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一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法

阅读:152发布:2020-05-12

专利汇可以提供一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法,该多功能融合酶可以表达木聚糖酶, 植酸酶 ,双葡聚糖酶和双 纤维 素酶活性,将其用于后期制备相应的转基因动物,该动物将自身分泌这些酶,起到消化 饲料 中木聚糖、植酸、葡聚糖, 纤维素 等 抗营养因子 ,达到提高饲料利用率,减少污染排放的功效。同时,解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题;解决2A连接肽多基因共表达效率低,基因 位置 确定困难问题,及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题,达到增强多基因高效共表达效率的目的。此外,还可以解决单个来源的纤维素酶基因表达和 水 解 纤维素效果差的问题。,下面是一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法专利的具体信息内容。

1.一种多功能融合酶XAET,其特征在于,所述的多功能融合酶基因由木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-纤维素酶基因-A3'-纤维素酶基因组成。
2.根据权利要求1所述的多功能融合酶XAET,其特征在于,所述的多功能融合酶XAET基因序列如SEQ ID No:11所示。
3.根据权利要求1所述的多功能融合酶XAET,其特征在于,所述的A3的基因序列如SEQ ID No:5所示。
4.根据权利要求1所述的多功能融合酶XAET,其特征在于,所述的A3'的基因序列如SEQ ID No:6所示。
5.根据权利要求1所述的多功能融合酶XAET,其特征在于,所述的多功能融合酶XAET基酸序列如SEQ ID No:12所示。
6.一种多功能融合酶定点整合真核特异表达载体,其特征在于,所述的载体包括权利要求2或5所述的多功能融合酶XAET。
7.根据权利要求6所述的多功能融合酶定点整合真核特异表达载体,其特征在于,所述的载体基因序列如SEQ ID No:13所示。
8.根据权利要求7所述的多功能融合酶定点整合真核特异表达载体,其特征在于,所述载体的构建方法,包括如下步骤:
候选目的基因的筛选和优化;
连接肽的设计;
目的基因与连接肽连接;
多功能融合酶基因XAET的合成;
构建CEP112位点定点转XAET基因表达载体。
9.根据权利要求8所述的多功能融合酶定点整合真核特异表达载体,其特征在于,所述的构建CEP112位点定点转XAET基因表达载体包括如下步骤:
将XAET多顺反子替换CEP112-LA340RA3219载体中BEXA顺反子,构建新载体Cep112-mPSP-XAET;
用PacI和sexAI线性化Cep112-mPSP-XAET,然后用inf-npsp引物扩增npsp上游调控区,并替换现有mpsp序列;
构建CEP112位点定点转XAET基因表达载体Cep112-npsp-XAET。
10.一种多功能融合酶XAET的应用,其特征在于,所述的多功能融合酶XAET用于制备节粮环保转基因动物。

