一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用
阅读：704发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于 治疗 应激性认知损伤的药物中的用途，包括上述病毒载体的药物组合物、制备上述病毒载体的方法、以及上述病毒载体在针对表观遗传调控机制的研究中和针对应激所致 认知障碍 的治疗中的应用，其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性 蛋白质 ；所述治疗性蛋白为TET1(1418-2136aa)。本发明通过人工制备具有表观遗传修饰功能的腺相关病毒，该腺相关 病毒感染 机体 后可通过表观遗传修饰诱导BDNF等神经营养因子的表达，维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟，从而起到对抗和治疗应激性认知损伤的作用。，下面是一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.包含一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，
其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗性蛋白为TET1(1418-2136aa)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-2任一项所述重组单链DNA病毒载体。
4.一种制备权利要求1-2任一项所述重组单链DNA病毒载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：含TET1酶催化活性结构域真核表达载体的构建及鉴定；
S2：重组质粒表达检测，将鉴定出的阳性重组质粒转染293T细胞，收集细胞提取蛋白，通过western blot实验检测重组质粒表达情况；
S3：包装腺相关病毒，将重组表达质粒pAAV-TET1(1418-2136aa)和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞，3天后收集细胞上清和细胞，裂解获得AAV颗粒，通过CsCl密度梯度离心和超滤对病毒进行浓缩和纯化，最后通过real-time PCR检测病毒的滴度。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，步骤S1中，通过PCR获得Tet1酶催化活性结构域的编码基因，再克隆至腺相关表达载体内。
6.根据权利要求4-5任一项所述的制备方法，其中，所述PCR反应所采用的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
7.根据权利要求4-5所述的制备方法，其特征在于，所述腺相关表达载体为GV467，元件顺序为CMV-betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA。
8.权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，通过PCR获得的扩增产物翻译产生的肽段为TET1 1418-2136aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.权利要求1-3任一项所述的病毒载体在针对表观遗传调控机制的研究中以及针对应激所致认知障碍的治疗中的应用。
一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着现代社会生活节奏的加快和社会竞争的加剧，多数人都处在不同程度的应激负荷之下，表现为交感神经系统的过度活化和HPA轴功能亢进。流行病学调查显示，长期处于应激状态的人群其轻度认知障碍和痴呆的患病率是同年龄非应激人群的两倍以上。在确诊的认知功能障碍患者当中，超过70％伴随有HPA轴的功能紊乱。高水平应激激素可导致多个脑区出现结构和功能改变，包括海马体积缩小、椎体细胞树突棘数量减少、突触可塑性异常、齿状回神经发生受阻、前额叶皮层神经环路重塑、自发活动降低等，但临床上针对应激激素为靶点的药物尚不能够有效地预防和治疗应激相关的认知功能异常。
[0003] 神经营养因子包含多种不同成员，在中枢神经中分布广泛，对神经元的存活与分化、神经发生、树突结构重塑、突触形成、长时程增强的产生均具有重要的调节作用。应激条件下，海马结构中BDNF等神经营养因子表达显著降低，与成人应激性认知功能损伤具有关联。神经营养因子的表达调控机制各不相同，以BDNF为例，其启动子区具有糖皮质激素反应元件和若干CpG岛区域，可同时受激素核受体类转录因子和DNA表观遗传修饰的调节。因神经营养因子的表达调控机制目前仍不完全清楚，尚未见到通过表观遗传修饰调控其表达治疗应激性认知损伤的报道。
