宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
阅读：666发布：2020-05-12
专利汇可以提供宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于大肠杆菌技术领域，具体涉及一种宽裂解谱的大肠杆菌 噬菌体 及其组合物、 试剂 盒 和应用。噬菌体为大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1），保藏编号为CCTCC M 2018936。本发明的噬菌体对正常 微 生物 菌群无毒害作用且其DNA无法编码毒 力 基因，为开发新型抗菌制剂提供了优良菌种资源，具有良好的应用开发前景。，下面是宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用专利的具体信息内容。
1.一种宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coliphageCL1），保藏编号为CCTCC M 2018936；。
2.根据权利要求1所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coliphageCL1）为烈性噬菌体，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径约为100nm,尾部长约150nm,属于肌尾科噬菌体；且在pH3～pH11、在4℃～37℃条件下具有耐碱性，MOI=0.1条件下培养6h，其效价为1.4×1010 pfu/mL。
3.根据权利要求1所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1）具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；大肠杆菌噬菌体CL6（Escherichia coli phage CL6）具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；大肠杆菌噬菌体CL7（Escherichia coli phage CL7）具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1 所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1）的主要结构蛋白相对分子量为43kDa。
5.一种含有权利要求1～4任一项所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物含有大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1），大肠杆菌噬菌体CL6（Escherichia coliphage CL6）或大肠杆菌噬菌体CL7（Escherichia coli phage CL7）中的一种。
6.根据权利要求5所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物含有大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1），大肠杆菌噬菌体CL6（Escherichia coliphage CL6）和大肠杆菌噬菌体CL7（Escherichia coli phage CL7）中的两种或两种以上。
7.一种含有权利要求1～6任一项所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
8.一种权利要求7 所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体组合物或含有大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在制备大肠杆菌引发的仔猪黄痢，鸡白痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎等疾病的药物中的应用。
宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
技术领域
[0001] 本发明属于大肠杆菌的研发技术领域，具体涉及宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。
背景技术
[0002] 大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，是为人和动物肠道中的常居菌。大多数大肠杆菌菌株无害。然而，有些大肠杆菌可引起食源性疾病。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原 (O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为二百多个型，其中一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症。该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。
[0003] 噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性。由于其具备强大的杀菌能力，噬菌体可作为一种抗细菌感染制剂使用，自20世纪初以来一直受到国内外许多学者关注。
[0004] 孙利厂等人(《中国动物传染病学报》2018,12，10)从养殖场采集的污水样品中分离到宽噬菌谱肠出血性大肠杆菌烈性噬菌体，并进行了噬菌斑、噬菌谱、形态学(透射电镜)、遗传物质、酸碱及热稳定性、一步生长曲线等生物学特性及控制养殖环境中的肠出血性大肠杆菌的污染研究。
[0006] 中国专利CN106591241A公开了一种新型肠出血性大肠杆菌O157，以用于防治污水排放或回用引发的肠出血性大肠杆菌O157的污染。
[0007] 中国专利CN110129283A公开了一种短尾强裂解性大肠杆菌噬菌体，命名为PD38，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年9月26日，保藏编号为CGMCC No.16391。该噬菌体对大肠杆菌具有较好的裂解作用，对食品、养殖环境中的大肠杆菌具有良好的消杀作用，同时可以防治鸡大肠杆菌引起的疾病。
[0008] 中国专利CN109251899A公开了一种耐药大肠杆菌噬菌体及其应用。分类命名为 Escherichia phage vB_EcoP-EG1，保藏号为：CCTCC M 2018562，保藏日期为2018年8月 21日。
[0009] 中国专利CN106754751A一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用，该噬菌体菌株保藏号为CCTCC NO：M 2016539，于2016年9月29日保藏于中国武汉大学中国典型培养物保藏中心，分类命名为肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_ECM_MIE， Entero-hemorrhagic Escherichia coli O157:H7 phage vB_ECM_MIE；对EHEC具有高效杀菌能力。
[0010] 韩国专利KR102003786B1公开了一种新的大肠杆菌特异性噬菌体EcoH7及其制备方法。更噬菌体EcoH7对产大肠杆菌具有非常高的特异性，可以解决抗生素对抗生素的耐药性，食品中的残留问题，以及广泛的宿主范围，因此可广泛用于抗生素，组合物，饲料，消毒剂或清洗剂领域。
[0011] 美国专利US10265353B2公开了一种从自然界中分离的能够特异性杀死肠出血性大肠杆菌菌株的肌病毒科噬菌体ESC-CHP-1，保藏号:KCTC12660bp，使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物可以预防和治疗肠出血性大肠杆菌的感染。
[0012] 美国专利US7635584B2公开了一种对大肠杆菌O157:H7菌株具有强裂解活性的分离的噬菌体，以及使用该噬菌体和/或衍生自该噬菌体的后代或衍生物来控制大肠杆菌O157:H7 在各种环境中的生长的方法。
[0013] 目前，关于大肠杆菌噬菌体的研究主要集中于肠出血性噬菌体方面，针对更多病原的大肠杆菌噬菌体及其应用方面的研究鲜见报道。综上，急需开发新的裂解谱宽、安全性高的新型噬菌体。
发明内容
[0014] 本发明的目的在于提供一种宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用，具有裂解谱宽，安全性好的特点。
[0015] 采用的一种宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体CL1 (Escherichia coliphageCL1)，保藏编号为CCTCC M 2018936。
[0016] 进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coliphageCL1)为烈性噬菌体，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径约为100nm,尾部长约150nm,属于肌尾科噬菌体；且在pH3～pH11、在4℃～37℃条件下具有耐碱性，MOI＝0.1条件下培养6h，其效价为1.4×1010pfu/mL。