说明书全文

一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表

达载体及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶腮腺组织特异表达的定点整合载体及其构建方法。

背景技术

[0002] 非淀粉多糖(NSP)是由若干单糖通过糖苷键连接成的多聚体,包括除α-葡聚糖以外的大部分多糖分子。NSP最初是根据提取和分离多糖所采用的方法进行分类的。细胞壁经一系列提取后剩余的不溶物叫纤维素,溶在碱液中的物质称为半纤维素。考虑到非淀粉多糖的化学结构及生物功能,人们发现依据其溶解度分类有失精准。通常非淀粉多糖一般分为3大类,即纤维素、非纤维多糖(半纤维素性聚合体)和果胶聚糖。其中非纤维多糖又包括木聚糖、β-葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。按照溶性的不同,非淀粉多糖又可分为可溶性非淀粉多糖(SNSP)和不可溶性非淀粉多糖(INSP),这是因为在谷物细胞壁中,一些非淀粉多糖以氢键松散地与纤维素、木质素、蛋白质结合,故溶于水,称为可溶性非淀粉多糖。
[0003] 非淀粉多糖(NSP)是饲料膳食纤维的主要组成成分,这些纤维将饲料营养物质包围在细胞壁里面,部分纤维可溶解于水并产生粘性物质。这些粘性物质抑制动物的正常消化功能,妨碍动物吸收营养。如将这些NSP去除,营养物质就能从细胞壁里释放出来,从而提高代谢能和蛋白质的利用率。玉米、小麦中均含有大量的NSP,许多植物蛋白源,如大豆粕,同样含有 NSP。在饲料中添加酶制剂,可将这些NSP去除,如大豆粕中被细胞结构包围的淀粉和蛋白就可释放,从而提高了大豆粕的代谢能和蛋白质的利用率。
[0004] 在饲料中添加酶制剂可以解决NSP的消化吸收问题,但酶制剂在饲料制粒和膨化过程中容易受高温失活,还增加了饲料的成本,也对饲料的储存条件更加严苛,增加了运输和饲用成本。因此,亟需一种其他的解决办法。近几年,陆续有研究表明,将可以表达木聚糖酶、葡聚糖酶等纤维素素或非纤维素多糖的酶基因转入动物体内,通过获得表达该基因的转基因动物,可以通过该动物自身分泌和表达相应的酶,来消化饲料中的NSP,达到提高饲料营养消化吸收的目的。因而,利用转基因育种技术培育在猪体内表达自身缺乏的消化酶的动物新品种是解决饲料抗营养问题的新途径。2001年加拿大科学家Golovan等(2001)首次利用将大肠杆菌耐酸性植酸酶appA基因整合到猪体内,提高饲料磷的消化率,粪磷排放量显著降低75%。2013年本课题同样利用猪腮腺分泌蛋白上游调控区域成功制备得到转纤维素酶基因小鼠(Huang et al.,2013)和转甘露聚糖酶基因小鼠(李紫聪等,2013),2018年zhang等用2A多肽将木聚糖酶-葡聚糖酶-植酸酶融合后导入猪基因猪,提高猪生产性能,减少磷氮排放。在公开号为 CN106086068A专利中亦公开了利用2A连接肽,实现了果胶酶-木聚糖酶- 植酸酶-纤维素酶融合表达,但表达效率不高。然而这些现有技术,存在如下问题,转单基因,表达量高,但表达酶种类少,消除个别饲料营养因子对动物性能改善水平有限,经济价值不大。2A介导的转多基因依然存在共表达效率不高,多基因融合酶的首尾基因表达不一致的问题,基因位置难以确定,还存在一些基因序列会干扰2A的剪切,导致表达产物功能尚失。

