P75NTR神经营养因子结合蛋白的治疗性用途
阅读：3发布：2020-06-17
专利汇可以提供P75NTR神经营养因子结合蛋白的治疗性用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及p75NTR神经营养因子结合蛋白和相关分子在 治疗 骨关节炎中的新治疗性用途。，下面是P75NTR神经营养因子结合蛋白的治疗性用途专利的具体信息内容。
1.一种p75NTR神经营养因子结合蛋白(p75NTR(NBP))，用于治疗骨关节炎。
2.根据权利要求1所述用途的p75NTR(NBP)，其中治疗骨关节炎包括缓解骨关节炎的症状。
3.p75NTR(NBP)，其中缓解骨关节炎的症状包括减少疼痛、炎症、肿胀、触痛、关节僵硬或增加关节活动性或它们的任何组合。
4.根据权利要求1所述用途的p75NTR(NBP)，其中治疗骨关节炎包括延缓或控制病状进展。
5.根据权利要求1所述用途的p75NTR(NBP)，其中治疗骨关节炎包括逆转疾病进展、软骨再生长和/或治愈性治疗。
6.根据权利要求4或5所述用途的p75NTR(NBP)，其中通过软骨损失或软骨再生长的速率确定疾病进展。
7.根据权利要求1所述用途的p75NTR(NBP)，其中治疗骨关节炎包括预防性治疗。
8.根据任何前述权利要求所述用途的p75NTR(NBP)，其中所述p75NTR(NBP)包括与一种或多种辅助分子连接的p75NTR(NBP)。
9.根据权利要求8所述用途的p75NTR(NBP)，其中所述一种或多种辅助分子选自：(a)转铁蛋白或其部分；(b)白蛋白或其部分；(c)免疫球蛋白Fc或其部分；或(d)聚乙烯二醇聚合物链。
10.根据权利要求8或9所述用途的p75NTR(NBP)，所述p75NTR(NBP)通过一个或多个接头与所述一种或多种辅助分子连接。
11.根据权利要求9或10所述用途的p75NTR(NBP)，其中所述p75NTR(NBP)包括与免疫球蛋白Fc或其部分连接的p75NTR(NBP)。
12.根据任何一项前述权利要求所述用途的p75NTR(NBP)，其中所述p75NTR(NBP)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
13.根据任何一项前述权利要求所述用途的p75NTR(NBP)，其中所述p75NTR(NBP)以如通过表面等离子体共振在20℃所测量的约5pM至约5nM之间的结合亲和力(Kd)与NGF、BDNF、NT3或NT4/5的任一者结合。
14.根据任何一项前述权利要求所述用途的p75NTR(NBP)，其中所述p75NTR(NBP)在与第二药理活性化合物组合的组合中分别、依次或同时使用。
15.根据权利要求14所述用途的p75NTR(NBP)，其中所述组合的第二药理活性化合物选自阿片类镇痛药、非甾体类抗炎药(NSAID)、巴比妥类镇静剂、具有镇静作用的苯二氮 具有镇静作用的H1拮抗剂、镇静剂、如格鲁米特、甲丙氨酯、甲喹酮或二氯醛比林；骨骼肌松弛药；NMDA受体拮抗剂、α-肾上腺素能药、三环类抗抑郁药、抗惊厥药、速激肽(NK)拮抗剂、特别是NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂、毒蕈碱拮抗剂、COX-2选择性抑制剂、煤焦油镇痛药、尤其乙酰氨基酚；神经安定药、香草素受体激动剂或拮抗剂；β-肾上腺素能药；局部麻醉药；皮质类固醇；5-HT受体激动剂或拮抗剂；5-HT2A受体拮抗剂；胆碱能(烟碱)镇痛药；曲马多；PDEV抑制剂；大麻素；促代谢型谷氨酸盐亚型1受体(mGluR1)拮抗剂；血清素再吸收抑制剂；去甲肾上腺素(去甲肾上腺素(norepinephrine))再吸收抑制剂；血清素-去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂；诱生型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂；乙酰胆碱酯酶抑制；前列腺素E2亚型4(EP4)拮抗剂；白三烯B4拮抗剂；5-脂加氧酶抑制剂；钠通道阻滞剂；或5-HT3拮抗剂及它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
16.根据任何一项前述权利要求所述用途的p75NTR(NBP)，其中将p75NTR(NBP)配制用于口服、舌下、颊部、局部、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、肌内、心内、骨内、滑膜内、皮内、腹膜内、经粘膜、阴道、玻璃体内、关节内、关节周、局部或经皮肤施用。
17.一种编码p75NTR(NBP)的核酸，用于如权利要求1至16中任一项所限定的治疗骨关节炎。
18.一种用于转染细胞的复制型表达载体，所述载体包含编码p75NTR(NBP)的核酸，用于如权利要求1至16中任一项所限定的治疗骨关节炎。
19.一种表达p75NTR(NBP)的宿主细胞，用于如权利要求1至16中任一项所限定的治疗骨关节炎。
20.一种药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1至16中任一项所述的p75NTR(NBP)或根据权利要求17所述的核酸分子，或根据权利要求18所述的复制型表达载体，或根据权利要求19所述的宿主细胞，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
21.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
a.根据权利要求1至16中任一项所述的p75NTR(NBP)或根据权利要求17所述的核酸分子，或根据权利要求18所述的复制型表达载体，或根据权利要求19所述的宿主细胞或根据权利要求20所述的药物组合物；和
b.针对以下任一种或多种情况向个体施用有效量的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体或药物组合物的说明书：预防或治疗骨关节炎和/或骨关节炎症状或用于缓解、控制、减少骨关节炎和/或骨关节炎症状的发生率、或延迟或逆转骨关节炎和/或骨关节炎症状的形成或进展。
22.一种治疗和/或预防个体中骨关节炎和/或骨关节炎症状的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的p75NTR(NBP)或根据权利要求17所述的核酸分子，或根据权利要求18所述的复制型表达载体，或根据权利要求19所述的宿主细胞或根据权利要求20所述的药物组合物，任选地还包括药学上可接受的载体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中p75NTR(NBP)包括与免疫球蛋白Fc或其部分连接的p75NTR(NBP)。
P75NTR神经营养因子结合蛋白的治疗性用途
技术领域
[0001] 本发明涉及p75NTR神经营养因子结合蛋白和相关分子在治疗骨关节炎中的新治疗性用途。
背景技术
[0003] 普遍认为该病状因机械损伤关节中的软骨伴随自我修复不充分所致。除导致炎症、疼痛和肿胀之外，软骨损失可能导致形成骨赘生物(骨赘)，所述骨赘生物加重症状并且可能导致关节狭窄和扭曲。软骨损伤和损失的精确机制尚未精确地理解并且可能是多种因素组合的结果。
[0005] 神经营养因子、神经营养生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子 (BDNF)、神经营养因子3(NT-3)和神经营养因子4/5(NT-4/5)通过4 种受体：低亲和力p75神经营养受体(p75NTR)和高亲和力酪氨酸激酶受体TrkA、TrkB和TrkC发挥作用。低亲和力受体p75NTR结合并且被全部 4种神经营养因子激活并且已经报道独立于其它受体发挥作用。但是，更选择性地激活Trk受体，即，NGF是TrkA的选择性配体，BDNF是TrkB 的配体，并且NT-3、4/5是TrkC的配体。此外已经报道，当p75NTR蛋白和Trk蛋白共表达时，它们形成改变两种受体的信号传导的复合物(Huang 和Reichardt，2003)。实际上，已经提出p75NTR促进每种神经营养因子对其相应Trk受体的选择性。
[0006] p75NTR是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFR-SF)的成员并且是这个超家族中充分表征的第一个成员。这个超家族(在人类中由大约30个基因编码)由配体结合结构域定义，所述配体结合结构域由首先在p75NTR中鉴定的40氨基酸半胱氨酸丰富结构域(CRD)的一个或多个(一般4个)重复序列组成(Johnson等人，1986；Radeke等人，1987)。与之相反，全部 TNFR-SF家族成员的胞内结构域不共有序列基序。因此，TNFR-SF蛋白的信号传导机制大幅度变动。
[0007] p75NTR结构的不寻常特征是存在借助跨膜结构域内部的半胱氨酰残基形成的二硫键连接的p75NTR二聚体。这个二硫键是p75NTR进行有效神经营养因子依赖性信号传导所需要的并且在胞内和胞外结构域的形成中发挥重要作用(Vilar等人，2009b)。神经营养因子在生理学上作为非共价缔合的二聚体存在(Bothwell和Shooter，1977)，分布半寿期为大约5分钟(Tria等人，1994)。神经营养因子依赖性p75NTR激活神经营养因子二聚体与p75NTR二聚体的两个胞外结构域的CRD 2-4缔合(He和Garcia， 2004)。最近的研究支持一种模型，其中神经营养因子结合造成p75NTR二聚体的两个胞外结构域相互移动靠得更近，迫使胞内结构域以该二硫键为中心的蜗牛钳样运动展开并允许胞内结构域与信号传导衔接头蛋白NRIF 和TRAF6缔合(Vilar等人，2009a，2009b)。先前尚未在其它TNFR-SF 家族成员中或任何其它膜蛋白中描述跨膜结构域内二硫键，如p75NTR中存在的那些。
[0008] p75NTR以类似于Notch和β-淀粉样前体蛋白的切割依赖性信号传导途径的方式依次接受α-分泌酶活性和γ-分泌酶活性和基质金属蛋白酶 (MMP)的蛋白酶剪切，释放其胞内结构域(ICD)至细胞质中(Jung等人，2003；Kanning等人，2003)。p75NTR ICD通过这条途径的胞质释放促进相关NRIF的信号传导(Kenchappa等人，2006)。在α-分泌酶活性和γ-分泌酶活性和MMP的蛋白酶剪切后，p75NTR胞外结构域的作用未充分理解。
[0009] 已经记录，NGF和其它神经营养因子(BDNF、NT-3和NT-4/5)在病变例如因骨关节炎、胰腺炎、类风湿性关节炎、银屑病、搔痒症和多发性硬化所致的疼痛中发挥重要作用(Watanabe等人，2010；Raychaudhuri等人，2011；Barthel等人，2009；Truzzi等人，2011；McDonald等人，2011； Yamaoka等人，2007)。证实针对任何神经营养因子；NGF或BDNF、NT-3 和NT-4/5的选择性抗体显著地减少疼痛。另外，还已经证实针对神经营养因子受体p75NTR Trk A、Trk B或Trk C的抗体在疼痛模型中有效(Orita S 等人，2010；Svensson P等人，
2010；Iwakura等人，2010；Cirilio等人， 2010；Pezet等人，2010；Hayashi等人，2011；Chu等人，2011；Ueda等人，2010；Ghilardi等人，2010；Fukui等人，2010)。Fukui等人(2010) 在一个疼痛模型中(坐骨神经挤压后的机械性异常疼痛)用抗p75NTR抗体治疗后展示疼痛相关性终点方面的显著功效。从这项研究得出结论，用 p75NTR抑制性抗体治疗减少CGRP和p75NTR表达，导致显著减少疼痛。
