学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”。质粒pDONR201
作为 技术的部分从Invitrogen购买。
学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”。质粒pDONR201
作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[1210] 包含SEQ ID NO：104的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。 这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图
与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元
件。 用于组成型表达的稻HMGB启动子(SEQ ID NO：106)位于该Gateway盒上游。
与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元
件。 用于组成型表达的稻HMGB启动子(SEQ ID NO：106)位于该Gateway盒上游。
[1211] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pHMGB： ：GRP(图8)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
[1212] 实施例17：植物转化
[1213] 稻转化
[1214] 使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。 将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
[1215] 将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。 农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。 随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
[1216] 对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养箱转移至温室。 在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
[1217] 实施例18：表型评价方法
[1218] 18.1评价建立
[1219] 产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。 留下下述5个事件，其中所述事件的T1子代对所述转基因的存在
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
[1220] 4个T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，不过每个事件采用更多个体。
[1221] 植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1222] 18.2统计分析：F-检验
[1223] 使用两因素ANOVA(变量分析)作为整体评价植物表型特征的统计模型。 对于用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。 实施F检验以
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
[1224] 因为实施了具有重叠事件的两个实验，故而进行联合分析。 这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且若是一致的，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
[1225] 18.3测量的参数
[1226] 生物量相关的参数测量
[1227] 植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素总数而确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。
[1228] 种子相关的参数测量
[1229] 将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。充实粒使用吹
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
[1230] 实施例19：转基因植物表型评价的结果
[1231] 在HMGB启动子的控制下表达如SEQ ID NO：104所表示的GRP核酸序列的转基因稻植物显示对于种子总重量、饱满种子数、饱满率和收获指数超过5％的提高。
[1232]T1世代中5个事件的 T2世代中2个事件平
总平均％提高 均％提高
早期萌发势 21％ 7％
每株植物的总种子产量 23％ 27％
饱满种子总数 22％ 28％
种子饱满率 12％ 15％
收获指数 18％ 17％
绿度指数 4％ 9％
总平均％提高 均％提高
早期萌发势 21％ 7％
每株植物的总种子产量 23％ 27％
饱满种子总数 22％ 28％
种子饱满率 12％ 15％
收获指数 18％ 17％
绿度指数 4％ 9％
[1233] 实施例20：其他作物转化
[1234] 玉米转化
[1235] 玉米(Zea mays)的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方法进行。 在玉米中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1236] 小麦转化
[1237] 小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。 栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化中。 不成熟的胚与
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1238] 大豆转化
[1239] 根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。 几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。 栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1240] 油菜/卡诺拉油菜转化
[1241] 使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。 商业品种Westar(Agriculture
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，含
有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将生
根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA
插入物的植物产生T1种子。
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，含
有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将生
根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA
插入物的植物产生T1种子。
[1242] 苜蓿转化
[1243] 使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(Medicagosativa)的再生性克隆。 苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植
物。 已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品种
Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
物。 已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品种
Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1244] 棉花转化
[1245] 使用根癌农杆菌，在下胚轴外植体上进行棉花(Gossypium hirsutum L.)转化。商业品种如Coker 130或Coker 312(SeedCo，Lubbock，TX)是用于转化的标准品种，不过
其他品种也可以使用。将种子进行表面消毒并在黑暗中萌发。 从萌发的幼苗切下下胚轴
外植体成约1-1.5厘米长度。该下胚轴外植体浸没在含有所述表达载体的根癌农杆菌接种
物中5分钟，随后在MS+1.8mg/l KNO3+2％葡萄糖上在24℃于黑暗中共培育约48小时。
所述外植体转移至含有适宜细菌选择标记和植物选择标记的相同培养基(更换数次)，直
至看到生胚性愈伤组织。将所述愈伤组织分开继代培养直至体细胞胚出现。 从所述体细
胞胚衍生的小植物在生根培养基上成熟直至根发育。 将生根的枝条移植至温室中的盆栽
土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种
子。
其他品种也可以使用。将种子进行表面消毒并在黑暗中萌发。 从萌发的幼苗切下下胚轴
外植体成约1-1.5厘米长度。该下胚轴外植体浸没在含有所述表达载体的根癌农杆菌接种
物中5分钟，随后在MS+1.8mg/l KNO3+2％葡萄糖上在24℃于黑暗中共培育约48小时。
所述外植体转移至含有适宜细菌选择标记和植物选择标记的相同培养基(更换数次)，直
至看到生胚性愈伤组织。将所述愈伤组织分开继代培养直至体细胞胚出现。 从所述体细
胞胚衍生的小植物在生根培养基上成熟直至根发育。 将生根的枝条移植至温室中的盆栽
土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种
子。
[1246] 实施例21：非生物胁迫筛选
[1247] 干旱筛选
[1248] 来自T1、T2或其它世代的稻植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。 随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。 将湿度探针插入随机选择
的花钵内，以监测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述
植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培