发明内容

[0005] 本发明公开提供一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法,该多功能融合酶可以表达木聚糖酶,植酸酶,双葡聚糖酶和双纤维素酶活性,将其用于后期制备相应的转基因动物,该动物将自身分泌这些酶,起到消化饲料中木聚糖、植酸、葡聚糖,纤维素等抗营养因子,达到提高饲料利用率,减少污染排放的功效。同时,解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题;解决2A连接肽多基因共表达效率低,基因位置确定困难问题,及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题,达到增强多基因高效共表达效率的目的。此外,还可以解决单个来源的纤维素酶基因表达和水解纤维素效果差的问题。
[0006] 根据本公开的一个方面,提供了多功能融合酶,该多功能酶可以同时表达木聚糖酶,植酸酶,双葡聚糖酶和双纤维素酶。
[0007] 在某些实施方式中,该多功能融合酶基因由木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-纤维素酶基因-A3'-纤维素酶基因组成。由于在2个以上蛋白共表达时,单纯使用柔性肽或刚性肽都很难实现所有基因共表达,本发明通过组合应用A3和2A,解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题;解决2A连接肽多基因共表达效率低的问题,及多基因共表达中 2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题,达到多基因高效共表达的效果。同时,与单纯2A连接肽相比,本发明利用A3和furin P2A构建XAET显著提高四种酶不同PH条件下的活性,消除2A多肽对上游基因的影响,也避免部分蛋白空间结构抑制2A反应活性的问题,同时还避开对不同蛋白顺序优化繁琐试验过程,酶表达量比2A更高。刚性肽只能用于两种融合酶的构建,本发明将2A和A3巧妙结合,即保留A3优势,又增强融合酶的多基因共表达能。在融合酶第二和第三号基因连接处采用自剪切效率最高的P2A,同时在其N端添加furin酶识别基序RVKR,RVKR可在细胞器高尔基体高效剪切,仅残留2个基酸残基,该设计与一般2A序列,具有更高的剪切效率,对表达产物影响最小。由此,通过本公开设计获得的XAET基因序列,可以高效表达木聚糖酶,植酸酶,双葡聚糖酶和双纤维素酶,解决了四种基因共表达的难题,更为以后将其用于转基因动物和酶发酵工业生产来提高基因转移和酶的生产效率提供了基础。同时,在公开号为CN106086068A 专利中公开的,采用2A连接两个基因序列时,两个基因的连接顺序都会影响基因的表达及功能的发挥,而且两个基因的酶活都不及单基因的酶活高;在多基因连接时,若只采用2A连接肽,这种位置效应会更加明显,对于每个基因酶活的影响会更加突出。但是本公开采用A3和2A连接肽组合使用构建的上述多功能酶基因,可以克服位置效应,木聚糖酶和植酸酶基因表达的酶活与单基因相当。但由于纤维素酶采用了两个双基因共表达,其表达的纤维素酶活性要高于单基因酶活性。
[0008] 在某些实施方式中,该多功能融合酶基因中A3的基因序列如SEQ ID No:5所示。
[0009] 在某些实施方式中,该多功能融合酶基因中A3'的基因序列如SEQ ID No:6所示。
[0010] 在某些实施方式中,该多功能融合酶基因XAET序列如SEQ ID No:11所示。由于2A多肽高效的自剪切功能,可较好实现前后两个蛋白的共表达,被誉为蛋白融合表达最可靠的linker。但是,部分酶蛋白融合2A的C端多肽后功能显著受损,后一个蛋白的表达量降低。多基因共表达时,对蛋白组合顺序要求苛刻,需要繁琐验证排列组合,才能实现低水平的共表达(公开号为CN106086068A专利中已表明此现象),不利于多功能融合酶的构建。 2A序列剪切效率与上游多肽基序有关,部分蛋白氨基酸基序会严重影响2A 切割活性,导致2A介导前后两个酶因无法完全切割,导致二级结构折叠异常,还有可能被上游基因信号肽迁移到靶向错误的细胞器,无法正确的加工和分泌,导致功能尚失,表达失败。本公开中,采用A3与
2A连接肽组合使用的方式来构建4种基因融合表达的多功能融合酶,可以克服2A及 A3连接肽各自的缺点,使该多功能融合酶可以高效的表达四种酶活,可为获得表达该四种酶的转基因动物做好基础。