2010；Iwakura等人，2010；Cirilio等人， 2010；Pezet等人，2010；Hayashi等人，2011；Chu等人，2011；Ueda等人，2010；Ghilardi等人，2010；Fukui等人，2010)。Fukui等人(2010) 在一个疼痛模型中(坐骨神经挤压后的机械性异常疼痛)用抗p75NTR抗体治疗后展示疼痛相关性终点方面的显著功效。从这项研究得出结论，用 p75NTR抑制性抗体治疗减少CGRP和p75NTR表达，导致显著减少疼痛。
发明内容
[0010] 本发明显示p75NTR的胞外结构域可用于治疗骨关节炎。已经显示 p75NTR的胞外结构域阻止并甚至逆转该疾病进展。
[0011] 因此，在第一方面提供了一种用于治疗骨关节炎的p75NTR神经营养因子结合蛋白(p75NTR(NBP))。
[0012] 在优选的实施方案中，治疗骨关节炎包括缓解骨关节炎的症状。优选地，缓解骨关节炎的症状包括但不限于减少疼痛、炎症、肿胀、触痛、关节僵硬或增加关节活动性或它们的任何组合。
[0013] 在一个特别优选的实施方案中，治疗骨关节炎包括延缓或控制 (arresting)疾病进展和/或减少软骨损失。优选地，治疗骨关节炎包括逆转疾病进展、软骨再生长和/或治愈性治疗。优选地，通过软骨损失或再生长的速率确定疾病进展。在其它优选实施方案中，可以通过确定关节中存在的软骨细胞的数目，监测疾病进展。
[0014] 在其它优选实施方案中，治疗骨关节炎包括预防性治疗。
[0015] 在某些优选的实施方案中，p75NTR(NBP)是人p75NTR(NBP)。
[0016] 在其它优选实施方案中，p75NTR(NBP)包括与一种或多种辅助分子连接的p75NTR(NBP)。优选地，一种或多种辅助分子选自：(a)转铁蛋白或其部分；(b)白蛋白或其部分；(c)免疫球蛋白Fc或其部分；或(d)聚乙烯二醇聚合物链。在其它仍优选的实施方案中，p75NTR(NBP)经一个或多个接头与一种或多种辅助分子连接。
[0017] 在一个特别优选的实施方案中，p75NTR(NBP)具有根据SEQ ID NO 3 的氨基酸序列。
[0018] 在一个特别优选的实施方案中，p75NTR(NBP)以如通过表面等离子体共振在20℃所测量的约5pM至约5nM之间的结合亲和力(Kd)与NGF、 BDNF、NT3或NT4/5的任一者结合。
[0019] 在一个优选实施方案中，p75NTR(NBP)在与第二药理活性化合物组合的组合中分别、依次或同时使用。优选地，该组合的第二药理活性化合物选自阿片类镇痛药、非甾体类抗炎药(NSAID)、巴比妥类镇静剂、具有镇静作用的苯二氮 (benzodiazepine)、具有镇静作用的H1拮抗剂、镇静剂、如格鲁米特(glutethimide)、甲丙氨酯(meprobamate)、甲喹酮(methaqualone) 或二氯醛比林(dichloralphenazone)；骨骼肌松弛药；NMDA受体拮抗剂、α-肾上腺素能药、三环类抗抑郁药、抗惊厥药、速激肽(NK)拮抗剂、特别是NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂、毒蕈碱拮抗剂、COX-2选择性抑制剂、煤焦油镇痛药、尤其乙酰氨基酚(paracetamol)；神经安定药、香草素受体 (vanilloid receptor)激动剂或拮抗剂；β-肾上腺素能药；局部麻醉药；皮质类固醇；5-HT受体激动剂或拮抗剂；5-HT2A受体拮抗剂；胆碱能(烟碱)镇痛药；曲马多 PDEV抑制剂；大麻素(cannabinoid)；促代谢型谷氨酸盐亚型1受体(mGluR1)拮抗剂；血清素再吸收抑制剂；去甲肾上腺素(noradrenaline)(去甲肾上腺素(norepinephrine))再吸收抑制剂；血清素-去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂；
诱生型一氧化氮合酶(iNOS) 抑制剂；乙酰胆碱酯酶抑制；前列腺素E2亚型4(EP4)拮抗剂；
白三烯 B4拮抗剂；5-脂加氧酶抑制剂；钠通道阻滞剂；或5-HT3拮抗剂及它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
诱生型一氧化氮合酶(iNOS) 抑制剂；乙酰胆碱酯酶抑制；前列腺素E2亚型4(EP4)拮抗剂；
白三烯 B4拮抗剂；5-脂加氧酶抑制剂；钠通道阻滞剂；或5-HT3拮抗剂及它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
[0020] 优选地，将p75NTR(NBP)配制用于口服、舌下、颊部、局部(topical)、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、肌内、心内、骨内、滑膜内 (intrasynovial)、皮内(intradermal)、腹膜内、经粘膜、阴道、玻璃体内、关节内、关节周、局部(local)或经皮肤(epicutaneous)施用。
[0021] 在本发明的又一个方面，提供了编码用于如上文定义的治疗骨关节炎的p75NTR(NBP)的核酸。
[0022] 在本发明的另一个方面，提供了用于转染细胞的复制型表达载体，所述复制型表达载体包含编码用于如上文定义的治疗骨关节炎的 p75NTR(NBP)的核酸。
[0023] 在本发明的又一个方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达用于如上文定义的治疗骨关节炎的p75NTR(NBP)。
[0024] 在本发明的更进一步的一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上文所述的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体或宿主细胞，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0026] a.上文描述的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体、宿主细胞或药物组合物；和
[0027] b.针对以下任一种或多种情况向个体施用有效量的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体或药物组合物的说明书：预防或治疗骨关节炎和/ 或骨关节炎症状或用于缓解、控制、减少骨关节炎和/或骨关节炎症状的发生率、或延迟或逆转骨关节炎和/或骨关节炎症状的形成或进展。
[0028] 在本发明的另一个方面，提供了一种治疗和/或预防个体中骨关节炎和 /或骨关节炎症状的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的上文描述的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体、宿主细胞或药物组合物，所述药物组合物任选地还包含药学上可接受的载体。附图说明
[0029] 将通过参考附图进一步理解本发明，其中：
[0031] 图2：苏木素和伊红染色的大鼠膝部的内侧面(medial aspect)，所述大鼠膝部来自对照抗体(A、B)或p75NTR 0.3mg/kg(C、D)、1mg/kg(E、 F)、3mg/kg(G、H)治疗的动物。通过关节内注射MIA在每只动物的左膝部(A、C、E、G)中诱导实验性骨关节炎。用ETF-PBS(对照；B、 D、F、H)注射右膝部。(X4放大率)从独立动物拍摄每组左膝部图像和右膝部图像以显示对侧对照。
[0032] 图3：番红O染色的大鼠膝部的内侧面，所述大鼠膝部来自对照抗体 (A、B)或p75NTR 3mg/kg(C、D)治疗的动物。通过关节内注射MIA 在每只动物的左膝部(A和C)中诱导实验性骨关节炎。用ETF-PBS(对照；B和D)注射右膝部。(X4放大率)从独立动物拍摄每组左膝部图像和右膝部图像以显示对侧对照。
[0035] 图6：p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)。α分泌酶切割位点和γ分泌酶切割位点以粗体显示。IgG1的Fc部分以斜体显示。
[0036] 图7：图9中所述的核酸序列(SEQ ID NO.4)(从起始密码子至终止密码子)的翻译产物(SEQ ID NO.2)。
[0037] 图8：优选的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)。 IgG1的Fc部分以斜体显示。p75NTR(NBP)部分和Fc部分之间的接头序列加下划线显示。
[0038] 图9：从5’克隆位点至3’克隆位点的完整产物基因的核酸序列(SEQ ID NO.4)[0039] 图10.p75-NTR(NBP)-Fc融合蛋白变体：1：p75_NTR-p75-NTR序列 (SEQ ID NO.6)；2：市售p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.7)；3：p75_Fc -Fc序列相对于IgG1za的龙沙(Lonza)恒定区被修饰的市售p75-NTR-Fc 融合蛋白(SEQ ID NO.8)；4：p75_Fc_C222S-Fc序列相对于IgG1za的 Lonza恒定区被修饰及位置222处额外的半胱氨酸至丝氨酸突变的市售 p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.9)；5：p75_Fc_G4x1-变体1，所提出的具有4残基甘氨酸接头的p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.10)；6： p75_Fc_G4Sx1-变体2，所提出的具有单个四甘氨酸丝氨酸接头的 p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.11)；7：p75_Fc_G4Sx2-变体3，所提出的具有两个四甘氨酸丝氨酸接头的p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO. 12)；8：IgG1za的Lonza恒定区(SEQ ID NO.13)。
[0040] 在这个比对中，一种格式方案用来突出显示推定性受体、Fc-融合蛋白和Fc恒定区之间具有相似性的区域：加框的类型用来显示变体蛋白和 p75-NTR之间序列相同的区域；单下划线用来显示全部Fc-融合蛋白和 Lonza IgG1za Fc之间序列相同的区域；斜体用来显示在p75-NTR和Fc恒定区交界处的接头区域；双下划线和粗体类型用来显示接头区域外部序列不相同的位置，在等同于亲本p75-NTR Fc-融合蛋白中222的位置处。
[0041] 图11：SEQ ID NO.14人p75NTR完整氨基酸序列
[0042] 图12：SEQ ID NO.15包含信号序列的人p75NTR胞外结构域
[0043] 图13：SEQ ID NO.16不含信号序列的人p75NTR胞外结构域
[0044] 图14：SEQ ID NO.17人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域1
[0045] 图15：SEQ ID NO.18人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域2
[0046] 图16：SEQ ID NO.19人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域3
[0047] 图17：SEQ ID NO.20人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域4
[0048] 图18：SEQ ID NO.21人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域5
[0049] 图19：SEQ ID NO.22人转铁蛋白
[0050] 图20：SEQ ID NO.23人白蛋白
[0051] 图21：SEQ ID NO.24人Fc IgG1