[0017] 进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coli phage CL1)具有SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。
[0018] 进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coli phage CL1)的主要结构蛋白相对分子量为43kDa。
[0019] 一种含有上述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体的组合物，所述组合物含有大肠杆菌噬菌体 CL1(Escherichia coli phage CL1)，大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coliphage CL6)或大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coli phage CL7)中的一种。
[0020] 一种含有上述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体的组合物，所述组合物含有大肠杆菌噬菌体 CL1(Escherichia coli phage CL1)，大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coliphage CL6)和大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coli phage CL7)中的两种或两种以上。
[0022] 一种含有上述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
[0023] 上述的大肠杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体组合物或含有大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在制备由大肠杆菌引发的仔猪黄痢，鸡白痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎等疾病的药物中的应用。
[0024] 本发明具有如下有益效果：(1)本发明大肠杆菌噬菌体CL1、CL6以及CL7均为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；具有较广的宿主范围；其DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可进行大规模发酵培养；其培养液可于室温下稳定存活，于4℃下可保存12个月。本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的3株大肠杆菌噬菌体能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。本发明中CL1， CL6及CL7对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达
80.00％，76.00％和74.00％。其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7， CL1+CL6+CL7的裂解率分别为90.00％，86.00％，88.00％和94.00％。
80.00％，76.00％和74.00％。其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7， CL1+CL6+CL7的裂解率分别为90.00％，86.00％，88.00％和94.00％。
[0025] (2)本发明大肠杆菌噬菌体CL1、CL6以及CL7或其组合物的产品形式包括但不限于以载体携带、浓缩喷洒或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、生活水体等范围；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于含水性载体；浓缩喷洒形式包括但不限于虾苗喷洒等；药剂浸泡形式包括但不限于漂洗剂等。
[0026] (3)本发明大肠杆菌噬菌体CL1、CL6以及CL7或其组合物被制备常作为有效成分应用于环境消毒的各种产品，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。上述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于消毒剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、海水等。附图说明
[0027] 图1是电镜鉴定的大肠杆菌噬菌体CL1形态结构示意图；图2是电镜鉴定的大肠杆菌噬菌体CL6形态结构示意图；
图3是电镜鉴定的大肠杆菌噬菌体CL7形态结构示意图。
图3是电镜鉴定的大肠杆菌噬菌体CL7形态结构示意图。
具体实施方式
[0028] 以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
[0029] 以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。
[0030] 大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coliphageCL1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018936，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；
大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coliphageCL6)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018932，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；
大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coliphageCL7)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018933，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日。
大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coliphageCL6)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018932，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；
大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coliphageCL7)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018933，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日。
[0031] 以下实例中，TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；
TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水
1000mL；
TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水
1000mL；
SM液配方为.氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水
1000mL。
TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水
1000mL；
TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水
1000mL；
SM液配方为.氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水
1000mL。
[0032] 实施例1：噬菌体的分离制备及纯化培养本发明中大肠杆菌噬菌体CL1的来源样品采集于江苏省南京市江宁区众彩农贸市场污水， CL6的来源样品采集于江苏省南京市江宁区江南奶牛场牛粪，CL7的来源样品采集于江苏省南京市江宁大学城地下污水，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。
[0033] 噬菌体的分离：取10mL过滤后上清液，加入10mL 2倍TSB培养基中，同时加入1mL 噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养6h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5mL噬菌体宿主菌对数期菌液，加入5mL， 40℃半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10μl，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养6h，形成噬菌体点滴斑。