[0011] 在某些实施方式中,该多功能融合酶具有如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列。连接肽最重要的指标是氨基酸链的长度,不同长度的GGGGS连接肽对融合蛋白的表达量和活性有着不同的影响,并不是连接肽越长表达量就越高。融合酶对柔性肽要求比较苛刻,过长或过短的柔性肽都不利于融合酶活性。分子质量大、结构复杂的蛋白需要的折叠空间也就越大,连接肽也应加长,但过长的肽链可能会增加抗原性,同时也易被酶水解断裂。连接肽过短形成空间位阻效应会影响蛋白的正确折叠,也提高了聚体形成的几率。刚性连接肽由于二级结构的稳固,不可伸展弯曲的特性,常用来固定两端功能蛋白间距,保证功能域的完整。由此,设计的刚性连接肽 A3/A3'与自剪切的P2A共同作用连接4个基因,实现4个基因的共表达, A3/A3'与P2A连接肽序列经过优化设计,使得木聚糖酶、植酸酶、、葡聚糖酶和纤维素酶均可高效表达。
[0012] 根据本公开的另一个方面,提供了一种多功能融合酶定点整合真核特异表达载体,该表达载体包括如权利要求5或6所述的多功能融合酶。
[0013] 在某些实施方式中,多功能融合酶定点整合真核特异表达载体的基因序列如SEQ ID No:13所示。
[0014] 在某些实施方式中,提供了一种多功能融合酶定点整合真核特异表达载体的构建方法,其包括如下步骤:
[0015] 候选目的基因的筛选和优化;
[0016] 连接肽的设计;
[0017] 目的基因与连接肽连接;
[0018] 多功能融合酶基因XAET的合成;
[0019] 构建CEP112位点定点转XAET基因表达载体。
[0020] 在某些实施方式中,构建CEP112位点定点转XAET基因表达载体包括如下步骤:
[0021] 将XAET多顺反子替换CEP112-LA340RA3219载体中BEXA顺反子,构建新载体Cep112-mPSP-XAET;
[0022] 用PacI和sexAI线性化Cep112-mPSP-XAET,然后用inf-npsp引物扩增 npsp上游调控区,并替换现有mpsp序列;
[0023] 构建CEP112位点定点转XAET基因表达载体Cep112-npsp-XAET。
[0024] 根据本公开的另一个方面,提供了一种多功能融合酶XAET的应用,该多功能融合酶XAET可用于制备节粮环保转基因动物,例如转基因猪、转基因、转基因羊等[0025] 本公开的有益效果:
[0026] 1)本发明设计构建pxynB-A3-APPA-furin-P2A-pegⅡ-A3'-TeEGI(XAET)融合酶,具有共表达木聚糖酶,植酸酶,双葡聚糖酶和双纤维素酶四种酶活性,相较于单纤维素酶基因具有更好的葡聚糖酶和纤维素酶活性。囊括饲料中消除主要抗营养因子所需要水解酶,对提高高纤维饲料转化率具有重要价值。本发明设计提高了基因表达效率,若将其用于转基因动物和酶发酵工业生产,能显著提高基因转移和酶的生产效率,具有重要的经济价值;
[0027] 2)与单纯2A连接肽相比,本发明获得XAET显著提高四种酶不同PH 条件下的活性,消除2A多肽对上游基因的影响,也避免部分蛋白空间结构抑制2A反应活性的问题,同时还避开对不同蛋白顺序优化繁琐试验过程;
[0028] 3)刚性肽只能用于两种融合酶的构建,本发明将2A和A3巧妙结合,即保留A3优势,又增强融合酶的多基因共表达能力;
[0029] 4)在融合酶第二和第三号基因连接处采用自剪切效率最高的P2A,同时在其N端添加furin酶识别基序RVKR,RVKR可在细胞器高尔基体高效剪切,仅残留4个氨基酸残基,该设计与一般2A序列,具有更高的剪切效率,对表达产物影响最小;
[0030] 5)携带XAET基因由猪CEP112位点高效定点整合载体运载,可高效制备转基因猪,快速获得整合位置一致的转基因家系,培育转基因猪新品种。附图说明
[0031] 图1为pxynB-A3-APPA-furin-P2A-pegII-A3'-teEGI(XAET)结构示意图;
[0032] 图2为木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)双顺反子优化组合与表达结果: A.木聚糖酶-植酸酶双顺反子优化组合设计示意图;B.xynB的pH范围;C. appA的pH范围;D.xynB的pH稳定性(39.℃,2h);appA的pH稳定性 (39.℃,2h);
[0033] 图3为葡聚糖酶(egⅡ)-纤维素酶(TeEGⅠ)双顺反子优化组合与表达结果:A.egⅡ-TeEGⅠ双顺反子优化组合设计示意图;B.葡聚糖酶的pH范围;C.纤维素酶的pH范围;D.葡聚糖酶的pH稳定性;E.appA纤维素酶的 pH稳定性;
[0034] 图4为融合酶与酶单基因表达产物酶活差异结果:A.不同pH条件下,纤维素酶活性比较;B:纤维素酶对不同pH环境耐受性(39度,处理2h);C: 融合酶与单基因表达量Q-PCR(TeEGI基因),D:融合酶与单基因表达量 Q-PCR(egII);
[0035] 图5为XAET在pK15细胞中表达检测结果;
[0036] 图6为Cep112-npsp-XAET质粒图谱。