[0052] 图22：SEQ ID NO.25人Fc IgG2
[0053] 图23：SEQ ID NO.26人Fc IgG3
[0054] 图24：SEQ ID NO.27人Fc IgG4
[0055] 图25：SEQ ID NO.28经工程化以延长血清半寿期的人Fc片段
[0056] 图26：SEQ ID NO.29经工程化缺少效应子功能的人Fc片段
[0057] 图27：SEQ ID NO.30p75NTR(NBP)-Fc接头
[0058] 图28：SEQ ID NO.31p75NTR(NBP)-Fc接头
[0059] 图29：SEQ ID NO.32p75NTR(NBP)-Fc接头
[0060] 图30：在第0天的平均体重。以克计的体重作为均数±标准偏差 (mean±standard deviations)作图。用1mg/kg p75NTR-Fc治疗组1中的动物，用3mg/kg p75NTR-Fc治疗组2中的动物，用0.3mg/kg p75NTR-Fc治疗组3中的动物，用3mg/kg PG-007治疗组4中的动物，并且用3mg/kg 对照IgG Fc治疗组5中的动物。
[0061] 图31：在实施例3中描述的8周研究期间大鼠的平均体重。以克计的体重作为均数±标准偏差作图。用1mg/kg p75NTR-Fc治疗组1中的动物，用3mg/kg p75NTR-Fc治疗组2中的动物，用0.3mg/kg p75NTR-Fc治疗组 3中的动物，用3mg/kg PG-007治疗组4中的动物，并且用3mg/kg对照 IgG Fc治疗组5中的动物。
[0062] 图32：在测试剂治疗后以时间测定的自发性疼痛量值。在每个时间点 (从第35天至第56天)显示每只动物的数据。用1mg/kg p75NTR-Fc治疗组1中的动物，用3mg/kg p75NTR-Fc治疗组2中的动物，用0.3mg/kg p75NTR-Fc治疗组3中的动物，用3mg/kg PG-007治疗组4中的动物，用 3mg/kg对照IgG Fc治疗组5中的动物，用ETF-PBS治疗组6中的动物并且组7未用药。*相对于理论均数0.5的一份样品t检验而言，p<0.05和 **<0.01。
[0063] 图33：在测试剂治疗后以时间测定的自发性疼痛量值。在每个时间点 (从第35天至第56天)显示每只动物的数据。用1mg/kg p75NTR-Fc治疗组1中的动物，用3mg/kg p75NTR-Fc治疗组2中的动物，用0.3mg/kg p75NTR-Fc治疗组3中的动物，用3mg/kg PG-007治疗组4中的动物，用 3mg/kg对照IgG Fc治疗组5中的动物，用ETF-PBS治疗组6中的动物并且组7未用药。*相对于理论均数0.5的一份样品t检验而言，p<0.05和 **<0.01。
[0064] 图34：番红O固绿染色的大鼠膝部的内侧面(X4放大率)，所述大鼠膝部来自第0天注射低浓度MIA或ETF-PBS至膝部后，从第28天至第56 天用3mg/kg对照IgG-Fc治疗的动物。从3mg/kg对照IgG-Fc治疗的动物拍摄代表性图像。从一只独立动物拍摄每组左膝部图像和右膝部图像以显示对侧对照。
[0065] 图35：番红O固绿染色的大鼠膝部的内侧面(X4放大率)，所述大鼠膝部来自第0天注射低浓度MIA或ETF-PBS至膝部后，从第28天至第56 天用3mg/kg PG-007治疗的动物。从3mg/kg PG-007治疗的动物拍摄代表性图像。从一只独立动物拍摄每组左膝部图像和右膝部图像以显示对侧对照。
[0066] 图36：番红O固绿染色的大鼠膝部的内侧面(X4放大率)，所述大鼠膝部来自第0天注射低浓度MIA或ETF-PBS至膝部后，从第28天至第56 天用3mg/kg p75NTR-Fc治疗的动物。从3mg/kg p75NTR-Fc治疗的动物拍摄代表性图像。从一只独立动物拍摄每组左膝部图像和右膝部图像以显示对侧对照。
[0067] 图37：番红O固绿染色的大鼠膝部的内侧面(X4放大率)，所述大鼠膝部来自第0天注射低浓度MIA或ETF-PBS至膝部后，从第28天至第56 天用1mg/kg p75NTR-Fc治疗的动物。从1mg/kg p75NTR-Fc治疗的动物拍摄代表性图像。从一只独立动物拍摄每组左膝部图像和右膝部图像以显示对侧对照。
[0068] 图38：番红O固绿(Safranin O Fast Green)染色的大鼠膝部的内侧面 (X4放大率)，所述大鼠膝部来自第0天注射低浓度MIA或ETF-PBS至膝部后，从第28天至第56天用0.3mg/kg p75NTR-Fc治疗的动物。从0.3 mg/kg p75NTR-Fc治疗的动物拍摄代表性图像。从一只独立动物拍摄每组左膝部图像和右膝部图像以显示对侧对照。
[0069] 图39：软骨病变等级。PG007的施用未显示组织学上显著的效力影响。 P75NTR-Fc在0.3mg/kg和1.0mg/kg显示明显的软骨保护效力。在3.0 mg/kg的效力特征更可变-该组的50％显示与对照组重叠。
[0070] 图40：软骨下骨(Sub-chondral bone)等级。与对照组相比，PG007 的施用与软骨下骨病变的组织学显著增加相关-–类似于随3.0mg/kg P75NTRFc所观察到的特征。相比之下，在0.3mg/kg和1.0mg/kg施用 P75NTR-Fc与软骨下骨结构显著改善相关。
[0071] 图41：基质空洞(stromal cavity)等级。PG007的施用与任何组织学上显著的效力影响不相关。相比之下，P75NTR-Fc在全部剂量的施用与溶骨性病变减少和基质空洞扩大相关，尽管在0.3mg/kg和1.0mg/kg的影响最明显–两个基团均减少病变至几乎正常的水平。
[0072] 图42：松质骨(Cancellous bone)等级。PG007的施用与类似于对照的松质骨病变相关–两份样品超过对照范围。相比之下，P75NTR-Fc在0.3 mg/kg和1.0mg/kg剂量水平显著减少松质骨病变。在3.0mg/kg的 P75NTF-Fc展示更可变的特征，大部分样品显示与对照组重叠。
[0073] 图43：骨髓细胞过多(bone marrow hyper-cellularity)。PG007的施用与骨髓中髓样细胞扩充相关，四份样品达到最高或超过对照范围。 P75NTR-Fc在0.3mg/kg剂量和1.0mg/kg剂量减少骨髓细胞构成–髓样扩充减少是明显特征。尽管显示出抑制趋势，3.0mg/kg剂量显示与对照组中的低水平反应体重叠。
[0074] 图44：多灶性骨硬化(Multi-focal bone sclerosis)。各研究组之间不存在组织学上显著的差异–尽管P75NTR-Fc样品的确显示向对照范围的上端簇集。
[0075] 图45：成骨细胞增生(Osteoblas hyperplasia)。P75NTR-Fc在0.3mg/kg 和1.0mg/kg施用与组织学上显著的成骨细胞增殖相关-栅栏样和成骨细胞性骨板(palisading and osteoblastic plate)形成在骨骺带中，在软骨下骨/ 软骨带处特别明显。此外，虽然未评定，但是在这个带中存在明显的‘成纤维细胞样’细胞。PG007和P75NTR-Fc(3.0mg/kg)在组织学上类似于对照(图45)。
具体实施方式
[0076] 骨关节炎症状包括炎症、疼痛和肿胀。此外，软骨损失可能导致形成骨赘生物(骨赘)，所述骨赘生物加重症状并且可能导致关节狭窄和扭曲。治疗选项是目前限于疾病处理选项，所述病状处理选项包括物理治疗、施用镇痛药和/或施用抗炎药并且在一些情况下，借助手术置换关节。直至现在，尚未报道骨关节炎的愈性治疗选项。未报告阻止这种退行性病状进展的治疗。因此，本发明寻求解决对治愈性骨关节炎治疗的需求或至少寻求提供能够阻止骨关节炎恶化的治疗。
[0077] 令人惊讶地，本发明人已经发现，在接受的骨关节炎动物模型中施用 p75NTR神经营养因子结合蛋白(p75NTR(NBP))不仅阻止疾病进展，还导致因骨关节炎进展所致的损伤明显逆转。
[0078] 因此，在第一方面提供了一种用于治疗骨关节炎的p75NTR神经营养因子结合蛋白(p75NTR(NBP))。
[0079] 在优选的实施方案中，治疗骨关节炎包括缓解骨关节炎的症状。优选地，缓解骨关节炎的症状包括但不限于减少疼痛、炎症、肿胀、触痛、关节僵硬或增加关节活动性或它们的任何组合。
[0080] 在一个特别优选的实施方案中，治疗骨关节炎包括延缓或控制疾病进展和/或减少软骨损失。优选地，治疗骨关节炎包括逆转疾病进展、软骨再生长和/或治愈性治疗。优选地，通过软骨损失或再生长的速率确定疾病进展。可以通过多种方法监测软骨损失的速率，所述方法包括但不限于磁共振成像(MRI)或X射线计算机断层扫描(X射线CT)。在其它优选实施方案中，可以通过确定关节中存在的软骨细胞的数目，监测疾病进展。
[0081] 如本文所用的术语“治愈性治疗”意在涵盖使患者恢复到其疾病前状态的治疗。这类治疗可以要求持续施用活性化合物以维持疾病前状态。备选地，一旦实现疾病前状态，可以停止治愈性治疗。
[0082] 在其它优选实施方案中，治疗针对原发性或继发性骨关节炎。治疗原发性骨关节炎包括治疗原发泛发性结节性骨关节炎和侵蚀性骨关节炎 (EOA，也称作炎性骨关节炎)。
[0083] 治疗骨关节炎还意在包括改善如依据WOMAC评定系统或奥特布里奇分级系统(Outerbridge classification system)分类的疾病症状。在优选的实施方案中，治疗骨关节炎产生疾病进展逆转，导致疾病分期(WOMAC评定)或等级(奥特布里奇分级)的变化。
[0084] 在其它优选实施方案中，治疗骨关节炎包括预防性治疗。
[0085] 在某些优选的实施方案中，p75NTR(NBP)是人p75NTR(NBP)。
[0086] 在其它优选实施方案中，p75NTR(NBP)包括与一种或多种辅助分子连接的p75NTR(NBP)。优选地，一种或多种辅助分子选自：(a)转铁蛋白或其部分；(b)白蛋白或其部分；(c)免疫球蛋白Fc或其部分；或(d)聚乙烯二醇聚合物链。在其它仍优选的实施方案中，p75NTR(NBP)经一个或多个接头与一种或多种辅助分子连接。优选地，接头选自：(a)共价键；(b) 非共价键；(c)肽键；或(d)构成肽的一个氨基酸或多个氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，p75NTR(NBP)包含与免疫球蛋白Fc或其部分连接 (任选地经接头连接)的p75NTR(NBP)。
[0087] 在p75NTR(NBP)与多于一个辅助分子连接的情况下，每个辅助分子任选地是相同或不同的或是相同者和不同者的混合物。类似地，在 p75NTR(NBP)与多于一个辅助分子经一个或多个接头连接的情况下，每个接头任选地是相同或不同的或是相同者和不同者的混合物。
[0088] 在一个特别优选的实施方案中，p75NTR(NBP)具有根据SEQ ID NO 3 的氨基酸序列。
[0089] 在一个特别优选的实施方案中，p75NTR(NBP)以如通过表面等离子体共振在20℃所测量的约5pM至约5nM之间的结合亲和力(Kd)与NGF、 BDNF、NT3或NT4/5的任一者结合。
[0090] 在一个优选实施方案中，p75NTR(NBP)在与第二药理活性化合物组合的组合中分别、依次或同时使用。优选地，该组合的第二药理活性化合物选自阿片类镇痛药、非甾体类抗炎药(NSAID)、巴比妥类镇静剂、具有镇静作用的苯二氮 具有镇静作用的H1拮抗剂、镇静剂、如格鲁米特、甲丙氨酯、甲喹酮或二氯醛比林；骨骼肌松弛药；NMDA受体拮抗剂、α- 肾上腺素能药、三环类抗抑郁药、抗惊厥药、速激肽(NK)拮抗剂、特别是NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂、毒蕈碱拮抗剂、COX-2选择性抑制剂、煤焦油镇痛药、特别是乙酰氨基酚；神经安定药、香草素受体激动剂或拮抗剂；β-肾上腺素能药；局部麻醉药；皮质类固醇；5-HT受体激动剂或拮抗剂；5-HT2A受体拮抗剂；胆碱能(烟碱)镇痛药；曲马多；PDEV抑制剂；大麻素；促代谢型谷氨酸盐亚型1受体(mGluR1)拮抗剂；血清素再吸收抑制剂；去甲肾上腺素(noradrenaline)(去甲肾上腺素(norepinephrine)) 再吸收抑制剂；血清素-去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂；诱生型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂乙酰胆碱酯酶抑制；前列腺素E2亚型4(EP4)拮抗剂；白三烯B4拮抗剂；5-脂加氧酶抑制剂；钠通道阻滞剂；或5-HT3拮抗剂及它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
