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一种基于组织 支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法

阅读：412发布：2020-06-23

专利汇可以提供一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法。它是将人iPSc源性的3D 视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸‑羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行培养，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基；对培养到一定时期的聚乳酸‑羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞进行钠离子通道检测，检测其神经基础功能。选择对PLGA膜片上培养的神经细胞进行钠离子通道免疫荧光染色，更加真实的反映组织膜片上细胞的状态，为进一步对膜片上细胞进行膜片钳检测功能电位提供依据及基础。，下面是一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行培养，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基；对培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞进行钠离子通道检测，检测其神经基础功能；
所述的钠离子通道检测是将培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞，吸除其培养基，用PBS洗涤后，用固定液固定，再弃固定液，用PBS洗涤，然后加入PB液，打孔封闭，孵育一抗、二抗、然后DAPI染核，置于载玻片上，加入抗荧光猝灭剂，将盖玻片盖在猝灭剂上，活细胞显微镜下观察细胞钠离子通道染色；
所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2 supplement 1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。
2.根据权利要求1所述的基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，所述的培养是在37℃、5％C02，饱和湿度下进行培养。
3.根据权利要求1所述的基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。

说明书全文

一种基于组织 支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道

检测方法

技术领域：

[0001] 本发明属于干细胞组织工程领域及神经生物学领域，具体涉及一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法。背景技术：

[0002] 青光眼是一组威胁和损害视神经及其视觉通路，最终导致视觉功能损害，主要与病理性眼压升高有关的临床征群或眼病。其视神经病变的特征是视网膜神经节细胞(RGC)的渐进性丧失以及其轴突与大脑中枢连接的损害。目前临床上降低眼内压的主要治疗，虽可以减缓疾病进展，但并不能完全阻止病情的进一步发展，尤其是对于晚期青光眼的患者更是收效甚微。因此，有必要寻找一种新的治疗策略，减缓或阻止进行性的RGC损害。

[0003] 现已有许多研究通过运用干细胞及组织工程学技术，对青光眼神经保护和细胞替代两方面进行了积极的尝试并取得了较大进展。但干细胞移植中存在诸多复杂和关键的问题：如细胞生长部位难以精确控制；移植细胞不能完全生长分化且难以与宿主细胞有效整合，形成功能性突触链接；移植入眼内的细胞存活率较低等等。将干细胞和组织工程学有机结合，可增进或改善视网膜受损组织修复的形态及功能为确保移植体系的质量，有必要对接种于组织支架进行体外培养分化的细胞进行形态及功能的评估和检测。发明内容：

[0004] 本发明的目的是提供一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，利用该方法可以直接反映神经支架上生长的神经样细胞钠离子通道蛋白的表达情况，为后续功能电位的检测奠定基础并提供依据，可作为神经支架功能评价的一项重要指标。

[0005] 本发明的基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0006] 将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行培养，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基；对培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞进行钠离子通道检测，检测其神经基础功能。

[0007] 所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2 supplement 1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。

[0008] 所述的培养是在37℃、5％C02，饱和湿度下进行培养。

[0009] 所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。

[0010] 所述的钠离子通道检测是将神经样细胞在组织膜片培养条件下，进行钠离子通道蛋白的免疫荧光鉴定。具体优选是将培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞，吸除其培养基，用PBS洗涤后，用固定液固定，再弃固定液，用PBS洗涤，然后加入PB液，打孔封闭，孵育一抗、二抗、然后DAPI染核，置于载玻片上，加入抗荧光猝灭剂，将盖玻片盖在猝灭剂上，活细胞显微镜下观察细胞钠离子通道染色。

[0011] 本发明人团队前期已成功将人源性的iPSc细胞诱导分化为人iPSc源性的3D视网膜(Xiufeng Zhong,et al.Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs,Nat Commun.2014 Jun 10；5:4047)。本发明将hiPSC来源的三维视网膜组织中的神经层细胞接种于PLGA组织膜片，构建了一个人iPS源性的可降解神经支架。通过前期实验观察发现，同一批神经层细胞分别接种于PLGA膜片及普通盖玻片上，其生长分化的形态并不完全相同。因此对该体系的评估，选择直接对PLGA膜片上培养的神经细胞进行钠离子通道免疫荧光染色，更加真实的反映组织膜片上细胞的状态，为进一步对膜片上细胞进行膜片钳检测功能电位提供依据及基础。附图说明：