育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件
生长下详述那样记录生长和产量参数。
的花钵内，以监测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述
植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培
育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件
生长下详述那样记录生长和产量参数。
[1249] 盐胁迫筛选
[1250] 来自T1、T2或其它世代的稻植物在由椰子纤维和argex(3∶1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养溶液。 在这两周后，添
加25mM盐(NaCl)至所述营养溶液，直至收获植物。如对正常条件生长下详述那样记录
生长和产量参数。
加25mM盐(NaCl)至所述营养溶液，直至收获植物。如对正常条件生长下详述那样记录
生长和产量参数。
[1251] 氮使用效率筛选
[1252] 来自T1、T2或其它世代的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。 从移植至成熟期间用氮(N)浓度降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液
浇灌所述花钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物
相同。 如对正常条件生长下详述那样记录生长和产量参数。
浇灌所述花钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物
相同。 如对正常条件生长下详述那样记录生长和产量参数。
[1253] 实施例22：在本发明方法中所用的核酸序列的克隆
[1254] 克隆SEQ ID NO：131(编码GRP，其中所述GRP多肽是异戊烯基转移酶(IPT)多肽)
[1255] 本发明方法中所用的核酸序列SEQ ID NO：131通过PCR，使用定制的拟南芥混合组织cDNA文库(在pCMV Sport 6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩
增。 使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板
进行PCR。 所用的引物是prm03095(SEQID NO：134；有义)：
增。 使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板
进行PCR。 所用的引物是prm03095(SEQID NO：134；有义)：
[1256] 5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatgacagaactcaacttccac 3’
[1257] 和prm03096(SEQ ID NO：135；反义，互补)：
[1258] 5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaactaattttgcaccaaatg 3’
[1259] 其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。 也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语
学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”。质粒pDONR201
作为 技术的部分从Invitrogen购买。
学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”。质粒pDONR201
作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[1260] 包含SEQ ID NO：131的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。 这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图
与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元
件。 用于种子特异性表达的稻谷醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO：133)位于该Gateway盒
上游。
与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元
件。 用于种子特异性表达的稻谷醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO：133)位于该Gateway盒
上游。
[1261] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pProl::GRP(图11)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
[1262] 实施例23：植物转化
[1263] 稻转化
[1264] 使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。 将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
[1265] 将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。 农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。 随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
[1266] 对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养箱转移至温室。 在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
[1267] 实施例24：表型评价方法
[1268] 24.1评价建立
[1269] 产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。 留下下述6个事件，其中所述事件的T1子代对所述转基因的存在
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
[1270] 4个T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，不过每个事件采用更多个体。
[1271] 植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1272] 24.2统计分析：F-检验
[1273] 使用两因素ANOVA(变量分析)作为整体评价植物表型特征的统计模型。 对于用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。 实施F检验以
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
[1274] 因为实施了具有重叠事件的两个实验，故而进行联合分析。 这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且若是一致的，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
[1275] 24.3测量的参数
[1276] 生物量相关的参数测量
[1277] 植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素总数而确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。
[1278] 种子相关的参数测量
[1279] 将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。充实粒使用吹
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
[1280] 实施例25：转基因植物表型评价的结果
[1281] 在谷醇溶蛋白启动子的控制下表达如SEQ ID NO：131所表示的GRP核酸序列的转基因稻植物显示对于每株植物的总种子产量、饱满种子数、种子总数和收获指数超
过5％的提高。
过5％的提高。
[1282]T1世代中4个事件的 T2世代中4个事件平
总平均％提高 均％提高
每株植物的总种子产量 19％ 14％
饱满种子数 20％ 16％
种子总数 16％ 8％
收获指数 9％ 15％
总平均％提高 均％提高
每株植物的总种子产量 19％ 14％
饱满种子数 20％ 16％
种子总数 16％ 8％
收获指数 9％ 15％
[1283] 实施例26：其他作物转化
[1284] 玉米转化
[1285] 玉米(Zea mays)的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方法进行。 在玉米中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1286] 小麦转化
[1287] 小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。 栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化中。 不成熟的胚与
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1288] 大豆转化
[1289] 根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。 几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。 栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1290] 油菜/卡诺拉油菜转化
[1291] 使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。 商业品种Westar(Agriculture
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，含
有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将生