[0091] 优选的阿片类镇痛药包括但不限于吗啡(morphine)、海洛因(heroin)、氢吗啡酮(hydromorphone)、羟吗啡酮(oxymorphone)、左啡诺(levorphanol)、左洛啡烷(levallorphan)、美沙酮(methadone)、哌替啶(meperidine)、芬太尼(fentanyl)、可卡因(cocaine)、可待因(codeine)、双氢可待因 (dihydrocodeine)、羟考酮(oxycodone)、氢可酮(hydrocodone)、右丙氧芬(propoxyphene)、纳美芬(nalmefene)、烯丙吗啡(nalorphine)、纳洛酮 (naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、丁丙诺啡(buprenorphine)、布托啡诺 (butorphanol)、纳布啡(nalbuphine)或喷他佐辛(pentazocine)。
[0092] 优选的非甾体类抗炎药(NSAID)包括但不限于阿司匹林、双氯芬酸 (diclofenac)、二氟尼柳(diflusinal)、依托度酸(etodolac)、芬布芬(fenbufen)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟苯柳(flufenisal)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮基布洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、尼美舒利(nimesulide)、硝基氟吡洛芬
(nitroflurbiprofen)、奥沙拉秦 (olsalazine)、奥沙普秦(oxaprozin)、保泰松、吡罗昔康(piroxicam)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)或佐美酸(zomepirac)。
(nitroflurbiprofen)、奥沙拉秦 (olsalazine)、奥沙普秦(oxaprozin)、保泰松、吡罗昔康(piroxicam)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)或佐美酸(zomepirac)。
[0093] 优选的巴比妥类镇静剂包括但不限于异戊巴比妥(amobarbital)、阿普比妥(aprobarbital)、仲丁巴比妥(butabarbital)、布他比妥(butabital)、甲苯比妥(mephobarbital)、美沙比妥(metharbital)、美索比妥(methohexital)、戊巴比妥(pentobarbital)、苯巴比妥(phenobartital)、司可巴比妥 (secobarbital)、他布比妥(talbutal)、塞米乐(theamylal)或硫喷妥 (thiopental)。
[0094] 优选的具有镇静作用的苯二氮 类包括但不限于氯氮 (chlordiazepoxide)、氯拉 酸(clorazepate)、地西泮(diazepam)、氟西泮(flurazepam)、劳拉西泮(lorazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、替马西泮(temazepam)或三唑仑(triazolam)。
[0095] 优选的具有镇静作用的H1拮抗剂包括但不限于苯海拉明 (diphenhydramine)、吡拉明(pyrilamine)、异丙嗪(promethazine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)或氯环嗪(chlorcyclizine)。
[0096] 优选的镇静剂包括但不限于格鲁米特(glutethimide)、甲丙氨酯 (meprobamate)、甲喹酮(methaqualone)或二氯醛比林(dichloralphenazone)。
[0097] 优选的骨骼肌松弛药包括但不限于巴氯芬(baclofen)、卡立普多 (carisoprodol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、环苯扎林(cyclobenzaprine)、美索巴莫(methocarbamol)或邻甲苯海拉明(orphrenadine)。
[0098] 优选的NMDA受体拮抗剂包括但不限于右美沙芬(dextromethorphan) ((+)-3-羟-N-甲基吗啡喃)或其代谢物右啡烷(dextrorphan)((+)-3-羟-N- 甲基吗啡喃)、氯胺酮(ketamine)、美金刚(memantine)、吡咯并喹啉奎宁 (pyrroloquinoline quinine)、顺-4-(膦酰甲基)-2-哌啶羧酸、布地品(budipine)、 EN-3231( 吗啡和右美沙芬(dextromethorphan)的组合制剂)、托吡酯(topiramate)、奈拉美生(neramexane)或培净福太(perzinfotel)，包括NR2B拮抗剂，例如艾芬地尔(ifenprodil)、曲索罗地(traxoprodil) 或(-)-(R)-6-{2-[4-(3-氟苯基)-4-羟-1-哌啶基]-1-羟乙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮。
[0099] 优选的α-肾上腺素能药包括但不限于多沙唑嗪(doxazosin)、坦索罗辛 (tamsulosin)、可乐定(clonidine)、胍法辛(guanfacine)、碟美塔托米定 (dexmetatomidine)、莫达非尼(modafinil)、或4-氨基-6,7-二甲氧基-2-(5- 甲烷-磺酰氨基-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-基)-5-(2-吡啶基)喹唑啉。
[0100] 优选的三环类抗抑郁药包括但不限于地昔帕明(desipramine)、丙咪嗪 (imipramine)、阿米替林(amitriptyline)或去甲替林(nortriptyline)。
[0101] 优选的抗惊厥药包括但不限于卡马西平、拉莫三嗪(lamotrigine)、托吡酯(topiratmate)或丙戊酸盐(valproate)。
[0102] 优选的速激肽(NK)拮抗剂包括但不限于(αR,9R)-7-[3,5-双(三氟甲基) 苄基]-8,9,10,11-四氢-9-甲基-5-(4-甲基苯基)-7H-[1,4]二氮杂环辛并 [2,1-g][1,7]-萘啶-
6-13-二酮(TAK-637)、5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]-甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3- 酮(MK-869)、阿瑞吡坦
(aprepitant)、拉奈匹坦(lanepitant)、达匹坦(dapitant) 或3-[[2-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-甲氨基]-2-苯基哌啶(2S,3S)。
6-13-二酮(TAK-637)、5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]-甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3- 酮(MK-869)、阿瑞吡坦
(aprepitant)、拉奈匹坦(lanepitant)、达匹坦(dapitant) 或3-[[2-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-甲氨基]-2-苯基哌啶(2S,3S)。
[0103] 优选的毒蕈碱拮抗剂包括但不限于奥昔布宁(oxybutynin)、托特罗定 (tolterodine)、丙哌维林(propiverine)、曲司氯铵(tropsium chloride)、达非那新(darifenacin)、索利那辛(solifenacin)、替米维林(temiverine)和异丙托铵
(ipratropium)。优选的COX-2选择性抑制剂包括但不限于塞来考昔(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、帕瑞考昔(parecoxib)、伐地考昔 (valdecoxib)、地拉考昔(deracoxib)、依托考昔(etoricoxib)或鲁米考昔 (lumiracoxib)。
(ipratropium)。优选的COX-2选择性抑制剂包括但不限于塞来考昔(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、帕瑞考昔(parecoxib)、伐地考昔 (valdecoxib)、地拉考昔(deracoxib)、依托考昔(etoricoxib)或鲁米考昔 (lumiracoxib)。
[0104] 优选的煤焦油镇痛药包括但不限于乙酰氨基酚(paracetamol)。
[0105] 优选的神经安定药包括但不限于氟哌利多(droperidol)、氯丙嗪 (chlorpromazine)、氟哌啶醇(haloperidol)、奋乃静(perphenazine)、硫利达嗪(thioridazine)、美索达嗪(mesoridazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、氟奋乃静(fluphenazine)、氯氮平(clozapine)、奥氮平(olanzapine)、利培酮(risperidone)、齐拉西酮(ziprasidone)、喹硫平(quetiapine)、舍吲哚(sertindole)、阿立哌唑
(aripiprazole)、索奈哌唑(sonepiprazole)、布南色林(blonanserin)、伊潘立酮(iloperidone)、哌罗匹隆(perospirone)、雷氯必利(raclopride)、佐替平(zotepine)、联苯芦诺(bifeprunox)、阿塞那平(asenapine)、鲁拉西酮(lurasidone)、氨磺必利(amisulpride)、巴拉皮利酮(balaperidone)、帕林朵(palindore)、依利色林
(eplivanserin)、奥沙奈坦(osanetant)、利莫纳班(rimonabant)、美兰纳坦
(meclinertant)、曲马多 或沙立佐坦(sarizotan)。
(aripiprazole)、索奈哌唑(sonepiprazole)、布南色林(blonanserin)、伊潘立酮(iloperidone)、哌罗匹隆(perospirone)、雷氯必利(raclopride)、佐替平(zotepine)、联苯芦诺(bifeprunox)、阿塞那平(asenapine)、鲁拉西酮(lurasidone)、氨磺必利(amisulpride)、巴拉皮利酮(balaperidone)、帕林朵(palindore)、依利色林