[0004] 基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。腺相关病毒载体是基因治疗中常用的病毒载体，它具有安全性良好、宿主范围广、感染效率高、制备方便且易纯化浓缩等特点。以腺相关病毒为载体的药物已经广泛应用于包括恶性肿瘤在内的多种疾病的治疗。
[0005] 本发明通过人工制备具有表观遗传修饰功能的腺相关病毒，该腺相关病毒感染机体后可通过表观遗传修饰诱导BDNF等神经营养因子的表达，维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟，从而起到对抗和治疗应激性认知损伤的作用，首次解决了通过表观遗传修饰调控脑内基因表达以治疗应激性认知损伤的技术难题
发明内容
[0006] 针对上述问题，本发明第一方面提供包含一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，
[0007] 其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质；
[0008] 其中，所述治疗性蛋白为TET1(1418-2136aa)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0009] 本发明另一方面提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括上述重组单链DNA病毒载体。
[0010] 本发明还提供一种制备上述重组单链DNA病毒载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0011] S1：含TET1酶催化活性结构域真核表达载体的构建及鉴定；
[0012] S2：重组质粒表达检测，将鉴定出的阳性重组质粒转染293T细胞，收集细胞提取蛋白，通过western blot实验检测重组质粒表达情况；
[0013] S3：包装腺相关病毒，将重组表达质粒pAAV-TET1(1418-2136aa)和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞，3天后收集细胞上清和细胞，裂解获得AAV颗粒，通过CsCl密度梯度离心和超滤对病毒进行浓缩和纯化，最后通过real-time PCR检测病毒的滴度。
[0014] 其中，步骤S1中，通过PCR获得Tet1酶催化活性结构域的编码基因，再克隆至腺相关表达载体内；
[0015] 特别地，所述PCR反应所采用的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
[0016] 特别地，所述腺相关表达载体为GV467，元件顺序为CMV-betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA；
[0017] 其中，所述步骤S1中，通过PCR获得的扩增产物翻译产生的肽段为TET11418-2136aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0018] 本发明最后提供上述病毒载体在针对表观遗传调控机制的研究中以及针对应激所致认知障碍的治疗中的应用。
[0019] 本发明的有益效果在于：
[0020] 1、本发明制备了包含人甲基胞嘧啶双加氧酶(Tet1)表达序列的腺相关病毒，感染哺乳动物后可高效产生Tet1蛋白，诱导感染区域DNA的表观遗传修饰。该病毒表达Tet酶效率较高，能够实现在体水平对动物局部组织产生明显表观遗传修饰作用，可以用于多种疾病的表观遗传调控研究。
[0021] 2、在针对表观遗传调控机制的研究中，本发明与现常用的甲基转移酶抑制剂相比，成本低廉，尤其在整体动物水平长时程给药时，仅需局部单次注射3×109个病毒，成本为连续腹腔注射5-aza等甲基转移酶抑制剂的三分之一至一半。同时，本发明所涉及的腺相关病毒，可以诱导主动地DNA去甲基化过程，不依赖于DNA复制，较甲基转移酶抑制剂起效更快，应用范围更广，可用于神经元等不可分裂细胞(图10、11)。另外，本发明所涉及的腺相关病毒可以诱导局部组织的DNA去甲基化，避免了全身给药导致的非特异性作用。
[0022] 3、使用本发明所构建的腺相关病毒注射应激所致认知障碍大鼠的海马区，能够明显抑制应激大鼠海马结构脑源性神经营养因子BDNF基因启动子的甲基化，增加BDNF水平，从而提升新物体识别能力、增强学习记忆能力。本发明所述的腺相关病毒宿主范围广，导入的人Tet1基因在哺乳动物中有很高的同源性，应用对象不仅限于大鼠、小鼠，还适用于包括人在内的其它哺乳动物，本发明所涉及的Tet1腺相关病毒构建方法在治疗各种应激压力所致的认知功能下降方面具有潜在的应用价值。附图说明
[0023] 图1：人Tet1基因的结构与扩增引物位置；
[0024] 图2：通过PCR方法获取Tet1目的基因的电泳鉴定，其中1为PCR产物，2为Marker；
[0025] 图3：构建目的基因重组表达载体所用的质粒结构；
[0026] 图4：重组质粒的转化鉴定，其中1：阴性对照(ddH2O)，2：阴性对照(空载自连对照组)，3：阳性对照(GAPDH)，4：Marker，自上而下依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp、100bp，5-12：11-18号转化子；