根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA
插入物的植物产生T1种子。
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，含
有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将生
根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA
插入物的植物产生T1种子。
[1292] 苜蓿转化
[1293] 使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(Medicagosativa)的再生性克隆。 苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植
物。 已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品种
Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
物。 已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品种
Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1294] 棉花转化
[1295] 使用根癌农杆菌，在下胚轴外植体上进行棉花(Gossypium hirsutum L.)转化。商业品种如Coker 130或Coker 312(SeedCo，Lubbock，TX)是用于转化的标准品种，不过
其他品种也可以使用。将种子进行表面消毒并在黑暗中萌发。 从萌发的幼苗切下下胚轴
外植体成约1-1.5厘米长度。该下胚轴外植体浸没在含有所述表达载体的根癌农杆菌接种
物中5分钟，随后在MS+1.8mg/l KNO3+2％葡萄糖上在24℃于黑暗中共培育约48小时。
所述外植体转移至含有适宜细菌选择标记和植物选择标记的相同培养基(更换数次)，直
至看到生胚性愈伤组织。将所述愈伤组织分开继代培养直至体细胞胚出现。 从所述体细
胞胚衍生的小植物在生根培养基上成熟直至根发育。 将生根的枝条移植至温室中的盆栽
土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种
子。
其他品种也可以使用。将种子进行表面消毒并在黑暗中萌发。 从萌发的幼苗切下下胚轴
外植体成约1-1.5厘米长度。该下胚轴外植体浸没在含有所述表达载体的根癌农杆菌接种
物中5分钟，随后在MS+1.8mg/l KNO3+2％葡萄糖上在24℃于黑暗中共培育约48小时。
所述外植体转移至含有适宜细菌选择标记和植物选择标记的相同培养基(更换数次)，直
至看到生胚性愈伤组织。将所述愈伤组织分开继代培养直至体细胞胚出现。 从所述体细
胞胚衍生的小植物在生根培养基上成熟直至根发育。 将生根的枝条移植至温室中的盆栽
土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种
子。
[1296] 实施例27：非生物胁迫筛选
[1297] 干旱筛选
[1298] 来自T1、T2或其它世代的稻植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。 随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。 将湿度探针插入随机选择
的花钵内，以监测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述
植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培
育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件
生长下详述那样记录生长和产量参数。
的花钵内，以监测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述
植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培
育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件
生长下详述那样记录生长和产量参数。
[1299] 盐胁迫筛选
[1300] 来自T1、T2或其它世代的稻植物在由椰子纤维和argex(3∶1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养溶液。 在这两周后，添
加25mM盐(NaCl)至所述营养溶液，直至收获植物。如对正常条件生长下详述那样记录
生长和产量参数。
加25mM盐(NaCl)至所述营养溶液，直至收获植物。如对正常条件生长下详述那样记录
生长和产量参数。
[1301] 氮使用效率筛选
[1302] 来自T1、T2或其它世代的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。 从移植至成熟期间用氮(N)浓度降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液
浇灌所述花钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物
相同。 如对正常条件生长下详述那样记录生长和产量参数。
浇灌所述花钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物
相同。 如对正常条件生长下详述那样记录生长和产量参数。
[1303] 实施例28：在本发明方法中所用的核酸序列(编码STO(盐耐受性)蛋白质)的克隆
[1304] 本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的稻幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。 使用Hifi Taq DNA聚
合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。 所用的引物是
prm1-STO(SEQ ID NO：216；有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaa
gcaggcttaaaca aaggtgcagtgcga-3’和prm2-STO(SEQ ID NO：217；反义，互补)：5’-g
gggacactttgtacaagaaagctgggttcaccagtacaagcagggag 3’，其中所述引物包括用于Gateway重
组的AttB位点。 也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。 随后进行Gateway方法的第一
步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在
体内重组以产生“进入克隆”pSTO。 质粒pDONR201作为 技术的部分从
Invitrogen购买。
合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。 所用的引物是
prm1-STO(SEQ ID NO：216；有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaa
gcaggcttaaaca aaggtgcagtgcga-3’和prm2-STO(SEQ ID NO：217；反义，互补)：5’-g
gggacactttgtacaagaaagctgggttcaccagtacaagcagggag 3’，其中所述引物包括用于Gateway重
组的AttB位点。 也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。 随后进行Gateway方法的第一
步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在
体内重组以产生“进入克隆”pSTO。 质粒pDONR201作为 技术的部分从
Invitrogen购买。
[1305] 包含SEQ ID NO：168的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。 这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图
与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元
件。 用于根特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：218)位于该Gateway盒上游。
与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元
件。 用于根特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：218)位于该Gateway盒上游。
[1306] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::STO(图17)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
[1307] 实施例29：植物转化
[1308] 稻转化
[1309] 使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。 将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
[1310] 将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。 农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。 随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
[1311] 对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养箱转移至温室。 在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
[1312] 玉米转化
[1313] 玉米(Zea mays)的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方法进行。 在玉米中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1314] 小麦转化
[1315] 小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。 栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化中。 不成熟的胚与