[0034] 噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mL SM缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀2 4 6
释，取10 ，10 和10 稀释液分别加入对数期宿主菌0.5mL，混合均匀静置15min后，加入 5mL，
40℃半固体TSB培养基，立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于 37℃温箱培养6h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mL SM缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1mL对数期宿主菌菌液的50mL TSB培养基中，37℃条件下180rpm摇培6h。取培养物在
8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液，分别得到大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coliphageCL1)，保藏编号为CCTCC M 2018936；大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coliphageCL6)，保藏编号CCTCC M 2018932；大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coliphageCL7)，保藏编号CCTCC M 2018933。
释，取10 ，10 和10 稀释液分别加入对数期宿主菌0.5mL，混合均匀静置15min后，加入 5mL，
40℃半固体TSB培养基，立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于 37℃温箱培养6h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mL SM缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1mL对数期宿主菌菌液的50mL TSB培养基中，37℃条件下180rpm摇培6h。取培养物在
8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液，分别得到大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coliphageCL1)，保藏编号为CCTCC M 2018936；大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coliphageCL6)，保藏编号CCTCC M 2018932；大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coliphageCL7)，保藏编号CCTCC M 2018933。
[0035] 实施例2：噬菌体的电镜观察分别取实施例1制得的各噬菌体培养物上清作电镜观察：取20μL样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸(PTA)于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察：结果如图1所示，大肠杆菌噬菌体CL1形态发现，有一呈多面体对称的头部和较长的尾部，长径L约为60nm,横径W约为15nm；尾长约60nm，宽约2nm,有可收缩的肌鞘(参见图1)；大肠杆菌噬菌体CL6形态发现，其形态为蝌蚪状，具有多面体对称的头部结构和较长的尾部，头部长径L约为50nm,横径W约为52；尾部长约50nm，宽约3nm,有可收缩的肌鞘，尾部的末端具有3条短棘(参见图2)；大肠杆菌噬菌体CL7形态发现，具有呈正多面体的头部结构和较长的尾部，头部长径L约为60nm, 横径W为50nm；尾部长约50nm，宽约3nm,有可收缩的肌鞘，尾部的末端具有3条短棘 (参见图3)。
[0036] 实施例3：噬菌体基因组的提取与测序分别取实施例1制得的各噬菌体100mL，加入终浓度1μg/mL的DNaseI，RNaseA，37℃条件孵育60min后加入5.84g Nacl(终浓度1mol/L)，溶解后置于冰浴中1h。4℃条件下，11000rpm 离心10min，将上清转移至新的离心管中。加入固体PEG8000(终浓度10％，即100mL加入
10g)，完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。再次加入DNase I、RNase A至终浓度1μg/mL，37℃反应30～60min。加入EDTA 至终浓度
20mmol/L(即1mL SM液加入40μL0.5mol/L EDTA)，同时每1mLSM液中加入10 μL10％SDS。从加入蛋白酶步骤开始，使用DP315-R TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒(Tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用Eppendorf BioPhotometer Plus测定其浓度和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：
大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coliphageCL1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coliphageCL6)具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coliphageCL7)具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
10g)，完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。再次加入DNase I、RNase A至终浓度1μg/mL，37℃反应30～60min。加入EDTA 至终浓度
20mmol/L(即1mL SM液加入40μL0.5mol/L EDTA)，同时每1mLSM液中加入10 μL10％SDS。从加入蛋白酶步骤开始，使用DP315-R TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒(Tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用Eppendorf BioPhotometer Plus测定其浓度和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：
大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coliphageCL1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coliphageCL6)具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coliphageCL7)具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0037] 实施例4：噬菌体的毒力基因或不良基因缺失检测试验本发明选取43种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表1)，通过测定大肠杆菌噬菌体CL1，CL6，及CL7的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本发明3株供试噬菌体均不含有下列毒力基因。
[0038] 表1病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因实施例5：噬菌体MOI及效价的测定
挑取大肠杆菌DC1单个菌落，接种到盛有3mL TSB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1∶100比例转接到10mL TSB培养液，37℃
160rprn 振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为10、1、0.01和0.0001的比例分别加入噬菌体3 种噬菌体纯培养液和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中160rpm振荡培养6h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，按如下方法测定噬菌体效价：用SM液做稀释液，将噬菌体CL1,CL6及CL7原液(由实施例1 制得)分别10倍梯度稀释至107倍。分别取105、106及107稀释度的噬菌体培养液100μL与其宿主菌大肠杆菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4mL冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。