[0028] 图6：质粒转染后表达的重组Tet1鉴定，其中1：分子量Marker，2：SURVIVIN-3FLAG-GFP标准品阳性对照(分子量48KDa)，3：未转染的293T细胞对照，4：转染表达的目的基因融合蛋白(分子量108KDa)；
[0029] 图7：应激条件下脑内海马结构神经营养因子BDNF基因启动子甲基化的变化(*：与对照相比p<0.05)；
[0030] 图8：应激条件下脑内海马结构神经营养因子BDNF基因表达水平的变化(*：与对照相比p<0.05)；
[0031] 图9：应激对大鼠认知功能的影响(*：与对照相比p<0.05)；
[0032] 图10：Tet1基因腺相关病毒转染对应激大鼠海马结构神经元BDNF基因启动子甲基化的影响(*：与应激组相比p<0.05)；
[0033] 图11：Tet1基因腺相关病毒转染对应激大鼠海马结构神经元BDNF基因表达的影响(*：与应激组相比p<0.05)；
[0034] 图12：Tet1基因腺相关病毒转染对应激大鼠认知功能的改善作用(*：与应激组相比p<0.05)。
具体实施方式
[0035] 下面结合附图，对实施例作详细说明。
[0036] 实施例1、含TET1酶催化活性结构域真核表达载体的构建及鉴定
[0037] 1.1目的基因克隆及纯化
[0038] (1)Tet1 mRNA的CDS区序列(NM_030625.3)
[0039] >NM_030625.3:529-6939Homo sapiens tet methylcytosine dioxygenase 1(TET1),mRNA，具体序列如SEQ ID NO:1所示，其中下划线为PCR引物位置。
[0040] (2)设计并合成克隆用引物。
[0041] Tet1的全长基因由于长度较长，无法全部克隆至腺相关表达载体内，因此设计引物通过PCR获得Tet1酶催化活性结构域的编码基因，再克隆至腺相关表达载体内。克隆所用引物序列如下：
[0042] SEQ ID NO:3TET1-Forward primer：
[0043] GGAGGTAGTGGAATGGATCCCGCCACCATGGAACTGCCCACCTGCAGCTGTC；
[0044] SEQ ID NO:4TET1-Reverse primer:
[0045] TCACCATGGTGGCGGGATCGACCCAATGGTTATAGGGCCCCGCAAC。
[0046] 其中，下划线序列为酶切位点(BamHI)。产物长度：2207bp，序列如SEQ ID NO:5所示，退火温度60℃。产物翻译产生的肽段为TET1 1418-2136aa(图1)，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0047] (3)以含有human-TET1全长的质粒为模板，利用高保真酶(Takara公司)进行PCR，扩增获得TET1片段。PCR反应溶液配制如下：
[0048]
[0049]
[0050] 在PCR仪中按如下程序进行PCR反应：98℃预变性5min；98℃变性10sec，60℃退火10sec，72℃延伸2min30 sec，共进行35个循环；最后72℃反应8min。
[0051] (4)向PCR产物中加入10μL 6×loading buffer，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，确认产物大小(图2)。将目的条带在紫外灯下切下，并依据胶回收试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行回收纯化。
[0052] 1.2片段和载体的酶切
[0053] (1)所用腺相关表达载体为GV467；元件顺序为CMV-betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA；克隆位点：BamHI/BamHI。(图3)
[0054] (2)用限制性内切酶BamHI(NEB公司)分别对回收的片段和载体进行切割。
[0055] 按如下体系配制反应溶液，混匀后37℃水浴锅中酶切过夜。
[0056] 片段酶切体系：
[0057]
[0058] 载体酶切体系：
[0059]
[0060] (3)分别向片段和载体的酶切产物中加入10μL 6×loading buffer，进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带在紫外灯下切下，并依据胶回收试剂盒(天根)说明书进行回收。
[0061] 1.3片段与载体的连接
[0062] (1)各取1μL回收的片段和载体进行琼脂糖凝胶电泳，进行灰度定量，计算摩尔质量，按片段和载体的摩尔比3:1进行连接。
[0063] (2)按如下体系配制反应溶液，混匀后室温放置1～2hr。
[0064]
[0065] 1.4重组载体的转化与筛选