(eplivanserin)、奥沙奈坦(osanetant)、利莫纳班(rimonabant)、美兰纳坦
(meclinertant)、曲马多 或沙立佐坦(sarizotan)。
[0106] 优选的香草素受体激动剂包括但不限于树胶脂毒素(resiniferatoxin)。优选的香草素受体拮抗剂包括但不限于辣椒平(capsazepine)。
[0107] 优选的β-肾上腺素能药包括但不限于普萘洛尔(propranolol)。优选的本地麻醉药包括但不限于美西律(mexiletine)。优选的皮质类固醇类包括但不限于地塞米松(dexamethasone)。
[0108] 优选的5-HT受体激动剂或拮抗剂、特别地5-HT1B/1D激动剂包括但不限于依立曲坦(eletriptan)、舒马曲坦(sumatriptan)、那拉曲坦(naratriptan)、佐米曲坦(zolmitriptan)或利扎曲坦(rizatriptan)；优选的5-HT2A受体拮抗剂包括但不限于R(+)-α-(2,3-二甲氧基-苯基)-1-[2-(4-氟苯乙基)]-4-哌啶甲醇(MDL-100907)。
[0109] 优选的胆碱能(烟碱)镇痛药包括但不限于异丙克兰(ispronicline) (TC-1734)、(E)-N-甲基-4-(3-吡啶基)-3-丁烯-1-胺(RJR-2403)、(R)-5-(2- 吖丁啶基甲氧基)-2-氯吡啶(ABT-594)或尼古丁。
[0110] 优选的PDEV抑制剂包括但不限于5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基-磺酰基)苯基]-1-甲基-3-正丙基-1,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(西地那非(sildenafil))、(6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-六氢-2-甲基-6-(3,4-亚甲二氧苯基)-吡嗪并[2',1':6,1]-吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(IC-351或他达拉非 (tadalafil))、2-[2-乙氧基-5-(4-乙基-哌嗪-1-基-1-磺酰基)-苯基]-5-甲基-7- 丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(伐地那非(vardenafil))、5-(5-乙酰基-2-丁氧基-3-吡啶基)-3-乙基-2-(1-乙基-3-吖丁啶基)-2,6-二氢-7H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-7-酮、5-(5-乙酰基-2-丙氧基-3-吡啶基)-3-乙基-2-(1-异丙基-3-吖丁啶基)-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮、5-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1- 基磺酰基)吡啶-3-基]-3-乙基-2-[2-甲氧乙基]-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮、4-[(3-氯-4-甲氧苄基)氨基]-2-[(2S)-2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]-N-(嘧啶-2-基甲基)嘧啶-5-甲酰胺、3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6,7-二氢-1H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-5-基)-N-[2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基]-4-丙氧基苯磺酰胺。
[0111] 优选的大麻素包括但不限于四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)、大麻醇(cannabinol)、大麻二醇(cannabidiol)、大麻萜酚(cannabigerol)、四氢次大麻二酚(tetrahydrocannabivarin)、次大麻二酚(cannabidivarin)和大麻色原烯(cannabichromene)。
[0112] 优选的血清素再吸收抑制剂包括但不限于舍曲林(sertraline)、舍曲林代谢物-去甲基舍曲林、氟西汀(fluoxetine)、诺氟西汀(norfluoxetine)(氟西汀去甲基代谢物)、氟伏沙明(fluvoxamine)、帕罗西汀(paroxetine)、西酞普兰(citalopram)、西酞普兰代谢物-去甲基西酞普兰 (desmethylcitalopram)、艾司西酞普兰(escitalopram)、d,l-芬氟拉明 (d,l-fenfluramine)、非莫西汀(femoxetine)、伊福西汀(ifoxetine)、氰基度硫平(cyanodothiepin)、利托西汀(litoxetine)、达泊西汀(dapoxectine)、萘法唑酮(nefazodone)、西文氯胺(cericlamine)和曲唑酮(trazodone)。
[0113] 优选的去甲肾上腺素(noradrenaline)(去甲肾上腺素(norepinephrine)) 再吸收抑制剂包括但不限于马普替林(maprotiline)、洛非帕明(lofepramine)、米氮平(mirtazepine)、羟丙替林(oxaprotiline)、非唑拉明(fezolamine)、托莫西汀(tomoxetine)、米安色林(mianserin)、安非他酮(buproprion)、安非他酮代谢物-羟安非他酮(hydroxybuproprion)、诺米芬辛(nomifensine) 和维洛沙秦(viloxazine)特别地是选择性去甲肾上腺素再吸收抑制剂如瑞波西汀(reboxetine)、尤其(S,S)-瑞波西汀。
[0114] 优选的血清素-去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂包括但不限于文拉法辛(venlafaxine)、文拉法辛代谢物O-去甲基文拉法辛 (O-desmethylvenlafaxine)、氯米帕明(clomipramine)、氯米帕明代谢物- 去甲基氯米帕明(desmethylclomipramine)、度洛西汀(duloxetine)、米那普仑(milnacipran)和丙咪嗪(imipramine)。
[0115] 优选的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂包括但不限于S-[2-[(1-亚氨乙基)氨基]乙基]-L-同型半胱氨酸、S-[2-[(1-亚氨乙基)氨基]乙基]-4,4-二氧代-L-半胱氨酸、S-[2-[(1-亚氨乙基)氨基]乙基]-2-甲基-L-半胱氨酸、 (2S,5Z)-2-氨基-2-甲基-7-[(1-亚氨乙基)氨基]-5-庚烯酸、2-[[(1R,3S)-3-氨基 -4-羟-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-5-氯-3-吡啶甲腈；2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟 -1-(5-噻唑基)-丁基]硫代]-4-氯苯腈、(2S,4R)-2-氨基-4-[[2-氯-5-(三氟甲基) 苯基]硫代]-5-噻唑丁醇、2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-6-(三氟甲基)-3-吡啶甲腈、2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟-1-(5-噻唑基)丁基] 硫代]-5-氯苯腈、N-[4-[2-(3-氯苄氨基)乙基]苯基]噻吩-2-甲脒或胍基乙基二硫醚。
[0116] 优选的乙酰胆碱酯酶抑制包括但不限于多奈哌齐(donepezil)。
[0117] 优选的前列腺素E2亚型4(EP4)拮抗剂包括但不限于N-[({2-[4-(2- 乙基-4,6-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)苯基]乙基}氨基)-羰基]-4-甲基苯磺酰胺或4-[(1S)-1-({[5-氯-2-(3-氟苯氧基)吡啶-3-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸。
[0118] 优选的白三烯B4拮抗剂包括但不限于1-(3-联苯基-4-基甲基-4-羟-苯并二氢吡喃-7-基)-环戊烷羧酸(CP-105696)、5-[2-(2-羧乙基)-3-[6-(4-甲氧苯基)-5E-己烯基]氧苯氧基]-戊酸(ONO-4057)或DPC-11870。
[0119] 优选的5-脂加氧酶抑制剂包括但不限于齐留通(zileuton)、6-[(3-氟 -5-[4-甲氧基-3,4,5,6-四氢-2H-吡喃-4-基])苯氧甲基]-1-甲基-2-喹诺酮 (ZD-2138)或2,3,5-三甲基-6-(3-吡啶基甲基)、1,4-苯醌(CV-6504)。
[0120] 优选的钠通道阻滞剂包括但不限于利多卡因(lidocaine)。优选的5-HT3 拮抗剂包括但不限于昂丹司琼(ondansetron)。
[0121] 优选地，将p75NTR(NBP)配制用于口服、舌下、颊部、局部(topical)、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、肌内、心内、骨内、滑膜内、皮内(intradermal)、腹膜内、经粘膜、阴道、玻璃体内、关节内、关节周、局部(local)或经皮肤(epicutaneous)施用。
[0122] 在本发明的又一个方面，提供了编码用于如上文定义的治疗骨关节炎的p75NTR(NBP)的核酸。
[0123] 在本发明的另一个方面，提供了用于转染细胞的复制型表达载体，所述复制型表达载体包含编码用于如上文定义的治疗骨关节炎的 p75NTR(NBP)的核酸。
[0124] 在本发明的又一个方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达用于如上文定义那样治疗骨关节炎的p75NTR(NBP)。
[0125] 在本发明的更进一步的一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上文所述的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体或宿主细胞，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0126] 优选的药学上可接受的载体包括但不限于[…]
[0127] 本发明的另一个方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：
[0128] a.上文描述的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体、宿主细胞或药物组合物；和
[0129] b.针对以下任一种或多种情况向个体施用有效量的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体或药物组合物的说明书：预防或治疗骨关节炎和/ 或骨关节炎症状或用于缓解、控制、减少骨关节炎和/或骨关节炎症状的发生率、或延迟或逆转骨关节炎和/或骨关节炎症状形成或进展。
[0130] 在本发明的另一个方面，提供了一种治疗和/或预防个体中骨关节炎和 /或骨关节炎症状的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的上文描述的p75NTR(NBP)、核酸分子、复制型表达载体、宿主细胞或药物组合物，所述药物组合物任选地还包含药学上可接受的载体。