挑取大肠杆菌DC1单个菌落，接种到盛有3mL TSB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1∶100比例转接到10mL TSB培养液，37℃
160rprn 振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为10、1、0.01和0.0001的比例分别加入噬菌体3 种噬菌体纯培养液和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中160rpm振荡培养6h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，按如下方法测定噬菌体效价：用SM液做稀释液，将噬菌体CL1,CL6及CL7原液(由实施例1 制得)分别10倍梯度稀释至107倍。分别取105、106及107稀释度的噬菌体培养液100μL与其宿主菌大肠杆菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4mL冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。
[0039] 结果表明，培养6h条件下，噬菌体CL1效价达到最高(1.4×1010pfu/mL)时，其 MOI＝0.1；噬菌体CL6效价达到最高(2.6×1010pfu/mL)时，其MOI＝0.001；噬菌体CL7 效价达到最高(2.0×1010pfu/mL)时，其MOI＝0.0001。
[0040] 表2 3株噬菌体MOI值实施例6制备噬菌体鸡尾酒组合物
将实施例5富集得到的噬菌体溶液分装至50ml离心管中，每管40ml；加入固体PEG8000(终浓度10％，即40ml加入4g)，完全溶解后，冰浴至少3h；将噬菌体4℃，12000rpm离心
20min；弃去上清液，使用等体积的SM缓冲液充分溶解沉淀；将噬菌体SM洗脱液使用0.22μm滤膜，过滤除菌。检测效价后，根据表3中的要求分别将噬菌体进行稀释混合。最终获得的鸡尾酒混合液总效价均为3×108pfu/mL，各噬菌体的单位体积有效工作效价相等。
将实施例5富集得到的噬菌体溶液分装至50ml离心管中，每管40ml；加入固体PEG8000(终浓度10％，即40ml加入4g)，完全溶解后，冰浴至少3h；将噬菌体4℃，12000rpm离心
20min；弃去上清液，使用等体积的SM缓冲液充分溶解沉淀；将噬菌体SM洗脱液使用0.22μm滤膜，过滤除菌。检测效价后，根据表3中的要求分别将噬菌体进行稀释混合。最终获得的鸡尾酒混合液总效价均为3×108pfu/mL，各噬菌体的单位体积有效工作效价相等。
[0041] 表3不同的噬菌体组合物及比例实施例7：噬菌体及噬菌体鸡尾酒组合物pH和温度稳定性的测定
7-1：不同pH条件下噬菌体的稳定性
将1ml效价为1×108pfu/mL CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体和1ml效价为1×108pfu/ mL的噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”“,CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”各7份分别置于4ml pH＝1,3,5,7,9,11和13的SM溶液中，制成效价为5×107pfu/mL的噬菌体溶液，4℃培养24h后，再检测其效价。
7-1：不同pH条件下噬菌体的稳定性
将1ml效价为1×108pfu/mL CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体和1ml效价为1×108pfu/ mL的噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”“,CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”各7份分别置于4ml pH＝1,3,5,7,9,11和13的SM溶液中，制成效价为5×107pfu/mL的噬菌体溶液，4℃培养24h后，再检测其效价。
[0042] 结果如表4所示，在pH5～pH9之间，3株噬菌体CL1，CL6,及CL7及其噬菌体鸡尾酒“CL1+CL6”“,CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”的效价均无显著变化，表明其在中性，微酸和微碱条件下有较好的稳定性。
[0043] 在pH＝3的酸性条件下和pH＝11的碱性条件下，3株噬菌体及其噬菌体鸡尾酒的效价有一定程度的下降，但是与pH＝7条件下相比，效价仍未下降超过3个数量级，表明其在酸性和碱性条件下仍有一定程度的耐受性。在pH＝1的极酸性条件下和pH＝13的极碱性条件下， 3株噬菌体及其噬菌体鸡尾酒的效价1个小时内均下降为0。
[0044] 表4 3株单一噬菌体及其鸡尾酒混合物在不同pH条件下的稳定性7-2：不同温度条件下噬菌体的稳定性
将效价为1.0×107pfu/mL CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，以及总效价为3.0×
107pfu/ mL的噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”“, CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”分别置于4℃，25℃以及37℃条件下，检测其效价。
将效价为1.0×107pfu/mL CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，以及总效价为3.0×
107pfu/ mL的噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”“, CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”分别置于4℃，25℃以及37℃条件下，检测其效价。
[0045] 结果表明，在4℃条件下，CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”“, CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”都具有较好的稳定性，存放3个月后，效价并无明显下降，且存放12个月后，效价下降依然未超过1个数量级；在25℃条件下；CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”, “CL1+CL7”“,CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”在1周之内效价无明显下降，4周后，效价均大约仅仅下降1个数量级；
在37℃条件下，CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”“,CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”在 24小时内效价没有明显下降，72小时后，效价均大约仅仅下降1个数量级。由此表明，由上述3种噬菌体组成的鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”“, CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”在不同温度条件下都具有较好的稳定性，参见表
5—7。
在37℃条件下，CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”“,CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”在 24小时内效价没有明显下降，72小时后，效价均大约仅仅下降1个数量级。由此表明，由上述3种噬菌体组成的鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”“, CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”在不同温度条件下都具有较好的稳定性，参见表
5—7。
[0046] 表5 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物在4℃条件下的稳定性表6 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物在25℃条件下的稳定性
表7 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物在37℃条件下的稳定性
实施例8噬菌体对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌的裂解能力
采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取从山东，四川，重庆，安徽，广东和河南等6省分离所得的45株猪源耐药性大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养
6-8h，观察结果。试验重复三次。