[0066] (1)取一只E.coli DH5α感受态细胞(Takara公司)，置于冰上自然融化。将10μL连接产物加到感受态细胞中，冰上静置20min。42℃水浴锅中热休克90sec，立即插到冰上，放置2min。加入700μL LB培养基，37℃摇床摇菌45min。
[0067] (2)将菌液均匀涂到含氨苄青霉素的琼脂平板上。先在37℃烘箱里正置30min，后倒置培养12～16hr。
[0068] (3)挑取多个单克隆分别放入摇菌管，加3mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床摇菌12～16hr。
[0069] 1.5阳性重组子的鉴定
[0070] (1)设计并合成鉴定PCR用引物，序列如下：
[0071] P1：CACTAAAACTTATTCGCTGATG；
[0072] P2：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
[0073] 产物长度为1007bp，退火温度60℃。
[0074] (2)以菌液为模板，进行PCR，反应体系如下：
[0075]
[0076] 在PCR仪中按如下程序进行PCR反应：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃反应10min。
[0077] (3)取6μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认产物大小(图4)。
[0078] (4)对PCR初步鉴定出的阳性菌群进行测序(上海吉凯生物有限公司)，与目的基因序列比对，确认重组质粒序列正确，无基因突变。
[0079] (5)将测序正确的菌液加入10mL含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃摇床摇菌12～16hr。用质粒小提中量试剂盒(天根生物有限公司)根据说明书提取重组质粒，获得pAAV-TET1(1418-2136aa)。
[0080] 实施例2、重组质粒表达检测
[0081] 2.1细胞转染
[0082] (1)取对数生长期的293T细胞，按50％的密度接种至6孔培养板中，置于5％CO2、37℃孵箱内培养至细胞密度达到约80％。
[0083] (2)根据lipofectamine 2000转染试剂(invitrogen公司)使用说明书，配制质粒与转染试剂的混合物，逐滴加入细胞。
[0084] (3)4～6hr后观察细胞状态，更换为新鲜的完全培养基。转染24～48hr后于荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，并拍照(图5)。
[0085] 2.2提取细胞总蛋白
[0086] (1)上述细胞长满后，弃去培养基，PBS洗涤两次，每孔加入100μL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(碧云天公司)，用细胞刮刮下细胞，转移至EP管中，冰上裂解15min。
[0087] (2)超声破碎细胞(200W共4次，每次5s，间隔2s)。离心，4℃，12000g×15min，取上清。
[0088] (3)用BCA法测定蛋白浓度，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书(碧云天公司)操作。根据蛋白定量结果，调整每个样品蛋白浓度为2μg/μL。-80℃保存备用。
[0089] 2.3SDS-PAGE电泳及转膜
[0090] (1)配制SDS-PAGE胶，分离胶浓度为10％，积层胶胶浓度为5％。待胶凝固后拔去梳子，组装好电泳装置，加入电泳缓冲液。
[0091] (2)取20μg蛋白样品，加入6.5μL的4×loading buffer，混匀后缓慢加入上样孔中。
[0093] (4)电泳结束后，使用湿转转膜装置，由正极到负极的方向，按滤纸-膜-胶-滤纸的顺序放入，每层中间不要有气泡。在4℃、300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。
[0094] 2.4抗体孵育与检测
[0096] (2)用抗体稀释液按1:3000稀释Flag抗体(sigma)。用TBST溶液将膜洗涤三次，8min/次后，放入一抗，室温孵育2hr或4℃过夜。
[0097] (3)用抗体稀释液按1:4000稀释鼠源二抗(santa-cruz)。用TBST溶液将膜洗涤三次，8min/次后，放入二抗，室温孵育1.5hr。
[0098] (4)用TBST溶液将膜洗涤三次，8min/次。将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上，根据ECL底物试剂盒说明书(Thermo)以1:40混合A液和B液，均匀滴加在PVDF膜上，避光反应5min。
[0099] (5)将膜取出，稍微沥干多余的ECL底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1-2min。
[0100] (6)取出X光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min(曝光时间需要多尝试几次，根据肉眼能否看见荧光以及荧光的强弱无适当调整曝光时间)。