具体实施方式

[0037] 一、目的基因的筛选
[0038] 分别将来源于黑曲霉的木聚糖酶基因xynB(Guo et al.,2013),来源于大肠杆菌的植酸酶基因appA,来源于里氏木霉的纤维素酶基因egⅡ(Akbarzadeh et al.,2014),来源于蟋蟀的纤维素酶基因TeEGⅠ(Kim et al., 2008),经SignalP 4.1 Server预测信号肽后,分别去掉其自身的信号肽,然后根据猪密码子偏好进行优化,并将猪或牛来源的腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)信号肽(signal peptide,sp)序列分别添加到密码子优化后的候选基因的氨基酸序列的N端,如pigPSP-SP-xynB,pigPSP-SP-appA, pigPSP-SP-egⅡ,pigPSP-SP-teEGⅠ分别简写为pSPxyn、pSPappA、pSPeg2、pSPTeEG,密码子优化后的成熟肽基因分别命名为pxyn(基因序列如SEQ ID No:1所示),pappA(基因序列如SEQ ID No:2所示),pegII(基因序列如SEQ ID No:3所示),pTEGI(基因序列如SEQ ID No:4所示)。
[0039] 二、构建木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA),纤维素酶(egⅡ)-纤维素酶(TeEG Ⅰ)多顺反子基因序列
[0040] 利用A3刚性肽,分别将木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA),纤维素酶(eg Ⅱ)-纤维素酶(TeEGⅠ)连接构建双功能融合酶,去掉A3上游基因终止密码子,同时去掉A3 C端下游基因信号肽。
[0041] 经优化突变后的A3序列如下:
[0042] A3(SEQ ID No:5):GAGGCTGCCGCCAAAGAAGCTGCCGCCAAGGAGGCTGCCGCC AAG[0043] A3'(SEQ ID No:6):GAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCC AAG[0044] 经优化后A3连接的双功能酶基因序列为xynB-A3-APPA与 egII-A3'-TeEGI。将上述融合设计多功能酶顺反子经猪密码子优化,去除稀有密码子,选择猪细胞使用频率较高的密码子。
[0045] 并分别将多顺反子内A3重复序列和猪腮腺蛋白信号肽再次优化,以减少重复序列对多顺反子结构稳定性的影响,优化后的序列进行人工合成。优化后的xynB-A3-APPA基因序列如SEQ ID No:7所示,氨基酸序列如SEQ ID No:8所示;优化后的egII-A3'-TeEGI基因序列如SEQ ID No:9所示,氨基酸序列如SEQ ID No:10所示。
[0046] 利用Furin酶识别基因序列和高效自剪切P2A序列,将pxynB-A3-APPA 与pegII-A3'-TeEGI,连接构建多功能顺反子 pxynB-A3-APPA-furin-P2A-pegII-A3'-TeEGI(XAET)(基因序列如SEQ ID No:11所示,氨基酸序列如SEQ ID No:12所示,基因结构图谱如图1所示)克隆到 pcDNA3.1(+)真核表达载体多克隆位点BamHI/EcoRI上。
[0047] 利用P2A分别将木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA),纤维素酶(egⅡ)- 纤维素酶(TeEGⅠ),连接构建双功能酶pxynB-p2A-pAPPA、pegII-p2A-pTeEG,克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上多克隆位点,作为对照组。
[0048] 三、木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)-纤维素酶(egⅡ)-纤维素酶(TeEGⅠ)真核表达载体构建
[0049] 将优化后的多功能酶顺反子XAET插入真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点BamHI/EcoRI上,经酶切和测序鉴定,多功能酶顺反子XAET真核表达载体pCD-XAET构建成功。
[0050] 四、木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)-纤维素酶(egⅡ)-纤维素酶(TeEGⅠ)多功能酶的体外表达与功能验证