[0012] 图1是本发明对PLGA膜片上细胞进行了DAPI染色，细胞核呈蓝色荧光，可显示细胞核的位置及形态；

[0013] 图2是本发明PLGA膜片上的细胞在诱导分化前经GFP转染，细胞呈绿色荧光，可显示细胞整体形态；

[0014] 图3是本发明对PLGA膜片上的细胞进行了Anti-Nav1.1抗体染色，钠离子通道蛋白呈红色荧光，可显示细胞钠离子通道蛋白是否表达，表达位置等；

[0015] 图4是本发明将PLGA膜片上同一视野下细胞的免疫荧光的不同彩色通道图像进行合成，即将同一视野下细胞核的蓝色荧光图像、细胞的绿色荧光图像及钠离子通道蛋白的红色荧光图像合并，在同一副图中显示钠离子通道蛋白的表达情况。具体实施方式：

[0016] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0017] 实施例1：

[0018] 一、人iPSc源性的3D视网膜分离消化：

[0019] 1、采用机械分离的办法，将培养50-60天的人iPSc源性的3D视网膜(具体制备方法参考文献：Xiufeng Zhong,et al.Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs,Nat Commun.2014Jun 10；5:4047)的神经纤维层放入D-Hanks液中，于50倍正置显微镜下使用0.45mm针头分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分(色素层)，保留金黄色的组织部分(神经纤维层)；将分离的神经纤维层组织使用移液管转移至3.5cm培养皿，使用PBS冲洗10分钟；吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞，置于37℃培养箱中30min；过程后期可将细胞吸入离心管吹打，在10倍正置显微镜下见细胞团被消化成单细胞后加入2ml诱导分化培养基终止消化。将混悬液离心(1000转/5min)后吸出上清，得到种子细胞(沉淀)，种子细胞进行GFP转染，将GFP基因转入种子细胞并使其表达，然后在转染有GFP基因的种子细胞中加入诱导分化培养基吹打混匀，将该含有种子细胞的诱导分化培养基分别移入预先底层铺有PLGA膜片并用基质胶Matrigel包被的96孔板中(种植密度：1×105个/cm2)，摇动孔板使细胞均匀，37℃、5％CO2饱和湿度下进行培养；所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2 supplement 1ng、非必须氨基酸(essential media-non essential amino acids NEAAs)1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。其配制方法为：将DMEM培养基和F12培养基按照体积比
1：1混合形成DMEM/F12培养基，然后按照上述成份的含量，在DMEM/F12培养基中添加bFGF、BDNF、CNTF、N2 supplement、非必须氨基酸和肝素，混合均匀而得诱导分化培养基。

[0020] 2、细胞贴膜培养至14天，吸除培养孔培养基，1×PBS洗2遍，加入质量分数4％PFA(多聚甲醛)室温固定5min后，弃固定液，1×PBS洗3遍，每遍5min，加入PB液(0.2％Triton 100+10％驴血清)，室温下打孔及封闭，15-20min；

[0021] 3、孵育一抗(冰上操作)：弃0.5％Triton+驴血清，用ADS液(0.04％Triton x-100 with 2％donkey serum)稀释一抗anti-Nav1.1(比例1:200)；37℃过夜后，弃一抗，用1×PBS洗3遍，每遍5min；

[0022] 4、孵育二抗(避光操作)：ADS液稀释(比例1:500)二抗(LifeTech ALEXA FLUOR 555 DONKEY A31572)室温下孵育1h。弃二抗，用1×PBS洗3遍，每遍5min；

[0023] 5、DAPI染核5min,每个样品200μl，1×PBS洗1遍；

[0024] 6、将膜片一干净载玻片，滴一滴抗荧光猝灭剂，将盖玻片盖在猝灭剂上。

[0025] 7、活细胞显微镜下观察细胞钠离子通道染色。

[0026] 如附图1和2所示，蓝色荧光显示细胞核，绿色荧光显示细胞整体，两者同一视野下图像吻合，共同在膜片上标识出了细胞的位置；附图3中，膜片上有细胞存在的位置显示较强红色荧光，红色荧光与背景分界清楚，从附图4合成图像中可以看到，同一视野下红色荧光部分与细胞核及细胞的部分完全吻合，从荧光强度及位置表明，膜片上神经样细胞表达钠离子通道蛋白。

[0027] 钠离子通道是由细胞膜上的特殊蛋白质形成的可以让钠离子通过细胞膜的通道。钠离子通道根据启动方式可分为电压门控型通道及配体门控型通道，其中电压门控型钠离子通道与细胞膜动作电位关系密切。细胞电活动是生命现象的基本特征之一，而离子通道是其结构和功能的基础。因此,研究PLGA膜片上钠离子通道表达及细胞膜动作电位情况具有重要意义。本发明用电压门控钠离子通道蛋白特异抗体对PLGA上膜片神经样细胞的钠离子通道蛋白进行检测，结果显示神经样细胞上有钠离子通道蛋白表达，为后续研究细胞膜上动作电位功能提供了结构基础。

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一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道

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