[0101] (7)取出X光片，晾干，分析并拍照记录(图6)。
[0102] 实施例3、包装腺相关病毒
[0103] 3.1AAV-293细胞的培养
[0104] (1)复苏AAV-293细胞
[0105] a.配置含10％FBS的DMEM培养基(称为完全培养基)，用于AAV-293细胞的培养。
[0106] b.将3mL完全培养基加入10mL玻璃离心管中。
[0107] c.将细胞从液氮罐或-80℃冰箱取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇动1～2min使之完全融化。
[0108] d.将冻存管拿至超净台中，用酒精棉球擦拭表面进行消毒。将细胞悬液加至提前准备好的离心管中。
[0109] e.离心800g×3min，弃上清，加入2mL新的完全培养基，用滴管轻轻吹打使细胞悬浮，接种至10cm含有8mL新鲜完全培养基的培养皿中，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。
[0110] 3.2AAV-293细胞传代
[0111] a.每天观察绅胞生长状态及密度，当细胞密度达到50％时进行传代。
[0112] b.吸去原培养基，用10mL生理盐水清洗细胞两次，加1mL 0.5％胰蛋白酶溶液，放入37℃孵箱中消化1～3min至细胞刚从培养皿脱落。
[0113] c.加入3mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至10mL玻璃离心管。
[0114] d.离心800g×3min，弃上清。加入5mL新的完全培养基，用滴管轻轻吹打使细胞悬浮，取1mL接种至10cm含有8mL新鲜完全培养基的培养皿中，共接种5瓶，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。
[0115] 3.3冻存AAV-293细胞
[0116] a.取对数生长期的AAV-293细胞，吸去原培养基，用10mL生理盐水清洗细胞两次，加1mL 0.5％胰蛋白酶溶液，放入37℃孵箱中消化1～3min至细胞刚从培养皿脱落。
[0117] b.加入3mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至10mL玻璃离心管。
[0118] c.离心800g×3min，弃上清。加入3mL细胞冻存液(苏州新赛美有限公司)重悬细胞，分装至冻存管，1mL/管，放入-80℃冰箱，第二天放入液氮罐中长期保存。
[0119] 3.4细胞转染
[0120] (1)取对数生长期的AAV-293细胞，接种至10cm培养皿，置于37℃、5％CO2孵箱中培养，当细胞密度达到70～80％时进行转染。
[0121] (2)取1个1.5mL EP管，加入500μL CaCl2溶液(0.3M)，然后加入各10μg的pAAV-TET1(1418-2136aa)、pAAV-RC和pHelper，轻轻混合。
[0122] (3)取1个新的1.5mL EP管，加入500μL的2×HBS溶液，逐滴加入DNA/CaCl2混合液，颠倒混匀。
[0123] (4)将混合好的DNA/CaCl2/HBS溶液滴加至细胞培养皿上，同时轻轻晃动培养皿，使溶液均匀分布在培养基中，置于5％CO2、37℃孵箱内培养。
[0124] (5)6hr后换液，加10mL新鲜完全培养基，继续培养66～72hr。
[0125] 3.5收集腺相关病毒
[0126] (1)观察细胞形态及培养基颜色变化，待部分细胞变圆脱落以及培养基的颜色由红色发为橙色或黄色时，说明病毒包装成功。一般转染后三天收集病毒。
[0127] (2)用滴管将细胞轻轻吹下，连同培养基转移至15mL离心管中。
[0128] (3)离心800g×3min，将上清转移至新的15mL离心管，向细胞沉淀加入1mL PBS进行重悬。
[0129] (4)将细胞悬液反复置于液氮和37℃水浴中，冻融4次。
[0130] (5)离心10000g×3min，将上清转移至新的EP管。
[0131] 3.6病毒浓缩
[0132] (1)在(三)-(3)上清中加入适量PEG8000(40％)，使其终浓度为8％，冰上放置2hr，期间每15min颠倒混匀一次。
[0133] (2)离心2500g×30min，弃去上清，加入PBS重悬，并与(三)-(5)收集的上清合并。
[0134] (3)离心3000g×30min，将上清转移至新的EP管中。加入Benzonase核酸酶(终浓度为50U/mL)(Merck公司)消化去除残留的质粒DNA，颠倒混匀，37℃孵育30min。
[0135] (4)利用0.45μm的过滤器滤除溶液中的杂质。
[0136] 3.7病毒纯化
[0137] (1)向病毒浓缩液中加固体CsCl，约6.5g/10mL，浓度为1.41g/mL，振荡溶解。
[0138] (2)将样品加至超速离心管中，用预先配置的CsCl溶液(1.41g/mL)填满离心管的剩余空间。