[0051] 将pCD-XAET真核表达载体按照转染试剂盒LipofectamineTM LTX +PLUSTM Reagent(invitrogen)说明书瞬时转染猪肾pK15细胞系,48-72h,收集细胞上清液作为粗酶液测定酶活,检测其酶活力及其pH耐受力。酶活测定方法和定义参考纤维素酶《NYT/912-2004》、葡聚糖酶《NYT/911-2004》、木聚糖酶《GBT/23874-2009》、植酸酶《GBT/18634-2009》。
[0052] 1、木聚糖酶(xynB)和植酸酶(appA)融合酶表达分析
[0053] 将木聚糖酶(xynB)和植酸酶(appA)分别用furin-P2A和A3融合,并在猪pK15细胞表达,结果显示,融合后A3连接的融合酶成功表达木聚糖酶和植酸酶双功能酶,且其表达木聚糖酶和植酸酶在pH2.0-pH6.5均具有较高的生物学活性,其中pxynB-A3-appA的木聚糖酶活性,在pH2.0-5.0高于 pxynB-p2A-pappA,在pH5.0后略低于后者,但pxynB-A3-appA表达的木聚糖酶对pH2.0-pH7.0耐受能力明显高于pxynB-p2A-pappA。pxynB-A3-appA表达的植酸酶在不同pH缓冲液中活性和耐受性均显著优于 pxynB-p2A-pappA,结果如图2所示。
[0054] 2、纤维素酶(egⅡ)-纤维素酶(TeEGⅠ)融合酶表达分析
[0055] 纤维素结构复杂,且溶解度低,是限制其水解的主要原因,目前发现的纤维素酶基因活性普遍偏低。为提高纤维素酶活性,本研究将里氏木酶来源egⅡ基因与蟋蟀来源TeEGⅠ基因通过A3和2A进行融合,结果显示, pegⅡ-A3'-TeEGⅠ双顺反子表达的葡聚糖酶和纤维素酶在不同pH缓冲液中活性和耐受性均优于pegⅡ-p2A-pTeEGⅠ,酶活力显著提高,结果如图3所示。
[0056] 与单酶基因表达相比,融合酶pegⅡ-A3'-TeEGⅠ表达纤维素酶有所提高,根据定量结果可知,单基因表达量一般高于融合酶表达量2倍以上(质粒大小与转染效率成反比),而采用本设计的融合酶表达纤维素酶活性比单基因更高,结果如图4所示。
[0057] 3、多顺反子XAET在pK15细胞中表达检测
[0058] 分别用电转和脂质体化学转染方法,将多顺反子XAET真核表达载体 pCD-XAET导入PK15细胞,于48h后收集细胞上清培养液,测定其表达情况,结果显示,多顺反子XAET均成功表达出木聚糖酶,植酸酶和纤维素酶,结果如图5所示。
[0059] 五、定点整合到CEP112位点转木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)-纤维素酶(eg Ⅱ)-纤维素酶(TeEGⅠ)(XAET)基因表达载体构建
[0060] 首先将XAET多顺反子替换前期研究载体CEP112-LA340RA3219(来源于第“201711477805.5”号“一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法”,公开号“108285906A”专利)中的BEXA顺反子,构建了新载体 Cep112-mPSP-XAET,在其基础上,用PacI和sexAI线性化Cep112-mPSP-XAET,然后用表1中inf-npsp引物扩增npsp上游调控区,并替换现有序列, npsp(-11.5kb~-5.7kb)在原mpsp(-11.1kb~-5.7kb)基础上延长了调控区序列 
395bp,构建Cep112-npsp-XAET载体(序列如SEQ ID No:12所示),经酶切验证,切割条带大小与预期相符,经过测序验证,确定成功获得一个能在猪唾液腺中特异表达XAET四种功能酶的转基因载体,质粒图谱如图6所示。
[0061]
[0062] 获得的Cep112-npsp-XAET载体为猪CEP112位点高效定点整合载体运载,可高效制备转基因猪,快速获得整合位置一致的转基因家系,为后续快速培育遗传背景一致的转基因猪新品种做好基础。
[0063] 六、转多功能融合酶XAET基因猪的获得
[0064] 将构建成功的Cep112-npsp-XAET载体转染猪成纤维细胞系,获得表达 XAET多顺反子的阳性细胞系,将阳性细胞系作为供核细胞进行核移植,通过体细胞克隆的方法获得转XAET基因猪。
[0065] 对获得的转XAET基因猪进行基因及测序水平的鉴定,采集阳性猪的唾液,进行检测,发现转XAET基因猪均可高效的表达植酸酶,木聚糖酶、葡聚糖酶和纤维素酶,且木聚糖酶和植酸酶的活性与转单基因猪酶的活性相当,纤维素酶的活性高于转单基因猪酶的活性。
[0066] 以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于发明的保护范围。
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