[0131] 实施例
[0132] 实施例1–使用Biacore测量p75NTR的亲和力
[0133] 方法
[0134] 使用Biacore T200(通用电气医疗(GE Healthcare)，瑞典)，通过表面等离子体共振技术测定p75NTR的动力学和亲和力。Biacore方法基于 Abdiche和同事推荐的那些方法(Abdiche等人,2008)。使用如胺偶联试剂盒中所提供的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide)，EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(N-hydroxy-succinimide，NHS)和乙醇胺，通过胺偶联法，将蛋白A (10mM乙酸钠缓冲液中10μg/mL)固定在CM5生物传感器芯片的表面上。
[0135] 简而言之，涉及胺偶联法固定向导(wizard)到Biacore仪上的步骤是：
[0136] ·将EDC和NHS按1:1混合
[0137] ·将EDC/NHS混合物在CM5芯片的每个流动小室上方按10μL/分钟注射420秒[0138] ·将10mM乙酸钠缓冲液、pH 4.5中的蛋白A[10μg/mL]在相同的流动小室上方按10μL/分钟注射420秒
[0139] ·将乙醇胺在相同的流动小室上方按10μL/分钟(min)注射420秒
[0140] 固定大约2200-2900响应单位(response unit，RU)。将一个流动小室设定为空白对照。按10μL/分钟流量注射p75NTR(HBS-EP[0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％v/v表面活性剂P20]中10μg/mL) 30秒，将p75NTR-Fc在15℃捕获到生物传感器芯片的其它流动小室上，以实现所需的p75NTR RU水平(～400RU；使用p75NTR(相关神经营养因子)的分子量和化学计量比率计算)。固定p75NTR而非配体有助于确保神经营养因子处于其天然状态。
[0141] 通过以下方式进行单循环动力学研究：将HBS-EP缓冲液中渐增浓度的神经营养因子在流动小室上方按每种神经营养因子浓度30μL/分钟(min) 注射120秒。在神经营养因子最终注射后，使HBS-EP在芯片上方流过600 秒以确定解离速率。在每个新注射循环之前，通过将10mM甘氨酸HCl， pH 2按30μL/分钟(min)注射60秒，使芯片传感器表面再生恢复它们的蛋白A表面。
[0142] 通过以下方式进行多循环动力学研究：在流动小室上方将最低浓度的神经营养因子按30μL/分钟(min)注射300秒，随后将HBS-EP缓冲液按 30μL/分钟(min)注射300秒。芯片随后通过2x60秒注射10mM甘氨酸、 HCl pH 2再生，并且该循环对每种渐增的神经营养因子浓度重复。
[0143] 结果
[0144] p75NTR可逆地结合至神经营养因子NGF、BDNF、NT-3和NT-4。表 1中给出使用Biacore测量的亲和力。
[0145] 表1：p75NTR对四种神经营养因子的亲和力
[0146]神经营养因子 亲和力(pM) 亲和力范围(pM)
NGF 554 50-5000
BDNF 41.8 5-500
NT-3 14.2 1-100
NT-4 181 10-1000
NGF 554 50-5000
BDNF 41.8 5-500
NT-3 14.2 1-100
NT-4 181 10-1000
[0147] 实施例2-单碘乙酸盐诱导的骨关节炎研究
[0148] 通过大鼠后膝中关节内注射单碘乙酸盐(monoiodoactetate，MIA)诱导的实验性骨关节炎是充分认可的骨关节炎模型。已经报道疾病的病理学进展和疼痛行为(Guzman等人，2003)(Fernihough等人，2004)。MIA通过抑制甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 破坏糖酵解，导致软骨细胞死亡(Harvey和Dickenson，
2009)。软骨的结构完整性依赖于软骨细胞的正常功能，因此MIA诱导的软骨细胞损失导致与骨关节炎(OA)临床组织病理学一致的软骨变性和软骨下骨变化(Janusz 等人，2001；
Kobayashi等人，2003；Naveen等人，2014)。注射0.3mg MIA 引起历经10周时间的软骨损失。
软骨损失在第3周至第6周之间最大(图 1)。
2009)。软骨的结构完整性依赖于软骨细胞的正常功能，因此MIA诱导的软骨细胞损失导致与骨关节炎(OA)临床组织病理学一致的软骨变性和软骨下骨变化(Janusz 等人，2001；
Kobayashi等人，2003；Naveen等人，2014)。注射0.3mg MIA 引起历经10周时间的软骨损失。
软骨损失在第3周至第6周之间最大(图 1)。
[0149] 成对放置并且在第2天称重200-250g的44只雄性Wistar大鼠(查尔斯河(Charles River),英国(UK))按对随机分配接受治疗，从而每个治疗组的平均体重是相似的。在第0天，大鼠接受如如表1中所示的治疗。皮下施用新鲜配制的人IgG(无内毒素磷酸盐缓冲盐水[ETF-PBS]中3.25 mg/mL)和p75NTR(EF-PBS中3.25mg/mL)。实验室人员在这项研究期间自始至终不知道动物治疗情况。
[0150] 表2：治疗组MIA，单碘乙酸盐；IgG，免疫球蛋白G
[0151]治疗组(n) MIA 抗体
1(6) 0.3mg 人IgG 3.0mg/kg
2(6) 0.3mg p75NTR 0.3mg/kg
3(6) 0.3mg p75NTR 1.0mg/kg
4(6) 0.3mg p75NTR 3.0mg/kg
1(6) 0.3mg 人IgG 3.0mg/kg
2(6) 0.3mg p75NTR 0.3mg/kg
3(6) 0.3mg p75NTR 1.0mg/kg
4(6) 0.3mg p75NTR 3.0mg/kg
[0152] 三小时后，全部动物均用异氟烷麻醉。每只麻醉的动物根据随机分组方案在右膝或左膝接受50μL含有0.3mg MIA的EF-PBS的关节内注射。用50μL EF-PBS注射每只麻醉动物的对侧膝。在第5天和第15天进行又一种相应的抗体或p75NTR治疗。
[0153] 研究在第26日终止，此时，软骨损失明显且活跃(图1)。使用异氟烷麻醉动物，通过心脏穿刺法(cardiac puncture)取得终末血液样品(terminal blood sample)并且制备血浆样品。移除后下腿上的皮肤并且将肌束与骨分离，但连同膝部一起保持完整。将股骨、腓骨和胫骨切断并且将膝部连同附着的肌肉置于10％中性缓冲的福尔马林中。组织样品在缓冲的福尔马林中保留48-72小时，之后加工供组织学分析。
[0154] 采集后尽快使用标准程序，制备组织样品供光学显微镜检查，以最小化因福尔马林固定造成的损伤。样品在8％甲酸中脱钙10天，使用珊顿 Citadel组织处理器(Shandon Citadel tissue processer)加工并包埋入熔融的石蜡。使用自动化线性染色器(莱卡(Leica)ST4040)，从每个大鼠膝盖组织块加工至少4张切片(10μm)用于标准苏木素和曙红(H&E)染色。使用番红O染色其它切片。按4倍或10倍放大率观察切片并且使用计算机化系统进行图像分析。测量软骨总面积(从软骨表面向下至钙化软骨和软骨下骨之间的边界)。在单色光下以数字式光密度测定法定量与组织切片结合的染色剂的光吸收。当吸收阈值设定在130nm时，通过测量染色的软骨面积，对葡糖氨基葡聚糖被番红O红色染色的强度定量。
[0156] 结果-p75NTR对MIA诱导的OA后膝中组织学变化的影响
[0157] 来自全部治疗组的动物中已经用ETF-PBS注射过的膝内未观察到组织变性，也未观察到OA的特征(图2B、D、F、H，图3B、D、F、H)。相反，在对照抗体治疗的动物中MIA注射的膝部显示轻度软骨细胞变性区域，这往往涉及关节软骨的整个厚度(图2A)。在一些地区内存在近期炎症反应的迹象，白细胞堆积明显。用p75NTR治疗未加速OA进展(图2C、E、 G)。与对照抗体治疗的动物相比，在低浓度MIA处理的用p75NTR治疗的膝部的构造中存在较少的组织学变化，显示免于损伤的保护作用或损伤的修复。这在测试的全部p75NTR浓度(0.3-3.0mg/kg)均明显。实际上，用最高剂量p75NTR-Fc治疗的动物具有显著(p<0.05)增加的软骨面积(OA 中p75NTR-Fc所致修复的证据，参见图4)。
[0158] p75NTR对MIA诱导的OA后膝中蛋白聚糖密度的影响
[0159] 在p75NTR-Fc治疗的动物中，MIA处理的膝部内软骨总面积改善：在 3.0mg/kg时p75NTR-Fc治疗的动物与关节内注射后第26天的相应对照动物相比显著差异(p<0.05)(图4)。
[0160] 如通过图像分析所评估，与软骨的糖胺聚糖含量成正比的番红O染色强度显示治疗组之间差异明显(p<0.05)(参见图5)。使用130nm吸收阈值，在对照抗体治疗的动物中仅20％来自MIA处理的膝部的软骨在130nm 阈值以上为红色染色，与对侧膝部相比，这表示糖胺聚糖大量损失。相反，在接受p75NTR-Fc的动物的MIA处理的膝部中大约50％的软骨高于
130 nm阈值(图5)。这表示p75NTR-Fc阻止MIA注射后持续的软骨结构完整性丧失并且还调节OA中的疾病。
130 nm阈值(图5)。这表示p75NTR-Fc阻止MIA注射后持续的软骨结构完整性丧失并且还调节OA中的疾病。
[0161] 实施例3-与PG-007相比p75NTR-Fc对大鼠中骨关节炎消退的影响
[0162] 这项研究的目的是评估一旦疾病已经建立，递增剂量的p75NTR-Fc是否可以引起OA消退。此外，已经根据与大鼠中MIA诱导的关节炎相关的疼痛，评估治疗的效力并且将这种效力与他尼珠样抗神经营养因子生长因子(NGF)抗体PG-007治疗比较。
[0163] 方案
[0164] 试剂
[0165]试剂 来源和目录编号 批号
碘乙酸单钠(MIA) Sigma I2512 #SLBB6147V
无内毒素PBS(ETF-PBS) Promocell C-40240 359P109
10％中性缓冲的福尔马林溶液 Sigma HT501320 090M4370
EDTA(二甲盐二水合物) Sigma ED2P BCBF9021V
碘乙酸单钠(MIA) Sigma I2512 #SLBB6147V
无内毒素PBS(ETF-PBS) Promocell C-40240 359P109
10％中性缓冲的福尔马林溶液 Sigma HT501320 090M4370
EDTA(二甲盐二水合物) Sigma ED2P BCBF9021V
[0166] 表3.实施例3中所用试剂的详情
[0167] MIA的制备
[0168] 按浓度0.3mg/50μl ETF-PBS(用于每次关节内注射的体积)制备MIA，这等同于6mg/ml MIA储备溶液。量出68mg MIA并溶解于11.3ml ETF-PBS中。提前一天制备MIA并且避光贮存在4℃直至需要。全部动物均接受从相同批次制备的MIA。
[0169] 测试剂
[0170]
[0171] 表4.实施例3中所用测试剂的详情
[0172] 测试剂的制备
[0173] 在动物给药的特定日新鲜配制这项研究中所用的测试剂(参见表4)。在可能的情况下，配制的每种抗体的体积相等，从而体内注射抗体的科学家不知道每个小瓶中的治疗是什么(参见表5)。
[0174]
[0175] 表5.实施例3中所用测试剂的常见配制
[0176] 动物
[0177] 实施例3中使用抵达时重120-150g的39只雄性Wistar大鼠(来自查尔斯河，UK)。每只动物在抵达时受到检查并且外观显得健康。将它们随机分配至三个笼子之一，并且依据尾上的刺青，为每只大鼠分配一个独特识别编号。在第0日启动研究前，动物适应于动物设施至少10天。