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1316] 大豆转化
[1317] 根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。 几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。 栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1318] 油菜/卡诺拉油菜转化
[1319] 使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。 商业品种Westar(Agriculture
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。 当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，
含有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将
生根的枝条(shoot)移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。 当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，
含有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将
生根的枝条(shoot)移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1320] 苜蓿转化
[1321] 使 用 (MeKersie 等，1999Plant Physiol 119：839-847)的 方 法 转 化 苜 蓿((Medicago sativa))的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再
生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品
种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品
种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1322] 实施例30：表型评价方法
[1323] 30.1评价建立
[1324] 产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。 留下下述6个事件，其中所述事件的T1子代对所述转基因的存在
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
[1325] 4个T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，不过每个事件采用更多个体。植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，
从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1326] 干旱筛选
[1327] 来自T2种子的植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。 将湿度探针插入随机选择的花钵内，以监
测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌
溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培育(植物成熟、
种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件下生长详述那样
记录生长和产量参数。
测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌
溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培育(植物成熟、
种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件下生长详述那样
记录生长和产量参数。
[1328] 氮使用效率筛选
[1329] 源自T2种子的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。从移植至成熟期间用氮(N)浓度降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液浇灌所述花
钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。 如对
正常条件下的生长详述那样记录生长和产量参数。
钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。 如对
正常条件下的生长详述那样记录生长和产量参数。
[1330] 30.2统计分析：F-检验
[1331] 使用两因素ANOVA(变量分析)作为整体评价植物表型特征的统计模型。 对于用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。 实施F检验以
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
[1332] 因为实施了具有重叠事件的两个实验，故而进行联合分析。 这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且若是一致的，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
[1333] 30.3测量的参数
[1334] 生物量相关的参数测量
[1335] 植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1336] 植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素总数而确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。 早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分的面积。 根
生物量的提高表述为总根生物量(测量为植物生命期期间观察到的最大的根生物量)的提
高；或者表述为根/枝条指数(测量为在根和枝条活性生长阶段根量和枝条量之间的比
例)的提高
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。 早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分的面积。 根
生物量的提高表述为总根生物量(测量为植物生命期期间观察到的最大的根生物量)的提
高；或者表述为根/枝条指数(测量为在根和枝条活性生长阶段根量和枝条量之间的比
例)的提高
[1337] 早期萌发势通过计数来自植物部分的区别于背景的像素总数确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且转化成通过校正以平方mm表述的物理
表面值。 下述结果针对萌发后3周的植物。
表面值。 下述结果针对萌发后3周的植物。
[1338] 按照以前所述计算开花时间(PCT/EP2007/001422)。 简而言之，计算在播种和当第一个圆锥花序在植物中出现时之间所持续的时间。 第一个圆锥花序的出现是指在植
物的摄像图像(如(PCT/EP2007/001422)中所描述的进行)中圆锥花序是可见并且可检
测的时间点。
物的摄像图像(如(PCT/EP2007/001422)中所描述的进行)中圆锥花序是可见并且可检
测的时间点。
[1339] 种子相关的参数测量
[1340] 将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。充实粒使用吹
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
[1341] 实施例31：转基因植物表型评价的结果
[1342] 在非胁迫条件下表达STO核酸的转基因稻植物的评价结果显示如下。 与相对的对照植物相比，对于出苗萌发势(早期萌发势)观察到至少5％的提高，并且在第3至6
天之间(6％-9％)，取决于特定的转基因系，在转基因植物中观察到更早的开花。
天之间(6％-9％)，取决于特定的转基因系，在转基因植物中观察到更早的开花。
[1343] 在干旱胁迫条件下表达STO核酸的转基因稻植物的评价结果显示如下。 对于总种子重量、饱满种子数、饱满率、收获指数和千粒重观察到提高(表D)。
[1344] 表D：转基因STO植物的表型评价结果
[1345]参数 转基因植物相对于对照植物的差异百分数
出苗萌发势 15
开花时间(早/更短) 7
出苗萌发势 15
开花时间(早/更短) 7
[1346] 实施例32：在本发明方法中所用的核酸序列(编码UGE(UDP-葡萄糖4-差向异构酶或UDP-Gal4-差向异构酶)多肽)的克隆
[1347] 本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的稻幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。 使用Hifi Taq DNA聚
合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。 所用的引物是
prm1(SEQ ID NO：272；有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcag
gcttaaaca gtttcggccttgttg-3’和prm2(SEQ ID NO：273；反义，互补)：5’-ggggaccac
tttgtacaagaaagctgggtgctgctgctactggaggatt-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB
位点。 也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。 随后进行Gateway方法的第一步骤，即
BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以
产生“进入克隆”pUGE。 质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购
买。
合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。 所用的引物是