表7 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物在37℃条件下的稳定性
实施例8噬菌体对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌的裂解能力
采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取从山东，四川，重庆，安徽，广东和河南等6省分离所得的45株猪源耐药性大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养
6-8h，观察结果。试验重复三次。
[0047] 结果如表8所示，CL1，CL6及CL7对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达62.22％，64.44％和66.67％。
[0048] 其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7，CL1+CL6+CL7的裂解率分别为84.44％，84.44％，82.22％和91.11％。由此表明，采用上述3种噬菌体的鸡尾酒混合物对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。
[0049] 表8噬菌体对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌的裂解结果注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”实施例9噬菌体对不同来源地的牛源耐药性大肠杆菌的裂解能力
采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取从山东，河南，河北，吉林和广东等 5省分离所得的40株牛源耐药性大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-
8h，观察结果。试验重复三次。
采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取从山东，河南，河北，吉林和广东等 5省分离所得的40株牛源耐药性大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-
8h，观察结果。试验重复三次。
[0050] 结果如表9所示，CL1，CL6及CL7对不同来源地的牛源耐药性大肠杆菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达67.5％，70.00％和72.50％。
[0051] 其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7，CL1+CL6+CL7的裂解率分别为82.50％，85.00％，77.50％和85.00％。由此表明，采用上述3种噬菌体的鸡尾酒混合物对不同来源地的牛源耐药性大肠杆菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。
[0052] 表9噬菌体对不同来源地的牛源耐药性大肠杆菌的裂解结果注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”实施例10：噬菌体对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌的裂解能力采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取从山东，河南，安徽，江苏，江西和广东等6省分离所得的50株禽源耐药性大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取
5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
[0053] 结果如表9所示，CL1，CL6及CL7对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达80.00％，76.00％和74.00％。
[0054] 其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7，CL1+CL6+CL7的裂解率分别为90.00％，86.00％，88.00％和94.00％。由此表明，采用上述3种噬菌体的鸡尾酒混合物对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。
[0055] 表10噬菌体对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌的裂解结果注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”实施例11：噬菌体对非宿主性致病性细菌的裂解试验
挑取20株非宿主性病原细菌单菌落，包括无乳链球菌4株，停乳链球菌4株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌4株，鲍曼不动杆菌3株。分别接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm 培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μL噬菌体培养液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果显示，3株噬菌体及其鸡尾酒混合物均无法识别20株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株(表11)。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。
挑取20株非宿主性病原细菌单菌落，包括无乳链球菌4株，停乳链球菌4株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌4株，鲍曼不动杆菌3株。分别接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm 培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μL噬菌体培养液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果显示，3株噬菌体及其鸡尾酒混合物均无法识别20株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株(表11)。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。
[0056] 表11 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物对非宿主性致病性细菌的裂解试验注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”本发明宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体组合物或含有大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒可适用于制备大肠杆菌引发的仔猪黄痢，鸡白痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎等疾病的药物中。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 弓形虫乳酸脱氢酶基因敲除虫株的构建方法及用途 | 2020-05-08 | 553 |
| 检测Ⅰ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法 | 2020-05-11 | 317 |
| 水产养殖和其他动物系统中病原菌生物控制的新系统 | 2020-05-08 | 570 |
| 一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法、菌株及其应用 | 2020-05-11 | 138 |
| 一种防治桃细菌性穿孔病的复合制剂及用途 | 2020-05-12 | 222 |
| 柯萨奇病毒A16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法 | 2020-05-13 | 877 |
| 检测Ⅲ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法 | 2020-05-11 | 481 |
| 耐高温的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用 | 2020-05-12 | 108 |
| 一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯及其用途 | 2020-05-12 | 253 |
| 一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-SH及其用途 | 2020-05-12 | 238 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