[0178] 一旦大鼠已经适应其环境，则将它们转移至其中实施全部体内流程的储藏室/流程室。如1986年内政部动物(Home Office Animals)(科学规程 (Scientific Procedures))法案中推荐，通过设定成产生12小时光照-黑暗循环(07.00开灯，19.00关灯)的荧光灯，对动物给予照明。给各房间装上空气调节器并且常规测量空气温度(21℃+/-2℃)和相对湿度。
[0179] 大鼠喂养R105-25照射的完整的饮食(科学的动物食品与工程 (Scientific Animal Food and Engineering)，Augy，法国)并且可随意获得高压灭菌水。检查每个批次的饮食并且常规筛查组合物和污染物。将窝和笼子高压灭菌并且使每个笼子独立通风(IVC系统)。
[0180] 实验设计
[0181] 在一个膝部中通过关节内注射MIA诱导关节炎后并且一旦观察到MIA 处理的肢体承重情况与ETF-PBS处理的其对侧对照肢体相比显著差异(失能度量(incapacitance measurement))，则将动物随机分配至具有等同疼痛行为的五个治疗组(n＝6只动物每组)和一个溶媒对照组(n＝3)。包括六只未用过药的动物作为阴性对照。
[0182]
[0183] 表6.实施例3的实验设计概述
[0184] 整个研究期间定期记录体重并且按周间隔测量自发性疼痛的评估。
[0185] 由于已经显示抗NGF(抗-神经营养因子)引起大鼠搔抓面部和颈部周围，因此定期观察到动物的皮肤损害迹象并且记录任何损害评分，特别地在第6天后，以确保我们未达到如先前研究中所确定的人体临床终点(如果皮肤总损害的最大面积超过10cm2或如果任一个损害尺寸大于2cm x 3 cm并且变得更深和更湿，同时24小时时间内无愈合迹象，则处死动物)。
[0186] 在终末日，通过心脏穿刺法取得血液样品并且制备血浆。取出膝部并置于10％中性缓冲的福尔马林盐水中并加工用于组织学。
[0187] 一种或多种处理的随机化
[0188] MIA的注射
[0189] 实施随机化，从而将每只大鼠的左膝或右膝用MIA注射(并且来自每只大鼠的对侧膝部用ETF-PBS注射)。使用Mac用微软Excel(版本14.1.1) 中的随机数生成程序生成每只大鼠的哪个膝部接受MIA或盐水的分配。不接触动物的人员实施随机化流程和分配(方案参见附录1)。对每只动物标记两个7ml聚丙烯小瓶以指示左膝或右膝(总计66个小瓶)。两个人(一人评定并检查主要随机化工作薄并且一人等分用于关节内注射溶液)准备这66个小瓶。等分过程依次实施，从而首先灌装MIA小瓶，接着剩下的小瓶用ETF-PBS灌装(这是用于每只动物的对侧膝部小瓶)。未用过药的动物的小瓶留空。
[0190] 测试剂的给予
[0191] 将动物随机分配至已经用MIA处理的膝部的疼痛行为与溶媒对照 (vehicle control)治疗的膝部相比等同的治疗组中。这在诱导OA后第28 天进行。
[0192] 动物程序
[0193] 膝部的关节内注射
[0194] 使用博伊尔斯装置(Boyles Apparatus)，通过吸入异氟烷麻醉大鼠。剪掉每只动物的两个膝部上的毛发并且膝部用乙醇擦拭。使用0.5ml无菌碧迪公司微细胰岛素注射器(Becton Dickinson Micro-Fine insulin syringe)连同随附的27G针头，用ETF-PBS中的50μl 0.3mg MIA或单独ETF-PBS 经髌韧带内注射每个膝部。将六只未用过药的动物麻醉并且仅剪掉双膝上的毛发。在整个体内研究期间，科学家不知道全部动物的处理状态。
[0195] 测试剂的给予
[0196] 通过皮下途径在颈背或腹部，使用剂量体积5ml/kg给予测试剂。
[0197] 自发性疼痛的评估
[0198] 通过使用双足平衡测痛仪(Incapacitance tester)(林顿仪器(Linton Instruments)，U.K.)测量左后肢和右后肢的承重，按每周间隔测定每只动物的自发性疼痛。将大鼠置于双足平衡测痛仪上适当大小的有机玻璃动物盒中，从而它们后足坐在分离的传感器上。所选盒的大小基于大鼠体重(小的大鼠夹持器用于至多450g的大鼠和大的大鼠/豚鼠夹持器用于超过450g 的大鼠)，这允许大鼠在不受挤压的情况下舒适地蹲坐，但是类似地不提供使得大鼠可转圈的太多空间。一旦大鼠坐稳并平静，记录每个肢体的承重 5秒并且记录以克计由两个后肢发出的平均力量。在每个时间点测定每只大鼠后爪的重量分布5次，并且计算5个读数的均数。通过右肢的重量除以两个后肢的总重量，将各个的承重数据换算成重量分布。
[0199] 终末血液样品
[0200] 在异氟烷麻醉药作用下通过心脏穿刺，用已经以MilliQ水中1％EDTA 钾冲洗的泰尔茂(Terumo)2ml注射器和21G针头取得终末血液样品。将采集的血液置入2ml聚丙烯管中。随后通过颈椎脱臼法处死动物。
[0201] 血浆制备
[0202] 将终末血液样品以2700x g离心10分钟并且将血浆等分入聚丙烯管 (每只动物四份等分试样)并在-80℃冷冻。
[0203] 取出大鼠膝部
[0204] 移除下腿上的皮肤并且将肌束与骨分离，但连同膝部一起保持完整。将股骨、腓骨和胫骨切断并且将膝部连同附着的肌肉取出并且置于125ml 螺旋盖容器中大约80ml 10％中性缓冲的福尔马林中。将膝部在缓冲福尔马林中保存48至72小时，之后加工用于组织学分析。
[0205] 组织学加工
[0206] 使用标准程序，制备组织样品用于光学显微镜检查，并且制备过程在剑桥大学兽医学院外部实施。简而言之，在膝关节固定后，将组织用PBS 淋洗并且随后在8％甲酸中脱钙10天。在脱钙后，使用珊顿Citadel组织处理器加工组织，所述组织处理器通过一系列分级的乙醇浓度使组织脱水 (4小时六次更换，范围从75％至100％乙醇)、用100％氯仿淋洗(4小时三次更换)并且最终包埋入熔融的石蜡以形成组织块(4小时两次更换)。使用Surgipath PEC3001器连同熔融的石蜡，将组织包埋入盒中。采集后尽快加工组织以最小化因福尔马林固定造成的损伤，从而组织切片可能潜在地用于免疫组织化学。
[0207] 使用莱卡RM2135蜡超薄切片机，从每个大鼠膝组织块切下至少4个 10μm切片。将两个切片置于玻璃载片上，并且使用自动化线性染色器(莱卡ST4040)，将载片用标准苏木素和伊红(H&E)和番红O固绿(番红O F/G)染色。简而言之，线性染色机器具有遵循标准H&E或番红O F/G方案的按载片染色用布局布置的23个试剂工作站和4个水工作站。对于H&E，将载片在每个工作站内一分钟后在27个工作站之间交换并且遵循二甲苯、乙醇、水、苏木素、水、酸醇、水、伊红、水、乙醇和二甲苯的顺序(全部溶剂均来自飞世尔科技(Fisher Scientific)并且H&E来自莱卡)。允许切片风干，封装并且覆以盖玻片，准备好在显微镜下观察。
[0208] 图像分析
[0209] 使用奥林巴斯(Olympus)AX70显微镜使用Image-Pro Plus图像分析软件(一套v7.0，分析软件(Media Cybernetics)，U.K.)，以2、4或10倍放大率观察载片。就OA样特征进行着色组织切片的初步信息分析以显示每只大鼠内侧膝关节的总大体变化。
[0210] 使用X2物镜，对SO/FG载片进行图像分析，其中测定全部大鼠膝部 (MIA和ETF-PBS处理的膝部)的软骨总面积(以mm2计)。测量软骨层的厚度(每个内侧膝关节最少6次测量)并且这个值与来自相同膝关节的软骨下骨的厚度比较。
[0211] 数据分析
[0212] 使用经典统计学，分析每只动物的图像分析(如软骨面积)和疼痛评估数据(例如，重量分布失衡)。从p75-NTR-Fc(在不同剂量)或PG-007 治疗的动物采集多个量值并且平均化，并且使用适当的经典统计检验，将数值与对照动物比较。对于全部分析，取p<0.05显示统计显著性。
[0213] 结果
[0214] 体重
[0215] 比较不同组中大鼠的体重以检验动物大小的差异。在第0天，在不同治疗组中动物的体重之间不存在统计显著差异(p＝0.76n.s.，单因素方差分析(one-way ANOVA)，参见图30)。
[0216] 在研究过程期间，六个治疗组之间的平均体重(p75NTR-Fc或PG-007 治疗的大鼠与对照抗体治疗的大鼠比较)统计上彼此无显著差异(p＝n.s.，两因素方差分析(two way ANOVA)，参见图31)。
[0217] 自发性疼痛量值
[0218] p75NTR-Fc和PG-007对OA激发的自发性疼痛的影响
[0219] 使用双足平衡测痛仪测量重量遍布后肢的分布，评估自发性疼痛。在基线时(组7，未用过药的动物例外)进行评估并且向一只膝盖注射MIA 后(用ETF-PBS注射对侧膝盖)第15天、第21天和第28天再次进行评估。数据在图32中显示并且说明由MIA处理的后肢支撑的后肢上总体重的比例。对于未用过药的动物，显示传递至左后肢的重量的比例。
[0220] 对于全部动物，治疗的后肢上重量的比例和理论期望值0.5之间不存统计显著差异(基线时在第0天跨两个后肢均匀分布(p＝0.379，克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal Wallis test)；参见图32)。截至第28天，全部五个治疗组相对于理论均数0.5具有显著差异并且基本上取得它们MIA注射膝部的重量(参见图32)。基于先前的研究，显示OA病变的程度显著到足以启动大鼠给药。
[0221] 在大鼠中从第30天起直至第56天研究结束，采用相应治疗方案启动给药(每5天通过皮下途径治疗)。在研究过程期间，测量自发性疼痛的进一步评估结果(在第35天、第42天、第49天和第56天进行，参见图4)。在这项研究自始至终直至第49天，对照IgG Fc治疗的动物在处理的后肢上体重的比例和理论期望值0.5之间保持显著差异，表明MIA处理的膝盖造成动物疼痛(参见图33)。相反，在抗NGF PG-007治疗的动物和 p75NTR-Fc(从0.3mg/kg至3mg/kg)治疗的那些动物中，随着时间进展，在MIA处理的后肢上体重的比例和理论期望值
0.5(即，体重均匀分布在后肢上)之间不存在显著性。
0.5(即，体重均匀分布在后肢上)之间不存在显著性。
[0222] 在Mia诱导的Oa后膝部的组织学变化
[0223] p75NTR-Fc和PG007对OA消退的影响
[0224] 来自对照抗体治疗的动物的用MIA注射的膝部显示多个软骨细胞变性区域，在某些区域中软骨细胞变性已经导致软骨完全损失(图34)。这由软骨中相关的番红O固绿染色损失突出显示。此外，在位于最大软骨损伤区域下方的软骨下骨中存在明显的病理学变化(图34)。软骨下骨中存在一系列变化，这些变化反映了反应性变化和因从重塑至硬化性变化而推动的进程(图34)。
[0225] 与对照抗体治疗的动物相比，在明显病变已经建立后(由其中处理的后肢上体重的比例和理论期望值0.5显著差异的疼痛评估结果鉴定)用3 mg/kg PG-007治疗28天的动物显示显著的组织学变化，同时大鼠膝部的总体完整性丧失并且不存在效力的组织学证据(图35)。这种病变与相关的软骨和骨髓损失和骨坏死迹象相符，后者总体上导致整体快速进展并且在一些动物中与对照抗体治疗的动物相比导致OA恶化(图35)。相反， p75NTR-Fc治疗(0.3mg/kg至3mg/kg)的动物显示迥然不同的组织病理学，并且与对照抗体治疗的动物相比，存在明显的软骨保护迹象和相关的软骨下骨病理学明显增加，这导致骨病变和OA的严重程度总体降低(图 36-图38)。表型上，这表现为骨髓中髓样扩充减少，这种减少削弱了炎性介导的溶骨驱动力。
[0226] 用较低剂量p75NTR-Fc(0.3mg/kg和1mg/kg)治疗的动物显示最明显的组织病理学变化(参见图37和图38)，并且在两个治疗组中病变几乎处于正常水平。考虑到3mg/kg p75NTR-Fc时的组织学结果(参见图36)，总体特征表明p75NTR-Fc显示出“钟形”剂量反应曲线。