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位点。 也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。 随后进行Gateway方法的第一步骤，即
BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以
产生“进入克隆”pUGE。 质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购
买。
[1348] 包含SEQ ID NO：224的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。 这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图
与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元
件。 用于根特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：274)位于该Gateway盒上游。
与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元
件。 用于根特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：274)位于该Gateway盒上游。
[1349] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::UGE(图22)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
[1350] 实施例33：植物转化
[1351] 稻转化
[1352] 使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。 将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。 无菌的种子随后在含有2，
4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片
衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培
养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。 胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培
养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
[1353] 将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。 农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。 随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15
分钟。 该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中
孵育3日。 共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下
培育4周。 在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。 将这种材料转移至再生培养基
并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。 将枝条从愈伤
组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至
土壤。 硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
[1354] 对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养箱转移至温室。 在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。 种子随后在移栽后3至5个月收
获。 该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等
1993，Hiei等1994)。
[1355] 玉米转化
[1356] 玉米(Zea mays)的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方法进行。 在玉米中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
再生。 近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材
料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。 谷穗在授粉后大约11日(DAP)从
玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。 不成熟的胚与含有所述表达载
体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 切下的胚在愈伤组织
诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪
唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。 培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至
枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至
根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有
单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1357] 小麦转化
[1358] 小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。 栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化中。 不成熟的胚与
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。 在与农
杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其
中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在
25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。 将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养
基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所
述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1359] 大豆转化
[1360] 根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。 几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。 栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。 将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年
幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。 切下这些辅助节并与含
有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。 在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养
基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养
基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。 从针对所述选择剂显示耐受性
并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1361] 油菜/卡诺拉油菜转化
[1362] 使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。 商业品种Westar(Agriculture
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。 当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，
含有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将
生根的枝条(shoot)移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面
消毒以便体外播种。 从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶
柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。 所述外植体
随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培
养基上培养2日。 与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、
头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后
在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再
生。 当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，
含有0.5mg/l BAP)。 将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。 将
生根的枝条(shoot)移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1363] 苜蓿转化