[0139] (3)离心175000g×24hr，形成密度梯度，按顺序分别收集不同密度的溶液，进行滴度测定，收集含有AAV颗粒的组成。
[0140] (4)重复一次上述步骤。
[0141] 3.8超滤脱盐
[0142] (1)向Amicon-15超滤装置中加入4mL去离子水，使膜浸湿。
[0143] (2)将纯化得到的病毒溶液加至超滤装置中，用PBS将总体积补至4mL，盖上盖子。
[0144] (3)1500g离心，每5min观察剩余溶液体积，直至终体积为200～250μL。
[0145] (4)向剩余溶液中加入PBS将体积补至4mL。
[0146] (5)重复上述步骤3次。
[0147] (6)离心超滤管，使病毒溶液最终体积为0.5mL。
[0148] (7)加入适量甘油(终浓度5％)，分装于-80℃保存。
[0149] 3.9病毒滴度测定
[0150] (1)采用Zfcas9质粒(2.45E+13Copies/mL)，用ddH2O梯度稀释获得标准品，浓度分别2.45E+10、2.45E+9、2.45E+8、2.45E+7、2.45E+6Copies/mL。
[0151] (2)按如下方法稀释梯度稀释病毒溶液：
[0152]名称 病毒溶液 ddH2O
Sample-2 10uL原液 40uL
Sample-3 10uL Sample-2 90uL
Sample-4 10uL Sample-3 90uL
Sample-5 10uL Sample-4 90uL
Sample-2 10uL原液 40uL
Sample-3 10uL Sample-2 90uL
Sample-4 10uL Sample-3 90uL
Sample-5 10uL Sample-4 90uL
[0153] (3)配制real-time PCR反应溶液，每孔的反应体系如下：
[0154]
[0155] (4)加至96孔板中，每孔15μL，再加入5μL标准品或样品，设置复孔。
[0156] (5)将96孔板封膜后放入real-time PCR仪器，按如下程序进行反应：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30min，共进行40个循环；95℃反应15sec，
60℃ 60sec，95℃ 15sec获得溶解曲线。
60℃ 60sec，95℃ 15sec获得溶解曲线。
[0157] (6)根据标准品浓度的对数值和Ct平均值绘制出标准曲线：Y＝-3.345*LOG(X)+39.74,R2＝0.999。
[0158] (7)根据各Sample的Ct值计算浓度。由于标准品是双链DNA，而AAV病毒颗粒是单链DNA，病毒原液浓度等于各Sample浓度除以稀释度再乘2。
[0159] (8)对各Sample计算得到的病毒原液浓度取平均值，得到AAV病毒滴度为3.07E+13Copies/mL。
[0160]
[0161] 实施例4、过表达TET1在应激性认知损伤治疗中的应用
[0162] 此处以慢性不可预见性温和刺激(CUMS)应激模型为例，但AAV-TET1(1418-2136aa)的应用不仅限于该应激模型，还包括其他应激模型导致的认知损伤的治疗。
[0163] 4.1应激对bdnf DNA甲基化和认知能力的影响
[0164] (1)通过给予大鼠慢性不可预见性温和刺激(CUMS)，建立应激动物模型。取海马组织，提取DNA，进行甲基化特异性PCR实验，检测应激对海马结构神经营养因子bdnf基因启动子甲基化的影响。结果显示应激大鼠海马内bdnf基因启动子甲基化水平升高(图7)。
[0165] (2)进一步通过Western blot和免疫组化实验证实应激大鼠海马内BDNF表达降低(图8)。
[0166] (3)通过旷场实验、物体识别实验、水迷宫实验检测应激对大鼠认知能力的影响。结果显示与对照组相比，应激组大鼠的旷场得分和物体识别认知指数降低，水迷宫寻台时间增加，表明应激可导致大鼠认知能力降低(图9)。
[0167] 4.2海马内注射AAV-TET1(1418-2136aa)对bdnf DNA甲基化和认知能力的调控作用
[0168] (1)向应激组大鼠海马内注射1μL AAV-TET1(1418-2136aa)和对照病毒(3×109TU/μL)，取海马组织，提取DNA，进行甲基化特异性PCR实验，检测过表达TET1对bdnf基因启动子甲基化的影响。结果显示TET1可降低bdnf基因启动子的甲基化(图10)。
[0169] (2)通过Western blot和免疫组化实验证实在应激大鼠海马内过表达TET1可促进BDNF表达(图11)。
[0170] (3)通过旷场实验、物体识别实验、水迷宫实验检测过表达TET1对应激大鼠认知能力的影响。结果显示与注射对照病毒相比，过表达TET1大鼠的旷场得分和物体识别认知指数升高，水迷宫寻台时间减少，表明过表达TET1能够促进应激大鼠的认知能力的恢复，提示TET1可能是应激性认知损伤治疗的潜在靶点(图12)。
[0171] 此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
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