[0227] 组织病理学评估
[0228] 对番红O固绿染色的脱钙膝切片进行组织病理学评估。总体上，组织加工和染色的质量优异，仅三张载片因质量原因被扔掉。将载片组成治疗组并且从而初始病理学评估结果未设盲。然而，出于分级的目的，使用简单随机数序列，将全部组(除了溶媒组)随机分配，旨在减少观察者偏倚和诊断漂移。
[0229] 描述性软骨组织病理学表型
[0230] 对照组
[0231] 在配对的载片之间存在清晰的区别。软骨病变最明显的载片是：4RA、 5LA、6LB、10RA、11LB(载片11RA上的软骨不足以评定)和12RB。大部分软骨变化是整个厚度侵蚀附带明显的外周软骨细胞坏死。
[0232] 组4-PG007，3mg/kg
[0233] 在配对的载片之间存在清晰的区别。软骨病变最明显的切片是：1RA、 2RB、3LB、34LA、35LA、36RB。总体上，软骨病变在组织学上类似于对照组。
[0234] 组3-P75NTR-Fc，0.3mg/kg
[0235] 与对照组相比，配对载片之间的区别不是如此明显。P75NTR-Fc的施用与明显抑制MIA诱导的软骨病变相关-实际上在两个病例中几乎正常。三个载片因质量原因从这个组扔掉。
[0236] 组1-P75NTR-Fc，1.0mg/kg
[0237] 与对照组相比，配对载片之间的区别不是如此明显。软骨病变最明显的载片(虽然与对照损害相比最适中的)是：7LA、8LA、13RB、15RA、 31RB、33LB。P75NTR-Fc的施用与明显抑制MIA诱导的软骨病变相关。
[0238] 组2-P75NTR-Fc，3.0mg/kg
[0239] 就效力而言，这个组展示明显的软骨病变影响变异性-伴随一系列影响，从对照型损害至类似组1的那些损害(50％)。软骨病变最明显的载片是： 16LB、17RA、18RB、22RB、23LA和24LA。在最高剂量施用P75NTR-Fc 并未显示与与0.3mg/kg和1.0mg/kg相关的明确影响。
[0240] 组织病理学等级标准
[0241] 评分的分配基于每个解剖区内部观察到的最频繁损害。基于初步评估，鉴定了对照组中的关键组织学特征，并且所述特征显示施用1.0mg/kg P75NTR-Fc后的明显变化。评定标准是已经在先前的MIA研究病理学评估 (MLF)中使用的那些。
[0242] 软骨病变
[0243] 许多出版物详述了Mankin评分评定人软骨病变的用途。原始Mankin 评分(或HHGS评分)范围从0(正常)至14(严重病变)并且受明显的观察者间偏倚影响。此外，这种评分系统低估血管翳病变的涉及并且经常使早期变化与正常变异混杂。重要地，Mankin评分扩展评定范围用于中度至重度，并且明显地使轻度变化混入中度变化。因此，直接应用的Mankin 评分在临床前研究中具有存疑的实用性，因为它很少描述药效动力学范围并且对啮齿类和人类之间细胞更新的差异不敏感。本研究中所用的评定系统是使用Pelletier描述性方案的OARSI体系修改形式：
[0244] 0-无明显异常；1-细微浅表原纤维形成；2-浅表侵蚀；浅表区软骨细胞丧失；3-深区侵蚀；4-全厚度糜烂；软骨下骨多灶性暴露，<50％面积；5- 软骨板丧失；关节间隙内碎屑形成，>50％面积
[0245] 软骨下骨
[0246] 在发生退行性变化之前，软骨下骨板对软骨完整性丧失以一系列软骨评级作出反应-基本上是骨质溶解介导的。0-无明显异常；1-浅表区瓦解(不规则骨样区)；2-全厚度瓦解；3-多灶性骨质溶解；4-多灶性骨质减少；5- 汇合性骨质减少区
[0247] 基质空洞(Stromal cavities)
[0248] 基质空洞是软骨下骨板内部和紧邻其远端的骨髓空洞。0-无明显异常； 1-微小骨质溶解；2-中度骨质溶解；3-明显骨质溶解，伴大部分空洞内部多个溶解性凹陷的证据；4-溶骨后空洞融合；5-融合的空洞侵入软骨下骨和/ 或骨外膜
[0249] 松质骨
[0250] 松质骨系统因关节生物力学变化而经历细微软骨病变的反应性变化- 进展成继发于炎症的更多的退行性表型
[0251] 0-无明显异常；1-浅表骨吸收/骨质溶解的多灶性区域；2-多个明显骨质溶解区域；3-多个骨质溶解区域伴随正常潮线成带现象丧失；4-多灶性骨质溶解区伴随明显的骨细胞丧失；5-松质骨破坏伴随/不伴随骨融合
[0252] 骨髓细胞过多
[0253] 0-无显著异常；1-骨髓基质内部多个局灶性凝缩细胞灶；2-骨髓基质和骨膜窝内部多个局灶性凝缩细胞灶；3-弥散性骨髓细胞过多-带状；4-骨髓扩充入基质空洞；5-在血管翳混合/不混合的情况下骨髓区室侵入软骨下骨板或骨膜
[0254] 骨硬化
[0255] 通常将骨硬化视作来自基质空洞的成纤维扩充区域。0-无明显异常； 1-偶发性小病灶；2-多个病灶；3-多个汇合病灶；4-多个汇合病灶伴随相关的骨变性；5-多个汇合病灶伴随骨囊肿
[0256] 成骨细胞增生
[0257] 0-无明显异常；1-多个成骨细胞板；2-多个肥大性成骨细胞板；3-明显的成骨细胞栅栏样；4-肥大性成骨细胞板-带状；5-肥大性成骨细胞板-多带状。
[0258] 组织学评级结果(来自配对集合的最严重软骨病变样品作图)
[0259] 软骨病变
[0260] PG007的施用未显示组织学上显著的效力影响。P75NTR-Fc在0.3 mg/kg和1.0mg/kg显示明显的软骨保护效力。在3.0mg/kg的效力特征更可变-该组的50％显示与对照组重叠(图39)。
[0261] 软骨下骨
[0262] 与对照组相比，PG007的施用与软骨下骨结构的组织学显著增加相关- 类似于用3.0mg/kg P75NTRFc所观察到的特征。相比之下，在0.3mg/kg 和1.0mg/kg施用P75NTR-Fc与软骨下骨结构显著改善相关(图40)。
[0263] 基质空洞
[0264] PG007的施用与任何组织学上显著的效力影响不相关。相比之下， P75NTR-Fc在全部剂量的施用与溶骨性病变减少和基质空洞扩大相关，尽管在0.3mg/kg和1.0mg/kg的影响最明显-两个基团均减少病变至几乎正常的水平(图41)。
[0265] 松质骨
[0266] PG007的施用与类似于对照的松质骨病变相关-两份样品超过对照范围。相比之下，P75NTR-Fc在0.3mg/kg和1.0mg/kg剂量水平显著减少松质骨病变。在3.0mg/kg的P75NTF-Fc展示更可变的特征，大部分样品显示与对照组重叠(图42)。
[0267] 骨髓细胞过多
[0268] PG007的施用与骨髓中髓样细胞扩充相关，四份样品达到最高或超过对照范围。P75NTR-Fc在0.3mg/kg和1.0mg/kg剂量减少骨髓细胞构成- 髓样扩充减少是明显特征。尽管显示出控制趋势，3.0mg/kg剂量显示与对照组中的低水平反应体重叠(图43)。
[0269] 骨硬化
[0270] 各研究组之间不存在组织学上显著的差异-尽管P75NTR-Fc样品的确显示向对照范围的上端簇集(图44)。
[0271] 成骨细胞增生
[0272] P75NTR-Fc在0.3mg/kg和1.0mg/kg施用与组织学上显著的成骨细胞增殖相关-栅栏样和成骨细胞性骨板形成在骨骺带中，在软骨下骨/软骨带处特别明显。此外，虽然未评定，但是在这个带中存在明显的‘成纤维细胞样’细胞。PG007和P75NTR-Fc(3.0mg/kg)在组织学上类似于对照(图 45)。
[0273] 不良作用
[0274] 用3mg/kg PG-007治疗的两只大鼠出现皮肤损害。截至第45天(治疗后15天)，非常少量的皮肤损害开始在一些大鼠的面部、颈部和肩区域周围出现，但是从第49天往后在一只大鼠中变得更明显(治疗后19天)。这些损害与注射部位不相关。定期检查大鼠并且定量每个损害的数目、大小和程度以确保我们保持处于人类研究临床终点内部。用p75NTR-Fc在任何浓度治疗的大鼠均未出现皮肤损害。
[0275] 讨论
[0276] 组织病理学
[0277] PG007与效力的组织学证据不相关。相反，在0.3mg/kg和1.0mg/kg 的P75NTR-Fc与组织学上明显的软骨保护作用相关，骨病变和骨质溶解介导的骨侵蚀的严重程度降低。骨髓细胞过多(尤其髓样扩充)减少的观察结果支持这种表型，并且表明炎症介导溶骨性驱动力的局限性涉及效力反应。重要地，这些剂量还与成骨细胞池扩充相关-表明P75NTR-Fc效力的机理是一种限制骨质溶解(因此限制髓样细胞活化)同时扩充成骨细胞池(因此增大间充质细胞池)的双重机理。3.0mg/kg P75NTR-Fc组的组织学特征表明P75NTR-Fc显示出‘钟形’剂量反应曲线。尽管在许多方面，3.0mg/kg P75NTR-Fc和PG007的组织学特征相似，但是精确表型表明，基于剂量相等，P75NTRFc的溶骨驱动力小于PG007。传统地，MIA模型的组织病理学评估基于来自导致反应性骨变化的主要软骨病变的线性关系。经常认骨髓变化随之而来，继起于反应性滑膜炎，所述反应性滑膜炎源自因软骨损失所致的生物力学变化。来自骨免疫学的数据正在积累，这些数据显示这种线性关系是全新的并且骨区室可能在调节软骨反应的时间演进和表型中发挥重要作用。实际上，这项研究支持来自人体研究的影像学数据，所述影像学数据显示甚至在最小等级软骨损害中骨再造。因此，有可能应当将软骨和软骨下骨视为综合功能单位-后者提供调节作用以支持软骨细胞增殖和存活并且从而影响骨关节炎中的结构性结果。来自本研究的数据支持以下假设：NGF途径的处理，在提供减少骨质溶解的可能性之同时，还可以增进间充质细胞介导的骨保护作用-并且因此抑制从浅表软骨坏死至深区损害的驱动力并且因此抑制软骨全厚度侵蚀和软骨损失。
[0278] 结论
[0279] 在这项研究中，研究使用p75NTR-Fc(从0.3mg/kg至3mg/kg)的治疗性给药方案的影响以确定是否可以观察到MIA注射后OA病变的消退。允许OA在开始给药之前发展30天，这通过明显不同于理论均数0.5的疼痛量值鉴定。
[0280] 用较低剂量p75NTR-Fc(0.3mg/kg和1mg/kg)治疗的动物得到镇痛并显示有效，并且与对照抗体治疗的动物相比，显示出显著更少的OA病变。相反，尽管3mg/kg PG-007治疗的大鼠显示痛觉缺失，但是这与效力的组织学证据和OA病变的任何改善不相关。然而，用较高剂量p75NTR-Fc (3mg/kg)治疗的动物显示镇痛；相对于3mg/kg PG-007治疗的动物，存在某种组织病理学相似性。
[0281] 本发明在范围方面不受本文中描述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前文描述和附图是本领域技术人员显而易见。这类修改意在落入所附权利要求的范围内。另外，如果适宜，本文所述的全部实施方案将视为与任何和全部其它一致性实施方案广义适用和与之可组合。
[0282] 本文中援引多种出版物是，其公开内容通过引用的方式完整并入。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种氨基酸强化型发酵酶解豆粕及其应用 | 2020-05-08 | 422 |
| 植物乳杆菌DP189及其应用 | 2020-05-14 | 531 |
| 一种抗体药物偶联物及其应用 | 2020-05-08 | 538 |
| 一种土著乳杆菌培养方法与养殖应用配方 | 2020-05-08 | 115 |
| 用于对样品进行实时聚糖测定的系统和方法 | 2020-05-11 | 902 |
| 一株高效降解佛波酯菌株及其在麻疯树饼粕发酵脱毒中的应用 | 2020-05-12 | 813 |
| 用于由人干细胞分化人外周感觉神经元的方法及其用途 | 2020-05-13 | 217 |
| 发酵大豆粕及其制备方法 | 2020-05-13 | 183 |
| 杂芳基吡啶酮和氮杂-吡啶酮酰胺化合物 | 2020-05-13 | 420 |
| 一种蒸汽热处理破壁麸皮粉的加工方法 | 2020-05-15 | 818 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