[1364] 使 用 (McKersie 等，1999Plant Physiol 119：839-847)的 方 法 转 化 苜 蓿((Medicago sativa))的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再
生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品
种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。 例如，这些再生性植物可以选自栽培品
种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue
Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯
康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。 叶柄外植体与含有
所述表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)
或LBA4404的过夜培养物共培育。 所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L
硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。 所
述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺
种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培
养基上。 几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的
BOi2Y发育培养基中。 体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。 生
根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。 从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷
贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
[1365] 实施例34：表型评价方法
[1366] 34.1评价建立
[1367] 产生大约35个独立的T0稻转化体。 将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。 留下下述6个事件，其中所述事件的T1子代对所述转基因的存在
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大
约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗
(失效合子)。 转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。 温室条件是短日
照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
[1368] 4个T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，不过每个事件采用更多个体。植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，
从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1369] 干旱筛选
[1370] 来自T2种子的植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。 将湿度探针插入随机选择的花钵内，以监
测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌
溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培育(植物成熟、
种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件下生长详述那样
记录生长和产量参数。
测土壤水分含量(SWC)。 当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌
溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。 其余的培育(植物成熟、
种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。 如对正常条件下生长详述那样
记录生长和产量参数。
[1371] 氮使用效率筛选
[1372] 源自T2种子的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。从移植至成熟期间用氮(N)浓度降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液浇灌所述花
钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。 如对
正常条件下的生长详述那样记录生长和产量参数。
钵。 其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。 如对
正常条件下的生长详述那样记录生长和产量参数。
[1373] 34.2统计分析：F-检验
[1374] 使用两因素ANOVA(变量分析)作为整体评价植物表型特征的统计模型。 对于用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。 实施F检验以
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真
实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。 显著性F检验值
指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
[1375] 因为实施了具有重叠事件的两个实验，故而进行联合分析。 这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且若是一致的，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。
通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
[1376] 34.3测量的参数
[1377] 生物量相关的参数测量
[1378] 植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。 在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
[1379] 植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素总数而确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。 早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分的面积。 根
生物量的提高表述为总根生物量(测量为植物生命期期间观察到的最大的根生物量)的提
高；或者表述为根/枝条指数(测量为在根和枝条活性生长阶段根量和枝条量之间的比
例)的提高
转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。 实验证实以这种方式测量的地上部分植
物面积与地上植物部分的生物量相关。 地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的
时间点上所测量的面积。 早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分的面积。 根
生物量的提高表述为总根生物量(测量为植物生命期期间观察到的最大的根生物量)的提
高；或者表述为根/枝条指数(测量为在根和枝条活性生长阶段根量和枝条量之间的比
例)的提高
[1380] 早期萌发势通过计数来自植物部分的区别于背景的像素总数确定。 该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且转化成通过校正以平方mm表述的物理
表面值。 下述结果针对萌发后3周的植物。
表面值。 下述结果针对萌发后3周的植物。
[1381] 种子相关的参数测量
[1382] 将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。充实粒使用吹
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
气装置与空粒分开。 弃去空粒并且再次计数剩余部分。 充实粒在分析天平上称重。 饱
满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。 种子总产量通过称量
从一株植物收获的全部充实粒而测量。 每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的
壳数目测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。 收获指数(HI)在
2 6
本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm)之间的比率，乘以系数10。 如本发
明中定义的每圆锥花序总花数是种子总数与成熟原发圆锥花序之间的比例。 如本发明中
定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
[1383] 实施例35：转基因植物表型评价的结果
[1384] 在非胁迫条件下和在干旱胁迫条件下(水受限)表达UGE核酸的转基因稻植物的评价结果显示如下。对于总种子产量、饱满种子数、饱满率和收获指数观察到至少5％
的提高。 表E显示了表型评价的结果。
的提高。 表E显示了表型评价的结果。
[1385] 表E：转基因植物的表型评价结果
[1386]产量性状 非胁迫 干旱胁迫
＊ ＊
％差异转基因/对照 ％差异转基因/对照
种子产量(克) 15 45
饱满种子Nr 13 42
饱满率 5 45
收获指数 10 49
＊ ＊
％差异转基因/对照 ％差异转基因/对照
种子产量(克) 15 45
饱满种子Nr 13 42
饱满率 5 45
收获指数 10 49
[1387] ＊在转基因植物相对于对应的对照无义纯合子植物中测量的提高，表述为百分数(％)。
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